CN113812396B - 一种鸭精液冷冻保存稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸭精液冷冻保存稀释液，包括不含甘油的Tris‑卵黄冷冻保存稀释液A和含甘油的Tris‑卵黄冷冻保存稀释液B，每100mL Tris‑卵黄冷冻保存稀释液B中含有：Tris‑碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄10‑25g、甘油1.5‑12mL和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水。本发明的Tris‑卵黄冷冻保存稀释液用于雷州黑鸭或其他品种鸭精子冷冻保存能大大提升保存的鸭精液品质，配制及操作简单易行，能有效的提高冻解精子活力，为雷州黑鸭乃至禽类精液冷冻保存、种质资源保存和利用等领域研究提供技术支撑。

Description

一种鸭精液冷冻保存稀释液
技术领域
本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种鸭精液冷冻保存稀释液。
背景技术
家禽的精液保存是人工授精技术中的关键环节,该技术水平的高低将直接影响生产过程中的经济效益。精液冷冻保存可以不受限于时间和空间，提高优良种公禽的利用率，促进品种改良等优点。利用冷冻保存技术,可以将精子、卵子、胚胎等置于-196℃的环境中,抑制其新陈代谢,从而进行保存,在需要时再解冻利用。目前因禽类冷冻精液活力低导致受精率极不稳定,只有少数国家建立了禽类精子冷冻库。国内外对家禽精液冷冻保存研究主要集中在鸡上,鸭的研究较少,相关报道也较少。鸭精液通过冷冻可长期保存,这样对精液的使用、选种、杂交改良,打破了精液使用的时空限制,使优秀基因迅速传播。雷州黑鸭是广泛分布于雷州半岛一带，属于黑羽蛋肉兼用型地方鸭，是具有肉质鲜美、产蛋量高、抗病力强、青壳率高和耐粗饲等种质特性的地方优良品种之一。雷州黑鸭精液冷冻保存对品种资源保护具有重要意义,可降低保种费用。目前鸭人工授精使用新鲜或15℃保存2-3天精液，受精率较高，但受时间限制无法广泛使用。鸭精液相比鸡、鹅对低温刺激敏感，冷冻保存后精子活力降低，进而受精率低等问题导致人工授精上无法推广利用。
种公鸭精液质量受很多因素的影响。种公鸭年龄、健康状况、季节气候、精液采集方式等对精液质量的影响较大，进而影响产蛋率和孵化率。雷州黑鸭精液冷冻稀释液和冷冻保存技术方面的研究尚未空白。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸭精液冷冻保存稀释液，以提高冻-解精子活力、质膜完整性和存活时间。
本发明的第一个目的是提供一种鸭精液冷冻保存稀释液。
本发明的鸭精液冷冻保存稀释液，包括Tris-卵黄冷冻保存稀释液A和Tris-卵黄冷冻保存稀释液B，所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液A，每100mL中含有：Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄10-25g和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水；所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液B，每100mL中含有：Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄10-25g、甘油1.5-12mL和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水。
优选，所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液A，每100mL中含有：Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄15-20g和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水。
优选，所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液B，每100mL中含有：Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄15-20g、甘油3-6mL和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水。
