KR20140072209A

KR20140072209A - 세포 및 조직의 동결 보존용 조성물

Info

Publication number: KR20140072209A
Application number: KR1020147013041A
Authority: KR
Inventors: 가즈아키 마츠무라; 하지메 스가이; 승휴 현
Original assignee: 가부시키가이샤 바이오베르데
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-26
Publication date: 2014-06-12
Also published as: EP2305792A1; US9826732B2; KR101490093B1; JP5726525B2; EP2305792B1; HK1156970A1; HK1196034A1; US20140243426A1; CN103858859A; CN102124098A; JPWO2009157209A1; KR101457749B1; CN102124098B; CN103858859B; EP2305792A4; US20160309706A1; US9603355B2; WO2009157209A1; KR20110055522A; US20110172315A1

Abstract

본 발명은 사람을 포함하는 동물이나 식물의 세포나 조직을 디메틸설폭시드 등의 유해한 동결 보존제를 사용하지 않고 안전하게 동결 보존 가능한 동결 보존용 조성물을 제공하고, 식품이나 의약품의 동결 보존이나 동결 건조 제품으로의 응용을 제공하는 것으로, ε-폴리-L-리신에 무수 숙신산을 반응시키고, ε-폴리-L-리신의 아미노기의 60 % 이상을 블록하며, 이와 같이 하여 수득된 고분자 화합물을, 시판의 배양액 중 하나인 둘베코 변성 배지(DMEM)에 7.5 w/w% 용해시켜 동결 보존액으로 하고, 또한 식품이나 의약품으로는 ε-폴리-L-리신 숙신산 유도체를 0.5~10 % 첨가하여 동결 농축을 방지하는 것을 특징으로 한다.

Description

세포 및 조직의 동결 보존용 조성물{CRYOPRESERVATIVE COMPOSITION FOR CELL AND TISSUE}

본 발명은 사람을 포함하는 동물 세포 및 조직의 동결 해동 장해를 경감시킬 수 있는 동결 보존제에 관한 것이다. 또한, 피부, 각막, 췌도(膵島), 심장 판막 등 다른 생체조직 이식 분야 및 조혈 간세포, 간엽계 간세포, ES 세포, iPS 세포 등의 간세포를 사용하는 재생 의약 분야에서도 이 기술의 수요는 높아질 것으로 예측된다.

식물이나 동물의 세포, 조직, 또는 식품 등의 물을 포함하는 물질을 장기 보존하기 위해 0℃ 이하의 온도에서의 동결 보존법이 일상적으로 사용되고 있다. 그러나, 이들 물을 함유하는 물질을 동결하면, 동결 중에 물 분자끼리 용질이나 혼입물의 매질을 배제(排除)하면서 결정화하여 물 분자만으로 이루어진 얼음 결정을 형성하므로, 함수물 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산되어, 동결 농축이 발생하는 것으로 알려져 있다.

이와 같은 동결 농축을 방지하기 위해, 여러 가지 저분자 화합물을 첨가하는 방법이 실시되고 있다. 예를 들어, 세포의 동결 보전을 실시하는 경우에 동결 보존 중에 일어나는 세포내의 결정화에 의한 세포로의 악영향을 최소한으로 억제하기 위해 동결 보호제로서 디메틸설폭시드(DMSO)나 글리세롤 등을 첨가하는 방법이 실시되고 있다.

즉, 5~20 %의 디메틸설폭시드, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 동결 보존제를 포함하는 배양액 등의 생리적 용액에 세포를 현탁하여 크라이오 튜브에 채워 냉각하고, 최종적으로 -80 ℃ 또는 -196 ℃의 극저온에서 동결 보존하는 것이 일반적이다.

그 중에서도 가장 효과가 높고, 자주 사용되고 있는 것이 디메틸설폭시드이다. 그러나 디메틸설폭시드가 특히 높은 농도에서는 생리학적으로 유독하고, 동결 보존된 세포를 주입받은 환자에게 고혈압, 오심(惡心), 구토를 일으키는 것도 알려져 있다. 디메틸설폭시드의 독성에 의해 해동한 세포의 배양시 또는 생체에 주입한 후의 생존율이나 기능이 저하되는 문제도 있다.

또한, 글리세린 등의 다른 동결 보존제는 효과가 낮으므로, 세포를 현탁하고 얼마동안 실온 또는 냉장에서 방치하고 나서 동결할 필요가 있고, 프로그램 프리저 등에 의한 엄밀한 온도 관리가 필요하다. 또한, 동결 보호 효과가 낮고, 해동후의 기능이 저하되는 등의 문제가 있다.

한편, ES 세포나 iPS 세포 등의 간세포나 정자, 난자, 수정란 등에서는 예를 들어 디메틸설폭시드, 아세트아미드, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도의 동해(凍害) 보호 물질을 함유하는 급속동결법(유리화법)이 알려져 있다. 유리화법이라는 것은 급격하게 저온으로 함으로써 세포에 포함되는 수분을 유리 형상으로 하고, 빙정(氷晶) 형성에 의한 장해를 피하는 방법이다. 그러나, 이 때 사용되는 고농도의 동해 방지제의 독성이 높으므로, 세포나 조직을 손상시킬 가능성이 높아 조직의 동결 보호에는 한정적으로밖에 사용되고 있지 않다.

한편, 의약품이나 식품, 디스플레이용 얼음을 제조하는 경우에, 염화나트륨 등의 염류나, 글루코오스, 트레할로오스 등의 당류를 첨가하는 것도 실시되고 있다. 또한, 식물이나 어류, 곤충 등이 생산하는 부동 단백질이나 부동 당단백질의 첨가가 알려져 있다(특허 문헌 3~4).

