CN107809905A - 用于治疗目的的细胞的冷藏方法 - Google Patents
用于治疗目的的细胞的冷藏方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107809905A CN107809905A CN201680038095.3A CN201680038095A CN107809905A CN 107809905 A CN107809905 A CN 107809905A CN 201680038095 A CN201680038095 A CN 201680038095A CN 107809905 A CN107809905 A CN 107809905A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- tumor infiltrating
- infiltrating lymphocyte
- dmso
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 124
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 44
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 163
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 40
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 40
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 claims description 16
- 201000000195 skin tag Diseases 0.000 claims description 16
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 15
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 8
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical group Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 abstract 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 56
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 41
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000011160 research Methods 0.000 description 17
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 8
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 150000003625 trehaloses Chemical class 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 229920002892 amber Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- -1 prenyl benzoquinones Chemical class 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N galactotriose Natural products OC[C@@H]1O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H](O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H](CO)[C@@H]3O)[C@@H]2O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)C(O)O2)O)O1 FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 125000004151 quinonyl group Chemical group 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N reduced coenzyme Q9 Natural products COC1=C(O)C(C)=C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1OC NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000701 toxic element Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/33—Fibroblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明涉及一种组合物,其包含在生理上可接受的培养基中的:a)人白蛋白,b)至少一种糖类,c)辅酶Q10和L‑半胱氨酸以及至少一种C3‑C5链烷二醇,和d)除了肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的细胞。
Description
本发明涉及一种组合物,其包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人血清白蛋白,
b)至少一种糖类,
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,和
d)除去特定的肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的细胞。
本发明还涉及用于治疗目的的、除去特定的肿瘤浸润性淋巴细胞以外的至少一种细胞样品的冷藏方法,包括以下步骤:
i)将用于治疗目的的细胞样品与下列物质混合:
a)人血清白蛋白,
b)至少一种糖类,和
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,然后
ii)冷冻步骤i)中获得的混合物。
冷藏是生物样品低温储存的过程。生物材料的冷藏通常通过将所述材料冷冻在合适的支持物(例如由玻璃或塑料材料制成的管或小瓶(在冷藏领域中通常被称为“吸管”或低温管)中,所述载体适于在低温下长期储存。
然而,冷藏带来了一定的问题和技术限制。特别是在解冻过程中会出现细胞损伤,导致细胞凋亡或破裂。另外,冷藏细胞的存活可能取决于冷冻过程中使用的条件和技术。控制冷却速率是重要的:以低速冷却能使在细胞外的可冷冻水有序结晶-细胞变得脱水、收缩并且水离开细胞。在相反的情况下,细胞内冰的形成导致膜结构的破坏,这对细胞是致命的。
对于大多数哺乳动物细胞来说(细胞疗法的产品和用药就是这样),无论细胞是否经过遗传修饰,使用低温保护剂以保持细胞完整性和功能性也是至关重要的。
目前,在工业规模(特别是欧洲或全球)上用于细胞疗法的产品的制造带来了新问题,例如施用的成品的稳定性和与起始生物材料相关的差异性。
在大多数情况下,成品是经包装的:
-液体培养基(白蛋白或盐水溶液型)中是新鲜的,保存时间限制在几小时或几天,否则
-以基于DMSO的简单制剂冷冻,这种制剂不是很稳定,长期也不是很有效。具有潜在免疫原性作用的死亡细胞、碎片的并非微不足道的量以及常用赋形剂对患者的毒性都是限制性因素。通常建议在施用前洗涤细胞以去除这些有毒元素(无论是否是生物的):这些溶液与工业规模上的分配不相容。而且,与其他“常规”类别的药物不同,它们在给药和储存方面不具有很大的灵活性。
