CN104542578B - 一种细胞保存液及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及临床医学技术领域，特别涉及一种细胞保存液及其制备方法、应用。该细胞保存液包括白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液；保存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物。本发明的细胞保存液对两种以上的种子细胞的活力和形态起到优良维持作用，可长时间保存，维持其生物特性，从而显著提高种子细胞的治疗效果。

Description

一种细胞保存液及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及临床医学技术领域，特别涉及一种细胞保存液及其制备方法、应用。

背景技术

近年来，细胞治疗逐渐代替传统药物治疗，在各大疾病领域上发挥重要的作用。细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。其中，间充质干细胞和免疫细胞成为了疾病治疗的种子细胞。

间充质干细胞(MSCs)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛分布于各种不同的组织中，如骨髓、外周血、脐血、脂肪、胎肺、胎肾等组织。动物实验和临床研究表明，MSCs不表达MHC-Ⅱ类分子和FasL，不表达共刺激分子B7-1、B7-2，低水平表达MHC-Ⅰ类分子、CD40，将MSCs与异基因单个核细胞或同种异体T淋巴细胞共培养后不能引起同种异体T淋巴细胞显著增殖，说明MSCs具有低免疫原性和较低的抗原提呈能力，为他们临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据，可成为理想的细胞治疗材料，即使在HLA不匹配的个体间进行移植也不需要对宿主采用免疫抑制，这一新的细胞种类的发现为许多疾病的细胞替代治疗和治愈带来了光明的前景。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

然而，种子细胞的生物活性直接影响了其治疗效果。因此，如何维持种子细胞的高活力成为了治疗关键。在此之前，人们用生理盐水或葡萄糖溶液作为种子细胞的保存液，但是由于缺乏营养、溶液等张力或等渗力存在差异等原因，导致种子细胞在长期保存或运输中出现活力低下、大量溶胀死亡等现象。随后，人们进一步改善保存液的组成体系，添加了如NaCl、KCl、柠檬酸钠、MgCl₂、自体血小板等成分，如专利申请号为201210421365.2的一种细胞保存液，其制备方法是：称取NaCl、KCl、柠檬酸钠、葡萄糖、甘露醇、CaCl₂、白蛋白、氨基酸、维生素等，把上述物品溶于水中，形成保存液；如专利授权号为CN 102948413B的一种肝干细胞保存液，其制备方法是：取人血白蛋白、NaCl、葡萄糖酸钠、KCl、醋酸钠、MgCl₂、氨基酸、肝素钙等，把上述物品溶于水中，形成保存液；又如专利授权号为CN 102349500B的一种间充质干细胞自体保存液，其制备方法是：自体血液3000rpm离心8min，取上层血浆，加入CaCl₂溶液，颠倒后现成自体血小板裂解物，把自体溶液介质：血小板裂解物：维生素C注射液＝95:4:1的比例混匀，形成保存液。

虽然上述保存液在较长时间内很好的维持了种子细胞的活性。但保存液的成分复杂，配制过程繁琐，且只适合保存间充质干细胞，并不能用于维持免疫细胞的活力，同时对于间充质干细胞的保存效率也并未达到令人满意的效果。为了进一步的适应临床应用需要，开发一种能在长时间的保存和运输中，其既能维持间充质干细胞的活力，又能保持免疫细胞的生物活性的新保存液成为了当务之急。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法、应用。该细胞保存液对脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞及免疫细胞等两种以上的种子细胞的活力和形态起到优良维持作用，可长时间保存，维持其生物特性，从而显著提高种子细胞的治疗效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种细胞保存液，包括白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液；保存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物。

本发明通过研究发现：将白蛋白、葡萄糖、维生素C、复方电解质注射液和复方氨基酸注射液混合，从而形成了成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强的细胞保存液，该细胞保存液不仅可为种子细胞提供充足的营养物质，还能很好的维持种子细胞的活力及其原有细胞形态及生物特性。该保存液用于维持种子细胞活力的关键是提供种子细胞合适的生存环境及营养供给，保证移植的种子细胞在保存液中长时间的存活。因此，细胞保存液中的成分成为提高种子细胞活力至关重要的因素。