또한, 연료 전지에서는 전기 화학 반응에 따라서 한쪽의 전극에서 물이 발생한다. 예를 들어, 고체 고분자형 연료 전지에서는 캐소드 전극에서 물이 발생한다. 또한, 발생한 물의 일부는 전해질막을 통하여 애노드측으로 이동한다. 이와 같이 연료 전지 내에서 발생한 물, 또는 연료 전지에 공급되는 가스 중의 수증기가 연료 전지 내에서 응축되면, 연료 전지 내에서의 가스 흐름이 방해를 받을 가능성이 있다. 그리고, 전극으로의 가스의 공급이 방해를 받음으로써, 전지 성능이 저하될 가능성이 있다. 이와 같은 응축수가 가스 흐름을 방해하는 것에 기인하는 문제를 방지하기 위한 구성으로서, 연료 전지의 내부, 예를 들어 가스 세퍼레이터의 표면에 단백질 등의 친수성 도막을 설치함으로써, 물의 체류를 억제하는 구성이 알려져 있지만, 저온 조건하에서는 액수(液水)가 동결되는 것에 기인하는 문제가 발생하는 경우가 있었다. 상기 목적을 달성하기 위해, 예를 들어 고체 고분자 전해질막의 표면층을 이루는 경화성 수지에, 고분자 전해질과 함께 액수로부터의 얼음 결정의 성장을 억제하는 부동 단백질을 첨가하는 방법이 있지만(특허 문헌 5), 이것도 비용이 많이 드는 등의 문제가 있다.

일본 공표특허공보 평10-511402호 일본 특허 제3694730호 일본 공개특허공보 제2005-126533호 일본 공개특허공보 제2003-250506호 일본 공개특허공보 제2008-041596호

Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395, 1959 Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666, 1949 Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, Lakey JRT. Cell Preserv Technol 5, 16-24, 2007 Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20, 1779-1786, 2005 Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al. INT J HEMATOL ≡87: 189-194; 2008 Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer S. Toxicol in Vitro 20:265-271; 2006

급속 냉동법을 포함하는 현상태의 동결 보존법에서는 동결 해동 후의 세포·조직의 완전한 형태에서의 보존이 곤란하고, 독성이 낮은 새로운 동결 보존 물질이 요망되고 있다. 또한, 디메틸설폭시드는 HL-60 세포 등의 분화를 유도하는 것이 알려져 있고, 보존에 적합하지 않은 세포도 있다. 한편, 부동 단백질이나 부동 당단백질은 동결 농축을 방지하는 효과는 우수하지만, 너무 고가(130만엔/g)이고 식품 등에 응용하는 데에는 한계가 있다.

그래서 본 발명은 디메틸설폭시드 대신, 저독성이고 또한 세포 조직의 보호 효과가 우수한 동결 보존제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 식품이나 의약 등의 동결 보존이나 동결 건조 보존을 실시하는 데에 있어, 부동 단백질이나 부동 당단백질과 동등한 동결 농축을 방지하는 효과를 갖고, 저렴하고 또한 안전한 것을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 동결 보존액은 아미노기를 측쇄에 갖는 폴리아민을 실질상 1-50 %를 포함하고 그 밖의 조성은 생리식염수나 배양액 성분 등의 생리적 용액이다.

여러 사람을 포함하는 동물 세포, 식물 세포를 상기 보존액에 침지하여 -80 ℃ 또는 액체 질소 중 또는 액체 질소 증기 중에서 동결 보존함으로써 독성이 높은 디메틸설폭시드 등의 기존의 동결 보존제를 사용하지 않고 생존율, 생리 활성을 유지한 채로 보존하는 것이 가능하다. 기존의 디메틸설폭시드나 글리세린, 에틸렌글리콜 등의 동결 보존제를 사용하지 않으므로, 동결하는 세포에 대한 독성이 낮게 억제되고, 기능을 유지한 채 장기간 동결 보존하는 것이 가능하다. 또한, 소 태아 혈청, 알부민 등의 단백질 성분을 사용하지 않으므로 감염증 등의 염려가 없고 생물제제에 의한 로트간 격차도 영향을 주지 않는다.

ε-폴리-L-리신이나 폴리알릴아민 등의 아미노기를 측쇄에 갖는 폴리아민은 그 아미노기에 의해 세포막 친화성을 가지므로, 세포의 보호 효과가 있는 것으로 생각된다. 또한, 카르복실기를 분자 중에 다수 갖는 고분자 화합물은 물과의 친화성이 높고, 세포내의 액체를 동결 중에 빠르게 밖으로 배출하는 것을 돕는 점에서, 세포의 동결 보존시의 보호 효과가 있는 것으로 기대된다. 이들 두 관능기를 분자중에 적절한 비율로 가짐으로써 더욱 우수한 동결시 세포 보호 효과를 기대할 수 있다. 그래서, 본 발명에서는 측쇄에 아미노기 등의 양이온성 치환기를 갖는 폴리아미노산 또는 카르복실기 등의 음이온성 치환기를 갖는 고분자 화합물, 및 양이온성 치환기와 음이온성 치환기의 양쪽을 갖는 고분자 화합물의 조건을 예의 검토함으로써, 유효성과 안전성이 높은 동결 보존액을 제공한다.

또한, 본 발명의 동결 보존제는 DMSO에 비해 독성이 낮으므로, 해동후의 세정이 불필요하고, 그대로 배지에 첨가함으로써 곧바로 배양을 실시할 수 있다.

