CN103210903B

CN103210903B - 一种用于保存cik细胞的冻存液及其应用

Info

Publication number: CN103210903B
Application number: CN201310159574.9A
Authority: CN
Inventors: 官立萍; 姬明丽; 千智斌; 李振想; 武文杰; 李霞飞
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2033-05-03
Also published as: CN103210903A

Abstract

本发明公开了一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。本发明提供的用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的：在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5-15%，使右旋糖苷的体积百分含量为5-15%。与冻存前的细胞相比，采用本发明提供的冻存液冻存后的细胞：（1）细胞形态无明显差异；（2）免疫表型（CD3⁺CD56⁺和CD8⁺）无明显差异；（3）细胞增殖活力、细胞杀伤活性无明显差异。

Description

一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。

背景技术

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells），是一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T淋巴细胞，在外周血淋巴细胞中的比例为1%-5%。1991年Schmidt-Wolf等首先报道了一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，即CIK细胞。

目前，免疫细胞过继疗法已成为放、化疗后对肿瘤患者进行辅助治疗的重要手段之一，CIK细胞是过继治疗的主力军。通常采用自体外周血制备CIK，一方面CIK细胞数量不足，另一方面会加重患者体质虚弱，使机体处于免疫系统薄弱时期，易引起感染。脐血来源丰富，细胞增殖能力强，是较为理想的CIK细胞来源。因此，CIK细胞的保存技术很值得研究。CIK细胞培养周期较长，易污染，不利于其临床应用，因此寻找一种CIK细胞保存方法尤为重要。

人类的CIK细胞是一群异质性细胞群，已有研究证实CD3⁺CD56⁺细胞和CD8⁺杀伤T细胞是构成CIK细胞强大杀瘤活性的主要效应细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。

本发明提供的用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的：在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5-15%（如5-10%、10-15%、5%、10%或15%），使右旋糖苷的体积百分含量为5-15%（如5-10%、10-15%、5%、10%或15%）。

所述淋巴细胞无血清培养基具体可为GT-T551，具体可为购自日本TAKARA BIO INC货号为GT-T551的GT-T551培养液。

本发明提供的冻存液中，添加了右旋糖苷作为细胞外的非渗透性保护物质，在冷冻过程中可减少细胞内冰晶的形成，复苏时还可以减轻由于渗透压的改变而引起的细胞肿胀。本发明发现，右旋糖苷与DMSO的联合使用能发挥叠加或协调低温保护作用。右旋糖苷输注在临床上原本就被用于扩充血容量，且目前未发现对人体有副作用。

本发明还保护所述冻存液在保存CIK细胞中的应用。

本发明还保护一种保存CIK细胞的方法，包括如下步骤：用所述冻存液悬浮CIK细胞，得到细胞悬液，然后冷冻保存所述细胞悬液。

所述方法中，所述细胞悬液中的细胞浓度可为10⁸个细胞/ml的细胞悬液。

所述冷冻保存的步骤可为：将所述细胞悬液采用程控降温仪降温后置于液氮中保存。所述程控降温仪的降温参数可为：4℃～-40℃，1～2℃/每分钟；-40℃～-80℃，10℃/每分钟。在液氮中保存的时间具体可为180天以内。

与冻存前的细胞相比，采用本发明提供的冻存液冻存后的细胞：（1）细胞形态无明显差异；（2）免疫表型（CD3⁺CD56⁺和CD8⁺）无明显差异；（3）细胞增殖活力、细胞杀伤活性无明显差异。结果表明，本发明提供的冻存液显著优于传统冻存液。

附图说明

图1为实施例2中冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下的照片（×200）。

图2为实施例2中各组CIK细胞的一次流式检测结果。

图3为实施例2中各组细胞的生长曲线。

图4为实施例2中各组CIK细胞的细胞毒性比较。

图5为实施例3中冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下的照片（×200）。

图6为实施例3中各组CIK细胞的一次流式检测结果。

图7为实施例3中各组细胞的生长曲线。

图8为实施例3中各组CIK细胞的细胞毒性比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的统计学方法均为用SPSS10.0软件进行t检验和方差分析。

K562细胞（人慢性髓系白血病细胞）：购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，资源编号：3111C0001CCC000039。

Ficoll淋巴细胞分离液：美国Sigma公司，货号：10771。淋巴细胞无血清培养基，又称GT-T551培养液：日本TAKARA BIO INC，货号：GT-T551。细胞因子IFN-γ：Gibco公司，货号：PHC4033。细胞因子IL-2：，Gibco公司，货号：CTP0021。CD3单抗（CD3mAb）：Gibco公司，货号：MHCD0300。FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD56抗体、PE标记的CD8抗体、FITC标记的IgG1抗体和PE标记的IgG1抗体均购自美国beckman coulter。