在本发明中，间充质干细胞和免疫细胞在本发明提供的细胞保存液中保存48h后，其活力仍然能够保持在90％以上，形态也没有出现变化。可见，本发明的细胞保存液对两种以上的种子细胞的活力和形态起到优良维持作用，维持其生物特性，从而显著提高种子细胞的治疗效果。

作为优选，在细胞保存液中，白蛋白的体积百分浓度为1％～5％，葡萄糖的体积百分浓度为3％～8％，维生素C的体积百分浓度为0.1％～0.5％。

优选地，在细胞保存液中，白蛋白的体积百分浓度为1％，葡萄糖的体积百分浓度为5％，维生素C的体积百分浓度为0.5％。

作为优选，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为(1:1)～(1:2)。

优选地，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为1:1。

在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸和甘氨酸。

在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液是由18种氨基酸与山梨醇配制而成的灭菌水溶液，复方氨基酸注射液的组分为：每500mL含：L-脯氨酸(C₅H₉NO₂)0.50g；L-丝氨酸(C₃H₇NO₃)0.50g；L-丙氨酸(C₃H₇NO₂)1.00g；L-异亮氨酸(C₆H₁₃NO₂)1.76g；L-亮氨酸(C₆H₁₃NO₂)2.45g；L-门冬氨酸(C₄H₇NO₄)1.25g；L-酪氨酸(C₉H₁₁NO₃)0.13g；L-谷氨酸(C₅H₉NO₄)0.38g；L-苯丙氨酸(C₉H₁₁NO₂)2.67g；L-精氨酸盐酸盐(C₆H₁₄N₄O₂·HCl)2.50g；L-赖氨酸盐酸盐(C₆H₁₄N₂O₂·HCl)2.15g；L-缬氨酸(C₅H₁₁NO₂)1.80g；L-苏氨酸(C₄H₉NO₃)1.25g；L-组氨酸盐酸盐(C₆H₉N₃O₂·HCl·H₂O)1.25g；L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)0.45g；L-蛋氨酸(C₁₅H₁₁NO₂S)1.13g；L-胱氨酸(C₆H₁₂N₂O₄S₂)0.05g；甘氨酸(C₂H₅NO₂)3.80g；山梨醇(C₆H₁₄O₆)25.00g；亚硫酸氢钠(NaHSO₃)0.25g。辅料为注射用水。

在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液包括氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液的组分为：每1000mL含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。

本发明还提供了本发明的细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：

取复方电解质注射液和复方氨基酸注射液混合，获得保存基础液；

将白蛋白、葡萄糖、维生素C与保存基础液混合，获得细胞保存液。

作为优选，在细胞保存液制备方法中，白蛋白的体积百分浓度为1％～5％，葡萄糖的体积百分浓度为3％～8％，维生素C的体积百分浓度为0.1％～0.5％。

优选地，在细胞保存液制备方法中，白蛋白的体积百分浓度为1％，葡萄糖的体积百分浓度为5％，维生素C的体积百分浓度为0.5％。

作为优选，在细胞保存液制备方法中，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为(1:1)～(1:2)。

优选地，在细胞保存液制备方法中，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为1:1。

在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸和甘氨酸。

在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液是由18种氨基酸与山梨醇配制而成的灭菌水溶液，复方氨基酸注射液的组分为：每500mL含：L-脯氨酸(C₅H₉NO₂)0.50g；L-丝氨酸(C₃H₇NO₃)0.50g；L-丙氨酸(C₃H₇NO₂)1.00g；L-异亮氨酸(C₆H₁₃NO₂)1.76g；L-亮氨酸(C₆H₁₃NO₂)2.45g；L-门冬氨酸(C₄H₇NO₄)1.25g；L-酪氨酸(C₉H₁₁NO₃)0.13g；L-谷氨酸(C₅H₉NO₄)0.38g；L-苯丙氨酸(C₉H₁₁NO₂)2.67g；L-精氨酸盐酸盐(C₆H₁₄N₄O₂·HCl)2.50g；L-赖氨酸盐酸盐(C₆H₁₄N₂O₂·HCl)2.15g；L-缬氨酸(C₅H₁₁NO₂)1.80g；L-苏氨酸(C₄H₉NO₃)1.25g；L-组氨酸盐酸盐(C₆H₉N₃O₂·HCl·H₂O)1.25g；L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)0.45g；L-蛋氨酸(C₁₅H₁₁NO₂S)1.13g；L-胱氨酸(C₆H₁₂N₂O₄S₂)0.05g；甘氨酸(C₂H₅NO₂)3.80g；山梨醇(C₆H₁₄O₆)25.00g；亚硫酸氢钠(NaHSO₃)0.25g。辅料为注射用水。