본 발명에 의해 실험용 배양 세포의 동결 보존을 안정적으로 실시하는 것이 가능해질 뿐만 아니라, 췌도나 간세포와 같은 기능성 세포나 ES 세포나 간엽계 간세포, iPS 세포 등의 간세포도 그 기능을 잃지 않고 보존할 수 있으므로, 세포 이식의 효율이 향상되는 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 부동결 폴리아미노산을 사용함으로써, 생리 활성 물질을 포함하는 함수물(含水物)을 동결할 때 상기 생리 활성 물질의 실활(失活)을 억제할 수도 있다. 또한, 본 발명의 부동결 폴리아미노산을 사용함으로써, 물 분자 이외의 성분을 포함하는 함수물을 동결 또는 동결 건조하여 수득되는 동결물 또는 동결 건조물 중에서의 상기 성분의 확산을 균질하게 할 수도 있다. 동결물로서는 아이스크림, 셔벗, 빙과, 디스플레이용 얼음, 냉동 수프 등을 들 수 있다. 동결 건조물로서는 동결 건조에 의해 제조되는 분말 형상의 냉동 건조 식품이나 의약품 등을 들 수 있다.

또한, 공업용 연료 전지를 기동할 때의 액체의 동결에 기인하는 기동성의 저하를 억제하는 용도 등에도 적용 가능하다.

도 1은 무수 숙신산에 의해 부분적으로 아미노기를 블록한 ε-폴리-L-리신을 사용하여 L929 세포를 동결 보존한 경우 아미노기의 블록률과 세포 생존율의 관계를 도시한 그래프,
도 2는 아미노기 당 63 몰%의 무수 숙신산을 첨가한 ε-폴리-L-리신(PLL 무수 숙신산 63 %)을 사용하여 L929 세포를 동결 보존한 경우 이 부분 블록화 폴리리신의 농도와 세포 생존률의 관계를 도시한 그래프,
도 3a은 L929세포를 10 % DMSO/소 태아 혈청 중에서 동결하고, 해동후 세정이나 희석을 하지 않고 그대로 플레이트상에 옮겨 24 시간 배양한 경우의 모습을 도시한 현미경 사진,
도 3b는 L929세포를 PLL 무수 숙신산 63 %의 7.5 % 용액 중에서 동결하고, 해동 후에 세정이나 희석을 하지 않고 그대로 플레이트상에 옮겨 24 시간 배양한 경우의 모습을 도시한 현미경 사진,
도 4는 PLL 무수 숙신산 63 %의 7.5 % 용액, 및 10 % DMSO/소 태아 혈청을 동결 보존액으로서 사용하고 래트 간엽계 간세포(RMSC)를 동결 보존 후에 다분화능(뼈, 지방, 연골로의 분화 유도)를 평가한 결과를 도시한 그래프로, 미동결의 경우 및 비분화 유도계를 함께 도시한 그래프,
도 5는 수크로오스 30 %의 수용액에 무처리의 PLL(ε-폴리-L-리신) 및 무수 숙신산 처리 PLL(PLL 무수 숙신산 63 %)를 0.1-15 %로 첨가하고, 얼음 재결정 억제 효과를 관찰한 일련의 현미경 사진,
도 6은 무처리의 PLL(ε-폴리-L-리신)의 5 % 용액, 및 무수 숙신산 처리 PLL(PLL 무수 숙신산 63 %)의 5 % 용액을 동결시킨 경우 얼음 결정의 형태를 도시한 현미경 사진,
도 7은 동결 해동 한천 겔의 사진(1)으로, 좌측이 무첨가인 것, 우측이 PLL 무수 숙신산 63 %를 5 % 첨가한 것을 도시한 도면, 및
도 8은 동결 해동 한천겔의 사진(2)으로, PLL 무수 숙신산 63 %의 첨가량이 0 %인 것(좌측), 1 %인 것(중간), 및 3 %인 것(우측)을 도시한 도면이다.

본 발명의 동결 보존액은 생리적 용액에, 폴리리신 등의 고분자 화합물이 1~50 w/w% 용해되어 이루어진다. 바람직하게는 2~20 w/w%, 특히 바람직하게는 3~15 w/w%, 더욱 바람직하게는 5~10 w/w% 용해되어 이루어진다. 생리적 용액으로서는 생리 식염수 외에, 각종 세포 또는 조직용의 일반적인 배양액을 사용할 수 있다. 예를 들어, 둘베코 변형 이글루 MEM 배지(DMEM)를 바람직한 것으로서 들 수 있다. 폴리리신을 대신하여, 또는 폴리리신과 함께 폴리알릴아민을 사용할 수도 있다. 또한, 이들을 대신하여, 또는 이들 중 적어도 한쪽과 함께, 아미노화 다당류 등의 다른 폴리아민, 폴리아르기닌, 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산 등의 폴리아미노산 및 아미노화 다당류로부터 선택되는 화합물을 사용할 수 있고, 또한 폴리아크릴산 등의 폴리카본산 외에 덱스트란, 덱스트린, 플루란, 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다당류를 사용할 수도 있다. 이들 고분자 중에서도 동일 분자 내에 양이온성 치환기와 음이온성 치환기의 양쪽을 갖는 단량체가 중합된 형태의 고분자 화합물, 특히 폴리아미노산을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 즉, 고분자 화합물의 반복 단위가 아미노기 및 카르복실기를 함께 갖는 것이 특히 바람직하다. 폴리리신은 ε-폴리-L-리신 또는 ε-폴리-D-리신, α-폴리-L-리신, α-폴리-D-리신 중 어느 것이어도 좋다. 동결 보호 성분인 고분자 화합물은 분자량이 100~100,000이다. 가장 바람직한 고분자종(高分子種)으로서 미생물 또는 효소에 의해 생산되는 수평균 분자량이 1000~2만, 특히 1000~1만의 ε-폴리-L-리신을 들 수 있다. ε-폴리-L-리신은 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 방선균(放線菌)에 의해 생산되어 오로지 식품 첨가물로서 사용되고 있고(http://www.chisso.co.jp/fine/jp/polylisin/index.html), 중합도 15~35인 것 이외에, 중합도가 20 이하인 것의 생산도 시도되고 있다(예를 들어, 일본 공개특허공보 제2003-171463호, 일본 공개특허공보 제2005-318815호). 수 평균 분자량 또는 수평균 중합도의 측정은 SDS-PAGE[도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기 영동]법에 의해 예를 들어, 아토(주)제의 전기 영동 장치 및 덴시토그래프(AE-6920V형)을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 이 때, 표준 단백 마커를 사용한다. 또한, 폴리리신은 가열 처리에 의한 고분자량화에 의해 분자량 3만 이상으로 하여 사용할 수도 있다. 그러나, 점도의 상승을 방지하는 등의 관점으로부터 상기의 분자량 범위가 바람직하다. 말단에만 프리의 카르복실기를 갖는 폴리리신은 측쇄에 1 급 아미노기만을 갖고 있지만, 후술하는 바와 같이 무수 카본산을 사용하여 부분적으로 아미드화함으로써, 우수한 혼화성능 내지 가용화 성능을 발휘하는 것으로 생각된다. 특히, 무수 디카본산 등을 반응시켜 부분적으로 카르복실화함으로써, 우수한 성능을 발휘할 수 있다. 본 발명에서도 사용하는 특히 바람직한 고분자종의 다른 예로서, 중량 평균 분자량이 1000~1000000, 바람직하게는 1000~2만의 폴리알릴아민을 들 수 있다. 예를 들어, 알릴아민 중합체[닛토호세키(주)의 PAA-03]의 수용액에 무수 아세트산 또는 아세트산을 첨가한 것이나, 부분 메톡시카르보닐화 알릴아민 중합체[닛토호세키(주)의 PAA-U5000]를 들 수 있다. 알릴아민 중합체는 폴리리신의 경우와 동일하게, 측쇄에 1 급 아미노기만을 갖지만 단위 분자량 당의 1 급 아미노기의 밀도는 크고, 후술한 바와 같이 부분적으로 카르복실화한 경우, 폴리리신을 부분적으로 카르복실화한 것과 동일한 작용을 하는 것으로 생각된다.