本发明的稀释液配方中，Tris-碱有很高的缓冲能力，保持精子细胞结构和生理完整性提供保障，维持和调节稀释液pH值；乳糖为精子代谢提供能量；檬酸三钠二水具有良好的pH调节及缓冲性能；肌醇具有促进精子新陈代谢、促进发育功效；鸭卵黄具有保护精子细胞膜和提供能量作用；甘油作为渗透性保护剂，减少冰晶的形成、减轻自由基对细胞的损害、改变细胞膜的通透性；硫酸阿米卡星起到杀菌作用，从而延长精子的存活时间。
本发明的第二个目的是还提供一种鸭精液冷冻保存方法，其包括如下步骤：
a.采集鸭精液，将品质检查合格的精液预热至35-37℃备用；
b.于35-37℃条件下，用Tris-卵黄冷冻保存稀释液A将精液稀释4倍后装入离心管，将离心管放入35℃水中然后置于5℃条件下缓慢降温平衡2-3h；平衡到5℃后用Tris-卵黄冷冻保存稀释液B分两次稀释：第一次将精液与Tris-卵黄冷冻保存稀释液B按体积比2:1稀释，然后平衡5-10min；第二次将精液与Tris-卵黄冷冻保存稀释液B按体积比2:1稀释，然后再平衡5-10min；然后将稀释液分装至冷冻细管并封口，液氮熏蒸10-15min，然后放入液氮中保存。
优选，所述的鸭为雷州黑鸭、白鸭或麻鸭。也可以将上述的鸭精液冷冻保存稀释液和鸭精液冷冻保存方法应用于其他禽类精液冷冻保存。
所述的离心管为15mL规格的离心管。
所述的冷冻细管为0.25mL规格的冷冻细管。
所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液B使用前保持在5℃。
1.本发明的Tris-卵黄冷冻保存稀释液对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响
本发明开发和利用Tris-卵黄冷冻保存稀释液冷冻保存，对基础稀释液中主要成分进行筛选和优化比例。
向Tris-卵黄稀释液中添加同等浓度的乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响：糖可提供精子体外生存的能量，发挥很重要的作用。基础稀释液中添加等量的不同糖类，结果表明乳糖效果最佳与添加果糖组有显著的差异性(P<0.05)，葡萄糖和蔗糖组对比没有显著差异。乳糖效果显著是有可能依赖于基础稀释液。
不同浓度鸭卵黄对解冻后精子活力的影响：与对照组(无卵黄)对比添加鸭卵黄组明显的改善精子活力(P<0.05)，与低剂量组和高剂量组对比15％的卵黄组显著提高冻解鸭精子活力。卵黄作为提供营养和表面活性剂对精子有保护作用，低剂量是可能会达不到保护作，剂量过高可提高渗透压影响解精子寿命或运动能力。
抗冷冻剂甘油对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响：结果表明3-6％的甘油效果最佳，甘油浓度过高有可能提高渗透压和产生毒性作用，浓度低时脱水效果不全导致精子细胞内形成冰晶，进而损伤细胞结构。通过优化冷冻稀释液提高精子活力、维持受精能力和孵化率在人工授精中应用冷冻保存精液至关重要。
2.卵黄和无卵黄稀释液对冻-解雷州黑鸭精液品质的影响
Tris-卵黄稀释液常用于哺乳动物精液的冷冻保存，禽类精液冷冻中应用报告较少。本发明开发利用一种新的Tris-卵黄冷冻保存稀释液，为验证其效果筛选出一个在禽类上具有最优效果的无卵黄稀释液(组Ⅱ)做对比实验，分析对冻-解雷州黑鸭精子活力、细胞质膜完整率和畸形率的影响。研究结果表明，与新鲜精液活力对比，冷冻组显著降低精子活力，组I(Tris-卵黄冷冻保存稀释液)精子活力显著高于组II(P<0.05)。不同稀释液对冻-解雷州黑鸭精子质膜完整性和畸形率各冷冻保存组间无显著差异。
解冻后38℃水浴锅保存6h对精子活力的影响：结果阐明Tris-卵黄冷冻保存稀释液有效的维持精子活力。
上述的实验结果验证将Tris-卵黄冷冻保存稀释液用于雷州黑鸭或其他品种鸭精子冷冻保存能大大提升保存的鸭精液品质。
本发明的有益效果：
(1)本发明对Tris-卵黄冷冻保存稀释液(组分Ⅰ)中糖的种类、鸭卵黄浓度、甘油浓度进行筛选试验，选出最佳适宜糖、鸭卵黄浓度和甘油浓度。利用本发明的优选方案配方的稀释液对雷州黑鸭精液进行冷冻保存，改善其冻-解精子活力。
(2)本发明还提供一种价格低廉、效益明显的雷州黑鸭精液冷冻保存稀释液(组分Ⅱ)，与Tris-卵黄冷冻保存稀释液(组分Ⅰ)进行对比，结果表明有效维持精子活力和细胞膜完整性。
(3)本发明的精液稀释和平衡方法的优点是：稀释后精液放入装同温水的玻璃杯中置于5℃冰箱缓慢降温平衡2-3h，目的是避免降温过快对精子产生低温刺激，产生应激效应而导致精子死亡率升高。