在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液包括氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液的组分为：每1000mL含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。

本发明还提供了一种细胞保存方法，采用本发明的细胞保存液保存细胞；该细胞保存液包括白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液；保存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物；作为优选，在细胞保存液中，白蛋白的体积百分浓度为1％～5％，葡萄糖的体积百分浓度为3％～8％，维生素C的体积百分浓度为0.1％～0.5％；优选地，在细胞保存液中，白蛋白的体积百分浓度为1％，葡萄糖的体积百分浓度为5％，维生素C的体积百分浓度为0.5％；作为优选，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为(1:1)～(1:2)；优选地，复方电解质注射液与复方氨基酸注射液的体积比为1:1；在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸和甘氨酸。

在本发明提供的一些实施例中，复方氨基酸注射液是由18种氨基酸与山梨醇配制而成的灭菌水溶液，复方氨基酸注射液的组分为：每500mL含：L-脯氨酸(C₅H₉NO₂)0.50g；L-丝氨酸(C₃H₇NO₃)0.50g；L-丙氨酸(C₃H₇NO₂)1.00g；L-异亮氨酸(C₆H₁₃NO₂)1.76g；L-亮氨酸(C₆H₁₃NO₂)2.45g；L-门冬氨酸(C₄H₇NO₄)1.25g；L-酪氨酸(C₉H₁₁NO₃)0.13g；L-谷氨酸(C₅H₉NO₄)0.38g；L-苯丙氨酸(C₉H₁₁NO₂)2.67g；L-精氨酸盐酸盐(C₆H₁₄N₄O₂·HCl)2.50g；L-赖氨酸盐酸盐(C₆H₁₄N₂O₂·HCl)2.15g；L-缬氨酸(C₅H₁₁NO₂)1.80g；L-苏氨酸(C₄H₉NO₃)1.25g；L-组氨酸盐酸盐(C₆H₉N₃O₂·HCl·H₂O)1.25g；L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)0.45g；L-蛋氨酸(C₁₅H₁₁NO₂S)1.13g；L-胱氨酸(C₆H₁₂N₂O₄S₂)0.05g；甘氨酸(C₂H₅NO₂)3.80g；山梨醇(C₆H₁₄O₆)25.00g；亚硫酸氢钠(NaHSO₃)0.25g，辅料为注射用水；在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液包括氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁；在本发明提供的一些实施例中，复方电解质注射液的组分为：每1000mL含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。

在本发明提供的一些实施例中，细胞为间充质干细胞或免疫细胞。

在本发明提供的一些实施例中，间充质干细胞为脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。

在本发明提供的一些实施例中，免疫细胞为CIK细胞。

作为优选，在细胞保存方法中，细胞的密度为5×10⁵～5×10⁶个/mL。

本发明还提供了本发明细胞保存液的保存运输方法，其为在无菌、0～4℃条件下保存运输。低温保存制剂，一方面可避免营养成分变性，另一方面则很好的保持了种子细胞的生物活性，显著地提高治疗效果。

本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法、应用。该细胞保存液包括白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液；保存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物。本发明至少具有如下优势之一：

在本发明中，间充质干细胞和免疫细胞在本发明提供的细胞保存液中保存48h后，其活力仍然能够保持在90％以上，形态也没有出现变化。可见，本发明的细胞保存液对两种以上的种子细胞的活力和形态起到优良维持作用，可长时间保存，维持其生物特性，从而显著提高种子细胞的治疗效果；