因此,需要开发一种长期(即几个月)稳定的细胞疗法的产品和/或药物,其易于使用、可以直接注射且无毒。
本发明使得能够满足这种需要。事实上,根据本发明的组合物使得能够获得用于细胞疗法的产品,其包含用于治疗目的的细胞,所述产品是即用的(即准备好注射而不用洗涤,其避免所有额外导致细胞生存能力降低和细胞损失的处理操作)、长期稳定、易于使用且无毒。
因此,本发明涉及一种组合物,其包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人白蛋白(或人血清白蛋白),
b)至少一种糖类,
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,和
d)除了肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的细胞,
所述肿瘤浸润性淋巴细胞是这样获得的:体外培养来自患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品的肿瘤浸润性淋巴细胞,所述培养物包含在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现(也称为“出产”或“原代培养”),然后刺激从出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞,最后是扩增受刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞。
这些肿瘤浸润性淋巴细胞(也称为TIL)通过从患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节采集的样品的肿瘤浸润性淋巴细胞体外培养而获得的,所述培养包含:
-在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现。这种出现也被称为“原代培养”或“出产”;这是最初包含在运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中的肿瘤浸润性淋巴细胞移入培养基并在体外培养的步骤,然后
-由出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞的刺激,然后最后
-被刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞的扩增。
这种TIL在本申请中被称为“特异性肿瘤浸润性淋巴细胞”。
本发明还涉及除去特定的肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的至少一种细胞样品的冷藏方法,包括以下步骤:
i)将用于治疗目的的细胞样品与下列物质混合:
a)首先人白蛋白,然后
b)至少一种糖类,和
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,然后
ii)冷冻步骤i)中获得的混合物。
本发明还涉及包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人白蛋白,
b)至少一种糖类,和
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10的组合物的用途,用于除去特定的肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的至少一种细胞样品的冷藏。
在本申请中,根据本发明的组合物排除的特异性肿瘤浸润性淋巴细胞是自体的;它们对应于在肿瘤中含有的肿瘤浸润性淋巴细胞。
排除在本发明之外的这些肿瘤浸润性淋巴细胞是通过体外培养来自患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中的肿瘤浸润性淋巴细胞获得的,所述培养包括:
-在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现。这种出现也被称为“原代培养”或“出产”;这是最初包含在运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中的肿瘤浸润性淋巴细胞移入培养基并在体外培养的步骤,然后
-由出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞的刺激,然后最后
-被刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞的扩增。
具体而言,TIL出现的步骤可以通过原代培养取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品,尤其是通过在没有血清的型(由Cambrex Corp出售)、补充有白细胞介素-2(IL-2)的选择性培养基中的原代培养。
在TIL出现之后,后者经历刺激步骤,优选在区室化封闭的培养容器中,特别是存在至少非增殖的经辐照的同种异体饲养细胞的情况下。“封闭的培养容器”旨在表示这样的系统,其使得可以将细胞保持在合适的培养基中培养,而不使所述细胞直接与外部环境接触。最后,刺激TIL的步骤之后是扩增步骤。
优选地,将所有TIL从用于本申请的治疗目的的细胞中排除。
因此,根据本发明的组合物包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人白蛋白,
b)至少一种糖类,
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,和
d)除去特定的肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的细胞。
“生理上可接受的培养基”旨在表示包含电解质的含水培养基。电解质是例如钠、钾、镁和/或钙与氯化物,碳酸盐,氢氧化物或辛酸盐类型的阴离子的盐。生理上可接受的培养基优选为包含氯化钠和辛酸钠的水性培养基。
根据本发明的组合物包含人血清白蛋白(人白蛋白或化合物a))。该蛋白是高分子量(约65kDa)的血浆蛋白。它是血浆中最丰富的蛋白质;其正常平均浓度为38至48g/l。它使得能够缓冲pH值并保持渗透压。其纯度优选为95%。也可能使用人血清白蛋白的一种或多种片段和/或衍生物,所述片段或衍生物是非免疫原性的并且具有与人血清白蛋白类似的胶体性质。
优选地,相对于组合物的总重量,人血清白蛋白、其片段和/或衍生物的量为2至10重量%,优选2.5至6重量%,优选3.5至4.5重量%。
在本申请中,除非另外指出,否则所述量相对于组合物的总重量以重量计。
根据本发明的组合物还包含至少一种糖类(化合物b)。糖类通过保持渗透平衡改善细胞存活和功能。一小部分渗入细胞,使得能够稳定膜结构。糖类优选选自单糖、二糖和三糖。
单糖优选选自葡萄糖、半乳糖、果糖和甘露糖。
二糖优选具有式A-B,其中A和B各自独立地选自葡萄糖、果糖和甘露糖。糖类优选为二糖。二糖优选是葡萄糖二聚体。更优选地,二糖选自海藻糖和蔗糖。更优选地,二糖是海藻糖。
三糖优选选自棉子糖(半乳糖、葡萄糖和果糖的三聚体)、麦芽三糖和异麦芽三糖(葡萄糖三聚体)。
糖类优选以0.05M至0.5M,优选0.07M至0.3M,优选0.08M至0.12M的浓度存在于根据本发明的组合物中。
根据本发明的组合物最终至少包含DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10(化合物c)。因此,根据本发明的组合物包含作为化合物c)的至少DMSO和L-半胱氨酸。或者,根据本发明的组合物包含作为化合物c)的至少DMSO和辅酶Q10。
DMSO或二甲基亚砜是式CH3-SO-CH3的极性非质子有机溶剂。它是一种细胞内冷冻保护剂,其主要目的是替代细胞内液体,从而使得能够防止冰晶形成和冷冻/解冻阶段导致膜结构破裂的固有的渗透应力。它优选以2-15重量%,优选2.5-4.5重量%的量存在于本发明的组合物中。