폴리아민의 아미노기는 바람직하게는, 부분적으로 무수 카본산에 의해 카르복실화 또는 아세틸화되어 블록된다. 이 때, 폴리아민의 아미노기에 대해서 바람직하게는 50~99 몰%, 특히 50~93 몰%, 보다 바람직하게는 50~90 몰%, 더욱 바람직하게는 55~80 몰%, 가장 바람직하게는 58~76 몰%를 카르복실화 또는 아세틸화함으로써 블록한다. 또한, 폴리아민의 아미노기에 대해서 52~53 몰%의 무수 카본산을 반응시킴으로써 약 50 %의 아미노기를 블록할 수 있다. 또한, 100 몰%의 무수 카본산을 반응시킨 경우, 통상의 반응 조건에서 90~95 %의 아미노기를 블록할 수 있다. 블록률이 상기의 범위를 초과해도 또한 하회해도, 동결 보존 효과가 작아진다. 여기에서 사용되는 무수 카본산으로서는 무수 아세트산, 무수 시트르산, 무수 숙신산, 무수 글루탈산, 무수 말산, 무수 푸말산, 및 무수 말레인산을 들 수 있다. 이들 중, 무수 숙신산 및 무수 아세트산을 특히 바람직한 것으로서 들 수 있다.

그러나, 폴리아민의 아미노기가 블록되지 않고 프리의 상태에 있는 것을 사용할 수도 있다. 즉, 카르복실화 및 아세틸화의 정도는 0-100 mol/mol%의 범위에서 유효하다. 본 발명에서 카르복실기가 일부 아미노화된 폴리카본산도 유효하다. 즉, 폴리카본산의 카르복실기를 디아민, 트리아민, 폴리아민 등의 화합물과 반응시킴으로써 일부 아미노화한 것도 유효하다. 사용하는 디아민으로서는 에틸렌디아민, 아디포디히드라지드 등의 히드라지드 등을 들 수 있다. 이들 아미노 화합물과 카본산의 반응은 카르보디이미드를 사용한 부가 반응에 의한 것이다. 이 때의 아미노화의 정도는 0-100 mol/mol%의 범위에서 유효하지만, 아미노기를 블록하는 경우와 동일하게, 바람직하게는 50~99 몰%, 보다 바람직하게는 60~97 몰%의 카르복실기가 남고, 그 잔여가 아미노화되도록 반응을 실시한다. 예를 들어, 수평균 분자량 1000~300만의 폴리아크릴산, 특히 수평균 분자량 1000~1만의 폴리아크릴산을 사용하고, 그 카르복실기의 1~50 몰%, 바람직하게는 3~40 몰%를 에틸렌디아민, 디히드라지드 등의 아민종(種) 및 카르보디이미드 등을 사용하여 블록한다. 한편, 본 발명의 동결 보존제에는 디메틸설폭시드나 글리세롤, 에틸렌글리콜, 트레할로오스나 수크로오스 등의 기존의 동결 보호 물질이 0.1-50 w/w%, 특히 0.3~15 w/w% 공존하고 있어도 좋다. 세포가 동결하고나서 해동될 때 산화 스트레스에 의한 악영향을 받는 것으로 되어 있고, 항산화제를 첨가함으로써 한층 더한 유효성의 향상이 기대된다. 항산화제는 예를 들어 카탈라아제, 퍼옥시다아제, 수퍼옥시드디스무타아제, 비타민 E, 비타민 C, 에피갈로카테킨갈레이트 등의 폴리페놀류 또는 글루타치온 등을 들 수 있다.