(4)平衡至5℃后用含甘油稀释液进行两次稀释，目的是首先低温状态下精子处于休眠状态，抑制其运动、新陈代谢速度降低、能量消耗减缓，从而延长精子寿命。其次，甘油作为一种渗透性保护剂，减少冰晶的形成，从而保护精子。但过早添加或一次性添加甘油可引起稀释液渗透压急速升高导致精子脱水严重或死亡，因此分两次稀释提高精子存活率。
(5)精液冷冻时，在装液氮泡沫箱内制作漂浮船(-20～-30℃)，将灌装精液冷冻细管置于小船上熏蒸15min，可以保持缓慢降温避免急剧降温导致精子死亡。
本发明开发的Tris-卵黄冷冻保存稀释液，配制及操作简单易行，能有效的提高冻解精子活力，为雷州黑鸭乃至禽类精液冷冻保存、种质资源保存和利用等领域研究提供技术支撑。
附图说明
图1为精液冷冻保存实验技术路线图。
图2为不同糖(稀释液：组Ⅰ)对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响；不同字母之间表示显著差异(P<0.05)。
图3为不同浓度鸭卵黄(稀释液：组Ⅰ)对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响；不同字母之间表示显著差异(P<0.05)。
图4为不同浓度甘油(稀释液：组Ⅰ)对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响；不同字母之间表示显著差异(P<0.05)。
图5为不同稀释液对冻-解鸭(雷州黑鸭、白鸭、麻鸭)精子活力的影响；不同字母之间表示显著差异(P<0.05)。
图6为不同稀释液对冻-解雷州黑鸭精液品质不同指标的影响，不同字母之间表示显著差异(P<0.05)；图A：精子活力，图B：生存率，图C：精子细胞膜完整性，图D：畸形率。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1材料与方法
1.1材料与实验动物
实施例中涉及的原材料均来自普通市售产品。
试验所用雷州黑鸭由广东海洋大学与湛江市坡头区恒成种养专业合作社提供。选择12月龄以上的公鸭进行采精训练，最终筛选出13只雷州黑公鸭、5只白鸭、6只麻鸭用于试验。
1.2方法
精液冷冻保存试验技术路线图如图1所示。
1.2.1稀释液的配制
Tris-卵黄冷冻保存稀释液(组Ⅰ)：
Tris-卵黄冷冻保存稀释液A，不含甘油；取Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄10-25g和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，加超纯水补齐至100mL。
Tris-卵黄冷冻保存稀释液B，含甘油；取Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄10-25g、甘油1.5-12mL和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，加超纯水补齐至100mL。
无卵黄稀释液(组Ⅱ)：
无卵黄稀释液A，不含甘油；取果糖0.8g、柠檬酸钾0.2g、谷氨酸钠1.1g、肌醇0.06g、磷酸二氢钾0.88g和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，加超纯水补齐至100mL。
无卵黄稀释液B，含甘油；取果糖0.8g、柠檬酸钾0.2g、谷氨酸钠1.1g、肌醇0.06g、磷酸二氢钾0.88g、甘油5mL和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，加超纯水补齐至100mL。
配制稀释液的注意事项：使用的器具必须清洗干净，消毒后用；稀释液使用前2-3天配制5℃冰箱中保存，用前37℃预热30min使用；配制稀释液所用药品成分要纯净，称量准确，溶解充分；分别配制稀释液A(不含甘油)和稀释液B(含甘油：平衡到5℃后才用)。
1.2.2精液的采集
雷州黑鸭由广东海洋大学与湛江市坡头区恒成种养专业合作社提供，挑选12月龄以上的公鸭采用背部按摩法和诱情法采集精液，采集后精液色泽和气味无异常的进行精液品质检查，将品质检查合格的精液混合预热至35℃备用。
1.2.3精液的稀释和降温平衡
提前将稀释液预热至35℃，然后与原精液(品质合格精液混合使用)混合进一步稀释，原精液用每种稀释液A(不含甘油)按1：4(原精液：稀释液A)的比例稀释分别装入15mL离心管。然后500mL玻璃杯中装35℃温水300mL将装稀释精液的离心管放入其中，之后置于5℃冰箱缓慢降温平衡；平衡到5℃后用5℃的稀释液B(含甘油)分两次稀释；第一次稀释按精液：稀释液B为2：1的比例进行，然后平衡5min；之后进行第二次稀释，按精液：稀释液B为2：1的比例进行，然后再平衡5min。
