CN102792947B - 一种间充质干细胞冻存液及注射液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞冻存液，它包含如下体积百分比的成分：勃脉力A液25~75%、18AA5%复方氨基酸注射液10~35%、20%人血白蛋白1~50%、DMSO 5~20%。本发明还提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法。本发明间充质干细胞冻存液可克服现有细胞冻存液的缺陷，既能长时间维持间充质干细胞的活率，又能直接临床输注，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

一种间充质干细胞冻存液及注射液

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞冻存液及注射液。

背景技术

干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

由MSCs制备的干细胞注射液在临床上可以用于预防和治疗异体造血干细胞移植后产生的移植物抗宿主病（GVHD），以及治疗自生免疫性疾病，Ⅰ型糖尿病、如红斑狼疮、风湿性关节炎和硬皮病等。然而，与普通生物制品和药品不同，间充质干细胞注射液的活性物质是细胞，细胞在离体环境中，活性会迅速下降，传统方法用含人血白蛋白的氯化钠注射对MSCs进行保存，在8~24小时以内，细胞活性即大幅下降，无法长期保证细胞活性，给MSCs注射液大量、全国大范围临床应用于提出了严峻的挑战。

大量研究发现，用含有胎牛血清或者细胞培养基的保存液可以解决细胞活性下降快的问题，能够长时间维持细胞活率。但是，细胞接触胎牛血清时会内吞胎牛血清，进而引起细胞某些蛋白表达特性的变化，细胞回输人体后可能引起过敏反应，不能直接用于临床输注；细胞培养基因其成分与人体环境相差较远，未被批准临床使用，也不能直接临床输注，通常被科研机构用来体外培养及冻存细胞。

申请号：201010246409.3，发明名称：一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液的专利申请，公开了一种间充质干细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：1)将人AB血置于无菌离心管中，在1000rpm-1200rpm条件下离心15分钟；2)吸取上清液，转移入新的离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清即为冻存用人AB血浆；3)将二甲基亚砜、上述冻存用人AB血浆、勃脉力A注射液按体积比1∶3∶6混合均匀，即为间充质干细胞冻存液。由该专利申请文件的实施例表1可以看出，该发明的冻存液I和Ⅱ冻存1、2、3个月后复苏，检测细胞活率，冻存液I的细胞活率依次为96%、92.6%和89%，其细胞活率降低率为3.5%/月，冻存液Ⅱ细胞活率依次为97.4%、95%和为94.7%，其细胞活率降低率为1.35%/月，该申请公开的冻存液虽然可以直接静脉输注，但是细胞活率维持时间短。并且，该细胞冻存液中含有人AB血浆，血浆中含有大量未知成分，用于异体输注存在安全隐患，同时，血浆来源也很少，成本高，难以大规模应用。

综上，现有技术中的细胞的冻存液难以兼顾长时间维持细胞活率与临床直接输注。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的间充质干细胞冻存液。

本发明间充质干细胞冻存液，它包含如下体积百分比的成分：

优选地，所述冻存液包含如下体积百分比的成分：

进一步优选地，所述冻存液包含如下体积百分比的成分：

它包含如下体积百分比的成分：

进一步优选地，所述冻存液由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液：每1000ml含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g；

20%人血白蛋白：是药典规定的人血白蛋白制品，其中，人血白蛋白的浓度为20%（v/v）。

18AA5%复方氨基酸注射液：由18种氨基酸与山梨醇配制而成的灭菌水溶液。每1000ml含：L-脯氨酸1.00g、L-丝氨酸1.00g、L-丙氨酸2.00g、L-异亮氨酸3.52g、L-亮氨酸4.90g、L-门冬氨酸2.50g、L-酪氨酸0.25g、L-谷氨酸0.75g、L-苯丙氨酸5.33g、L-精氨酸盐酸盐5.00g、L-赖氨酸盐酸盐4.30g、L-缬氨酸3.60g、L-苏氨酸2.50g、L-组氨酸盐酸盐

(C6H9N3O2·HCl·H2O)2.50g、L-色氨酸0.90g、L-甲硫氨酸2.25g、L-胱氨酸0.10g、甘氨酸7.60g、山梨醇50.00g、亚硫酸氢钠0.5g。

DMSO：二甲基亚砜。

本发明还提供了一种间充质干细胞注射液，其包含前述间充质干细胞冻存液和间充质干细胞，间充质干细胞的浓度为1×10⁵~1×10⁸个/ml。间充质干细胞的浓度根据临床需求调整。