二甲基亚砜（DMSO）：Gibco公司，货号：C6295。右旋糖苷（Dextran；分子量为40000）：山东齐都药业有限公司，批号：1012030406。

实施例1、细胞冻存液的制备

细胞冻存液甲的制备方法：在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的浓度为10%（体积比），使右旋糖苷的浓度为10%（体积比）。

细胞冻存液乙的制备方法：在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的浓度为5%（体积比），使右旋糖苷的浓度为15%（体积比）。

细胞冻存液丙的制备方法：在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的浓度为15%（体积比），使右旋糖苷的浓度为5%（体积比）。

细胞冻存液丁（传统的细胞冻存液）：在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和人血白蛋白，使二甲基亚砜的浓度为15%（体积比），使人血白蛋白的浓度为10%（体积比）。

实施例2、CIK细胞的获得和冻存

一、CIK细胞的获得

脐带血：获自新乡医学院足月健康胎儿，征得家属同意。

1、采用Ficoll淋巴细胞分离液（密度梯度离心法）从脐带血中分离单个核细胞。

2、将步骤1得到的单个核细胞在100ml含有1000μg/ml IFN-γ和1%（体积比）自体血浆(即用于分离核细胞的脐带血血浆)的GT-T551细胞培养液中37℃静置培养24小时。

3、在完成步骤2的培养体系中加入CD3单抗和细胞因子IL-2，使CD3单抗的浓度为75ng/ml、细胞因子IL-2的浓度为1000U/ml，37℃静置培养24小时。

4、在完成步骤3的培养体系中加入300ml含有1000U/ml细胞因子IL-2的GT-T551细胞培养液，之后每48小时加入200ml含有1000U/ml细胞因子IL-2的GT-T551细胞培养液，培养条件为37℃静置培养。

二、CIK细胞的冻存

1、步骤一中，从步骤2接种单个核细胞开始计时，每24小时为1天，14天后收集CIK细胞（即冻存前的细胞）。

2、分组冻存处理

实验组甲：用细胞冻存液甲悬浮步骤1得到的CIK细胞，得到10⁸个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入1ml细胞悬液。

实验组乙：用细胞冻存液乙悬浮步骤1得到的CIK细胞，得到10⁸个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入1ml细胞悬液。

实验组丙：用细胞冻存液丙悬浮步骤1得到的CIK细胞，得到10⁸个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入1ml细胞悬液。

对照组：用细胞冻存液丁悬浮步骤1得到的CIK细胞，得到10⁸个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入1ml细胞悬液。

3、将步骤2得到的各个冻存管放置于冷冻盒中进行冷冻（程控降温仪降温速率为：4℃～-40℃，1～2℃/每分钟；-40℃～-80℃，10℃/每分钟），然后从冷冻盒中取出冷冻管迅速置于液氮中。

三、CIK细胞的复苏

1、迅速取出步骤二中在液氮中保存180天的冻存管，立即投入37℃-40℃水浴中，振荡至完全溶解（20-40秒），用pH7.2、0.01M的PBS缓冲液洗涤冻存管中的CIK细胞。

2、将步骤1得到的CIK细胞接种至含有1000U/ml细胞因子IL-2和1%（体积比）自体血浆的GT-T551细胞培养液中，37℃静置培养。

四、形态观察

1、步骤三的2中，从接种CIK细胞开始计时，24小时后收集CIK细胞（即复苏后细胞）。

2、将冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下进行观察，照片见图1。

图1中，A为冻存前的细胞，B为实验组甲复苏后的细胞，C为对照组复苏后的细胞。实验组乙复苏后的细胞、实验组丙复苏后的细胞的形态与实验组甲复苏后的细胞的形态一致。结果表明，实验组复苏后的细胞与冻存前的细胞在形态学上无明显差异，呈悬浮状、圆形、光泽较亮，有些呈克隆团。

五、免疫表型检测

2、将冻存前的细胞和复苏后的细胞分别进行如下操作：用pH7.2、0.01M的PBS缓冲液悬浮细胞，得到细胞浓度为10⁶个/ml的细胞悬液；在细胞悬液中加入FITC标记的CD3抗体和PE标记的CD56抗体，或在细胞悬液中加入FITC标记的CD3抗体和PE标记的CD8抗体，或在细胞悬液中加入FITC标记的IgG1抗体和PE标记的IgG1抗体，室温避光孵育20min后用流式细胞仪检测。

结果见图2和表1。

表1各组CIK细胞的流式检测结果-具有相应免疫表型的细胞的比例(%)

（三次重复实验的平均值）

	CD3⁺CD56⁺	CD3⁺CD8⁺
			冻存前的细胞	19.1±0.21	44.1±4.28
实验组甲复苏后的细胞	19.1±0.10	41.1±2.08
			实验组乙复苏后的细胞	19.2±0.79	42.6±0.62
实验组丙复苏后的细胞	19.6±0.85	42.9±2.45
			对照组复苏后的细胞	19.1±1.24	43.6±3.95