본 발명의 동결 보존제의 침투압은 200-1000 mOsm/㎏이고, 보다 바람직하게는 300-700 mOsm/㎏이고, 더욱 바람직한 것은 400-600 mOsm/㎏이다. 본 발명의 동결 보존제는 보존하는 대상이 세포에 한정되지 않고 조직에 대해서도 적용하는 것이 가능하다. 본 발명의 동결 보존제를 사용하여 동결 보존이 가능한 세포로서는 배양용 수립 세포, 사람을 포함하는 동물의 수정란 및 난세포를 들 수 있다. 또한, 정세포, ES 세포, iPS 세포, 간엽계 간세포, 조혈계 간세포, 신경 간세포, 제대혈 세포 등의 간세포(幹細胞), 간세포(肝細胞), 신경 세포, 심근 세포, 혈관내피 세포, 혈관 평활근 세포, 혈구 세포 등의 사람을 포함하는 동물 세포 또는 식물 세포를 들 수 있다. 본 발명의 동결 보존제를 사용하여 동결 보존이 가능한 조직·장기로서는 피부, 신경, 혈관, 연골, 각막, 간장, 신장, 심장, 췌도 등을 들 수 있다.

또한, 상기에 설명한 것과 동일한 고분자 화합물을, 식품 또는 의약품의 함수물에 첨가하고 동결 농축을 억제하여, 함유 성분이 균질하게 확산된 동결물 또는 동결 건조물의 제조에 응용할 수 있다. 구체적으로는 ε-폴리-L-리신, α-폴리-L-리신, 폴리아르기닌, 그 밖의 폴리아미노산, 아미노화 다당류, 및 폴리알릴아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노기 함유 단위의 중합체로 이루어진 고분자 화합물에 대해서 무수 숙신산, 무수 아세트산 또는 그 밖의 상기 무수 카본산을 반응시켜 카르복실화 또는 아세틸화함으로써 블록한 것을 사용할 수 있다. 이 경우, 생리적 용액 중에 용해시킨 것을 사용할 필요는 없고, 예를 들어 상술한 아이스크림의 함수 원료 조성물 또는 동결 건조 식품을 제조할 때의 함수 원료 조성물에, 아미노기를 부분적으로 블록한 폴리리신, 그 밖의 폴리아미노산 또는 아미노화 다당류를, 1~15 %의 중량 농도가 되도록 배합한다. 이와 같이 하여 동결 농축의 억제를 실현할 수 있다. 무수 숙신산을 사용한 경우, 아미노기의 50~85 몰%에 상당하는 무수 숙신산을 반응시킨 것(실제 블록률이 약 48~80 몰%의 것)을 사용하면 동결 농축 방지에서 우수한 효과가 수득되었다.

또한, 상기에 설명한 것과 동일한 고분자 화합물을 공업용 연료 전지에 첨가하여 기동시의 액체의 동결에 기인하는 기동성의 저하를 억제하는 용도 등에도 적용 가능하다. 구체적으로는 ε-폴리-L-리신, α-폴리-L-리신, 폴리아르기닌, 그 밖의 폴리아미노산, 아미노화 다당류, 및 폴리알릴아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노기 함유 단위의 중합체로 이루어진 고분자 화합물에 대하여 무수 숙신산, 무수 아세트산 또는 그 밖의 상기 무수 카본산을 반응시켜 카르복실화 또는 아세틸화함으로써 블록한 것을 연료 전지 내부에 노출되는 표면층의 재료에 첨가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 세퍼레이터나 고체 전해질막의 표면을 이루는 도막의 재료, 특히 UV 경화성의 수지액에, 1~15 %의 중량 농도가 되도록 배합할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 나타낸다. 또한, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1 동결 보존 용액의 조정>

ε-폴리-L-리신(칫소샤제, 분자량 4000)은 25 % 수용액의 것을, 폴리알릴아민[닛토호세키(주), 분자량 5000(PAA-05L), 15000(PAA-L), 60000(PAA-H)]은 20 % 수용액의 것을 사용하여 분자 중의 아미노기에 대해서, 몰%로 0~100 %의 무수 숙신산(와코준야쿠고교제)을 첨가함으로써 아미노기의 블록률이 다른 폴리아민을 작성했다. 각각의 폴리아민 용액을 둘베코 변형 배지(DMEM, 시그마알드리치제)에 0~10 w/w%가 되도록 첨가했다. 이 때, pH가 7.0~8.0의 범위내가 되도록 1 N의 염산 또는 수산화나트륨 수용액으로 중화했다. 또한, 용액의 침투압은 Wescor사제 5520형 증기압법 오스모미터에서 측정하고, 침투압의 조정에는 10 % 염화나트륨 수용액을 사용했다.

<실시예 2 배양 세포의 동결 보존>

1×10⁶ 개의 L929, MG63, Caco-2세포(다이닛폰스미토모세이야쿠), colon26, HT1080, B16F1, KB세포(ATCC)를 크라이오바이알(Simport Plastics)중에서 각 동결 보존액 1 mL에 현탁하고, -80 ℃의 프리저 중에서 동결 보존을 실시했다. 1 주간 후, 37 ℃의 온욕중에서 빠르게 융해하여 DMEM으로 세정한 후, 트리판 블루 염색에 의해 생사 판정을 실시했다. 또한, 해동한 세포는 6 웰 배양 접시에 1 × 10⁵개씩 파종하고 6 시간후, 24 시간후의 각각의 생존율을 트리판 블루 염색에 의해 평가했다. 비교예로서는 일반적으로 자주 사용되고 있는 보존액인 10 % DMSO/소 태아 혈청(FBS)을 사용했다.