本发明还提供一种制备前述间充质干细胞注射液的方法，它包括如下步骤：

（1）按照前述比例取勃脉力A液、18AA 5%复方氨基酸注射液、20%人血白蛋白和DMSO；

（2）将步骤（1）勃脉力A液、18AA 5%复方氨基酸注射液和20%人血白蛋白混匀，加入间充质干细胞至细胞浓度为1×10⁵~1×10⁸个/ml，得细胞悬液；

（3）将步骤（1）DMSO加入步骤（2）所得的细胞悬液，即可。

制备得到的间充质干细胞注射液，程控降温后保存在液氮罐里，使用时，取出复苏即可。

本发明间充质干细胞冻存液，可以长时间维持间充质干细胞的活性，不含细胞培养基、胎牛血清、人血浆等不安全成分，制备的间充质干细胞注射液，冻存复苏后可直接用于临床输注，安全有效，制备方法简单，成本低廉，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1生长曲线对比图

图2细胞冻存前生长形态

图3本发明间充质干细胞注射液冻存1年后复苏后细胞生长形态

图4对照组冻存一年后复苏期细胞生长形态

图5本发明间充质干细胞冻存1年复苏后细胞成脂分化能力图

图6未冻存新鲜细胞成脂分化能力图

图7对照组冻存细胞成脂分化能力图

图8本发明间充质干细胞注射液冻存1年复苏后细胞成骨分化能力图

图9未冻存新鲜细胞成骨分化能力图

图10对照组冻存细胞成骨分化能力图

图11本发明间充质干细胞注射液冻存1年复苏后48小时后细胞的成脂分化能力图

图12本发明间充质干细胞注射液冻存1年复苏后48小时后细胞的成骨分化能力图

图13本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面CD45检测结果

图14本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面HLA-DR检测结果

图15本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面CD14检测结果

图16本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面CD34检测结果

图17本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面79a检测结果

图18本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面CD90检测结果

图19本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面CD105检测结果

图20本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后细胞表面CD166检测结果

图21本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面CD45检测结果

图22本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面HLA-DR检测结果

图23本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面CD14检测结果

图24本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面CD34检测结果

图25本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面79a检测结果

图26本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面CD90检测结果

图27本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面CD105检测结果

图28本发明间充质干细胞注射液冻存1年，复苏后48h细胞表面CD166检测结果

具体实施方式

主要仪器及试剂：

仪器：离心机Eppendorf5810R、流式细胞仪Beckman FC500、细胞计数仪罗氏CASY Model77、倒置相差显微镜奥林巴斯CKX41、CO2培养箱Thermo8000；

试剂：

0.9%氯化钠注射液购自四川科伦药业股份有限公司生产

18AA5%氨基酸复方注射液购自山东鲁抗辰欣药业有限公司

勃脉力A液（PLASMA-LYTE）购自上海百特医疗用品有限公司

20%人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司

DMSO购自WAK-Chemie

LG-DMEM/F12基础培养基+10%胎牛血清购自GIBCO

人间充质干细胞无血清培养基购自GIBCO

0.05%胰酶-0.02%EDTA溶液购自GIBCO

0.25%胰酶-0.38g/L EDTA溶液购自GIBCO

0.04%台盼蓝染色液购自GIBCO

人间充质干细胞成骨分化试剂盒购自GIBCO

人间充质干细胞成骨分化试剂盒购自GIBCO

茜素红S购自Sigam

油红O购自Sigam

多聚甲醛购自Sigam

实施例1用本发明间充质干细胞冻存液制备注射液

1、制备本发明间充质干细胞注射液

如表1所示冻存液的配方，取勃脉力A液、18AA 5%复方氨基酸注射液和20%人血白蛋白，混匀，加入脐带间充质干细胞至细胞密度为1×10⁷个/ml，再加入DMSO，即可。

表1本发明间充质干细胞冻存液配方

组6中，白蛋白含量高，成本较其他组高。

对照组：取90ml完全培养基（90%（v/v）DMEM/F12+10%（v/v）胎牛血清），混匀，加入脐带间充质干细胞至细胞密度为1×10⁷个/ml，再加入10mlDMSO，即可。对照组的配方是国内作为常用的细胞冻存液配方。

2、细胞活率检测

取冻存前细胞，测试细胞活率；将本发明制备的间充质干细胞注射液以及对照组，程控降温后保存在液氮罐里，冻存1年后在37℃水浴复苏，测试细胞活率。

检测方法为台盼蓝经典染色法。

3、检测结果

结果如表2所示：

表2细胞活率实验结果

组别	细胞活率（100%）
		冻存前	96.8
对照组	92.2
		1	93.0
2	94.8
		3	95.4
4	91.5
		5	92.5
6	94.6
		7	89.2