L-半胱氨酸是具有巯基-SH的氨基酸。它优选以0.05mM至5mM的浓度存在于组合物中。
也被称为泛醌的辅酶Q10是包含醌基团的化合物。其化学名称是2,3-二甲氧基-5-甲基-6-十异戊二烯基苯醌。它优选以0.005-1重量%,优选0.007-0.5重量%,优选0.007-0.1重量%的量存在于本发明组合物中。
根据本发明的组合物优选包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人白蛋白,优选2.5-6重量%的量的人白蛋白,
b)糖类,优选海藻糖,优选浓度为0.05M至0.5M,
c)DMSO和L-半胱氨酸,优选分别是2-15重量%的量和0.5mM-2mM的浓度。
根据本发明的组合物是特别有益的,并且旨在冷藏用于治疗目的至少一种细胞样品。事实上,用于本发明组合物中的化合物a)至c)使得能够可持续和有效地冷藏用于治疗目的细胞。
用于治疗目的的细胞(化合物d))优选选自:
-免疫细胞,例如NK细胞,单核细胞,B淋巴细胞和天然或遗传修饰的T淋巴细胞,例如调节性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞和嵌合抗原受体(CAR)T淋巴细胞;
-人成肌细胞;
-造血干细胞;
-间充质干细胞;
-心脏细胞;
-成纤维细胞;和
-所有其他天然或遗传修饰的细胞。
NK细胞(或NK淋巴细胞)是先天免疫的细胞。它们是非T(CD3-)、非B(CD19-)淋巴细胞,在人类中通过标记CD56,CD16和NK表征。
单核细胞是进化为巨噬细胞、树突细胞或破骨细胞的白细胞。
B淋巴细胞是负责产生抗体的免疫细胞。
调节性T淋巴细胞是CD4+T淋巴细胞的亚群,并且抑制其他效应T淋巴细胞的增殖。
细胞毒性T淋巴细胞是CD8+T淋巴细胞的亚群,并破坏感染的细胞。
辅助性T淋巴细胞是CD4+T淋巴细胞的亚群,并介导免疫应答。
最后,具有嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞(也称为CAR-T细胞)对应于特定的细胞工程技术。它们是表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞。CAR-T细胞能够通过识别并结合存在于所述癌细胞上的肿瘤抗原来杀死癌细胞。
用于治疗目的的细胞样品可以来源于待治疗的患者(在这种情况下,患者和供体是同一个人),通过活组织检查或采集血液样品。在这种情况下,所获得的组合物,一旦冷藏然后解冻,将被施用给该同一患者:它是自体产品。
或者,用于治疗目的的细胞样品可以源自另一来源(即另一个体或细胞工程),特别是通过活组织检查或采集血液样品。在这种情况下,获得的组合物一旦冷藏然后解冻,将被施用于除了供体之外的待治疗患者:它是同种异体产品。
本发明还涉及除去特定的肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的至少一种细胞样品的冷藏方法,包括以下步骤:
i)将用于治疗目的的细胞样品与下列物质混合:
a)人白蛋白,
b)至少一种糖类,和
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,然后
ii)冷冻步骤i)中获得的混合物。
在该过程中,混合i)用于治疗目的的细胞样品与上述化合物a)-c)的步骤典型地通过稀释进行。优选将细胞以液体形式吸收到化合物a)中(优选占50%的体积),然后加入化合物b)和c)(优选预先混合在一起以获得2×浓度的溶液)。步骤i)的混合可以在约4℃或在室温(即20℃)下进行。
对于用于治疗目的的细胞样品,优选在体外在适当的培养基中预先培养。然后经历离心,除去上清液,并将沉淀悬浮在上述化合物a),b)和c)中。
冷冻步骤(步骤ii))优选在从+4℃或室温下降到-100℃和-160℃之间的温度下进行。冷冻步骤(步骤ii))优选进行至100℃至-180℃,优选-140℃至-160℃的温度。
然后将样品储存在通常低于-130℃的温度下。
优选地,冷冻ii)通过将步骤i)中获得的混合物放置在浸没在+4℃的异丙醇混合物中的容器中进行,所有一切都被置于-70℃至-90℃的温度。该系统(“在Nalgene盒中冷冻”)使得通过醇的缓慢冷却,几乎每分钟在-1℃和-2℃之间的温度线性降低。或者,优选地,冷冻ii)通过可编程冷冻器进行。这种冷冻器特别由Air Liquide或Cryobiosystem销售。
优选地,冷冻ii)尤其借助于可编程冷冻器通过以下步骤进行:
-将步骤i)中获得的混合物置于+4℃的温度下;然后
-将温度从4℃降至-40℃,每分钟降低1℃;然后
-将温度从-40℃降低到-150℃,每分钟降低10℃,以达到约-150℃的最终储存温度。
如此获得的冷冻产品可以在约150℃下保存数月。这些温度是应用于样品的温度。
下面的全部非限制性实施例说明了本发明。
实施例1:用根据本发明的制剂测试冷藏成肌细胞
制备以下制剂,命名为3.5%DMSO:
3.5%DMSO+1mM L-半胱氨酸+0.1M海藻糖+4%人血清白蛋白(HA)。
冷冻前需要在4℃下温育15分钟。
这种复杂的制剂与借助于CRF(可编程冷冻器)进行的自动化温度下降循环相结合,该CRF能够根据确定的循环实现复杂的温度下降。低至-40℃时,细胞被认为是敏感的:温度的下降是缓慢的并且逐渐的以能够形成规则的晶体。在此阈值以下,产品被认为是稳定的,并且温度的下降迅速下降到最高-150℃(气态或液态氮)的储存温度。
研究的背景
在研究成肌细胞的冷冻期间,进行了4个循环,其特征在下表中给出:
对于这4个循环,将来自健康患者的成肌细胞小瓶解冻。扩增细胞,然后通过CRF以5×106细胞/ml的浓度冷冻。
为了证明冷冻制剂的有效性,进行了3只组。对于每只组,将2个1ml小瓶解冻以进行试验。
*CS10:Cryostor 10,商业冷冻制剂(STEMCELL Technologies)
**10%DMSO+4%HA。
评价标准
为了评估冷冻制剂的有效性,在冷冻前(称为T0)和解冻后进行下表中列出的不同试验。将用解冻的细胞获得的结果与T0比较并以T0的%表示。第一次分析使得能够对于试验的每只组确定冷冻对细胞的影响。
其次,通过统计分析比较不同的冷冻组。由于实验室常用的参考冷冻制剂为10%DMSO+4%HA,因此第1组用作统计分析的参考。对于循环1和循环2,在不存在配制在10%DMSO中的细胞的情况下,第2组(在CS10中冷冻)用作参考。
在统计分析过程中,通过Fisher检验分析方差的一致性(F检验;如果p>0.05,一致方差)。在方差一致的情况下,用两个相等方差观测值进行均值相等性的检验。在Fisher检验非一致方差的情况下(p<0.05),用两种不同的方差观测值进行均值相等性的检验。如果p>0.10,均值没有显著差异。如果p<0.10,均值显著不同。
结果
细胞生存能力的分析
解冻后0小时的生存能力分析表明解冻后获得的百分比相当于第1、2和3组的T0(T0的90%到109%)。
对于批次1,与CS10条件相比,在3.5%DMSO中冷冻的细胞具有降低的生存能力,被认为是阳性对照。然而,生存能力仍然令人满意(>90%),同时CS10条件是稳定的。
对于批次4,CS10和10%DMSO条件彼此以及相对于T0没有区别,而3.5%DMSO组表现出往往低于10%DMSO参考组的生存能力。
对于批次3和2,所试验的两种制剂与T0和10%DMSO没有不同。
最后,不同制剂之间的差异很小,所以解冻后的生存能力不是决定性的标准。
解冻后的生存能力
批次1:
批次2:
批次3:
批次4:
细胞在室温下4小时后在其主容器和其冷冻剂制剂中的生存能力的分析使得能够评估细胞的解冻稳定性(模拟在实际情况下注射到患者体内之前的处理、运输和等待的条件)。这表明第4组的生存能力百分比的适度下降,低于T0的20%,这是可以接受的。
对于第3组,统计分析显示只有批次4的生存能力下降。
解冻后4小时的生存能力:
批次1:
批次2:
批次3:
批次4:
表型分析
进行表型分析以确定产物中成肌细胞的稳定性。对于前三批次,发现百分比与T0相同,并且与参考组没有显著差异。对于批次4,统计分析显示配制在3.5%DMSO中的细胞的百分比明显较低。
表型:
批次1:
批次2:
批次3:
批次4:
细胞增值的分析
批次1:
批次2:
批次3:
批次4:
用不同的温育时间进行增殖试验:
批次1:增殖3天。
批次2:增殖5天。
批次3:增殖5天。
批次4:增殖3天。
首先,结果的分析表明,冷冻后细胞增殖的潜力降低。事实上,T0的百分比变化很大。配制在3.5%DMSO中的细胞的扩增因数与参考组没有显著差异。但是,对于第4个循环,第3组的细胞的扩增因数比第1组的低。
研究结论
因此,目前的冷冻研究是对来自不同供体的4批人成肌细胞进行的。在所研究的标准中,结论是:
细胞的生存能力。就细胞生存能力而言,成肌细胞在3.5%DMSO制剂中的冷藏是有效的,因为它总是大于T0的80%。解冻后4小时的结果是合理的,并验证了临床应用。
增殖试验。冷冻成肌细胞导致细胞增殖能力的内在降低,反映在比T0更低的扩增因数。这种减少是所有组共同的。通常在实验室中观察到的这种现象不是用于排除冷冻制剂的标准。
表型。3.5%DMSO冷冻制剂完美地保留了目的细胞(成肌细胞)的百分比。
实施例2:根据本发明的制剂用于冷藏血液单核细胞(BMC)的试验
制备以下制剂,命名为3.5%DMSO:
3.5%DMSO+1mM L-半胱氨酸+0.1M海藻糖+4%HA。
冷冻前需要在4℃温育15分钟。
这种复杂的制剂与通过CRF(可编程冷冻器)进行的自动化温度下降循环相结合,该CRF能够根据限定的循环实现复杂的温度下降。低至-40℃时,细胞被认为是敏感的:温度的下降是缓慢的且逐渐的以能够形成规则的晶体。在此阈值以下,产品被认为是稳定的,并且温度下降迅速降到最高-150℃(气态或液态氮)的储存温度。
研究的背景
在对BMC进行冷冻研究期间,进行2个循环,其特征如下表所示:
循环(批号) | 起始材料 |
1(16Pi00230) | 来自细胞去除术捐赠试剂盒的环 |
2(16Pi00231) | 来自细胞去除术捐赠试剂盒的环 |
对两个循环,在Ficoll后从细胞去除术捐赠试剂盒环中分离BMC。在烧瓶中温育24小时后,使单核细胞贴壁,通过CRF以20×106个细胞/ml的浓度冷冻BMC。
为了证明冷冻制剂的有效性,进行3个组。对于每个组,将2个1ml小瓶解冻以进行试验。
*CS10:Cryostor 10,商业冷冻制剂
评价标准
为了评估冷冻制剂的有效性,下表中列出的不同标准与冷冻前对照(T0)以及冷冻参照10%DMSO和CS10进行比较。所得结果以T0的%表示。
通过检验T比较不同的冷冻组。实验室中通常使用的参考冷冻制剂10%DMSO+4%HA(第1组,阴性对照)用作统计分析的参考。
在统计分析过程中,通过Fisher检验评估方差的一致性(F检验,如果p>0.05,一致方差),根据结果,用相等或不同方差的两次观察进行均值相等性的检验。如果p<0.05,均值显著不同。
细胞生存能力的分析
对于每个批次,解冻后生存能力的分析表明解冻时获得的百分比相当于第1和第2组的T0(>T0的96.0%)。应该指出,条件1和2的生存能力相对于T0是稳定的。
对于批次16Pi00230,第2组与第1组没有任何区别。
2批次的第3组表现出较低的生存能力(均值为T0的89.0%)。统计分析证实了这一趋势,与10%DMSO相比,3.5%DMSO的生存能力显著较低。
在解冻后0小时BMCs生存能力的分析表
对解冻后4小时的生存能力的分析显示3个组相对于T0的生存能力百分比的适度降低,小于或等于12%。在此阶段,3.5%DMSO制剂与批次16Pi00230的10%DMSO制剂没有区别,但对于批次16Pi00231来说,明显较差。
在解冻后4小时BMCs存活能力的分析表
用CFSE试验分析细胞的增殖
该免疫标记方法的目的在于通过观察细胞内染色剂CFSE(羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯)的消失来测量细胞的增殖,所述细胞内染色剂通过将染色的亲本细胞分裂成2个子细胞而被稀释。它反映了细胞的功能状态。
对于每个批次,该试验都显示了所有组的解冻细胞增殖的能力。统计分析得出的结论是,在CS10和3.5%DMSO(仅用于批次16Pi00230)与10%DMSO中冷冻的组之间没有显著差异。然而,所测试的制剂和CS10给出了更一致的结果(副本之间低的方差),而10%DMSO对照变化很大(批次16Pi00230的标准差=14.5%)。
对于批次16Pi00231,冷冻在3.5%DMSO中的细胞的结果低于T0和10%DMSO条件。
BMCs解冻后增殖分析表
脱粒试验的分析
脱颗粒试验使得能够评估响应由珠子模拟的CD3-CD28活化信号,细胞(特别是CD8+细胞毒性效应群体)的免疫能力。
在相对于T0的所有冷冻条件下,脱粒细胞的百分比减少。
对于批次16Pi00230,不同条件相互之间的比较没有显示出显著差异,因为10%DMSO参考值也是高度可变的(=16.2±6.7)。
对于批次16Pi00231,在条件1和2的情况下,这种下降是适度且可接受的,与免疫能力下降剧烈的3.5%DMSO条件(从冷冻前的22.3%至6.1%)不同。对于第1组和第2组,增殖细胞的百分比是稳定的(大约20%)。
解冻后BMCs脱颗粒试验分析表
表型分析
它使得能够确定以百分比表示的BMC的细胞组成。在总细胞中:
·造血细胞(CD45+)
·非造血细胞杂质(CD45-)
在CD45+细胞中:
·CD45+/3+T淋巴细胞
·CD45+/3+/8+细胞毒性T淋巴细胞
·CD45+/3+/4+辅助T淋巴细胞
·CD45+/3+/16+和/或56+NK(自然杀伤细胞)
·CD45+/19+/3-B淋巴细胞
·CD45+/14+/3-单核细胞
BMC表型分析所获得的每批结果的总结表
T ly:T淋巴细胞。NK:自然杀伤细胞。B ly:B淋巴细胞
每个批次的结果都遵循相同的趋势。实际上,T0的值是接近的,并且能够分析两批的组合方式。下表将这些值表示为T0的百分比(n=2个批次的2个重复,即解冻条件的总共4个值,T0仅一式两份进行)。
表型分析表
均值表示为在两批次中获得的T0的%
根据所考虑的亚群,不同的制剂具有不同的保存特性:3.5%DMSO制剂对于保存单核细胞和B淋巴细胞是最有效的。观察到CD4和CD8T淋巴细胞减少(与T0相比-14.9%)。
NK的保存与制剂中DMSO的%相关。从中间3.5%DMSO制剂(75.0%)到10%DMSO制剂(84.2%)观察到剂量依赖性效应。含有10%DMSO的CS10条件与10%DMSO没有显著差异。
研究结论
本冷冻研究对源自2个不同健康人的细胞去除术环的2批BMCs进行冷冻研究。在所研究的标准中,结论是:
细胞的生存能力。BMCs的冷藏在3.5%DMSO制剂中是有效的(在3.5%DMSO中适度下降约10%)。在解冻后4小时获得的结果是令人满意的并且允许临床应用。
增殖试验(CFSE)。BMC在3.5%DMSO制剂中的冷冻不会不利地影响细胞的增殖能力。
脱粒试验。BMCs内T淋巴细胞群体的免疫能力相对变化且是患者依赖性的。第一批的结果是高度可变的,应该加以考虑(在所有情况下功能大大降低)。虽然解冻后获得的结果比T0获得的结果差,但T淋巴细胞保留了细胞毒性能力。
表型。3.5%DMSO冷冻制剂显示出特定的作用:它优先保存某些细胞群。实际上,3.5%DMSO制剂在保存NK中更为有效。
实施例3:使用根据本发明的制剂测试冷藏间充质干细胞(MSC)
制备以下制剂,命名为3.5%DMSO:
3.5%DMSO+1mM L-半胱氨酸+0.1M海藻糖+4%人血清白蛋白(HA)。
冷冻前需要在4℃下温育最多15分钟。
这种复杂的制剂与通过CRF(可编程冷冻器)进行的自动化温度下降循环相组合,该CRF能够根据限定的循环实现复杂的温度下降。低至-40℃时,细胞被认为是敏感的:温度的下降是缓慢的且逐渐的以能够形成规则的晶体。在此阈值以下,产品被认为是稳定的,并且温度下降迅速降到最高-150℃(气态或液态氮)的储存温度。