도 1에 도시한 바와 같이 L929 세포를 동결 보존하는 데에 있어 아미노기의 몰수에 대해서 50 % 이상의 몰수의 무수 숙신산을 첨가한 폴리리신(PLL)의 7.5 % 용액을 사용한 경우, 비교예의 DMSO 용액을 사용한 경우에 비해 파종후 24 시간에서 거의 동일하거나, 보다 양호한 생존율을 나타냈다. 또한, 100 몰%의 무수 숙신산을 첨가한 카르복실화 폴리리신에 대해서, 잔류 아미노기 함량을 닌히드린법 및 TNBS법으로 정량함으로써 아미노기의 블록률을 구한 바 93 %였다. 또한, 폴리리신의 아미노기에 대해서 10 몰%, 27 몰%, 45 몰%, 52 몰%, 63 몰% 및 79 몰%의 무수 숙신산을 첨가한 경우에 블록률은 각각 10 %, 25 %, 43 %, 50 %, 60 %, 76 %였다. 따라서, 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 50~93 %의 블록률에 대해서 동결 보존 효과가 확인된 이외에, 블록률이 60 %인 것(63 몰%의 무수 숙신산 첨가), 및 76 %의 것(79 몰%의 무수 숙신산 첨가)에서 특히 우수한 동결 보존 효과가 보였다. 아미노기를 부분적으로 블록한 폴리알릴아민(분자량 5000의 알릴아민 중합체에 대해서 아미노기의 45~90 몰%에 상당하는 무수 숙신산을 반응시킨 것)의 수용액을 사용한 경우에도 거의 동일하게, 무수 숙신산에 의한 아미노기 블록률이 증대됨에 따라서 보다 양호한 생존율이 수득되었다.

도 2에서는 동일하게 L929 세포를 동결 보존하는데에 있어, 아미노기의 몰수에 대해서 63 %의 몰수의 무수 숙신산을 첨가한 ε-폴리-L-리신[도표 중에 PLL(0.63)으로 표시하고, 이하 본문 중에 PLL 무수 숙신산 63 %로 표기]를 사용하고, 이 부분 블록화 폴리리신의 농도와 세포 생존율의 관계를 나타낸다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 부분 블록화 폴리리신(PLL 무수 숙신산 63 %)의 농도가 7.0 % 이상인 경우에, DMSO 용액을 사용한 경우와 거의 동등하거나, 보다 높은 세포 생존율이 수득되었다. 아미노기를 부분적으로 블록한 폴리알릴아민(분자량 5000의 알릴아민 중합체에 대해서, 아미노기의 63~85 몰%에 상당하는 무수 숙신산을 반응시킨 것)을 사용한 경우에도 동일한 경향을 나타냈다.

도 1~도 2에서 가장 양호한 결과를 나타내는 영역은 동결 보존액의 침투압을 구한 경우에 400~600 mOsm/㎏이다. 즉, 침투압이 400~600 mOsm/㎏에서 가장 높은 보존 효과가 수득되었다.

한편, 표 1에는 7.5 % PLL 무수 숙신산 63 %에서 보존했을 때의 그밖의 세포의 보존 효과를 나타낸다. 표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 모든 세포종에서 DMSO계(10 % DMOS/소 태아 혈청)과 거의 동일하거나 그 이상의 생존율을 나타냈다. 또한, 구체적인 데이터는 나타내지 않지만, 아미노기를 부분적으로 블록한 폴리알릴아민을 사용한 경우에도 동일했다.

<실시예 3 독성 시험>

L929 세포를 사용한 독성 시험을 실시했다. 10 % 소 태아 혈청을 함유한 둘베코 변성 이글루 MEM 배지(DMEM)에 현탁시킨 L929 세포를, 96 웰 마이크로플레이트에 1.0×10³ 세포/웰 파종하고 37 ℃에서 72 시간 배양한 후, ε-폴리-L-리신, 및 여러 가지 농도의 무수 숙신산을 첨가한 폴리리신을, 최종 농도 0-10 %가 되도록 첨가하고 48 시간 후, 미첨가계를 대조군으로 하여 세포의 증식이 50 % 저해되는 농도를 lC₅₀로 하여, MTT법으로 구했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 비교예는 DMSO계(10 % DMSO/소 태아 혈청)으로 했다. 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, PLL 무수 숙신산 58 %, 63 %, 79 %의 lC₅₀는, DMSO계의 경우의 2~3 배였다. 즉, 상기 실시예에서 사용한 부분 블록화 폴리리신의 독성은 종래 일반적인 동결 보존액의 1/2~1/3으로 판단되었다. 특히, 도 1의 데이터에서 세포 생존율이 높았던 PLL 무수 숙신산 63 %와, PLL 무수 숙신산 58 %에서 lC₅₀의 값이 특히 컸다.

한편, L929 세포를 포함하는 동결 보존액을 해동 후에, 그대로 12 웰 플레이트에 파종하고, 37 ℃에서 24 시간 배양한 후에 관찰했다. 즉, PLL 무수 숙신산 63 %의 7.5 % 용액, 및 10 % DMSO/소 태아 혈청의 각 동결 보존액에서 실시예 2와 동일하게 하여 동결 보존하여 해동을 실시했지만, 해동 후에 희석이나 세정을 하지 않고, 그대로 플레이트상에 옮겨 배양을 실시했다. 그 결과, 도 3a에 도시한 바와 같이 DMSO계(10 % DMSO/소 태아 혈청)에서는 분명히 세포가 둥글어지고 죽어 있는 데에 비해, 도 3b에 도시한 바와 같이 본 발명의 보존액에서는 접시에 부착되어, 양호하게 생착하고 있는 것이 확인되었다. 아미노기를 부분적으로 블록한 폴리알릴아민(분자량 5000의 알릴아민 중합체에 대해서 아미노기의 63~85 몰%에 상당하는 무수 숙신산을 반응시킨 것)에서도 동일한 저독성의 결과를 수득했다.

<실시예 4 간엽계 간세포의 보존>

래트 간엽계 간세포(RMSC)의 동결 보존을 실시했다. 비교예의 보존액은 10 % DMSO/소 태아 혈정이고 실시예의 보존액은 PLL 무수 숙신산 63 %의 7.5 % 용액[도 4 중에 7.5 % PLL(0.63)로 표시]이다.