1.2.4精液冷冻保存和解冻
之后将平衡精液吸入0.25mL的冷冻细管并封口置于预先准备的液氮漂浮船上(在泡沫箱内倒入2/3部位的液氮上制作漂浮船)液氮熏蒸15min，最后放入液氮中保存。液氮中保存1周后解冻检测精液品质，解冻时将细管从液氮中迅速取出立即在37℃温水解冻20s，并评估精液品质。
1.2.5精液品质检查
精子活力：将解冻精液放置在37℃水浴锅中解冻复苏10min后，取精液样本10μL放置在预先加热的载玻片上、盖好盖玻片，在显微镜下选取3个不同方位的视野进行精子活力的检测。重复检测3次，每次计数的精子数量不少于100个，分别计算3个视野内精子活力，取平均值，则该百分比就是本次试验精子的活力值。精子活力的公式为：精子活力＝(100w+75x+50y+25z)×100％。上式中w是指快速直线运动精子占总精子的百分率，x是指缓慢直线运动精子占总精子的百分率，y是指转圈或非连续运动精子占总精子的百分率，z是指原地摆动精子占总精子的百分率。
精子生存率：通过LIVE/DEAD sperm viability kit(SYBR-14/PI)染色进行评价。45μL DPBS中加入5μL精液恒温(37℃)5min，再加3μL SYBR-14混均后5min恒温。恒温后再添加PI 3μL恒温箱中静放5min。置于配有37℃恒温台的荧光显微镜下放大400倍观察,并使用DFC300图像采集系统同步获得荧光和相差显微镜图像，每个样品观察精子不少于100个。图像中精子头部被染红色为死精子，被染成绿色的为活精子。
精子质膜完整性：使用低渗膨胀法，将10μL精液与90μL的低渗液混合均匀，置于38℃水浴锅中10min，吸取10μL混合液置于载玻片盖好盖玻片，显微镜下观察精子质膜完整性。在显微镜下选3个不同的视野进行观察，每视野的精子总数不可低于100个，精子的质膜完整性表示为有卷曲尾巴(完整的质膜)的精子占精子总数的百分比。
精子畸形率：使用姬姆萨染色法，吸取10μL精液置于载玻片上抹片，无水乙醇固定15min，姬姆萨染色1.5h，之后从背面冲洗晾干检测。在显微镜下选3个不同的视野进行观察，每视野的精子总数不可低于100个，精子畸形率表示为形状异常的的精子占精子总数的百分比。
1.2.6数据分析
数据经EXCEL软件处理后,用SPSS 19.0软件中的Duncan’s进行均值显著性检验与单因素方差分析,结果用平均值±标准差(mean±SEM)表示；P<0.05表示差异显著。
2结果与分析
2.1Tris-卵黄冷冻保存稀释液中不同种类的糖对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响
向Tris-卵黄冷冻保存稀释液(其中，稀释液中鸭卵黄浓度为20g/100mL，稀释液B中甘油浓度为6mL/100mL)中添加不同种类的糖(乳糖、果糖、葡萄糖或蔗糖)至终浓度为0.35g/L，分析不同种类的糖对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响。结果图2所示：添加乳糖的效果对比果糖显著提高了(P<0.05)精子活力；对比葡萄糖和蔗糖效果有所改善精子活力，但无显著差异(P>0.05)。
2.2Tris-卵黄冷冻保存稀释液中不同浓度的鸭卵黄对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响
向Tris-卵黄冷冻保存稀释液(其中，稀释液中乳糖浓度为0.35g/100mL，稀释液B中甘油浓度为6mL/100mL)中分别添加鸭卵黄至终含量0(对照)、10g、15g、20g、25g每100mL，分析不同浓度的鸭卵黄对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响。结果图3所示：与对照组相比添加鸭卵黄所有组显著改善精子活力(P<0.05)；添加终浓度为质量分数15％鸭卵黄组效果为最好，与低浓度(质量分数10％)和高浓度(质量分数25％)相比显著提高精子活力(P<0.05)；鸭卵黄低浓度组(质量分数10％)与高浓度(质量分数25％)之间无显著差异(P>0.05)。
2.3Tris-卵黄冷冻保存稀释液中不同浓度的甘油对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响