由表2可以看出：

本发明间充质干细胞冻存液制备的注射液，冻存一年以后复苏，细胞活率均在89.2%之上，与冻存前相比，细胞活率最多仅下降了7.6%/年，经计算，细胞活率降低率最多仅为0.63%/月，下降幅度极低；在本发明优选范围内，可以进一步提高细胞活率，降低生产成本，同时，注射液的pH、渗透压接近人体的pH、渗透压，更为安全；其中，组3的细胞活率最高，为95.4%，pH为6.6~6.8，渗透压为320~360mOsmol/Kg，最接近人体pH和渗透压，安全有效，为最佳配比。

实验说明，本发明间充质干细胞冻存液可以长时间维持细胞活率。

根据本实施例结果，选取本发明最佳配比的间充质干细胞冻存液做进一步研究：

实施例2本发明间充质干细胞注射液冻存1年后各性能检测

1、实验方法

本发明间充质干细胞注射液：取与实施例1组3的制备方法相同的另一批次细胞，冻存1年后在37℃水浴复苏，保存在2~8度冰箱。

对照组：同实施例1。

（1）冻存1年后复苏，复苏后不同时间点的细胞活率检测

取冻存前细胞测试细胞活率；本发明间充质干细胞注射液和对照组复苏后0小时，24小时、48小时和72小时的细胞分别测试细胞活率。检测方法为台盼蓝经典染色法。

（2）生长曲线对比

取冻存前细胞，本发明间充质干细胞注射液和对照组复苏后0小时细胞，用台盼蓝经典染色法计数，分别将以2000个/cm²密度接种在T25培养瓶中，每个组别接种21瓶，分别每天每个组别计数三个培养瓶中细胞数量，取其平均值，进行生长曲线的绘制。没有计数的培养瓶每3天更换一次培养基。

（3）细胞生长形态

取步骤（2）生长到第5天的细胞进行显微镜下观察不同组别细胞生长的异同，并拍照。

（4）细胞分化能力测试

取冻存前细胞，本发明间充质干细胞注射液和对照组复苏后0小时，和48小时的细胞，分别以5000个/cm²的密度接种到6孔板中，待长至70%汇合度时，在培养基中加入分化GIBCO成骨、成脂诱导培养基，每4天更换一次培养基，14天时分别用油红O染色对成脂分化细胞染色，大于21天用茜素红S对成骨分化细胞进行染色。

（5）表面标志检测

取冻存前细胞，本发明间充质干细胞注射液和对照组复苏后0小时，和48小时的细胞，以FITC标记的CD90、CD45、HLA-DR以及以PE标记的CD105、CD14、CD34、CD79a、CD166进行流式测定。

2、实验结果

（1）细胞活率结果如表3所示：

表3细胞活率实验结果

时间	冻存前	本发明间充质干细胞注射液	对照组
				0h	96.8%±0.6%(n=3)	95.6%±0.5%(n=3)	92.2%±0.8%(n=3)
24h	--------	94.9%%±0.8%(n=3)	86.30%±1.1%(n=3)
				48h	--------	91.2%±1.0%(n=3)	54.41%%±1.2%(n=3)
72h	--------	86.30%±1.2%(n=3)	48.25%±1.4%(n=3)

注：国家标准规定，间充质干细胞注射液中的细胞活率不得低于85%。

由表3可以看出，与冻存前相比，本发明间充质干细胞注射液复苏后0h，细胞活率下降很微小。

在冻存复苏后0h、24h、48h和72h，本发明间充质干细胞注射液的细胞活率均高于对照组的细胞活率，随着时间增加，二者的差距增大，复苏后24h时，前者就显著高于后者了；复苏后，本发明间充质干细胞注射液中细胞活率的下降幅度小，而对照组细胞活率的下降幅度大，前者显著低于后者；本发明间充质干细胞注射液复苏后72h的细胞活率仍然维持在85%以上，复苏后的有效期长达3天，大大方便临床使用，而对照组在复苏后24h，其细胞活率就降到85%左右，复苏后的有效期仅为1天。

（2）生长曲线绘制

生长曲线密度接种约为2000个/cm²，每组每天计三个样取其平均值，结果如表4和图1所示：

表4生长曲线数据统计

由表4和图1可以看出，与冻存前和对照组相比，本发明间充质干细胞注射液在冻存1年后复苏，增殖能力没有明显变化。

（3）细胞形态对比

如图2~4所示，本发明间充质干细胞注射液在冻存1年后复苏，细胞形态与冻存前以及对照组细胞的形态没有明显变化，均呈梭形，折光度高，分布均一。

（4）细胞分化能力测试

如图5~12所示，本发明间充质干细胞注射液在冻存1年后复苏，其成脂、骨分化能力与冻存前以及对照组细胞的形态没有明显变化，均出现大量的脂肪滴和钙堆积。复苏后48h，本发明间充质干细胞注射液仍然具有成脂、骨分化能力。