표 3에 래트 간엽계 간세포(RMSC)의 해동 후의 생존율을 나타내지만, 본 발명의 동결 보존액에서 DMSO계와 거의 동일한 생존율을 나타냈다. 부분 블록화 폴리알릴아민을 사용한 동결 보존액(분자량 5000의 알릴아민 중합체에 대해서, 아미노기의 63~85 몰%에 상당하는 무수 숙신산을 반응시키고, DMEM 배지에 7.5 % 농도가 되도록 첨가한 것)에서도 동일한 높은 생존율이었다.

다음에, 실시예 2와 동일하게 하여 동결 보존 후에 해동한 후, 분화 유도를 가함으로써 골세포, 지방 세포, 연골 세포로의 분화능을 평가한 바, 도 4에 도시한 바와 같이 미동결계, DMSO계와 거의 동일하게 다분화능을 유지하고 있는 것이 이하와 같이 확인되었다. 도 4는 칼라의 현미경 사진의 화상 데이터에 대해서, 빛의 3 원색(RGB)으로의 색분해를 실시하고, 적색(R)의 색요소만을 도시한 것이다. 따라서, 적색 부분이 백색으로 표현되고, 청색 부분이 흑색으로 표현되어 있다. 골분화능은 칼슘의 침착을 알리자린 레드S 염색에 의해 평가한 결과, 어떤 경우도 동일하게 붉게 염색되었다. 도 4 중의 상단의 사진을 본 경우, 비분화 유도계에 비해, 분화 유도계가 모두 동일하게 옅은 모노클로 패턴으로 표현되어 있지만, 상기 옅은 모노클로 패턴은 칼라 사진에서 전체적으로 붉은기를 띠고 있는 것을 나타낸다. 또한, 알칼리성 포스파타아제 활성은 비분화 유도계에 비해, 어떤 보존액으로 동결한 경우에도 미동결계와 동일하게 높은 값을 나타냈다. 지방 분화능은 세포 중의 지방 방울을 오일레드 O를 사용하여 염색한 바, 어떤 보존액으로 동결한 경우에도 미동결계와 동일하게 붉게 염색된 지방 방울(도 4 중간단에서 직경이 수십 ㎛의 담색의 원형 내지 타원형 패턴으로서 표시된 부분)이 확인되었다. 연골 분화능에 관해서는 세포 덩어리 중의 프로테오글리칸을 알시안 블루로 염색한 바, 어떤 보존액으로 동결한 계에서도 미동결과 동일하게 푸르게 염색되는 프로테오글리칸(도 4의 하단에서 진한 흑색 부분으로서 표시된 부분)이 확인되었다. 폴리알릴아민으로 작성한 동결 보존제(분자량 5000의 알릴아민 중합체에 대해서 아미노기의 63~85 몰%에 상당하는 무수 숙신산을 반응시키고, DMEM배지에 7.5% 농도가 되도록 첨가한 것)로 동결한 경우에도 동일하게 다분화능을 유지하고 있었다.

<실시예 5 제대혈의 보존>

제대혈은 혈액 항응고제(EDTA2Na)를 10.5 ㎎ 충전된 7 mL 플라스틱제 진공 채혈관(테르모 가부시키가이샤제, 베노젝트 2 진공 채혈관)을 사용하여 사람 제대로부터 채취했다. 이어서, 이와 같이 항응고제를 첨가한 사람 제대혈 중에 7.5 %가 되도록 PLL 무수 숙신산 63 %[7.5 % PLL(0.63)]을 첨가하고, -80 ℃의 프리저 중에서 3개월간 동결 보존했다. 37 ℃의 온욕 중에서 빠르게 융해하고, 희석 등을 실시하지 않은 채로 사람 재대혈을 일부 채취하여 조혈간세포의 표면 마커인 CD34의 발현율을 플로우 사이토메트리법을 사용하여 측정했다. CD34 조혈간세포수를 플로우 사이토메트리를 사용하여 문헌[A. Higuchi et al., J. Biomed. Mater. Res., 68A, 34-42 (2004)]에 기재된 상법에 의해 측정했다. 즉, CD34 조혈간세포수는 Stem-Kit(베크만·코르타사제)를 사용하여 그 메뉴얼(국제혈액요법·이식학회 ISHAGE 가이드라인)에 따라서 실시했다. 3개월후에도 CD34 조혈간세포수는 첫날 계측된 70 % 전후의 세포수가 관찰되었다. 한편, 10 % DMSO 용액으로 동결 보존한 사람 제대혈 중의 CD34 조혈간세포수는 첫날 계측된 20 % 전후의 세포수였다. 이와 같이 ε-폴리-L-리신을 첨가한 보존액으로 사람 제대혈을 보존하면, CD34 조혈간세포를 미분화의 상태에서 장기간 보존할 수 있는 것이 명백해졌다.

이와 같이, 본 발명의 실시예의 동결 보존액은 제대혈의 보존 효과에서도 뛰어나게 우수한 것을 알 수 있었다.

<실시예 6 부동 단백 활성>

PLL(ε-폴리-L-리신) 및 무수 숙신산 처리 PLL의 부동 단백질 활성을 조사했다. 즉, 얼음의 재결정을 저해하는 효과에 대해서 조사했다. 부동 단백에는 여러 가지의 특수한 활성이 알려져 있고, 얼음의 표면에 흡착되는 등에 의해 열 히스테리시스, 얼음의 재결정 성장 억제, 빙정의 육방정 또는 바이피라미드 형상으로의 형태 변화를 일으키는 것이 알려져 있다(특허 문헌 3~4).