向Tris-卵黄冷冻保存稀释液(其中，稀释液中乳糖浓度为0.35g/100mL，鸭卵黄含量为15g/100mL)中分别添加甘油至终浓度为质量分数0(对照)、1.5％、3％、6％、9％、12％，分析不同浓度的甘油对冻-解雷州黑鸭精子活力的影响。结果图4所示：与对照组相比添加甘油显著改善精子活力(P<0.05)。甘油终浓度为质量分数3％和6％组活力明显高于其他添加组(P<0.05)，质量分数1.5％、9％、12％组之间无显著差异(P>0.05)。
2.4不同稀释液对冻-解不同品种鸭(雷州黑鸭、白鸭、麻鸭)精子活力的影响
使用不同稀释液(①Tris-卵黄稀释液，组Ⅰ；②无卵黄稀释液，组Ⅱ)对冻-解不同品种鸭(①雷州黑鸭、②白鸭、③麻鸭)精液精子活力的影响。如图5所示：对于相同品种鸭的精液，不同稀释液之间精子活力有显著差异(P<0.05)；同种稀释液对不同品种鸭精液之间精子活力差异不显著。
2.5不同稀释液对冻-解雷州黑鸭精液品质的影响
如图6所示：不同稀释液(①Tris-卵黄冷冻保存稀释液(组Ⅰ)；②无卵黄稀释液(组Ⅱ))对冻-解雷州黑鸭精液品质的影响。不同稀释液对冻-解雷州黑鸭精子活力和生存率的影响，结果如图6A、图6B所示：与新鲜精液相比冷冻保存组(组Ⅰ、Ⅱ)精子活力、生存率显著降低(P<0.05)；但组Ⅰ精子活力(62.5％vs 45.8％)、生存率(49.0％vs 37.8％)显著高于组Ⅱ(P<0.05)。不同稀释液对冻-解雷州黑鸭精子质膜完整性和畸形率的影响，结果如图6C、图6D所示：相比对照组，各冷冻保存组间无显著差异。
2.6冻-解后38℃保存6h对雷州黑鸭精液活力的影响
通过不同稀释液冷冻保存冻-解后(对照：新鲜精液)38℃保存6h(检测：0、0.5、1、3、6h时间点)对雷州黑鸭精液活力的影响。结果如表1所示：随着38℃保存时间延长精子活力明显降低。与对照组(新鲜精液)相比冻-解组各保存时间段精子活力显著降低(P<0.05)。组Ⅰ38℃保存6h内各个时间段对比组Ⅱ显著提高精子活力(P<0.05)。
表1冻-解后保存时间(38℃)对雷州黑鸭精液活力的影响
Figure GDA0003761950970000081
注：每个实验至少重复5次，所有结果均表示为平均值±标准误差(mean±SEM)，a-c同一列中带有不同字母之间表示显著差异(P<0.05)。

Claims (5)

1.一种鸭精液冷冻保存稀释液，其特征在于，包括Tris-卵黄冷冻保存稀释液A和Tris-卵黄冷冻保存稀释液B，所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液A，每100mL中含有：Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄15-20g和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水；所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液B，每100mL中含有：Tris-碱0.85g、乳糖0.35g、柠檬酸三钠二水0.5g、肌醇0.02g、鸭卵黄15g、甘油3-6mL和2mg/mL的硫酸阿米卡星200μL，余量为水。
2.一种鸭精液冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.采集鸭精液，将品质检查合格的精液预热至35℃-37℃备用；
b.于35℃-37℃条件下，用预热至35℃的权利要求1所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液A将精液稀释4倍后装入离心管，将离心管放入35℃水中然后置于5℃条件下缓慢降温平衡2-3h；平衡到5℃后，用5℃的权利要求1所述的Tris-卵黄冷冻保存稀释液B分两次稀释：第一次将精液与Tris-卵黄冷冻保存稀释液B按体积比2:1稀释，然后平衡5-10min；第二次将精液与Tris-卵黄冷冻保存稀释液B按体积比2:1稀释，然后再平衡5-10min；然后将稀释液分装至冷冻细管并封口，液氮熏蒸10-15min，然后放入液氮中保存。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鸭为雷州黑鸭、白鸭或麻鸭。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的离心管为15mL规格的离心管。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的冷冻细管为0.25mL规格的冷冻细管。
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