（5）表面标志检测

如图13~20所示，本发明间充质干细胞注射液冻存1年后复苏后0h细胞高表达CD90、CD105、CD166，而不表达CD14、CD34、CD79a、CD45、HLA-DR，符合MSCs表面标志的特征，说明冻存1年后的细胞仍然为间充质干细胞。

如图21~28所示，本发明间充质干细胞注射液冻存1年后复苏，复苏后48小时后的细胞高表达CD90、CD105、CD166，而不表达CD14、CD34、CD79a、CD45、HLA-DR，符合MSCs表面标志的特征，说明冻存1年后的细胞仍然为间充质干细胞。

实验说明，用本发明冻存液冻存间充质干细胞，细胞的增殖、分化能力均未受到影响，细胞本身也未发生变异，说明本发明冻存液不会影响间充质干细胞的性质；本发明间充质干细胞冻存液，无论是在冻存过程中，还是冻存复苏后，都可以长时间维持细胞活率，制备的注射液有效期长，复苏后有足够的时间给药，临床应用非常方便。

实施例3本发明间充质干细胞注射液细胞活率与冻存时间的关系

1、实验方法

本发明间充质干细胞注射液：按照实施例1组3配比，制备间充质干细胞注射液，程控降温后保存在液氮罐里。

对照：同实施例1。

冻存1、6和12个月后在37℃水浴复苏，分别测试细胞活率，检测方法为台盼蓝经典染色法。

2、实验结果

实验结果如表5所示：

表5细胞活率与冻存时间的关系

由表5可以看出，冻存1、6、12个月后复苏，本发明间充质干细胞注射液的细胞活率均高于对照组的细胞活率；冻存后，本发明间充质干细胞注射液的下降幅度小，降低率为0.10%/月，而对照组的下降幅度大，降低率为0.38%/月，前者显著低于后者。

本实施例进一步验证了本发明间充质干细胞可以长时间维持细胞活率。

综上，本发明冻存液冻可以在冻存时长时间维持细胞活率，冻存复苏后，细胞活率下降慢；既不含胎牛血清等不能直接临床输注的成分，也不含人血浆等存在安全隐患且成本极高的成分，因此，本发明的间充质干细胞注射液冻存效果极好，安全，成本低廉，有效期长，使用非常方便，具有良好的工业应用前景。

Claims (1)

1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于：

它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液               30%

18AA5%复方氨基酸注射液  35%

20%人血白蛋白            25%

DMSO                    10%；

所述注射液的pH为6.0~6.4，所述渗透压为520±20mOsmol/Kg；

或者，它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液               40%

18AA5%复方氨基酸注射液  25%

20%人血白蛋白            25%

DMSO                    10%；

所述注射液的pH为6.6~6.8，所述渗透压为360±20mOsmol/Kg；

或者，它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液                50%

18AA5%复方氨基酸注射液   15%

20%人血白蛋白             25%

DMSO                    10%；

所述注射液的pH为6.6~6.8，所述渗透压为340±20mOsmol/Kg；

或者，它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液                55%

18AA5%复方氨基酸注射液   10%

20%人血白蛋白             25%

DMSO                     10%；

所述注射液的pH为6.6~6.8，所述渗透压为320±20mOsmol/Kg；

或者，它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液                50%

18AA5%复方氨基酸注射液   20%

20%人血白蛋白             10%

DMSO                     20%；

所述注射液的pH为6.6~6.8，所述渗透压为400±20mOsmol/Kg；

或者，它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液                25%

18AA5%复方氨基酸注射液   10%

20%人血白蛋白             50%

DMSO                     15%；

所述注射液的pH为6.0~6.4，所述渗透压为340±20mOsmol/Kg；

或者，它由如下体积百分比的成分组成：

勃脉力A液                75%

18AA5%复方氨基酸注射液   19%

20%人血白蛋白             1%

DMSO                     5%；

所述注射液的pH为6.6~6.8，所述渗透压为380±20mOsmol/Kg。

2.一种间充质干细胞注射液，其特征在于：它包含权利要求1所述的间充质干细胞冻存液和间充质干细胞，间充质干细胞的浓度为1×10⁵~1×10⁸个/ml。

3.一种制备权利要求2所述间充质干细胞注射液的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）按照权利要求1所述比例取勃脉力A液、18AA 5%复方氨基酸注射液、20%人血白蛋白和DMSO；

（2）将步骤（1）勃脉力A液、18AA 5%复方氨基酸注射液和20%人血白蛋白混匀，加入间充质干细胞至细胞浓度为1×10⁵~1×10⁸个/ml，得细胞悬液；

（3）将步骤（1）DMSO加入步骤（2）所得的细胞悬液，即可。

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