本发明提供的细胞保存液与人体血液的渗透压一致，将种子细胞重悬回输至机体后，不会引起机体离子体系的失衡，无需对机体进行抽血等手术，降低了对机体的创伤；

本发明提供的细胞保存液的质量合格，在细菌、真菌、内毒素及病毒的检测中，均呈阴性，可用于机体内的回注，进行疾病的治疗或机体保健；

本发明提供的细胞保存液保存细胞时结团率低，有利于细胞的保存；

本发明提供的细胞保存液成本低廉，成分稳定、安全、无任何毒副作用；

本发明提供的细胞保存液制备步骤简便，能在短时间内大量配制，可规模化生产。

附图说明

图1示种子细胞的形态；其中，A示脐带间充质干细胞的形态(P3，40倍)，B示脐带间充质干细胞的形态(P3，40倍)，C示脐带间充质干细胞的形态(200倍)；

图2示脐带间充质干细胞在细胞保存液中保存12h后的活力检测图；

图3示脐带间充质干细胞在细胞保存液中保存12h后的形态分布图；

图4示脂肪间充质干细胞在细胞保存液中保存12h后的活力检测图；

图5示脂肪间充质干细胞在细胞保存液中保存12h后的形态分布图；

图6示CIK细胞在细胞保存液中保存12h后的活力检测图；

图7示CIK细胞在细胞保存液中保存12h后的形态分布图；

图8示脐带间充质干细胞在细胞保存液中保存24h后的活力检测图；

图9示脐带间充质干细胞在细胞保存液中保存24h后的形态分布图；

图10示脂肪间充质干细胞在细胞保存液中保存24h后的活力检测图；

图11示脂肪间充质干细胞在细胞保存液中保存24h后的形态分布图；

图12示CIK细胞在细胞保存液中保存24h后的活力检测图；

图13示CIK细胞在细胞保存液中保存24h后的形态分布图；

图14示脐带间充质干细胞在细胞保存液中保存48h后的活力检测图；

图15示脐带间充质干细胞在细胞保存液中保存48h后的形态分布图；

图16示脂肪间充质干细胞在细胞保存液中保存48h后的活力检测图；

图17示脂肪间充质干细胞在细胞保存液中保存48h后的形态分布图；

图18示CIK细胞在细胞保存液中保存48h后的活力检测图；

图19示CIK细胞在细胞保存液中保存48h后的形态分布图；

图20示脐带间充质干细胞在保存液中保存48h后的流式检测图；其中，A-1示阴性对照组检测细胞数量，A-2示阴性对照组里CD59HLA-DR双阴性细胞，A-3示阴性对照组里CD90CD45双阴性细胞；B-1示样品组检测细胞数量，B-2示CD59阳性HLA-DR阴性的细胞含量，B-3示CD90阳性CD45阴性的细胞含量；

图21示脂肪间充质干细胞在保存液中保存48h后的流式检测图其中，A-1示阴性对照组检测细胞数量，A-2示阴性对照组里CD59HLA-DR双阴性细胞，A-3示阴性对照组里CD90CD45双阴性细胞；B-1示样品组检测细胞数量，B-2示CD59阳性HLA-DR阴性的细胞含量，B-3示CD90阳性CD45阴性的细胞含量；

图22示CIK细胞在保存液中保存48h后的流式检测图；其中，A-1示阴性对照组检测细胞数量，A-2示CD3CD56双阴性的细胞含量；B-1示样品组中检测细胞数量，B-2示CD3阳性CD56阴性的细胞含量。

具体实施方式

本发明公开了一种细胞保存液及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的细胞保存液及其制备方法、应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。复方氨基酸注射液购买于广州白云山光华制药股份有限公司；复方电解质注射液购买于广州百济新特药业连锁有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1细胞保存液的制备

取复方电解质注射液和复方氨基酸注射液按质量比为1:1的比例混匀，形成保存基础液。

将白蛋白、葡萄糖和维生素C加入到上述制得的保存基础液中，白蛋白的质量百分含量为1％，葡萄糖的质量百分含量为5％，维生素C的质量百分含量为0.5％，充分混匀后制成细胞保存液。