研究的背景
在研究期间,进行了2个循环,其特征如下表所示:
每个循环对应于源自不同供体的一批细胞。对于这两个循环,将来自ATCC的用于第1循环的MSC和来自Thermo Fisher Scientific的用于第2循环的MSC小瓶进行解冻。将细胞在数周内扩增,然后以以下浓度通过CRF冷冻:
·第1循环为1.2×106个细胞/ml。
·第2循环为2.5×106个细胞/ml。
为了证明冷冻制剂的有效性,进行了3组。对于每个组,将2个1ml小瓶(一式两份)解冻用于测试。
*CS10:Cryostor 10,商业冷冻制剂(STEMCELL Technologies)
**10%DMSO+4%HA。
评价标准
为了评估冷冻制剂的有效性,在冷冻前(称为T0)和解冻后进行下表中列出的各种选择性试验。将解冻细胞获得的结果与T0比较,并以相对于T0的%表示。
通过统计分析比较不同的组。参考制剂(第1组)是10%DMSO+4%HA。
在统计分析过程中,通过Fisher检验分析方差的一致性(F检验;如果p>0.05,一致方差)。然后用两个相等或不相等的方差观测值进行均值相等性的检验。如果p>0.05,均值没有显著差异。如果p<0.05,均值显著不同。
结果
细胞生存能力的分析
对解冻后生存能力的分析表明,所有被冷冻的组的试验条件与T0没有不同(值>T0的98%)。统计分析显示的差异是由于试验的可变性。
MSCs解冻后生存能力的总结表
(生存能力%和相对于T0的%)
细胞在室温下4小时后在其主容器及其冷冻剂制剂中的生存能力的分析使得能够评估细胞的解冻稳定性(模拟注射到患者体内之前的处理、运输和等待的真实条件)。它显示了三组的生存能力的稳定百分比。
在解冻后4h的MSC的生存能力的分析表
(生存能力%和相对于T0的%)
对于2个批次,解冻后4h,变化很小(在T0的92%和101%之间)。在比较分析3.5%DMSO制剂后,相对于参考(10%DMSO)以及阳性对照(CS10)没有显示出显著的差异。该制剂具有接近CS10的保存能力。
具体而言,10%DMSO条件是两批试验细胞之间变化最大的,而CS10制剂是最稳定的。
最后,不同制剂之间的差异很小,所以解冻后的生存能力不是决定性的标准。
表型分析
进行表型分析以确定解冻产物中MSCs群体的稳定性。对于2批(62535836和8900-101),所获得的百分比与T0没有显著差异。因此目的细胞的量不受冷冻/解冻过程的影响。
MSC表型分析获得的结果的总结表
(相对于T0的%)
细胞增殖分析
增殖试验的原理是在6孔板中接种50 000个细胞,并在不改变培养基的增殖条件下7天后计数获得的细胞数目。细胞的扩增阶段在与预冷冻培养阶段相同的培养基中进行。
对于2个循环,增殖试验在T0条件下失败。在第一种情况下,细胞莫名地脱落(压力),在第二种情况下,细胞停滞。由此,将在3.5%DMSO中配制的组仅与对照组(10%DMSO和CS10)进行比较。
MSC增殖试验获得的结果的总结表
每种解冻条件都保留细胞的增殖能力。统计分析没有显示出它们之间的任何显著差异。因此,3.5%DMSO制剂与参考是等效的。
研究结论
对来源于商业小瓶的以及再培养的2批人MSC进行的本研究表明:
细胞的生存能力。在细胞生存能力方面,MSC在3.5%DMSO制剂中的冷藏是有效的,因为它总是大于T0的98%。而且,它相当于CS10(阳性对照)。解冻后4h获得的结果是非常好的(不降低生存能力)并验证临床应用。
增殖试验。用不同的制剂冷冻MSC不影响细胞的增殖能力。但是,在不存在T0的情况下,这是不可能的。在3.5%DMSO中配制的细胞的扩增因数与对照没有差异。这证明了制剂与CS10(对照)的等效性。
表型。3.5%DMSO冷冻制剂完美地保留了目的细胞(MSC)的百分比。
将2批MSC以2种不同的方式培养,从ATCC接收的第一批在ATCC(ATCC培养基+生长试剂盒)推荐的条件下扩增1个半月,另一批来自Thermo Fischer,在DMEM+低葡萄糖浓度+10%胎牛血清(FCS)的条件下培养3周。这些差异对结果没有影响,因为对于两个循环趋势是相同的。
实施例4:用根据本发明的制剂测试冷藏成纤维细胞
制备以下制剂,命名为3.5%DMSO:
3.5%DMSO+1mM L-半胱氨酸+0.1M海藻糖+4%人血清白蛋白(HA)。
冷冻前需要在4℃下温育最多15分钟。
这种复杂的制剂与通过CRF(可编程冷冻器)进行的自动化温度下降循环相结合,该CRF能够根据限定的循环实现复杂的温度下降。低至-40℃时,细胞被认为是敏感的:温度的下降是缓慢的且逐渐的以能够形成规则的晶体。在此阈值以下,产品被认为是稳定的,并且温度下降迅速降到最高-150℃(气态或液态氮)的储存温度。
研究的背景
在研究期间,进行了2个循环,其特征如下表所示:
对于这2个循环,将来自不同健康患者的成纤维细胞小瓶解冻。扩增细胞,然后通过CRF以5×106细胞/ml的浓度冷冻。
为了证明冷冻制剂的有效性,进行了3组。对于每个组,将2个1ml小瓶解冻用于试验。
*CS10:Cryostor 10,商业冷冻制剂(STEMCELL Technologies)
**10%DMSO+4%HA。
评价标准
为了评估冷冻制剂的有效性,在冷冻前(T0)和解冻后(第1-3组)进行多种选择性试验,如下表所示。将解冻细胞获得的结果与T0比较,并以相对于T0的%表示。
通过统计分析比较不同的组。参考制剂(第1组)是10%DMSO+4%HA。
在统计分析过程中,通过Fisher检验进行方差一致性(F检验;如果p>0.05,一致方差)。在方差一致的情况下,进行两个均等方差观测值的均值相等性检验。在方差不一致的情况下,进行两种不同方差观测值的均值相等性检验。如果p>0.05,均值没有显著差异。如果p<0.05,均值显著不同。
结果
细胞生存能力的分析
解冻后的生存能力证实了所有组的冷冻有效性(>T0的99%)。
成纤维细胞解冻后生存能力的分析表
(生存能力%以及相对于T0的%)
细胞在室温下在其主容器中4小时后的生存能力的分析使得可以评估细胞的解冻稳定性(在注射到患者体内之前模拟处理、运输和等待的真实条件)。
成纤维细胞在解冻后4小时的生存能力的分析表
(生存能力%以及相对于T0的%)
在解冻后4h,两批细胞的存生存能力保持稳定(与T0没有显著差异)。制剂在室温下对细胞无毒性。
3.5%DMSO制剂与10%DMSO(参考)和CS10(阳性对照)具有相同的保存潜力,通过在统计分析过程中没有显著差异来阐明。
表型分析
进行表型分析以确定产物中成纤维细胞群体的稳定性。发现百分比相对于T0是稳定的。因此目的细胞的量不受冷冻解冻过程的影响。
成纤维细胞表型获得的结果的总结表(以相对于T0的%表示)
细胞增殖分析
增殖试验的原理在于在6孔板中每个平板接种50 000个细胞,并测量培养3天后获得的细胞数。
成纤维细胞增殖试验获得的结果总结表(相对于T0的%)
根据所获得的结果,解冻的细胞保持其增殖能力并且彼此之间不显示任何显著差异。
研究结论
因此,目前的冷冻研究是对来自不同供体的2批人成纤维细胞进行的。在所研究的标准中,结论是:
细胞的生存能力。在细胞生存能力方面,成纤维细胞在3.5%DMSO制剂中的冷藏是有效的,因为它总是大于T0的97%。而且,它相当于CS10(阳性对照)。在解冻后4h获得的结果是令人满意的(没有观察到生存能力降低)并且使得能够临床应用。
增殖试验。成纤维细胞的增殖能力取决于所讨论的批次。对于第一批,细胞不受冷冻的影响,这反映在对于三个组,扩增因数大于或等于T0。对于第二个循环,解冻细胞的扩增程度更好。
表型。3.5%DMSO冷冻制剂有效地保留了目的细胞(成纤维细胞)的百分比。
Claims (12)
1.一种组合物,其包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人白蛋白,
b)至少一种糖类,
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,和