우선, 수크로오스 30 %의 수용액에 무처리의 PLL, PLL 무수 숙신산 20 %, PLL 무수 숙신산 46 %, PLL 무수 숙신산 50 %, PLL 무수 숙신산 65 %, PLL 무수 숙신산 76 %, 및 PLL 무수 숙신산 84 %를 0.1-15 %로 첨가했다. 이들 무수 숙신산 처리 PLL에서의 실제의 아미노기 블록률을 상술한 방법으로 측정한 바, 약 0.20, 0.43, 0.48, 0.62, 0.73 및 0.80이었다. 그 용액을 유리 플레이트에 4 μL 얹고, 또한 유리 플레이트로 커버하고 나서 린카무사제 10002L 온도 제어 현미경 스테이지에서 -30 ℃ 까지 급랭하여 얼음 결정을 작성했다. 그 후 천천히 온도를 높여가 -9 ℃에서 30 분 방치함으로써 얼음 결정의 성장을 현미경으로 관찰했다. 그 결과, 도 5의 일련의 현미경 사진에서 알 수 있는 바와 같이, PLL(ε-폴리-L-리신)의 아미노기에 대해서 그 50 몰% 이상의 카르복실기를 도입함으로써 PLL에 얼음 재결정 억제 효과를 부여할 수 있는 것이 확인되었다. 도 5에는 중량 농도가 5 %가 되도록 첨가한 경우를 도시하지만, PLL 무수 숙신산 50 %[PLL(0.50)]~PLL 무수 숙신산 84 %[PLL(0.84)]는 1 %~15 %까지의 농도에서 얼음 재결정 억제에 유효했다.

다음에 동일한 급랭 플레이트에서 PLL의 5 % 용액의 얼음 결정의 형태, 및 무수 숙신산 처리 PLL(PLL 무수 숙신산 65 %)의 5 % 용액의 얼음 결정의 형태를 조사했다. 즉, 일단 -30 ℃까지 급랭하고, 얼음 결정을 다수 작성한 후, 시야에 하나의 직경 10 ㎛ 정도의 얼음 결정이 존재하는 온도까지 0.02 ℃/분으로 온도를 상승시킨다. 그 상태에서 안정시키고 나서 이번에는 0.02 ℃/분으로 온도를 하강시킴으로써 얼음의 성장시의 형태를 관찰했다. 형태는 도 6의 현미경 사진에 도시한 바와 같이 무수 숙신산으로 처리함으로써 육방정을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, 이와 같은 육방정의 얼음 결정은 무수 숙신산 처리 PLL[PLL(0.50)~PLL(0.84)]의 농도가 1 %~15 %의 범위이면 보였다. 열 히스테리시스라는 것은 융점과 빙정 성장 개시 온도의 차에 관한 것으로, 부동 단백질의 특징으로서 들 수 있다. 무수 숙신산 처리 PLL에서 최대 0.1 도의 열 히스테리시스 효과가 수득되었다. 이러한 측면에서, PLL의 아미노기에 대해서 카르복실기를 50 몰% 이상 도입함으로써 부동 단백질의 활성이 수득되는 것이 확인되었다.

<실시예 7 식품의 보존>

동결 농축 방지(동결 융해 한천겔); 한천말[1 급 시약 나카라이테스크(주)사제]에 PLL 무수 숙신산 63 %를 첨가하여 5 % 용액을 조정하고, 이 용액에 적색 잉크를 첨가하여 플라스틱 용기에 넣고 -20 ℃에서 동결한 후 상온에서 해동했다. 결과를 도 7의 사진에 나타낸다. 좌측이 무첨가의 것, 우측이 PLL 숙신산 유도체 5 % 첨가인 것이다. 무첨가의 것은 적색의 부분(불투명한 상반부)과, 투명한 부분[겔을 얹은 부분의 우측 상부에 그림자를 발생시키고 있지만, 겔의 하방의 페이퍼 타올의 눈금 모양이 비쳐 보이고 있는 부분)으로, 명백하게 분리되어 있는 것을 알 수 있다. 한편, PLL 숙신산 유도체 5 % 첨가물은 해동 겔 전체가 균일하게 적색을 나타내고, 동결 농축을 방지할 수 있다는 것을 알 수 있다.

동결 건조 한천겔; 한천말[1 급 시약 나카라이테크(주)사제]에 PLL 무수 숙신산 63 %(실제의 블록률 0.60)를 0 %, 1 %, 3 % 첨가하여 플라스틱 용기에 넣고 -20 ℃에서 동결한 후, 진공도 1 torr에서 2~3 일간 동결 건조를 실시하고, 동결 건조 한천을 수득했다. 수득된 동결 건조물을 도 8의 사진에 나타낸다. PLL 숙신산 유도체의 첨가량이 0 %인 것(좌측)은 동결 건조에 의해 체적이 1/3 정도로 수축하고 있다. 그러나, PLL 숙신산 유도체의 첨가량이 1 %인 것(중간)과 3 %인 것(우측)의 동결 건조물은 체적의 수축이 별로 발생하지 않았다. 이러한 측면에서, 본 발명의 부동 폴리아미노산을 함유하여 동결 건조함으로써, 효율 좋고 또한 품질을 안정적으로 유지하여 피건조물을 건조시킬 수 있었다.

Claims

아미노기 함유 단위의 중합체로 이루어진 고분자 화합물인 ε-폴리-L-리신에 대해서 무수 숙신산을 반응시켜 카르복실화 또는 아세틸화함으로써 블록한 것을 식품 또는 의약품의 함수(含水) 원료 조성물에 1~15 w/w%가 되도록 배합하며, 이 후 동결, 또는 동결 및 동결 건조를 실시하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 의약품의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ε-폴리-L-리신의 아미노기의 50~99 몰%에 대해서, 무수 숙신산을 반응시켜 카르복실화 또는 아세틸화함으로써 블록하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 의약품의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 ε-폴리-L-리신의 수평균 분자량은 1000~2만인 것을 특징으로 하는 식품 또는 의약품의 제조 방법.