将上述制得的细胞保存液放入到无菌的空盒里，把转有细胞保存液的空盒转移至已放有冰袋的保存箱中，低温(0～4℃)进行运输；或者将上述制得的细胞保存液放入无菌容器，置于0～4℃冰箱中保存。

实施例2细胞保存液的制备

取复方电解质注射液和复方氨基酸注射液按质量比为1:1.5的比例混匀，形成保存基础液。

将白蛋白、葡萄糖和维生素C加入到上述制得的保存基础液中，白蛋白的质量百分含量为3％，葡萄糖的质量百分含量为8％，维生素C的质量百分含量为0.1％，充分混匀后制成细胞保存液。

将上述制得的细胞保存液放入到无菌的空盒里，把转有细胞保存液的空盒转移至已放有冰袋的保存箱中，低温(0～4℃)进行运输；或者将上述制得的细胞保存液放入无菌容器，置于0～4℃冰箱中保存。

实施例3细胞保存液的制备

取复方电解质注射液和复方氨基酸注射液按质量比为1:2的比例混匀，形成保存基础液。

将白蛋白、葡萄糖和维生素C加入到上述制得的保存基础液中，白蛋白的质量百分含量为5％，葡萄糖的质量百分含量为3％，维生素C的质量百分含量为0.3％，充分混匀后制成细胞保存液。

将上述制得的细胞保存液放入到无菌的空盒里，把转有细胞保存液的空盒转移至已放有冰袋的保存箱中，低温(0～4℃)进行运输；或者将上述制得的细胞保存液放入无菌容器，置于0～4℃冰箱中保存。

实施例4间充质干细胞或免疫细胞的制备及保存

1)获取间充质干细胞(脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞)：

①取第三代至第五代(P3-P5)的间充质干细胞，用PBS清洗两遍后，加入2～3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置显微镜下观察，80％间充质干细胞皱缩变圆时，加入5～8mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。

②将上述间充质干细胞悬液转移至50mL离心管中，500～800g离心3～5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20～40mL的生理盐水重悬细胞，500～800g离心3～5min，弃上清液(该步骤重复一次)。

2)获取免疫细胞(CIK细胞)：

取培养了12～15天、处于对数生长期的CIK细胞，吹打均匀后全部吸出，移至50mL离心管中，500～800g离心3～5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20～40mL的生理盐水重悬细胞，500～800g离心3～5min，弃上清液(该步骤重复一次)。

分别用实施例1至3制备的5～10mL细胞保存液重悬上述获取的间充质干细胞或免疫细胞，调整细胞密度为5×10⁵～5×10⁶个/mL(细胞总量为5×10⁷～5×10⁸个)，用70μm一次性滤网过滤后，用细胞悬液转移至50mL～100mL的细胞保存液中，使得细胞的密度为5×10⁵～5×10⁶个/mL。

实施例5细胞及制剂质量评价

(一)细胞质量评价(形态、活力与体积、表面抗原)

(1)质量评价方法

a.形态检测：取处于对数生长期的脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和CIK细胞，置倒置显微镜下观察细胞的形态。

b.活力与体积检测：

间充质干细胞：分别取在细胞保存液保存12h、24h、48h后的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞悬液5mL，调整细胞密度为5×10⁶cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝(v：v)＝3:1充分混匀，取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活力及体积检测。

CIK细胞：取在保存液保存12h、24h、48h后的CIK细胞，充分吹打均匀；调整CIK细胞密度为1×10⁷cell/mL；按细胞悬液：0.4％台盼蓝(v：v)＝9:1的比例，充分混匀两者。取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活力及体积检测。

c.流式结果检测：

间充质干细胞：分别取在细胞保存液保存48h的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞悬液5mL，调整细胞密度为1×10⁶cell/mL的细胞悬液，分别取抗人CD59、CD90、CD45及HLA-DR的单克隆抗体各2.5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。

CIK细胞：取在细胞保存液保存48h的CIK细胞悬液5mL，调整细胞密度为1×10⁶cell/mL的细胞悬液，分别取抗人CD3、CD56的单克隆抗体各2.5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。