d)除了肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的细胞,
所述肿瘤浸润性淋巴细胞是这样获得的:体外培养来自患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品的肿瘤浸润性淋巴细胞,所述培养包括在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现,然后刺激从出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞,最后是扩增受刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞。
2.权利要求1所述的组合物,其特征在于所述糖类选自单糖、二糖和三糖。
3.权利要求2所述的组合物,其特征在于所述糖类是选自海藻糖和蔗糖的二糖。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物,其特征在于所述人白蛋白相对于组合物的总重量以2至10重量%,优选2.5至6重量%的量存在。
5.权利要求1至4中任一项所述的组合物,其特征在于所述糖类以0.05M至1M,优选0.07M至0.5M的浓度存在。
6.权利要求1至5中任一项所述的组合物,其特征在于用于治疗目的的细胞选自免疫细胞,如NK细胞、单核细胞、B淋巴细胞、天然或遗传修饰的T淋巴细胞,例如调节性T淋巴细胞,细胞毒性T淋巴细胞,辅助T淋巴细胞和嵌合抗原受体(CAR)T淋巴细胞,人成肌细胞,造血干细胞,间充质干细胞,心脏细胞,成纤维细胞和所有其他天然或遗传修饰的细胞。
7.权利要求1至6中任一项所述的组合物,其特征在于其包含:
a)人白蛋白,优选2.5-6重量%的量,
b)海藻糖,优选浓度为0.05M至0.5M,
c)DMSO和L-半胱氨酸,优选分别以2-15重量%的量和0.5mM-2mM的浓度,和
d)除了肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的细胞,
所述肿瘤浸润性淋巴细胞是这样获得的:体外培养来自患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品的肿瘤浸润性淋巴细胞,所述培养包括在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现,然后刺激从出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞,最后是扩增受刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞。
8.一种除了肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的至少一种细胞样品的冷藏方法,包括以下步骤:
i)将用于治疗目的的细胞样品与下列物质混合:
a)人白蛋白,
b)至少一种糖类,和
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10,然后
ii)冷冻步骤i)中获得的混合物,
所述肿瘤浸润性淋巴细胞是这样获得的:体外培养来自患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品的肿瘤浸润性淋巴细胞,所述培养包括在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现,然后刺激从出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞,最后扩增受刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞。
9.权利要求8所述的冷藏方法,其特征在于所述冷冻ii)进行至-100℃至-180℃,优选-140℃至-160℃的温度。
10.权利要求8和9中任一项所述的冷藏方法,其特征在于通过将i)中获得的混合物放置在浸没在+4℃的异丙醇混合物中的容器中来进行冷冻ii),所有都达到-70℃和-100℃之间的温度。
11.权利要求8至10中任一项所述的冷藏方法,其特征在于通过可编程冷冻器进行所述冷冻ii)。
12.一种包含在生理上可接受的培养基中的:
a)人白蛋白,
b)至少一种糖类,和
c)DMSO和L-半胱氨酸或辅酶Q10的组合物的用途,用于除了肿瘤浸润性淋巴细胞以外的用于治疗目的的至少一种细胞样品的冷藏,
所述肿瘤浸润性淋巴细胞是这样获得的:体外培养来自患有3或4期黑素瘤的患者的运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品的肿瘤浸润性淋巴细胞,所述培养包括在取自运输中、淋巴结或转移性皮肤结节的样品中含有的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的出现,然后刺激从出现步骤产生的肿瘤浸润性淋巴细胞,最后是扩增受刺激的肿瘤浸润性淋巴细胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR1556167 | 2015-06-30 | ||
FR1556167A FR3038324B1 (fr) | 2015-06-30 | 2015-06-30 | Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique |
PCT/FR2016/051629 WO2017001782A1 (fr) | 2015-06-30 | 2016-06-30 | Procédé de cryoconservation de cellules a visée thérapeutique |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107809905A true CN107809905A (zh) | 2018-03-16 |
Family
ID=54848658
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680038095.3A Pending CN107809905A (zh) | 2015-06-30 | 2016-06-30 | 用于治疗目的的细胞的冷藏方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11412730B2 (zh) |
EP (1) | EP3316684B1 (zh) |
JP (1) | JP6879949B2 (zh) |
CN (1) | CN107809905A (zh) |
CA (1) | CA2990348C (zh) |
ES (1) | ES2762966T3 (zh) |
FR (1) | FR3038324B1 (zh) |
WO (1) | WO2017001782A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI788307B (zh) | 2016-10-31 | 2023-01-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 |
JP7125392B2 (ja) | 2016-11-17 | 2022-08-24 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | レムナント腫瘍浸潤リンパ球並びにそれを調製及び使用する方法 |
JP2020503351A (ja) | 2017-01-06 | 2020-01-30 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | カリウムチャネルアゴニストによる腫瘍浸潤リンパ球の増殖及びその治療的使用 |