结果表明，冻存前的细胞与冻存后复苏的细胞的免疫表型无显著差异，均具有CIK细胞的免疫表型。

六、细胞增殖力检测

1、步骤三的2中，从接种CIK细胞开始计时，每24小时取样计数细胞数量并绘制细胞生长曲线。

2、将冻存前的细胞接种至含有1000U/ml细胞因子IL-2和1%（体积比）自体血浆的GT-T551细胞培养液中，37℃静置培养，每24小时取样计数细胞数量并绘制细胞生长曲线。

细胞生长曲线见图3（每24小时为1天）。

结果表明，实验组甲的细胞的增殖活性、实验组乙的细胞的增殖活性和实验组丙的细胞的增殖活性均显著优于对照组的细胞。冻存前的细胞在培养21天后进入平台期。实验组甲的细胞在培养8-9天后进行平台期。对照组的细胞在培养5-6天后进入平台期，即对照组细胞快速增殖的时期较实验组短。

七、细胞杀伤活性检测

2、采用乳酸脱氢酶（LDH）分析法，以K562细胞为靶细胞，分别检测效应细胞（冻存前的细胞或复苏后的细胞）的杀伤活力。

效应细胞与靶细胞分别按照5：1、10:1、20:1和40:1的个数比加入96孔板，靶细胞数量为1×10⁴个细胞/孔。每个比例设4个平行孔，每孔总体积为200ul。效应细胞与靶细胞采用的培养基均为RPMI1640培养基。37℃静置培养4小时。采用LDH-Cytotoxicity Colorimetric Assay Kit‖（美国，BioVision，货号：K313-500），按照试剂盒说明书进行检测。用酶标仪检测波长490nm时的光吸收值（A）。

结果见图4。各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增强，实验组甲复苏后的细胞组和冻存前的细胞无明显统计学差异，对照组复苏后的细胞在不同效靶比时均低于冻存前的细胞，差异有统计学意义。

实施例3、CIK细胞的获得和冻存

本实施例中采用的CIK细胞购自上海拜力生物血清网。

一、CIK细胞的冻存

同实施例2的步骤二的2。

二、CIK细胞的复苏

1、同实施例2的步骤三的1。

2、将步骤1得到的CIK细胞接种至含有1000U/ml细胞因子IL-2和1%（体积比）人血浆的GT-T551细胞培养液中，37℃静置培养。

三、形态观察

1、步骤二的2中，从接种CIK细胞开始计时，24小时后收集CIK细胞（即复苏后细胞）。

2、将冻存前的CIK细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下进行观察，照片见图5。

图5中，D为冻存前的细胞，E为实验组甲复苏后的细胞，F为对照组复苏后的细胞。实验组乙复苏后的细胞、实验组丙复苏后的细胞的形态与实验组甲复苏后的细胞的形态一致。结果表明，实验组复苏后的细胞与冻存前的细胞在形态学上无明显差异，呈悬浮状、细胞饱满、折光性好，有些散在的集落。

四、免疫表型检测

方法同实施例2的步骤五。

结果见图6和表2。

表2各组CIK细胞的流式检测结果（三次重复实验的平均值）

具有相应免疫表型的细胞的比例(%)	CD3+CD56+	CD3+CD8+
			冻存前的细胞	19.8±1.15	43.23±0.33
实验组甲复苏后的细胞	19.4±0.89	42.8±0.89
			实验组乙复苏后的细胞	19.1±0.70	43.3±0.92
实验组丙复苏后的细胞	19.1±0.91	41.6±0.7
			对照组复苏后的细胞	19.5±0.97	42.9±1.82

五、细胞增殖力检测

方法同实施例2的步骤六。

细胞生长曲线见图7（每24小时为1天）。

结果表明，实验组甲的细胞的增殖活性、实验组乙的细胞的增殖活性和实验组丙的细胞的增殖活性均显著优于对照组的细胞。冻存前的细胞在培养22天后进入平台期。实验组甲的细胞在培养9-10天后进行平台期。对照组的细胞在培养6-7天后进入平台期，即对照组细胞快速增殖的时期较实验组短。

六、细胞杀伤活性检测

方法同实施例2的步骤七。

结果见图8。各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增强，实验组甲复苏后的细胞组和冻存前的细胞无明显统计学差异，对照组复苏后的细胞在不同效靶比时均低于冻存前的细胞，差异有统计学意义。

Claims

1.一种保存CIK细胞的方法，包括如下步骤：用冻存液悬浮所述CIK细胞，得到细胞悬液，然后冷冻保存所述细胞悬液；

所述冷冻保存的步骤为：将所述细胞悬液采用程控降温仪降温后置于液氮中保存；所述程控降温仪的降温参数可为：4℃～-40℃，1～2℃/每分钟；-40℃～-80℃，10℃/每分钟；在液氮中保存的时间为180天以内；

所述冻存液，是按照如下方法制备得到的：在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为10％，使右旋糖苷的体积百分含量为10％；

所述淋巴细胞无血清培养基为GT-T551细胞培养液。