(2)质量评价结果

a.形态检测结果如图1所示：

由图1(A)和图1(B)可见，脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞为两种典型的间充质干细胞，其在体外培养时贴壁生长，长梭形；细胞边缘清晰可见，折光性强；并未见漂浮的死亡细胞。当两者融合率达80％以上时，呈漩涡状，复合间充质干细胞的生物学特征。

由图1(C)可见，CIK细胞是一种具有免疫功能的细胞，其在体外培养时，具有密度依赖、悬浮生长的特点。在200倍镜下观察，CIK细胞体积小且匀称，清晰可见圆形、椭圆形等正常的细胞形态，细胞折光性强，并未出现死细胞。

b.活力与体积检测：

种子细胞在保存液中保存12h、24h及48h后的活力及形态见图2～图19。细胞活力如表1所示：

表1细胞活力检测结果

上述图表说明，种子细胞在保存液中保存12h、24h、48h，其活力仍维持在90％以上，形态也没有出现变化。脐带间充质干细胞的活力在48h内从97.94％～98.89％下降至91.52％～92.17％；脂肪间充质干细胞的活力在48h内从97.39％～98.24％下降至90.4％～92.43％；两者下降幅度不大，细胞的活力仍维持在90％以上，细胞状态良好。CIK细胞的活力在48h内从94.55％～95.81％下降至92.11％～93.45％，下降幅度最小且活力仍高达92.11％。其次，从细胞形态上来看，干细胞大小维持在18-22μm之间，CIK细胞维持在12μm。细胞形态并没有因保存时间长或长途运输而出现变化。说明本发明的细胞保存液对种子细胞的活力和形态起到优良维持作用。

c.流式结果检测：

脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和CIK细胞的流式检测结果分别见图20～图22：

脐带间充质干细胞是一种典型的间充质干细胞，其能表一般间充质干细胞所表达的表面抗原CD59和CD90，低表达HLA-DR和CD45。从图20样品组的检测结果可知，脐带间充质干细胞在保存液中保存48h后，仍高表达CD59和CD90两种表面抗原，表达率分别为99.4％和99.8％；而HLA-DR和CD45两种表面抗原的表达率只有0.6％和0.1％，仍维持低较低的表达率。从流式检测结果可知，脐带间充质干细胞在保存液中保存48h后，细胞维持原有间充质干细胞的特性，并未出现分化现象。

脂肪间充质干细胞是一种典型的间充质干细胞，其能表一般间充质干细胞所表达的表面抗原CD59和CD90，低表达HLA-DR和CD45。从图21样品组的检测结果可知，脂肪间充质干细胞在保存液中保存48h后，仍高表达CD59和CD90两种表面抗原，表达率分别为98.6％和99.0％；而HLA-DR和CD45两种表面抗原的表达率只有3.7％和0.0％，仍维持低较低的表达率。从流式检测结果可知，脂肪间充质干细胞在保存液中保存48h后，细胞维持原有间充质干细胞的特性，并未出现分化现象。

CIK的生物学特征是高表达表面抗原的CD3，低表达CD56。治疗用的CIK细胞CD3⁺CD56^-的表达率在20-30％，才符合治疗质量要求。由图22样品组可知，CIK在保存液中保存48h后，其表达率仍维持在29％，符合CIK的治疗质量要求。上述结果均表明了CIK细胞，在本发明的保存液中保存48h，仍维持着原有的生物学特征，并未出现变异。

(二)制剂质量评价(细菌、真菌、内毒素、病毒)

将实施例1至3制得的细胞保存液送去第三方检测机构检测。检测方法及结果如下：

(1)制剂质量检测方法

a.细菌、真菌检测：

用无菌的枪头分别加100μL、200μL被检测样本液于科伦比亚血琼脂培养基和沙保弱琼脂培养基，用无菌涂布棒均匀涂布，正置于超净台30min待干后，将培养基分别倒置于37℃生化培养箱和28℃生化培养箱培养(以未涂布的科伦比亚血琼脂培养基和沙保弱琼脂培养基作为空白对照)。除另有规定外，细菌培养3天，真菌培养7天，逐日观察菌落生长情况，观察，检测结果不长菌为合格。

b.内毒素检测：

加0.1mL细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解。注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在10min内使用(现配现用)。反应管中加入0.1mL检测液。封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的生化培养箱中温育60min±2min，温育期间避免振动。