JOP20190224A1 (ar) | 2017-03-29 | 2019-09-26 | Iovance Biotherapeutics Inc | عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي |
US11254913B1 (en) | 2017-03-29 | 2022-02-22 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
FR3074018B1 (fr) | 2017-11-27 | 2020-09-11 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique |
CN112120012B (zh) * | 2020-09-30 | 2022-03-22 | 广东康盾创新产业集团股份公司 | 一种car-t细胞冻存方法 |
AU2022274645A1 (en) * | 2021-05-14 | 2024-01-04 | Gi Cell, Inc. | Composition for nk cell cryopreservation, and cryopreservation formulation comprising same |
WO2023201369A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment |
WO2024106538A1 (ja) * | 2022-11-18 | 2024-05-23 | 株式会社ヘリオス | リンパ球の製造及び凍結保存方法、そのための洗浄液及び凍結保存液、並びに凍結保存したリンパ球からの移植用リンパ球の調製 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050026133A1 (en) * | 2002-01-31 | 2005-02-03 | Asahi Techno Glass Corporation | Cryopreservation medium for primate embryo stem cells and cryopreservation method |
WO2007025072A2 (en) * | 2005-08-22 | 2007-03-01 | Bioe, Inc. | Multi-lineage progenitor cells |
US20100158873A1 (en) * | 2006-09-15 | 2010-06-24 | Christian Pinset | Method for extracting and selecting cells |
CN104082277A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-10-08 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991012718A1 (en) | 1990-03-01 | 1991-09-05 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced cryopreservation with thermal hysteresis peptide |
US7129035B2 (en) | 2002-12-11 | 2006-10-31 | Cryolife, Inc. | Method of preserving tissue |
WO2005070120A2 (en) * | 2004-01-09 | 2005-08-04 | Serologicals Investment Company, Inc. | Cell culture media |
US20060058238A1 (en) | 2004-09-15 | 2006-03-16 | Lee Laurent-Applegate | Fetal skin cell protein compositions for the treatment of skin conditions, disorders or diseases and methods of making and using the same |
JP4588598B2 (ja) | 2004-09-24 | 2010-12-01 | セーレン株式会社 | 細胞凍結保存用組成物 |
US20060276464A1 (en) | 2005-05-13 | 2006-12-07 | Wyeth | Diarylsulfone sulfonamides and use thereof |
US8357531B2 (en) | 2007-07-03 | 2013-01-22 | Transgene S.A. | Immortalized avian cell lines |
NZ725201A (en) | 2014-04-25 | 2018-05-25 | Bluebird Bio Inc | Improved methods for manufacturing adoptive cell therapies |
FR3040396A1 (fr) * | 2015-06-30 | 2017-03-03 | Chu Nantes | Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur |
-
2015
- 2015-06-30 FR FR1556167A patent/FR3038324B1/fr active Active
-
2016
- 2016-06-30 CA CA2990348A patent/CA2990348C/fr active Active
- 2016-06-30 JP JP2017567728A patent/JP6879949B2/ja active Active
- 2016-06-30 WO PCT/FR2016/051629 patent/WO2017001782A1/fr active Application Filing
- 2016-06-30 US US15/737,469 patent/US11412730B2/en active Active
- 2016-06-30 EP EP16744445.4A patent/EP3316684B1/fr active Active
- 2016-06-30 ES ES16744445T patent/ES2762966T3/es active Active
- 2016-06-30 CN CN201680038095.3A patent/CN107809905A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050026133A1 (en) * | 2002-01-31 | 2005-02-03 | Asahi Techno Glass Corporation | Cryopreservation medium for primate embryo stem cells and cryopreservation method |
WO2007025072A2 (en) * | 2005-08-22 | 2007-03-01 | Bioe, Inc. | Multi-lineage progenitor cells |
US20100158873A1 (en) * | 2006-09-15 | 2010-06-24 | Christian Pinset | Method for extracting and selecting cells |
CN104082277A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-10-08 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