结果判断：将反应管从生化培养箱中轻轻取出，缓慢倒转180°。若管内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性，记录为(+)；不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性，记录为(—)。

c.病毒检测：

病毒检测由第三方检测机构进行。细菌、真菌、内毒素、梅毒的检测采用常规方法进行；HBV和HCV的检测方法参照文献《乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒快速检测的方法研究》；HIV的检测方法参照文献《HIV结构蛋白重组表达复性及检测方法的研究》。

(2)制剂质量检测结果：

表2细胞保存液的质量检测

经过第三方检测机构的检测，种子细胞保存液在细菌、真菌、内毒素及病毒的检测中，均呈阴性。说明了种子细胞保存液的质量合格，可用于机体内的回注，进行疾病的治疗或机体保健。

(三)细胞结团率检测

间充质干细胞：分别取在细胞保存液保存12h、24h、48h后的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞悬液1mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝(v：v)＝3:1轻轻混匀，取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞结团率的检测。

CIK细胞：与间充质干细胞的实验方法相同。

检测结果如表3：

表3种子细胞在保存液中结团率检测

脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在保存48h后，结团率分别为1.33％～1.37％和0.95％～1.07％，结团率低。两种种子细胞细胞团可在外力摇晃下自动散开，重新形成单细胞悬液。

CIK细胞是一种悬浮细胞，在短时间(24h)内，细胞结团率极低，仅为0.00％～0.02％。在48h后，细胞结团率上升至0.26％～0.46％，但细胞团块也可在外力作用下自动散开，重新形成新的细胞悬液。

对比例1细胞保存液的制备及活力检测

本发明设置了3组细胞保存液的对照，包括对照1、对照2和对照3：

对照1参照专利申请号为201210421365.2的实施例1提供的制备方法获得保存液；

对照2参照专利授权号为CN 102948413B的保存液3的制备方法获得保存液；

对照3参照专利授权号为CN 102349500B的保存液II的制备方法获得保存液。

按照实施例5中细胞活力检测方法检测对照1至3细胞保存液的细胞活力，检测结果见表4：

表4细胞活力检测结果

由表4的试验结果可见，经对照1～3的细胞保存液保存后的细胞活力显著低于经本发明实施例1～3的细胞保存液保存后的细胞活力。可见，本发明提供的细胞保存液能够更好地保持间充质干细胞和免疫细胞的活力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种细胞保存液，其特征在于，由白蛋白、葡萄糖、维生素C和保存基础液组成；保存基础液为复方电解质注射液和复方氨基酸注射液的混合物；在细胞保存液中，所述白蛋白的体积百分浓度为1％～5％，所述葡萄糖的体积百分浓度为3％～8％，所述维生素C的体积百分浓度为0.1％～0.5％。

2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，在细胞保存液中，所述白蛋白的体积百分浓度为1％，所述葡萄糖的体积百分浓度为5％，所述维生素C的体积百分浓度为0.5％。

3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述复方电解质注射液与所述复方氨基酸注射液的体积比为(1:1)～(1:2)。

4.根据权利要求3所述的细胞保存液，其特征在于，所述复方电解质注射液与所述复方氨基酸注射液的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述复方氨基酸注射液包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸和甘氨酸。

6.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述复方电解质注射液包括氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

7.如权利要求1至6中任一项所述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：

取复方电解质注射液和复方氨基酸注射液混合，获得保存基础液；

将白蛋白、葡萄糖、维生素C与所述保存基础液混合，获得细胞保存液。

8.一种细胞保存方法，其特征在于，采用权利要求1至6中任一项所述细胞保存液保存细胞。

9.根据权利要求8所述的细胞保存方法，其特征在于，所述细胞为间充质干细胞或免疫细胞。