STEPHEN D.BIRD ET.AL.: ""L-Cysteine improves survival and growth of mesothelial cells after freezing"", 《CELL BIOLOGY INTERNATIONAL》 * |
刘建福 等: "《细胞工程》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 * |
李景泰 等: "《临床医学分子生物学现状和未来》", 31 May 1993, 中国科学技术出版社 * |
李贵新 等: "《生物治疗实验室质量控制与临床管理》", 31 January 2013, 人民军医出版社 * |
武峰 等: "《安全血液与输血检验技术》", 31 July 2007, 中国科学技术出版社 * |
韩瑞发 等: "《浅表膀胱肿瘤基础与临床》", 31 March 2004, 天津科学技术出版社 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3316684A1 (fr) | 2018-05-09 |
CA2990348C (fr) | 2023-08-29 |
ES2762966T3 (es) | 2020-05-26 |
JP6879949B2 (ja) | 2021-06-02 |
US20190000070A1 (en) | 2019-01-03 |
JP2018520676A (ja) | 2018-08-02 |
EP3316684B1 (fr) | 2019-09-18 |
FR3038324A1 (fr) | 2017-01-06 |
WO2017001782A1 (fr) | 2017-01-05 |
FR3038324B1 (fr) | 2020-10-30 |
US11412730B2 (en) | 2022-08-16 |
CA2990348A1 (fr) | 2017-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107809905A (zh) | 用于治疗目的的细胞的冷藏方法 | |
JP6876004B2 (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球の凍結保存方法 | |
Mahadevan et al. | Effect of cryoprotective media and dilution methods on the preservation of human spermatozoa | |
Buchanan et al. | Preservation of differentiation and clonogenic potential of human hematopoietic stem and progenitor cells during lyophilization and ambient storage | |
CN108617638A (zh) | 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用 | |
CN102669087A (zh) | 一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法 | |
WO2009120996A1 (en) | Mehtod, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
CN103732247A (zh) | 用于加工含有活细胞的生物药物的方法 | |
KR100953400B1 (ko) | 고농도 말초혈액단핵구의 항암 치료제 제조를 위한 장기간 냉동 보존 방법 | |
Clarke et al. | Improved post-thaw recovery of peripheral blood stem/progenitor cells using a novel intracellular-like cryopreservation solution | |
KR102350423B1 (ko) | 세포 동결 보존 제제 및 세포 소생 방법 | |
Luo et al. | The state of T cells before cryopreservation: Effects on post-thaw proliferation and function | |
CN105211052A (zh) | 一种培养后的nkt细胞的冻存液及其制备方法 | |
Coriell et al. | Historical development of cell and tissue culture freezing | |
CN108029679B (zh) | 一种用于冻存单个核细胞的冻存液 | |
ES2763030T3 (es) | Procedimiento de crioconservación de células con objetivo terapéutico | |
Rueda et al. | Evaluation of survival and functionality in frozen platelets | |
US20230148586A1 (en) | Low-temperature storage of biological samples | |
Christy et al. | Refrigerated human mesenchymal stromal cells as an alternative to cryostorage for use in clinical investigation | |
KR100569609B1 (ko) | 세포면역치료제의 제조를 위한 림프구 장기 보관 방법 | |
El-Naggar et al. | Effect of thawing rate and post-thaw culture on the cryopreserved fetal rat islets: functional and morphological correlation | |
RU2303631C1 (ru) | Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием | |
Kozlowska-Skrzypczak et al. | Analysis of the effect of cryoprotectant medium composition to viability of autologous hematopoietic cells collected by leukapheresis | |
Tonev et al. | Cytotoxic effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) on hematopoietic stem cells: Influence of the temperature and the incubation time | |
Barrett et al. | Gamete preservation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: French pitot Applicant after: LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES Address before: French Eli Juris Applicant before: LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES |