WO2024106538A1 - リンパ球の製造及び凍結保存方法、そのための洗浄液及び凍結保存液、並びに凍結保存したリンパ球からの移植用リンパ球の調製 - Google Patents

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WO2024106538A1
WO2024106538A1 PCT/JP2023/041479 JP2023041479W WO2024106538A1 WO 2024106538 A1 WO2024106538 A1 WO 2024106538A1 JP 2023041479 W JP2023041479 W JP 2023041479W WO 2024106538 A1 WO2024106538 A1 WO 2024106538A1
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WO
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cells
lymphocytes
solution
cryopreservation
aqueous solution
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Application number
PCT/JP2023/041479
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Inventor
日野　資弘
隆之 福田
雲翔 張
Original Assignee
株式会社ヘリオス
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for washing and cryopreserving lymphocytes such as T cells and natural killer cells (hereinafter sometimes abbreviated as "NK cells") that is useful in the medical field, a washing solution and cryopreservation solution therefor, a lymphocyte-containing composition washed and cryopreserved using the method or solution, a transplantation diluent for the lymphocyte-containing composition, a kit for preparing lymphocytes for transplantation that contains the lymphocyte-containing composition and the transplantation diluent, a method for preparing lymphocytes for transplantation using the same, and a lymphocyte preparation for transplantation obtained by the method.
  • lymphocytes such as T cells and natural killer cells
  • the washing solution and transplantation diluent contain a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions
  • the cryopreservation solution contains a physiological aqueous solution, preferably a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.
  • Cells involved in cancer immunity include lymphocytes such as T cells, NK cells, and natural killer T (NKT) cells.
  • lymphocytes such as T cells, NK cells, and natural killer T (NKT) cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • technologies for inducing their differentiation and technological advances such as genetic modification of cells
  • As cell medicines containing genetically modified immune cells those using CAR-T cells targeting CD19 (Kymriah and Yescarta) have already been approved.
  • NK cells have unique properties that differ from T cells, there are high expectations for immune cell therapy using NK cells, and various clinical trials are actually being conducted for cell medicines using modified NK cells.
  • lymphocytes such as T cells and NK cells from pluripotent stem cells
  • methods for expanding and culturing lymphocytes have been published on methods for inducing differentiation of lymphocytes such as T cells and NK cells from pluripotent stem cells, and methods for expanding and culturing lymphocytes.
  • the applicant has developed a technology for efficiently mass-producing NK cells that maintain high activity even after freezing and thawing by forming pluripotent stem cell spheres of an appropriate size through three-dimensional suspension culture, inducing differentiation of hematopoietic progenitor cells from the spheres by perfusion exchange of medium (continuous three-dimensional perfusion culture), and differentiating the hematopoietic progenitor cells obtained through three-dimensional suspension culture into NK cells, and has filed a patent application for this technology (Patent Document 10).
  • cryopreservation solution used was a cell culture medium to which a cryoprotectant had been added, but there were dozens of medium components that could contain substances harmful to the recipient, and after thawing, the cells had to be washed prior to transplantation, resulting in problems such as time loss and reduced cell recovery and survival rates.
  • washing and cryopreservation solutions that can wash cells before freezing to remove harmful components and maintain high cell recovery and viability even after freezing and thawing.
  • solutions based on physiological aqueous solutions such as physiological saline and Ringer's solution as washing and cryopreservation solutions.
  • HuSA human serum albumin
  • bicarbonate Ringer's solution in the washing and cryopreservation process of human mesenchymal stem cells can suppress the decrease in cell viability in each process.
  • a solution containing glucose and/or HuSA and bicarbonate is used as a preservation solution for storing cells in a non-frozen state (refrigerated or at room temperature) for a long period of time in order to avoid the use of highly concentrated and harmful cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide (DMSO) and to apply to cells such as NK cells that have low storage stability after cryopreservation (Patent Documents 2 and 3).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Patent Documents 2 and 3 there have been no reports of using bicarbonate solution as a washing solution before cryopreservation of lymphocytes, and no studies have investigated the effect of the washing solution on the recovery rate or viability of cells after freezing and thawing, rather than after washing.
  • cryopreservation solutions for lymphocytes that contain, in addition to DMSO, dextran, glucose, HuSA, bicarbonate, and some of the following physiological aqueous solutions (e.g., physiological saline, Ringer's solution) (Patent Documents 1, 5-9).
  • physiological aqueous solutions e.g., physiological saline, Ringer's solution
  • the object of the present invention is to provide a washing solution and cryopreservation solution for lymphocytes that can produce lymphocytes for transplantation that maintain high cell recovery rates and survival rates even after freezing and thawing and maintain high physiological activity.
  • Another object of the present invention is to provide a transplantation diluent that can maintain high cell survival rates even after thawing a frozen lymphocyte-containing composition obtained using the washing solution and cryopreservation solution and store the frozen lymphocyte-containing composition at room temperature until transplantation, and to provide a lymphocyte preparation that is more suitable for transplantation using a preparation kit for lymphocytes for transplantation that contains the lymphocyte-containing composition and the transplantation diluent.
  • the inventors conducted extensive research to achieve the above-mentioned objective, and as a result, they discovered that when lymphocytes that had been maintained and expanded were suspended and allowed to stand (simulating a washing process) in a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions, such as bicarbonate Ringer's solution, and then cryopreserved in a conventionally known cryopreservation solution, the cell recovery rate and cell viability after thawing and recovery culture compared to before cryopreservation were significantly increased compared to when the lymphocytes were suspended and allowed to stand in a physiological aqueous solution not containing bicarbonate ions.
  • bicarbonate ions such as bicarbonate Ringer's solution
  • cryopreservation solution containing various concentrations of dextran, glucose, DMSO, HuSA, and a physiological aqueous solution (e.g., physiological saline, bicarbonate Ringer's solution, etc.).
  • a physiological aqueous solution e.g., physiological saline, bicarbonate Ringer's solution, etc.
  • the cryopreservation solution containing each of the above components in a specific concentration range significantly improved the viable cell recovery rate after thawing compared to commonly used cryopreservation solutions.
  • lymphocytes were suspended in the cryopreservation solution containing bicarbonate Ringer's solution as a physiological aqueous solution and then allowed to stand at room temperature for 0-4 hours before freezing, the decrease in viable cell recovery rate after thawing and recovery culture over time due to standing at room temperature was significantly suppressed.
  • the inventors thawed frozen NK cells, diluted the cell suspension with various physiological aqueous solutions, and allowed to stand at room temperature for 0-4 hours. They found that the recovery rate of viable cells was significantly improved when a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions was used, compared to a physiological aqueous solution not containing said ions. Based on these findings, the present inventors conducted further research and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [Item 1] A method for washing lymphocytes, comprising washing the lymphocytes with an aqueous physiological solution containing bicarbonate ions.
  • [Item 2] Item 2. The method of item 1, wherein the lymphocyte is a T cell or a NK cell.
  • [Item 3] Item 3. The method according to item 1 or 2, wherein the aqueous physiological solution containing bicarbonate ions is bicarbonate Ringer's solution.
  • [Item 4] A method for cryopreserving lymphocytes, comprising suspending and freezing lymphocytes treated by the method according to any one of items 1 to 3 in a cryopreservation solution containing a physiological aqueous solution.
  • [Item 5] Item 5.
  • the physiological aqueous solution is a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution.
  • Item 6 Item 6.
  • the method according to Item 5, wherein the aqueous physiological solution containing bicarbonate ions is bicarbonate Ringer's solution.
  • a washing solution for lymphocytes comprising an aqueous physiological solution containing bicarbonate ions.
  • a lymphocyte cryopreservation solution comprising a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution, dextran, glucose, DMSO and human serum albumin.
  • Item 9 Item 9.
  • a lymphocyte-containing composition comprising lymphocytes treated with a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution and the cryopreservation solution according to Item 8.
  • Item 10 Item 10.
  • a kit for preparing lymphocytes for transplantation comprising the lymphocyte-containing composition according to Item 9 and a diluent for transplantation containing a bicarbonate ion-containing aqueous physiological solution.
  • Item 11 Item 10.
  • Item 12 Item 10.
  • a method for preparing lymphocytes for transplantation comprising diluting the lymphocyte-containing composition according to Item 9, which has been frozen and then thawed, with a transplantation diluent containing a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.
  • a transplantation diluent containing a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.
  • the washing solution and cryopreservation solution of the present invention maintain high cell recovery and survival rates even after freezing and thawing, and can produce lymphocytes for transplantation (e.g., NK cells, T cells, etc.) that maintain high physiological activity. Furthermore, the lymphocyte-containing composition and transplantation diluent of the present invention can maintain high cell survival rates even when stored at room temperature after thawing until transplantation, making it possible to provide a lymphocyte preparation that is more suitable for transplantation.
  • lymphocytes for transplantation e.g., NK cells, T cells, etc.
  • washing method of the present invention provides a method for washing lymphocytes (hereinafter, sometimes referred to as the "washing method of the present invention"), which comprises washing lymphocytes with a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.
  • washing refers to the operation of suspending cells in a liquid (i.e., washing solution) in order to remove substances (e.g., medium components) present in the surrounding environment (e.g., culture solution) of the cells before washing.
  • Washing of cells can be performed, for example, by removing the dispersing medium from the cells before washing (e.g., centrifugation, filtration, etc.) and suspending the recovered cells in the washing solution (repeat this operation as necessary), or by replacing the dispersing medium before washing with the washing solution using, for example, an automatic concentration washing device, and the manner of washing is not particularly limited.
  • lymphocytes to be subjected to the washing method of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include NK cells, T cells (e.g., cytotoxic T cells (CTLs), helper T cells, regulatory T cells, etc.), B cells, etc., but are preferably NK cells and T cells, more preferably NK cells.
  • Lymphocytes can be isolated from blood (e.g., peripheral blood, umbilical cord blood, etc.) collected from humans or other mammals (preferably humans) or mononuclear cells separated therefrom, using a standard method such as flow cytometry, with the expression of a surface antigen marker (e.g., CD3, CD4, CD8, etc. in the case of T cells, CD56, etc. in the case of NK cells) that is specifically expressed in the target lymphocyte as an index.
  • a surface antigen marker e.g., CD3, CD4, CD8, etc. in the case of T cells, CD56, etc. in the case of NK cells
  • lymphocytes can be induced to differentiate from lymphocyte precursor cells, including pluripotent cells.
  • lymphocyte precursor cells include iPS cells, embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells (EG cells), hematopoietic stem cells, multipotent progenitors (MPPs) that have lost the ability to self-replicate, myelo-lymphoid common progenitors (MLPs), myeloid precursor cells (MPs), granulocyte mononuclear precursor cells (GMPs), macrophage-dendritic cell precursor cells (MDPs), and dendritic cell precursor cells (DCPs).
  • Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are preferred.
  • a method for inducing differentiation of the precursor cells into lymphocytes various known differentiation induction methods can be appropriately selected and used.
  • a known method for inducing differentiation from human pluripotent stem cells into T cells is, for example, the method described in Timmermans, F. et al., J. Immunol., 2009, 182, 68879-6888.
  • human iPS cells established from human peripheral blood T lymphocytes can be induced to differentiate into T cells by, for example, the method described in Nishimura, T. et al., Cell Stem Cell, 2013, 12, 114-126.
  • NK cells NK cells
  • known methods for inducing differentiation from human pluripotent stem cells into NK cells include, for example, the methods described in WO 2020/086889, Biochem Biophys Res Commun. 515(1): 1-8 (2019), and Methods Mol Biol. 2048: 107-119 (2019).
  • T cells can be activated and expanded by standard methods from T cell-containing samples such as PBMCs or T cells induced to differentiate from lymphocyte precursor cells.
  • a molecule that interacts with a T cell surface molecule to promote T cell activation and/or proliferation can be added to the medium of a T cell-containing sample and cultured.
  • examples of such molecules include CD3, which conjugates with TCR and is responsible for signal transduction via TCR, and molecules that specifically bind to surface molecules known as costimulators for T cell activation, such as CD28, ICOS, CD137, OX40, CD27, GITR, BAFFR, TACI, BMCA, and CD40L, and have the function of transmitting activation/proliferation signals or co-signals into T cells.
  • antibodies against CD3 and/or antibodies against CD28 are used. These molecules may be used alone or in complexes (e.g., TransAct (Milteny Biotech), Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific)) bound to a carrier (e.g., Dynabeads® (ThermoFisher Scientific)).
  • TransAct Milteny Biotech
  • Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific
  • Dynabeads® ThermoFisher Scientific
  • NK cells can be activated and expanded by standard methods from T cell-containing samples such as PBMCs or NK cells induced to differentiate from lymphocyte precursor cells. Examples of such methods include, but are not limited to, those described in WO 2020/086889, Biochem Biophys Res Commun. 515(1): 1-8 (2019), and Methods Mol Biol. 2048: 107-119 (2019).
  • the applicant has developed a method for efficiently mass-producing NK cells that maintain high activity even after freezing and thawing by inducing differentiation of hematopoietic progenitor cells from pluripotent stem cell spheres through continuous three-dimensional perfusion culture, and differentiating the resulting hematopoietic progenitor cells into NK cells through three-dimensional suspension culture (Patent Application No. 2022-013646).
  • the method includes: (1) forming pluripotent stem cell spheres having an average particle size of 200 ⁇ m or more in a first medium; (2) inducing the pluripotent stem cell sphere formed in step (1) into a cell population containing hematopoietic progenitor cells by three-dimensional culture using a second culture medium; and (3) inducing the cell population containing hematopoietic progenitor cells obtained in step (2) into a cell population containing NK cells by three-dimensional culture using a third culture medium.
  • the method is characterized in that steps (1) to (3) are carried out by a three-dimensional perfusion culture method.
  • the three-dimensional suspension culture method is a cell culture method characterized by culturing suspended cells, spheres (spheroids), or carriers for three-dimensional culture with cells attached, while expanding them three-dimensionally using an agitator or shaker.
  • the perfusion culture method is a continuous culture method, and by supplying a certain amount of new medium to the culture solution in the culture vessel while simultaneously removing a certain amount of medium, it is possible to achieve the purpose of continuous medium exchange, which is to supply new nutrients and remove waste products. In this method, it is preferable to perform perfusion culture continuously.
  • Continuous perfusion culture means that the medium for the next process is supplied while removing the medium from the previous process, without inserting the washing process that is usually performed when changing the medium, by simply replacing the membrane between each process.
  • the separation membrane used during perfusion culture should desirably have a certain pore size and characteristics (e.g., hydrophobicity) that will not allow the target cell population to escape from the culture system.
  • Appropriate pore sizes include a pore size of 15 to 75 ⁇ m for step (1), a pore size of 45 to 225 ⁇ m for step (2), and a pore size of 0.2 to 10 ⁇ m for step (3).
  • the first medium in step (1) is not particularly limited as long as it is a culture medium used for the maintenance culture of pluripotent stem cells, and for example, a medium capable of feeder-free culture is used.
  • the medium capable of feeder-free culture includes a medium containing a ROCK inhibitor.
  • the second medium in step (2) is not particularly limited as long as it is a medium capable of inducing pluripotent stem cells into hematopoietic progenitor cells, and examples thereof include a medium containing vascular endothelial growth factor (VEGF), bone morphogenetic protein 4 (BMP4) and a glycogen synthase 3 ⁇ (GSK3 ⁇ ) inhibitor, a medium containing stem cell factor (SCF) and a transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ )/Smad inhibitor, a medium containing SCF and Flt3 ligand (Flt3L), and the like.
  • the third medium in step (3) is not particularly limited as long as it is a medium capable of inducing hematopoietic progenitor cells to NK cells, and examples thereof include a medium containing IL-15 and SCF.
  • the average particle size of the spheres in step (1) is usually 200 ⁇ m or more, specifically, is appropriately adjusted within the range of 200 to 600 ⁇ m.
  • the culture period required for sphere formation is, for example, preferably about 2 to 10 days from cell seeding, and more preferably about 4 to 7 days.
  • the culture period in step (2) is usually 5 to 20 days, and preferably about 10 to 18 days.
  • the culture period in step (3) is usually 20 to 60 days, and preferably about 25 to 40 days.
  • step (3) a step of expanding and culturing the NK cells obtained as step (4), or a step of maturing the NK cells can be further carried out.
  • the expansion and culturing step or the maturation step can be carried out by appropriately applying a known method.
  • T cells can be induced from pluripotent stem cells by carrying out a method for inducing differentiation of hematopoietic stem cells into T cells, which is known per se.
  • physiological aqueous solution refers to an isotonic solution in which the salt and sugar concentrations are adjusted with sodium, potassium, etc. so as to be approximately the same as the osmotic pressure of a body fluid (e.g., plasma) or a cellular fluid
  • isotonic solutions include physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffered saline (TBS), HEPES buffered saline, Ringer's solution, Hank's balanced salt solution (HBSS), 5% glucose aqueous solution, etc.
  • the bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution used in the irrigation method of the present invention may be any physiological aqueous solution containing salts of bicarbonate ions and various cations.
  • bicarbonate salts include sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, ammonium bicarbonate, calcium bicarbonate, etc.
  • Preferred examples of the bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution include bicarbonate Ringer's solution and HBSS. More preferred is bicarbonate Ringer's solution.
  • the "bicarbonate Ringer's solution” in this specification is a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions, sodium ions, potassium ions, calcium ions, and chloride ions as electrolytes, with a bicarbonate ion concentration of 22 to 31 mEq/L and a sodium ion concentration of 120 to 150 mEq/L.
  • the pH of the bicarbonate Ringer's solution may be 6.8 to 7.8.
  • the osmotic pressure ratio to physiological saline may be, but is not limited to, 0.9 to 1.1.
  • the bicarbonate Ringer's solution may further contain magnesium ions and/or citrate ions as electrolytes.
  • each electrolyte may be, for example, as follows, but are not limited to: Sodium ion 120-150 mEq/L Potassium ion 3.6-4.4 mEq/L Calcium ion 2.7-3.3 mEq/L Magnesium ion 0.9-2.2 mEq/L Chloride ion 100-125 mEq/L Bicarbonate ion 22-31 mEq/L Citrate ion 3.6-5.5 mEq/L Specific examples of such bicarbonate Ringer's solutions include the commercially available Bicanate (registered trademark; Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) and Bicarbon (registered trademark; AY Pharmaceuticals, Inc.).
  • each electrolyte in these solutions is as follows.
  • the composition (w/v %) of each component (salt) of these bicarbonate Ringer's solutions is as shown in Table 8.
  • (Vicanate (registered trademark)) Sodium ion 130 mEq/L Potassium ion 4 mEq/L Calcium ion 3 mEq/L
  • HBSS includes HBSS(-) which contains bicarbonate ions, sodium ions, potassium ions, chloride ions, and phosphate ions as electrolytes and has the electrolyte composition shown in Table 1, and HBSS(+) which further contains calcium ions and magnesium ions and has the electrolyte composition shown in Table 1.
  • HBSS(+) is more preferable.
  • the cleaning solution of the present invention may contain components other than the above electrolytes, such as, for example, electrolytes (buffers) other than the above, such as phosphate ions, lactate ions, acetate ions, etc., sugars, such as glucose, galactose, fructose, mannose, maltose, sucrose, etc., and proteins derived from living organisms, such as serum albumin (e.g., HuSA, BSA, etc.), serum globulin, etc.
  • electrolytes buffers
  • sugars such as glucose, galactose, fructose, mannose, maltose, sucrose, etc.
  • proteins derived from living organisms such as serum albumin (e.g., HuSA, BSA, etc.), serum globulin, etc.
  • the washing solution of the present invention is a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution that does not contain buffers such as phosphate ions, lactate ions, acetate ions, etc., sugars (e.g., glucose, etc.), or biological proteins (e.g., HuSA, etc.).
  • buffers such as phosphate ions, lactate ions, acetate ions, etc., sugars (e.g., glucose, etc.), or biological proteins (e.g., HuSA, etc.).
  • the method of washing lymphocytes with the washing solution of the present invention is not particularly limited, and can be performed, for example, by removing the dispersion medium (e.g., culture solution) of lymphocytes before washing by centrifugation, filtration, etc., and suspending the recovered lymphocytes in the washing solution of the present invention (repeating the operation as necessary).
  • the dispersion medium e.g., culture solution
  • an automatic concentration washing device that includes a cell filter composed of a hollow fiber membrane module or the like in a circuit and can feed a cell suspension and a washing solution into the circuit is used, and a series of operations of priming (filling the circuit with a washing solution), concentration (feeding a cell suspension into the circuit and removing medium components (e.g., low molecular weight, proteins, etc.) outside the membrane while circulating the cell suspension in the hollow fiber membrane), washing (feeding a washing solution into the circuit and replacing it with medium components), and recovery (recovering a cell concentrate from which medium components have been removed) are performed in a closed system, thereby making it possible to wash cells in a dispersed state (removing medium components).
  • Such an automatic concentrating and washing device is commercially available, and for example, the Kaneka Cell Concentrating and Washing System (manufactured by Kaneka Corporation) can be used.
  • the washing step can be carried out at about 4°C or room temperature.
  • the washing method of the present invention even if lymphocytes are suspended in the washing solution of the present invention and left to stand at room temperature for 4 hours, the decrease in viable cell recovery rate and cell viability after freezing and thawing and recovery culture is significantly suppressed compared to when lymphocytes are suspended in a physiological aqueous solution that does not contain bicarbonate ions, such as physiological saline. Therefore, the washing solution and washing method of the present invention are extremely useful for use in the washing step (medium component removal step) of lymphocytes after expansion culture.
  • the present invention also provides a method for cryopreserving lymphocytes (hereinafter, sometimes referred to as the "cryopreservation method of the present invention"), which comprises suspending and freezing lymphocytes treated by the above-mentioned washing method of the present invention in a cryopreservation solution containing a physiological aqueous solution.
  • cryopreservation method of the present invention comprises suspending and freezing lymphocytes treated by the above-mentioned washing method of the present invention in a cryopreservation solution containing a physiological aqueous solution.
  • washing cultured cells with bicarbonate Ringer's solution containing sugars such as glucose and/or HuSA
  • bicarbonate Ringer's solution containing sugars such as glucose and/or HuSA
  • the present inventors have made the surprising discovery for the first time that washing lymphocytes with a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions (preferably containing neither sugars nor HuSA) improves the cell recovery rate and viability after thawing and recovery culture compared to washing with a physiological aqueous solution not containing bicarbonate ions, even when the lymphocytes are subsequently cryopreserved under the same conditions.
  • the lymphocytes obtained by the washing method of the present invention have novel and exceptionally remarkable unique characteristics compared to lymphocytes obtained by conventional washing methods, but it is impossible or almost impractical to distinguish the two by structure or physical properties.
  • the physiological aqueous solution used in the cryopreservation method of the present invention is not particularly limited as long as it improves the recovery rate of live cells after thawing when lymphocytes obtained by the washing method of the present invention are suspended in a cryopreservation solution containing the physiological aqueous solution and cryopreserved.
  • the physiological aqueous solution include any physiological aqueous solution such as those exemplified in the washing method of the present invention, but preferably, physiological saline or a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions is used, and physiological saline or bicarbonate Ringer's solution is more preferred.
  • the concentration of the physiological aqueous solution in the cryopreservation solution used in the cryopreservation method of the present invention is, for example, in the case of physiological saline, for example, but not limited to, 25-50% (v/v), preferably 30-45% (v/v), more preferably 32-41% (v/v).
  • its concentration in the cryopreservation solution is, for example, but not limited to, 35-75% (v/v), preferably 40-70% (v/v), more preferably 43-67% (v/v).
  • the cryopreservation solution used in the cryopreservation method of the present invention preferably contains one or more cryoprotectants.
  • cryoprotectants include, but are not limited to, dextran, DMSO, hydroxyethyl starch (HES), ethylene glycol, glycerol, and trehalose. Dextran and DMSO are preferred.
  • Dextran is a polysaccharide (C 6 H 10 O 5 ) n consisting of D-glucose and having an ⁇ 1 ⁇ 6 bond as the main chain.
  • the molecular weight of dextran there is no particular limitation on the molecular weight of dextran as long as it does not penetrate into cells, and examples of the molecular weight include a weight average molecular weight (Mw) of 40,000 (Dextran 40) to 70,000 (Dextran 70).
  • Mw weight average molecular weight
  • Dextran 40 to 70,000
  • Dextran can be produced by known methods such as chemical synthesis, production by microorganisms, and production by enzymes, and commercially available products may also be used. Examples of commercially available dextran include Dextran 40 (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) and Dextran 70 (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.).
  • Dextran or its derivatives may be in the form of a free form or a salt.
  • salts include acid addition salts with inorganic acids such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, and acetate, acid addition salts with organic acids such as propionate, toluenesulfonate, succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, and malate, metal salts such as sodium salt, potassium salt, and calcium salt, and basic salts such as ammonium salt and alkylammonium salt. These salts may form hydrates or solvates, and may be used alone or in combination of two or more.
  • inorganic acids such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, and acetate
  • organic acids such as propionate, toluenesulfonate, succinate, oxa
  • the concentration of dextran contained in the cryopreservation solution is, for example, but not limited to, 3-12% (w/v), preferably 3-11% (w/v), and more preferably 3.5-10.5% (w/v).
  • the preferred concentration range may vary depending on the type of physiological aqueous solution used.
  • DMSO dimethyl methacrylate
  • concentration of DMSO contained in the cryopreservation solution is, for example, but not limited to, 3-15% (w/v), preferably 5-12% (w/v), and more preferably 7.5-12% (w/v).
  • concentration range may vary depending on the type of physiological aqueous solution used.
  • the cryopreservation solution used in the cryopreservation method of the present invention may contain one or more sugars.
  • sugars include, but are not limited to, hexoses such as allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, precose, fructose, sorbose, tagalose, fucose, fuculose, and rhamnose, and other monosaccharides, pentoses such as ribulose, xylulose, ribose, arabinose, xylose, and lyxose, and other disaccharides such as sucrose and maltose, oligosaccharides such as raffinose and stachyose, and polysaccharides such as starch and glycogen. Glucose is preferred.
  • the concentration of sugars contained in the cryopreservation solution is, for example, but not limited to, 0.03-1.2% (w/v), preferably 0.04-0.8% (w/v), and more preferably 0.05-0.7% (w/v).
  • the preferred concentration range may vary depending on the type of physiological aqueous solution used.
  • the cryopreservation solution used in the cryopreservation method of the present invention may contain one or more proteins.
  • proteins include, but are not limited to, plasma-derived proteins such as serum albumin (e.g., HuSA, bovine serum albumin (BSA)) and serum globulins. HuSA is preferred.
  • the plasma-derived protein may be purified from animal plasma or recombinantly produced.
  • the concentration of protein contained in the cryopreservation solution is, for example, but not limited to, 0.5-5% (w/v), preferably 1-4% (w/v), and more preferably 1.2-3.5% (w/v).
  • the preferred concentration range may vary depending on the type of physiological aqueous solution used.
  • the cryopreservation solution used in the cryopreservation method of the present invention contains a physiological aqueous solution selected from physiological saline or bicarbonate Ringer's solution, dextran, DMSO, glucose and HuSA.
  • the composition of the cryopreservation solution is as follows: Physiological saline 30-45% (v/v) Dextran 7-11% (w/v) Glucose 0.04-0.8% (w/v) DMSO 5-12% (v/v) HuSA 1-4% (w/v); Preferably, Physiological saline 32-41% (v/v) Dextran 8-10% (w/v) Glucose 0.04-0.7% (w/v) DMSO 5-11% (v/v) HuSA 1.5-3% (w/v) It could be.
  • the composition of the cryopreservation solution is as follows: Bicarbonate Ringer's solution 40-70% (v/v) Dextran 3-11% (w/v) Glucose 0.04-0.8% (w/v) DMSO 5-12% (v/v) HuSA 1-4% (w/v); Preferably, Bicarbonate Ringer's solution 43-67% (v/v) Dextran 3.5-10.5% (w/v) Glucose 0.05-0.7% (w/v) DMSO 7.5-12% (v/v) HuSA 1.2-3.54% (w/v) It could be.
  • cryopreservation solution of the present invention provides a lymphocyte cryopreservation solution (hereinafter sometimes referred to as the "cryopreservation solution of the present invention") comprising a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution, dextran, glucose, DMSO and HuSA.
  • the components of the cryopreservation solution of the present invention namely the bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution, dextran, glucose, DMSO and HuSA, can be those described for the cryopreservation method of the present invention.
  • the bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution is preferably bicarbonate Ringer's solution.
  • the composition of the cryopreservation solution of the present invention is preferably as follows.
  • Bicarbonate Ringer's solution 40-70% (v/v) Dextran 3-11% (w/v) Glucose 0.04-0.8% (w/v) DMSO 5-12% (v/v) HuSA 1-4% (w/v); More preferably, Bicarbonate Ringer's solution 43-67% (v/v) Dextran 3.5-10.5% (w/v) Glucose 0.05-0.7% (w/v) DMSO 7.5-12% (v/v) HuSA 1.2-3.5% (w/v)
  • the washing solution is removed from the lymphocyte cell concentrate obtained by carrying out the washing method of the present invention, and the lymphocyte cell concentrate is resuspended in any of the cryopreservation solutions described above.
  • the cell concentrate can be collected in a centrifuge tube or the like, the cells are centrifuged to form a pellet, and then the cryopreservation solution can be added to suspend the cells.
  • the washing solution can be continuously replaced with the cryopreservation solution by simultaneously feeding the cryopreservation solution and withdrawing the washing solution.
  • the obtained cell suspension is placed in a cryopreservation tube, frozen in a freezer at -80°C, and then stored in a nitrogen tank in gas or liquid phase, but is not limited thereto.
  • the cell suspension is dispensed into cryopreservation vials using an automatic dispenser, and the freezing process can be optimized by performing programmed freezing using a freezer that can control the cooling rate, for example.
  • the cryopreservation solution is required not only to protect the cells from damage during cryopreservation and thawing, but also to stably preserve the cells at about 4°C or room temperature from the time when the cells are resuspended in the cryopreservation solution after washing until the freezing process is started.
  • cryopreservation method and cryopreservation solution of the present invention are extremely useful for cryopreservation of lymphocytes.
  • the frozen lymphocyte-containing composition obtained by the above-mentioned cryopreservation method of the present invention has a significantly improved recovery rate of live cells and cell survival rate after thawing and recovery culture, as compared with the case of using an existing cryopreservation solution.
  • the lymphocyte-containing composition has an advantageous effect as lymphocytes for transplantation.
  • the present invention also provides a lymphocyte-containing composition (hereinafter, sometimes referred to as "lymphocyte-containing composition of the present invention") comprising lymphocytes treated with a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution and the above-mentioned cryopreservation solution of the present invention.
  • lymphocyte-containing composition of the present invention comprising lymphocytes treated with a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution and the above-mentioned cryopreservation solution of the present invention.
  • the frozen lymphocyte-containing composition obtained through the washing method and cryopreservation method of the present invention was thawed, diluted with a diluent for transplantation containing a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions, and allowed to stand at room temperature for 4 hours, after which recovery culture was performed.
  • the cell viability after culture was evaluated, and a higher cell viability was obtained compared to when the composition was diluted with a physiological aqueous solution not containing bicarbonate ions (e.g., physiological saline, Ringer's acetate).
  • a physiological aqueous solution not containing bicarbonate ions e.g., physiological saline, Ringer's acetate.
  • the physiological aqueous solution containing bicarbonate ions is extremely useful as a transplant medium.
  • the present invention also provides a transplant diluent for the lymphocyte-containing composition of the present invention, which contains a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.
  • a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions any solution used in the washing solution of the present invention can be appropriately selected and used, but preferably it is Ringer's bicarbonate solution.
  • the present invention provides a kit for preparing lymphocytes for transplantation, which contains the lymphocyte-containing composition of the present invention and a diluent for transplantation containing a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.
  • the lymphocyte-containing composition may be provided in a frozen state.
  • the lymphocyte-containing composition may be transported from the CPC to the hospital in a frozen state, and after thawing, the lymphocyte-containing composition may be diluted and suspended in a transplantation diluent containing a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution to prepare a lymphocyte preparation for transplantation, which may be stably maintained at room temperature until transplantation.
  • the lymphocyte-containing composition may be diluted and suspended in a transplantation diluent containing a bicarbonate ion-containing physiological aqueous solution immediately after thawing in the CPC, and the lymphocytes may be transported to the hospital in a non-frozen state at room temperature, and transplantation may be performed immediately after arrival.
  • the present invention also provides a method for preparing lymphocytes for transplantation, which comprises diluting the lymphocyte-containing composition of the present invention, which has been cryopreserved and then thawed, with a diluent for transplantation containing a physiological aqueous solution containing bicarbonate ions.Furthermore, the present invention provides a lymphocyte preparation for transplantation obtained by said method.
  • the thus obtained lymphocyte preparation for transplantation can be administered to a patient, such as a cancer patient, using a method known per se, such as an administration form and dosage used in adoptive immunotherapy or donor lymphocyte infusion therapy.
  • Example 1 Production of iPS cell-derived NK cells Human umbilical cord blood-derived iPS cell stock was thawed, seeded in a flask, and cultured at 37°C and 5% CO2 , after which the cells were collected and seeded in a three-dimensional culture device. After seeding, perfusion culture was performed through a membrane filter to form 3D spheres of a certain size. Thereafter, a differentiation induction medium containing additive factors such as BMP4 was added to the cells, and 3D culture by perfusion culture was continued for 12-17 days to induce HPCs.
  • a differentiation induction medium containing additive factors such as BMP4 was added to the cells, and 3D culture by perfusion culture was continued for 12-17 days to induce HPCs.
  • HPCs were seeded in a three-dimensional culture device using an NK differentiation induction medium (AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific) with FBS added at a concentration of 5%, IL-15, IL-7, SCF, and Flt3L added to a final concentration of 50 ng/mL), and perfusion culture was performed for about 40 days to produce a large amount of NK cells with high physiological activity.
  • NK differentiation induction medium AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific) with FBS added at a concentration of 5%, IL-15, IL-7, SCF, and Flt3L added to a final concentration of 50 ng/mL
  • Example 2 Comparison of washing solutions in lymphocyte washing process (1) Preparation of NK cells The NK cells obtained in Example 1 were centrifuged at 300xg for 5 minutes, the medium supernatant was removed, and the cells were collected and suspended in five types of physiological aqueous solutions [(1) physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory), (2) Veen F (acetate Ringer's solution; Fuso Pharmaceutical), (3) Hespander (lactate Ringer's solution with added hydroxyethyl starch and glucose; Otsuka Pharmaceutical Factory), (4) HBSS(+) (balanced salt solution), (5) HBSS(-) (balanced salt solution)] to a concentration of 2.2 x 106 cells/mL (the electrolyte composition of each physiological aqueous solution is shown in Table 1). The NK cell suspension was placed in a 15 mL centrifuge tube and allowed to stand at room temperature. The standing treatment was used to simulate the process time of the concentration washing process, with 0 hours set as the comparative example and
  • the bicarbonate ion in the balanced salt solution HBSS is not contained in "physiological saline,” “acetated Ringer's solution,” or “lactated Ringer's solution with added hydroxyethyl starch and glucose.”
  • NK cells were thawed and reseeded to 1.0 x 106 cells/mL in a 6-well plate using the medium used for producing NK cells (AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher Scientific) supplemented with FBS at a concentration of 5%, and IL-15, IL-7, SCF, and Flt3L at a final concentration of 50 ng /mL).
  • AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher Scientific) supplemented with FBS at a concentration of 5%, and IL-15, IL-7, SCF, and Flt3L at a final concentration of 50 ng /mL).
  • Recovery culture was then carried out in an incubator at 37°C and 5% CO2 for 4 days.
  • the viable cell density in the well was then measured, and the viable cell recovery rate (see formula (I)) and cell viability were calculated.
  • Viable cell recovery rate (total number of viable cells after thawing and culturing / total number of viable cells frozen and
  • Example 3 Comparison of washing solutions in lymphocyte concentration washing process (1) Preparation of NK cell suspension and static treatment NK cells obtained in Example 1 were centrifuged at 300xg for 5 minutes, and the culture medium supernatant was removed and collected. The cells were then suspended in three types of physiological aqueous solutions [(1) physiological saline, (2) Lactec (lactate Ringer's solution; manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory), (3) Bicanate (bicarbonate Ringer's solution; manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory)] to a concentration of 2.2 x 106 cells/mL (the electrolyte composition of each physiological aqueous solution is shown in Table 3).
  • physiological aqueous solutions (1) physiological saline, (2) Lactec (lactate Ringer's solution; manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory), (3) Bicanate (bicarbonate Ringer's solution; manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory)] to a concentration of 2.2 x 106 cells/mL (the electrolyte composition of each physiological a
  • the NK cell suspension was placed in a 15mL centrifuge tube and allowed to stand at room temperature.
  • the static treatment was used to simulate the process time of the concentration washing process, with 0 hours set as the comparative example and 2 and 4 hours set as the examples.
  • Bicanate which is bicarbonate Ringer's solution, contains bicarbonate ions.
  • NK cells were thawed and reseeded in a 6-well plate at 1.0 x 10 6 cells/mL in the medium used for producing NK cells in Example 1 (AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher Scientific) with FBS added at a concentration of 5%, IL-15, IL-7, SCF and Flt3L added at a final concentration of 50 ng/mL), and recovery culture was performed in an incubator at 37 °C and 5% CO 2 for 3 days. Thereafter, the viable cell density in the well was measured, and the viable cell recovery rate (see formula (I)) and cell viability were calculated. The results are shown in Table 4.
  • Example 4 Cryopreservation solution for lymphocytes (1) Mixing of NK cell suspension and cryopreservation solution and freezing The culture solution containing NK cells obtained in Example 1 was centrifuged at 300xg for 5 minutes, and the medium supernatant was removed. The NK cell precipitate was loosened by tapping and suspended in physiological saline or bicarbonate Ringer's solution, and then cryopreservation solutions of the compositions shown in Table 5 or Table 6 were added and mixed well. After adding the cryopreservation solutions, each cell suspension was divided into freezing containers, transferred to cryopreservation containers such as Mr. Frosty (manufactured by Nalgene) or BICELL, and frozen at -80°C. To compare the performance of the cryopreservation solutions, cells suspended in STEM-CELLBANKER (registered trademark) GMP grade (SCB) were prepared and cryopreserved as a control sample.
  • STEM-CELLBANKER registered trademark
  • GMP grade SCB
  • NK cells after cryopreservation After thawing the frozen NK cells obtained in the above step (1), they were suspended in the medium used for producing NK cells in Example 1 (AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher Scientific) with FBS at a concentration of 5%, and IL-15, IL-7, SCF, and Flt3L at a final concentration of 50 ng/mL) and reseeded in a 12-well plate at 1.0 x 10 6 cells/mL. Then, recovery culture was performed for 3 days in an incubator under conditions of 37°C and 5% CO 2.
  • AIM V Serum Free Medium Thermo Fisher Scientific
  • compositions were: physiological saline; 32.7-40.8% (v/v), Dextran40 (Dex40; manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.); 8.06-9.68% (w/v), Glucose (manufactured by Terumo Corporation); 0.045-0.675% (w/v), CryoSure DMSO (DMSO; manufactured by WAK-Chemie Medical GmbH); 6.0-10.0% (v/v), and human serum albumin (HuSA; manufactured by Japan Blood Products Organization); 1.75-2.75% (w/v). (Table 5)
  • Example 5 Examination of cryopreservation solution for the temporal stability of NK cells (1) Mixing of NK cell suspension and cryopreservation solution and freezing The culture solution containing NK cells prepared in Example 1 was centrifuged at 300xg for 5 minutes, and the medium supernatant was removed. The NK cell precipitate was dissolved by tapping and suspended in physiological saline or bicarbonate Ringer's solution, and then cryopreservation solutions of the compositions shown in Table 7 were added and mixed well. The cell suspension to which the cryopreservation solution was added was divided into freezing containers and left to stand at room temperature for the desired time (1, 2, or 4 hours), and then transferred to cryopreservation containers (Mr. Frosty or BICELL) and frozen at -80°C.
  • Mr. Frosty or BICELL cryopreservation containers
  • Example 6 Dilution of NK cells after freezing and thawing After thawing the NK cells, 0.1 mL of the cell suspension was diluted and suspended in 10 times the amount of each physiological aqueous solution, and the stability was evaluated after standing at room temperature for 1, 2, and 4 hours. A medium for recovery culture was used as a control for the physiological aqueous solution. After standing, the cell suspension was centrifuged at 300xg for 5 minutes to remove the supernatant, and then resuspended in 2 mL of the medium for NK cell expansion culture of Example 1, and 1.9 mL was seeded on a 12-well plate, and recovery culture was performed in an incubator at 37°C and 5% CO2 for 3 days.
  • the viable cell density in the well was then measured, and the number of viable cells was counted.
  • the physiological aqueous solutions used in the study were physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory), Veen D (acetate Ringer's solution; Fuso Pharmaceutical), Veen F (acetate Ringer's solution; Fuso Pharmaceutical), Bicanate (bicarbonate Ringer's solution; Otsuka Pharmaceutical Factory), and Bicarbon (bicarbonate Ringer's solution; AY Pharmaceuticals) (the compositions of each physiological aqueous solution are shown in Table 8).
  • the washing method and cryopreservation method of the present invention maintain a high cell recovery rate and survival rate even after freezing and thawing, and can produce lymphocytes for transplantation (e.g., NK cells, T cells, etc.) that maintain high physiological activity. Furthermore, the lymphocyte-containing composition and transplantation diluent of the present invention can maintain a high cell survival rate even when stored at room temperature after thawing until transplantation, and can provide a lymphocyte preparation that is more suitable for transplantation. Therefore, the present invention is extremely useful in cellular immunotherapy using lymphocytes, including cancer immunotherapy.

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Abstract

本発明は、リンパ球を炭酸水素イオン含有生理的水溶液で洗浄することを含む、リンパ球の洗浄方法；当該方法により得られたリンパ球を、生理的水溶液を含有する凍結保存液に懸濁し凍結することを含む、リンパ球の凍結保存方法；炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有してなる、リンパ球用洗浄液；炭酸水素イオン含有生理的水溶液、デキストラン、グルコース、DMSO及びヒト血清アルブミンを含有してなる、リンパ球用凍結保存液；炭酸水素イオン含有生理的水溶液で処理されたリンパ球と、前記凍結保存液とを含有してなる、リンパ球含有組成物；該リンパ球含有組成物と、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液とを含む、移植用リンパ球の調製用キット等を提供する。

Description

リンパ球の製造及び凍結保存方法、そのための洗浄液及び凍結保存液、並びに凍結保存したリンパ球からの移植用リンパ球の調製
　本発明は、医療分野において有用なT細胞やナチュラルキラー細胞（以下、「NK細胞」と略記する場合がある）等のリンパ球の洗浄及び凍結保存方法、そのための洗浄液及び凍結保存液、当該方法又は溶液を用いて洗浄され、凍結保存されるリンパ球含有組成物、該リンパ球含有組成物のための移植用希釈液、該リンパ球含有組成物と該移植用希釈液を含む移植用リンパ球の調製用キット、それを用いた移植用リンパ球の調製方法、並びに当該方法により得られる移植用リンパ球製剤等に関する。当該洗浄液及び移植用希釈液は炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有し、当該凍結保存液は、生理的水溶液、好ましくは炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する。
　がん免疫に関与する細胞としては、T細胞、NK細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞などのリンパ球が挙げられる。近年、人工多能性幹細胞（iPS細胞）とその分化誘導法の開発、細胞の遺伝子改変法等の技術発展により、iPS細胞等の多能性幹細胞を遺伝子改変し目的の免疫細胞へ分化誘導することで、高い機能を付与された免疫細胞を製造することができるようになった。遺伝子改変された免疫細胞を含む細胞医薬品として、CD19を標的としたCAR-T細胞によるもの（Kymriah及びYescarta）が既に承認されている。一方、NK細胞はT細胞とは異なる独自の性質を有していることから、NK細胞を用いた免疫細胞療法にも期待が高まっており、実際に改変NK細胞を用いた細胞医薬品を対象とする様々な臨床試験が実施されている。
　免疫細胞を細胞医薬品として利用するには、大量の免疫細胞を調製する必要がある。多能性幹細胞からT細胞やNK細胞等のリンパ球を分化誘導する方法やリンパ球を拡大培養する方法についても、数多くの報告がなされている。例えば、本出願人は、三次元浮遊培養により好適なサイズの多能性幹細胞スフェアを形成させ、培地交換を灌流により行う（連続的に三次元灌流培養する）ことで、該スフェアから造血前駆細胞を分化誘導し、得られた造血前駆細胞を三次元浮遊培養してNK細胞に分化させることにより、凍結・解凍後も高い活性が維持されるNK細胞を効率よく大量に製造し得る技術を開発し、特許出願している（特許文献１０）。
　移植用細胞の培養はGMPレベルで実施する必要があるので、免疫細胞を細胞医薬品として利用する場合、細胞調製施設（CPC）で製造し凍結保存した細胞を病院に輸送し、病院内で解凍して移植用媒体に懸濁・希釈した後に、手術室に持ち込み移植を実施するのが一般的である。凍結保存液としては、細胞培養用の培地に凍害保護剤を添加したものが用いられていたが、数十種類にも及ぶ培地成分の中にはレシピエントに対して有害なものが含まれているおそれがあり、解凍後、移植に先立って細胞を洗浄することが必要になり、時間のロスや細胞の回収率及び生存率の低下といった問題があった。
　それらの課題に対し、凍結前に細胞を洗浄して有害な成分を除去し、凍結・解凍後も高い細胞の回収率及び生存率を維持し得る洗浄液及び凍結保存液の開発が進められてきた。洗浄液及び凍結保存液として、生理食塩水やリンゲル液等の生理的水溶液をベースとする溶液を用いた報告がある。例えば、ヒト間葉系幹細胞の洗浄及び凍結保存工程で、ヒト血清アルブミン（HuSA）及び重炭酸リンゲル液を含む溶液を用いることにより、「各工程」における細胞の生存率の低下を抑制し得ることが報告されている（特許文献１）。また、ジメチルスルホキシド（DMSO）等の高濃度で有害な凍結保護剤の使用の回避や、NK細胞等の凍結保存後の保存安定性が低い細胞への適用を目的として、グルコース及び／又はHuSAと重炭酸塩とを含む溶液を、細胞を非凍結状態（冷蔵ないし常温）で長時間保存するための保存液として使用することが報告されている（特許文献２、３）。しかしながら、リンパ球の凍結保存前の洗浄液として重炭酸塩溶液を用いた報告例はなく、また、洗浄後ではなく、凍結解凍後の細胞の回収率や生存率への洗浄液の影響を調べた例は皆無であった。
　リンパ球用の凍結保存液としては、DMSOの他、デキストラン、グルコース、HuSA、重炭酸塩及び生理的水溶液（例、生理食塩水、リンゲル液）のうちの一部を含有する溶液を用いた報告例がある（特許文献１、５－９）。しかしながら、前記のすべての成分を含有する又は該成分からなる凍結保存液は開示されていない。
国際公開第2009/057537号 特開2008-104407号公報 国際公開第2013/115322号 特開2018-138565号公報 国際公開第2011/021618号 特開2000-201672号公報 特開2018-183161号公報 国際公開第2018/084228号 中国特許出願公開第112868642号公報 国際公開第2023/145922号
　上記のように、移植用リンパ球の製造のために、凍結・解凍後も高い細胞の回収率及び生存率を維持し得る洗浄液及び凍結保存液が鋭意開発されてきたが、必ずしも満足のいくものとはいえなかった。特に移植用リンパ球の洗浄工程に着目し、凍結・解凍後の高い細胞回収率および細胞生存率を維持・向上させることは想定されていなかった。従って、本発明の目的は、凍結・解凍後も高い細胞の回収率及び生存率を維持し、かつ高い生理活性を維持した移植用リンパ球を製造し得る、リンパ球の洗浄液及び凍結保存液を提供することである。また別の本発明の目的は、当該洗浄液及び凍結保存液を用いて得られた凍結リンパ球含有組成物を解凍後、移植までの間、室温保存しても高い細胞生存率を維持し得る移植用希釈液を提供し、該リンパ球含有組成物と該移植用希釈液とを含む移植用リンパ球の調製用キットを用いて、移植により適したリンパ球製剤を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、維持増幅培養したリンパ球を、重炭酸リンゲル液等の炭酸水素イオンを含有する生理的水溶液に懸濁・静置（洗浄工程を模倣）した後、従来公知の凍結保存液にて凍結保存すると、驚くべきことに、凍結保存前に対する解凍後及び回復培養後の細胞回収率及び細胞生存率が、炭酸水素イオンを含有しない生理的水溶液に懸濁・静置した場合に比べて顕著に増大することを見出した。
　次に、本発明者らは、維持増幅培養したリンパ球を、デキストラン、グルコース、DMSO、HuSA及び生理的水溶液（例、生理食塩水、重炭酸リンゲル液等）を種々の濃度で含有する凍結保存液に懸濁して凍結保存したところ、前記各成分をそれぞれ所定の濃度範囲で含有する凍結保存液は、汎用されている凍結保存液に比べて、解凍後の生細胞回収率を顕著に向上させた。また、生理的水溶液として重炭酸リンゲル液を含有する当該凍結保存液に懸濁後、凍結保存前に室温で0-4時間静置した場合、室温静置による経時的な解凍・回復培養後の生細胞回収率の低下が顕著に抑制された。
　さらに、本発明者らは、移植用媒体（希釈液）としての生理的水溶液の効果を検討すべく、凍結NK細胞を解凍後、細胞懸濁液を種々の生理的水溶液で希釈して室温で0-4時間静置したところ、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を用いた場合、当該イオンを含有しない生理的水溶液に比べて、生細胞の回収率が顕著に向上することを見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は以下の通りである。
［項１］
　リンパ球を炭酸水素イオン含有生理的水溶液で洗浄することを含む、リンパ球の洗浄方法。
［項２］
　リンパ球がT細胞又はNK細胞である、項１に記載の方法。
［項３］
　炭酸水素イオン含有生理的水溶液が重炭酸リンゲル液である、項１又は２に記載の方法。
［項４］
　項１～３のいずれか一項に記載の方法により処理されたリンパ球を、生理的水溶液を含有する凍結保存液に懸濁し凍結することを含む、リンパ球の凍結保存方法。
［項５］
　生理的水溶液が炭酸水素イオン含有生理的水溶液である、項４に記載の方法。
［項６］
　炭酸水素イオン含有生理的水溶液が重炭酸リンゲル液である、項５に記載の方法。
［項７］
　炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有してなる、リンパ球用洗浄液。
［項８］
　炭酸水素イオン含有生理的水溶液、デキストラン、グルコース、DMSO及びヒト血清アルブミンを含有してなる、リンパ球用凍結保存液。
［項９］
　炭酸水素イオン含有生理的水溶液で処理されたリンパ球と、項８に記載の凍結保存液とを含有してなる、リンパ球含有組成物。
［項１０］
　項９に記載のリンパ球含有組成物と、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液とを含む、移植用リンパ球の調製用キット。
［項１１］
　項９に記載のリンパ球含有組成物のための移植用希釈液であって、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有してなる、移植用希釈液。
［項１２］
　凍結保存後解凍した項９に記載のリンパ球含有組成物を、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液で希釈することを含む、移植用リンパ球の調製方法。
［項１３］
　項１２に記載の方法により得られる、移植用リンパ球製剤。
　本発明の洗浄液及び凍結保存液によれば、凍結・解凍後も高い細胞の回収率及び生存率を維持し、かつ高い生理活性を維持した移植用リンパ球（例、NK細胞、T細胞等）を製造することができる。また、本発明のリンパ球含有組成物と移植用希釈液によれば、解凍後、移植までの間、室温保存しても高い細胞生存率を維持することができ、移植により適したリンパ球製剤を提供することができる。
［Ｉ］本発明の洗浄方法及び本発明の洗浄液
　本発明は、リンパ球を炭酸水素イオン含有生理的水溶液で洗浄することを含む、リンパ球の洗浄方法（以下、「本発明の洗浄方法」という場合がある。）を提供する。
　本明細書において「洗浄」とは、洗浄前の細胞の周辺環境（例、培養液）内に存在する物質（例、培地成分）を除去するために、該細胞を液体（即ち、洗浄液）に懸濁する操作を意味する。細胞の洗浄は、例えば、洗浄前の細胞の分散媒の除去（例、遠心分離、ろ過等）と回収された細胞の洗浄液への懸濁（必要に応じて当該操作を繰り返す）により行うこともできるし、あるいは、例えば自動濃縮洗浄装置を用いて洗浄前の分散媒を洗浄液と置換することにより行うこともでき、その様式は特に制限されない。
（Ａ）リンパ球
　本発明の洗浄方法に供されるリンパ球は特に制限されず、例えば、NK細胞、T細胞（例、細胞傷害性T細胞（CTL）、ヘルパーT細胞、制御性T細胞等）、B細胞などが挙げられるが、好ましくはNK細胞及びT細胞、より好ましくはNK細胞である。リンパ球は、ヒト又は他の哺乳動物（好ましくは、ヒト）から採取した血液（例、末梢血、臍帯血等）やそこから分離した単核細胞から、フローサイトメトリー等の常法を用いて、目的のリンパ球で特異的に発現する表面抗原マーカー（例、T細胞に場合、CD3、CD4、CD8等、NK細胞の場合、CD56等）の発現を指標にして単離することができる。
　好ましい一実施態様においては、多能性細胞を含むリンパ球の前駆細胞から各種リンパ球を分化誘導することができる。そのようなリンパ球の前駆細胞としては、例えば、iPS細胞、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）、造血幹細胞、自己複製能を失った多能性前駆細胞（multipotent progenitor：MPP）、ミエロ－リンフォイド共通前駆細胞（MLP）、ミエロイド系前駆細胞（MP）、顆粒球単核前駆細胞（GMP）、マクロファージ－樹状細胞前駆細胞（MDP）、樹状細胞前駆細胞（DCP）などが挙げられる。好ましくは、ES細胞やiPS細胞等の多能性幹細胞が挙げられる。
　前記の前駆細胞をリンパ球へ分化誘導する方法としては、種々の公知の分化誘導方法を適宜選択して用いることができる。例えば、ヒト多能性幹細胞からT細胞への公知の分化誘導方法としては、例えば、Timmermans, F. et al., J. Immunol., 2009, 182, 68879-6888に記載の方法が挙げられる。また、例えば、Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell, 2013, 12, 114-126に記載の方法により、ヒト末梢血Tリンパ球より樹立したヒトiPS細胞をT細胞に分化誘導することができる。また、ヒト多能性幹細胞からNK細胞への公知の分化誘導方法としては、例えば、WO 2020/086889、Biochem Biophys Res Commun. 515(1): 1-8 (2019)、Methods Mol Biol. 2048: 107-119 (2019) に記載の方法が挙げられる。
　PBMC等のT細胞含有試料やリンパ球前駆細胞から分化誘導したT細胞から、常法によりT細胞を活性化・拡大増殖させることができる。例えば、T細胞含有試料に、T細胞の表面分子と相互作用してT細胞の活性化及び／又は増殖を促進する分子を培地に添加して培養することができる。当該分子としては、TCRと共役してTCRを介したシグナル伝達を担うCD3や、T細胞活性化の共刺激因子として知られる表面分子CD28、ICOS、CD137、OX40、CD27、GITR、BAFFR、TACI、BMCA、CD40L等に特異的に結合して、活性化／増殖シグナルや共シグナルを、T細胞内に伝達する機能を有する分子が挙げられる。好ましくは、CD3に対する抗体及び／又はCD28に対する抗体が挙げられる。これらの分子は単独で用いてもよいし、担体（例：Dynabeads（登録商標）（ThermoFisher Scientific））に結合させた複合体（例：TransAct（Milteny Biotech）、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（ThermoFisher Scientific））で用いてもよい。抗CD3抗体及び／又は抗CD28抗体を用いてT細胞に増殖刺激を施す際には、IL-2、IL-7、IL-15等のサイトカインを更に培地に加えてもよい。
　PBMC等のT細胞含有試料やリンパ球前駆細胞から分化誘導したNK細胞から、常法によりNK細胞を活性化・拡大増殖させることができる。当該方法として、例えば、WO 2020/086889、Biochem Biophys Res Commun. 515(1): 1-8 (2019)、Methods Mol Biol. 2048: 107-119 (2019) に記載の方法が挙げられるが、それらに限定されない。
　前述のとおり、本出願人は、連続的に三次元灌流培養することで、多能性幹細胞スフェアから造血前駆細胞を分化誘導し、得られた造血前駆細胞を三次元浮遊培養してNK細胞に分化させることにより、凍結・解凍後も高い活性が維持されるNK細胞を効率よく大量に製造し得る方法を開発した（特願2022-013646）。より具体的には、当該方法は、
（１）第一の培地中で、平均粒径200μm以上の多能性幹細胞スフェアを形成する工程；
（２）工程（１）で形成した多能性幹細胞スフェアを、第二の培地を用いた三次元培養により造血前駆細胞を含む細胞集団に誘導する工程；及び
（３）工程（２）で得られた造血前駆細胞を含む細胞集団を、第三の培地を用いた三次元培養によりNK細胞を含む細胞集団に誘導する工程：
を含み、工程（１）ないし（３）を三次元灌流培養法で行うことを特徴とする。
　三次元浮遊培養法は細胞培養法のひとつであり、浮遊細胞、スフェア（スフェロイド）、若しくは細胞を接着させた三次元培養用の担体を攪拌翼若しくは振盪器を用いて三次元的に展開させながら培養することを特徴とする。また、灌流培養法は連続培養法の一つであり、培養容器内の培養液に一定量の新しい培地を供給しながら同時に一定量の培地を抜き取ることで、連続的に培地交換の目的である新しい栄養成分の供給と老廃物の除去を達成することが可能である。当該方法において、灌流培養は連続的に行うことがこのましい。「連続的に灌流培養する」とは、各工程間において膜交換を行うだけで培地交換時に通常行われる洗浄工程を挟むことなく、前工程の培地を抜き取りながら次工程の培地を供給することをいう。
　灌流培養の際に使用する分離膜は、目的の細胞集団を培養系外に逃さないような一定の細孔径、及び特性（例えば、疎水性度等）を有するものであることが望ましいが、適切な細孔径として、工程（１）について細孔径15～75μmであり、工程（２）について細孔径45～225μmであり、工程（３）について細孔径0.2～10μmが挙げられる。
　工程（１）における第一の培地は、多能性幹細胞の維持培養に用いられる培養液であれば特に限定されないが、例えばフィーダーフリー培養可能な培地が用いられる。好ましくは、フィーダーフリー培養可能な培地にROCK阻害剤を含む培地が挙げられる。
　工程（２）における第二の培地としては、多能性幹細胞を造血前駆細胞に誘導することができる培地であれば特に限定されないが、例えば、血管内皮増殖因子（VEGF）、骨形成タンパク質4（BMP4）及びグリコーゲン合成酵素3β（GSK3β）阻害剤を含む培地、幹細胞因子（SCF）及びトランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）/Smad阻害剤を含む培地、SCF及びFlt3リガンド（Flt3L）を含む培地等が挙げられる。
　工程（３）における第三の培地としては、造血前駆細胞をNK細胞に誘導することができる培地であれば特に限定されないが、例えばIL-15およびSCFを含む培地が挙げられる。
　工程（１）のスフェア平均粒子径は、通常200μm以上、具体的には200～600μmの範囲で適宜調整される。スフェア化に要する培養期間としては、例えば細胞播種から2～10日程度が好ましく、4～7日程度がより好ましい。
　工程（２）における培養期間は、通常5～20日であり、好ましくは10～18日程度である。
　工程（３）における培養期間は、通常20～60日であり、好ましくは25～40日程度である。
　工程（３）の後に、工程（４）として得られたNK細胞の増幅培養工程、あるいはNK細胞の成熟工程をさらに実施することができる。増幅培養工程、あるいは成熟工程は、公知の方法を適宜適用することができる。
　尚、上記方法において、工程（３）の代わりに、自体公知の、造血幹細胞からT細胞に分化誘導する方法を実施することにより、多能性幹細胞からT細胞を誘導することもできる。
（Ｂ）炭酸水素イオン含有生理的水溶液
　本明細書において「生理的水溶液」とは、体液（例えば血漿）や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるように、ナトリウムやカリウムなどによって塩や糖濃度等を調整した等張液を意味し、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、トリス緩衝化生理食塩水（TBS）、HEPES緩衝化生理食塩水、リンゲル液、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）、5% グルコース水溶液などの等張液を挙げることができる。本明細書において「等張」とは、浸透圧が250～380 mOsm/Lの範囲内であることを意味する。
　本発明の洗浄方法において用いられる炭酸水素イオン含有生理的水溶液（以下、「本発明の洗浄液」という場合がある。）としては、炭酸水素イオンと種々の陽イオンとの塩を含有する任意の生理的水溶液を挙げることができる。そのような炭酸水素塩としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウム等が挙げられる。好ましくは、炭酸水素イオン含有生理的水溶液として、重炭酸リンゲル液、HBSS等を挙げることができる。より好ましくは、重炭酸リンゲル液である。
　本明細書における「重炭酸リンゲル液」は、電解質として、炭酸水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及び塩素イオンを含有し、炭酸水素イオン濃度が22～31 mEq/L、ナトリウムイオン濃度が120～150 mEq/Lである生理的水溶液である。重炭酸リンゲル液のpHは6.8～7.8であり得る。生理食塩水に対する浸透圧比は0.9～1.1であり得るが、それらに限定されない。重炭酸リンゲル液は、電解質として、マグネシウムイオン及び／又はクエン酸イオンをさらに含有してもよい。重炭酸リンゲル液がマグネシウムイオン及びクエン酸イオンを含有する場合、各電解質の濃度は、例えば以下のとおりであり得るが、それらに限定されない。
　ナトリウムイオン　　　　　120～150 mEq/L
　カリウムイオン　　　　　　3.6～4.4 mEq/L
　カルシウムイオン　　　　　2.7～3.3 mEq/L
　マグネシウムイオン　　　　0.9～2.2 mEq/L
　塩素イオン　　　　　　　　100～125 mEq/L
　炭酸水素イオン　　　　　　 22～ 31 mEq/L
　クエン酸イオン　　　　　　3.6～5.5 mEq/L
　そのような重炭酸リンゲル液の具体例として、市販のビカネイト（登録商標；株式会社大塚製薬工場）及びビカーボン（登録商標；エイワイファーマ株式会社）を挙げることができる。それらにおける各電解質の濃度は以下のとおりである。また、これらの重炭酸リンゲル液の各成分（塩）の組成（w/v %）は、表８に示すとおりである。
（ビカネイト（登録商標））
　ナトリウムイオン　　　　　130 mEq/L
　カリウムイオン　　　　　　  4 mEq/L
　カルシウムイオン　　　　　  3 mEq/L
　マグネシウムイオン　　　　  2 mEq/L
　塩素イオン　　　　　　　　109 mEq/L
　炭酸水素イオン　　　　　　 28 mEq/L
　クエン酸イオン　　　　　　  4 mEq/L
（ビカーボン（登録商標））
　ナトリウムイオン　　　　　135 mEq/L
　カリウムイオン　　　　　　  4 mEq/L
　カルシウムイオン　　　　　  3 mEq/L
　マグネシウムイオン　　　　  1 mEq/L
　塩素イオン　　　　　　　　113 mEq/L
　炭酸水素イオン　　　　　　 25 mEq/L
　クエン酸イオン　　　　　　  5 mEq/L
　HBSSとしては、電解質として、炭酸水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン及びリン酸イオンを含有し、表１に示される電解質組成のHBSS(-)、さらにカルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含有し、表１に示される電解質組成のHBSS(+)を挙げることができる。より好ましくはHBSS(+)である。
　本発明の洗浄液は、上記の電解質以外の成分を含んでもよい。そのような成分として、例えば、リン酸イオン、乳酸イオン、酢酸イオン等の上記以外の電解質（緩衝剤）、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、マルトース、スクロース等の糖類、血清アルブミン（例、HuSA、BSA等）、血清グロブリン等の生体由来タンパク質などが挙げられる。
　しかしながら、好ましい実施態様においては、本発明の洗浄液は、リン酸イオン、乳酸イオン、酢酸イオン等の緩衝剤、糖類（例、グルコース等）、生体由来タンパク質（例、HuSA等）を含有しない、炭酸水素イオン含有生理的水溶液である。
（Ｃ）洗浄方法
　本発明の洗浄方法において、リンパ球を本発明の洗浄液で洗浄する方法は特に制限されず、例えば、洗浄前のリンパ球の分散媒（例、培養液）を遠心分離やろ過等により除去し、回収したリンパ球を本発明の洗浄液に懸濁する（必要に応じて当該操作を繰り返す）ことにより行うことができる。好ましい一実施態様においては、例えば、中空糸膜モジュール等で構成される細胞ろ過器を回路内に含み、細胞懸濁液と洗浄液とを該回路内に送液できる自動濃縮洗浄装置を用い、プライミング（回路内を洗浄液で満たす）、濃縮（回路内に細胞懸濁液を送液し、中空糸膜内を循環させながら培地成分（例、低分子、タンパク質等）を膜外に除去する）、洗浄（回路内に洗浄液とを送液し、培地成分と置換する）、及び回収（培地成分が除去された細胞濃縮液を回収する）の一連の操作を閉鎖系にて行うことにより、細胞の損傷やコンタミネーションリスクを低減しつつ、分散状態で細胞の洗浄（培地成分の除去）が可能となる。そのような自動濃縮洗浄装置は市販されており、例えば、Kaneka細胞濃縮洗浄システム（株式会社カネカ製）等を用いることができる。
　当該洗浄工程は、約4℃乃至室温にて行うことができる。例えば、3 L容のバイオリアクターを用いて拡大培養を行ったリンパ球を、自動濃縮洗浄装置を用いて洗浄する場合、培養後の細胞回収から洗浄工程の完了まで約2時間を要すると想定されるが、本発明の洗浄方法によれば、リンパ球を本発明の洗浄液中に懸濁し、室温で4時間静置しても、凍結解凍後及び回復培養後の生細胞回収率及び細胞生存率の低下が、生理食塩水等の炭酸水素イオンを含有しない生理的水溶液に懸濁した場合に比べて顕著に抑制される。従って、本発明の洗浄液及び洗浄方法は、拡大培養後のリンパ球の洗浄工程（培地成分の除去工程）に用いるのにきわめて有用である。
［ＩＩ］本発明の凍結保存方法及び本発明の凍結保存液
　本発明の洗浄方法により得られたリンパ球を、生理的水溶液を含有する凍結保存液に懸濁し凍結保存すると、STEM-CELLBANKER（登録商標）やCryoStor CS10等の汎用される市販の凍結保存液にて凍結保存した場合に比べて、解凍後の生細胞回収率が顕著に向上する。従って、本発明はまた、上記本発明の洗浄方法により処理されたリンパ球を、生理的水溶液を含有する凍結保存液に懸濁し凍結することを含む、リンパ球の凍結保存方法（以下、「本発明の凍結保存方法」という場合がある。）を提供する。
　重炭酸リンゲル液（但し、グルコース等の糖類及び／又はHuSAを含む）を用いて培養後の細胞を洗浄することにより、洗浄工程による細胞の回収率及び生存率の低下を抑制することは知られていたが、炭酸水素イオン含有生理的水溶液（好ましくは、糖類もHuSAも含まない）を用いてリンパ球を洗浄することにより、その後同じ条件でリンパ球を凍結保存した場合でも、炭酸水素イオンを含有しない生理的水溶液を用いて洗浄した場合に比べて、解凍後及び回復培養後の細胞の回収率及び生存率が向上することは、本発明者らが初めて見出した驚くべき知見である。即ち、本発明の洗浄方法により得られたリンパ球は、従来の洗浄方法により得られたリンパ球に対して、新規かつ格別顕著な固有の特徴を有しているが、両者を構造又は物性により区別することは、不可能もしくはおよそ非実際的である。
　本発明の凍結保存方法に用いられる生理的水溶液は、本発明の洗浄方法により得られたリンパ球を、該生理的水溶液を含有する凍結保存液に懸濁し凍結保存した場合に、解凍後の生細胞の回収率を向上させるものである限り特に制限はなく、本発明の洗浄方法において例示されたような任意の生理的水溶液が挙げられるが、好ましくは、生理食塩水又は炭酸水素イオン含有生理的水溶液が挙げられ、生理的食塩水又は重炭酸リンゲル液がより好ましい。
　本発明の凍結保存方法に用いられる凍結保存液中の生理的水溶液の濃度は、例えば生理食塩水の場合、例えば25～50% (v/v)、好ましくは30～45% (v/v)、より好ましくは32～41% (v/v)であるが、それらに限定されない。また、生理的水溶液が重炭酸リンゲル液の場合、凍結保存液中のその濃度は、例えば35～75% (v/v)、好ましくは40～70% (v/v)、より好ましくは43～67% (v/v)であるが、それらに限定されない。
　本発明の凍結保存方法に用いられる凍結保存液は、１以上の凍害保護剤を含有することが好ましい。凍害保護剤としては、例えば、デキストラン、DMSO、ハイドロキシエチルスターチ（HES）、エチレングリコール、グリセロール、トレハロース等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、デキストラン及びDMSOを挙げることができる。
　デキストランは、D-グルコースからなり、α1→6結合を主鎖とする多糖(C6H10O5)nである。デキストランの分子量は細胞内に浸透しない程度であれば特に制限はないが、例えば、重量平均分子量（Mw）として、40,000（デキストラン40）乃至70,000（デキストラン70）が挙げられる。デキストランは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等の自体公知の方法で製造することができ、また、市販品を用いてもよい。デキストランの市販品としては、例えば、デキストラン40（名糖産業社製）、デキストラン70（東京化成工業社製）等が挙げられる。
　あるいは、例えば、デキストラン硫酸、カルボキシル化デキストラン、ジエチルアミノエチル(DEAE)-デキストラン等の誘導体を用いることもできる。
　デキストラン又はその誘導体は、フリー体であっても塩の形態であってもよい。それらの塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩等無機酸との酸付加塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等の塩基性塩などが挙げられる。これらの塩は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は2種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
　凍結保存液中に含まれるデキストランの濃度としては、例えば3～12% (w/v)、好ましくは3～11% (w/v)、より好ましくは3.5～10.5% (w/v)であるが、それらに限定されない。また、好ましい濃度範囲は用いる生理的水溶液の種類に応じて変動し得る。
　DMSOは、細胞への悪影響を避けるため、なるべく高純度のものを用いることが好ましい。凍結保存液中に含まれるDMSOの濃度としては、例えば3～15% (w/v)、好ましくは5～12% (w/v)、より好ましくは7.5～12% (w/v)であるが、それらに限定されない。また、好ましい濃度範囲は用いる生理的水溶液の種類に応じて変動し得る。
　本発明の凍結保存方法に用いられる凍結保存液は、１以上の糖類を含有することができる。糖類としては、例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プリコース、フルクトース、ソルボース、タガロース、フコース、フクロース、ラムノース等の６炭糖、リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース等の５炭糖等の単糖類、スクロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、スタキオース等の少糖類、デンプン、グリコーゲン等の多糖類が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはグルコースである。
　凍結保存液中に含まれる糖類の濃度としては、例えば0.03～1.2% (w/v)、好ましくは0.04～0.8% (w/v)、より好ましくは0.05～0.７% (w/v)であるが、それらに限定されない。また、好ましい濃度範囲は用いる生理的水溶液の種類に応じて変動し得る。
　本発明の凍結保存方法に用いられる凍結保存液は、１以上のタンパク質を含有することができる。タンパク質としては、例えば、血清アルブミン（例、HuSA、ウシ血清アルブミン（BSA））、血清グロブリン等の血漿由来タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはHuSAである。血漿由来タンパク質は動物血漿から精製されたものでもよいし、組換え生産されたものであってもよい。
　凍結保存液中に含まれるタンパク質の濃度としては、例えば0.5～5% (w/v)、好ましくは1～4% (w/v)、より好ましくは1.2～3.5% (w/v)であるが、それらに限定されない。また、好ましい濃度範囲は用いる生理的水溶液の種類に応じて変動し得る。
　好ましい一実施態様において、本発明の凍結保存方法に用いられる凍結保存液は、生理食塩水又は重炭酸リンゲル液から選ばれる生理的水溶液、デキストラン、DMSO、グルコース及びHuSAを含有する。
　生理的水溶液が生理食塩水の場合、凍結保存液の組成は、
　生理食塩水　　　　　30～45% (v/v)
　デキストラン　　　　 7～11% (w/v)
　グルコース　　　 0.04～0.8% (w/v)
　DMSO　　　　　　　　 5～12% (v/v)
　HuSA　　　　　　　　 1～ 4% (w/v)；
好ましくは、
　生理食塩水　　　　　32～41% (v/v)
　デキストラン　　　　 8～10% (w/v)
　グルコース　　　 0.04～0.7% (w/v)
　DMSO　　　　　　　　 5～11% (v/v)
　HuSA　　　　　　　　1.5～3% (w/v)
であり得る。
　一方、生理的水溶液が重炭酸リンゲル液の場合、凍結保存液の組成は、
　重炭酸リンゲル液　　40～70% (v/v)
　デキストラン　　　　 3～11% (w/v)
　グルコース　　　 0.04～0.8% (w/v)
　DMSO　　　　　　　　 5～12% (v/v)
　HuSA　　　　　　　　 1～ 4% (w/v)；
好ましくは、
　重炭酸リンゲル液　　43～67% (v/v)
　デキストラン　　 3.5～10.5% (w/v)
　グルコース　　　 0.05～0.7% (w/v)
　DMSO　　　　　　 　7.5～12% (v/v)
　HuSA　　　　　　 1.2～3.54% (w/v)
であり得る。
　前述のとおり、リンパ球用の凍結保存液としては、DMSO、デキストラン、グルコース、HuSA、重炭酸塩及び生理的水溶液（例、生理食塩水、リンゲル液）のうちの一部を含有する溶液を用いた報告例はあるが、前記のすべての成分を含有する又は該成分からなる凍結保存液は未だ開示されていない。
　従って、本発明はまた、炭酸水素イオン含有生理的水溶液、デキストラン、グルコース、DMSO及びHuSAを含有してなる、リンパ球用凍結保存液（以下、「本発明の凍結保存液」という場合がある。）を提供する。
　本発明の凍結保存液の成分である炭酸水素イオン含有生理的水溶液、デキストラン、グルコース、DMSO及びHuSAとしては、本発明の凍結保存方法についてそれぞれ記載したとおりのものを使用することができる。炭酸水素イオン含有生理的水溶液としては、好ましくは重炭酸リンゲル液である。
　炭酸水素イオン含有生理的水溶液が重炭酸リンゲル液である場合、本発明の凍結保存液の組成としては、好ましくは以下のとおりである。
　重炭酸リンゲル液　　40～70% (v/v)
　デキストラン　　　　 3～11% (w/v)
　グルコース　　　 0.04～0.8% (w/v)
　DMSO　　　　　　　　 5～12% (v/v)
　HuSA　　　　　　　　 1～ 4% (w/v) ；
より好ましくは、
　重炭酸リンゲル液　　43～67% (v/v)
　デキストラン　　 3.5～10.5% (w/v)
　グルコース　　　 0.05～0.7% (w/v)
　DMSO　　　　　　　 7.5～12% (v/v)
　HuSA　　　　　　　1.2～3.5% (w/v)
　本発明の凍結保存方法ではまず、上記本発明の洗浄方法を行うことにより得られたリンパ球の細胞濃縮液から洗浄液を除去するとともに、上記のいずれかの凍結保存液に再懸濁させる。例えば、細胞濃縮液を遠心チューブなどに回収し、細胞を遠心してペレット化した後、凍結保存液を加えて懸濁することができる。あるいは、凍結保存液を送液しながら同時に洗浄液を抜き取ることにより、連続的に洗浄液を凍結保存液に置換することができる。
　得られた細胞懸濁液を凍結保存チューブに入れ、-80℃のフリーザーにて凍結後、気相もしくは液相の窒素タンクにて保存することができるが、それに限定されない。例えば、自動分注装置を用いて細胞懸濁液を凍結保存バイアルに分注し、例えば、冷却速度を制御できるフリーザーを用いてプログラム凍結を行うことにより、凍結処理を最適化することができる。
　例えば、3 L容のバイオリアクターを用いて拡大培養を行ったリンパ球を、本発明の洗浄方法に供して得られた細胞濃縮液の洗浄液を凍結保存液に置換し、得られた細胞懸濁液を凍結保存容器に分注し、凍結処理を開始するまでに要する時間は約2時間と想定される。当該操作は約4℃乃至室温にて行われる。従って、凍結保存液は、凍結保存中や解凍時の細胞のダメージから細胞を保護するだけでなく、洗浄後、細胞を凍結保存液に再懸濁させて凍結処理を開始するまでの時間、約4℃乃至室温で安定に細胞を保存できることが求められる。後述の実施例に示されるとおり、洗浄処理後のリンパ球を凍結保存液に懸濁し、室温で4時間静置した際の経時的な生細胞回収率の低下が、重炭酸リンゲル液を含む凍結保存液を用いて凍結保存を行うと、既存の凍結保存液であるSCBに比べて顕著に抑制される。従って、本発明の凍結保存方法及び凍結保存液は、リンパ球の凍結保存において極めて有用である。
［ＩＩＩ］本発明のリンパ球含有組成物、本発明の移植用希釈液、それらを含むキット、それを用いた移植用リンパ球調製方法、並びにそれにより得られる移植用リンパ球製剤
　上記本発明の凍結保存方法により得られる凍結リンパ球含有組成物は、解凍後及び回復培養後の生細胞の回収率及び細胞生存率が、既存の凍結保存液を用いた場合と比較して顕著に向上する。即ち、当該リンパ球含有組成物は、移植用リンパ球として有利な効果を奏する。従って、本発明はまた、炭酸水素イオン含有生理的水溶液で処理されたリンパ球と、上記本発明の凍結保存液とを含有してなる、リンパ球含有組成物（以下、「本発明のリンパ球含有組成物」という場合がある。）を提供する。
　後述の実施例に示されるとおり、本発明の洗浄方法及び凍結保存方法を介して得られた凍結リンパ球含有組成物を解凍後、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液で希釈し、室温で4時間静置した後回復培養を行い、培養後の細胞生存率を評価したところ、炭酸水素イオンを含有しない生理的水溶液（例、生理食塩水、酢酸リンゲル）で希釈した場合に比べて、高い細胞生存率が得られた。即ち、炭酸水素イオン含有生理的水溶液は、移植用媒体としてきわめて有用である。従って、本発明はまた、本発明のリンパ球含有組成物のための移植用希釈液であって、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有してなる、移植用希釈液を提供する。炭酸水素イオン含有生理的水溶液としては、前記本発明の洗浄液に用いられる溶液を適宜選択して用いることができるが、好ましくは重炭酸リンゲル液である。さらにまた、本発明は、本発明のリンパ球含有組成物と、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液とを含む、移植用リンパ球の調製用キットを提供する。
　前記移植用リンパ球の調製用キットにおいて、リンパ球含有組成物は凍結状態で提供され得る。例えば、CPCから凍結状態で病院内に輸送され、解凍後、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液により希釈懸濁され、移植用リンパ球製剤として調製することができ、移植手術までの間、室温にて安定に維持することができる。あるいは、別の態様によれば、CPCで凍結リンパ球含有組成物を解凍した直後に、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液に希釈懸濁し、室温下、非凍結状態でリンパ球を病院に輸送し、到着後速やかに移植手術を実施することもできる。
　従って、本発明はまた、凍結保存後解凍した本発明のリンパ球含有組成物を、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液で希釈することを含む、移植用リンパ球の調製方法を提供する。さらに、本発明は当該方法により得られる移植用リンパ球製剤を提供する。
　このようにして得られた移植用リンパ球製剤は、自体公知の方法、例えば養子免疫療法やドナーリンパ球輸注療法等で使用される投与形態、用法用量により、患者、例えば、がん患者等に投与することができる。
　以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、それらは単なる例示であって、本発明はそれらに何ら限定されない。
［実施例１］iPS細胞由来NK細胞の製造
　ヒト臍帯血由来iPS細胞ストックを解凍し、フラスコに播種、37℃，5% CO2環境において培養した後に細胞を回収し、三次元培養装置に播種した。播種後、膜ろ過フィルターを介して灌流培養を実施し、一定サイズの3Dスフェアを形成させた。その後、これにBMP4等添加因子を含む分化誘導培地を加え、灌流培養による3D培養を12－17日間継続することによってHPCを誘導した。さらに得られたHPCに対し、NK分化誘導培地（AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific)にFBSを5%濃度で加えた培地に、IL-15,IL-7,SCF,およびFlt3Lを終濃度50 ng/mLとなるように添加した培地）を用い、三次元培養装置に播種し、約40日間灌流培養することによって、高い生理活性を有する大量のNK細胞を作製した。
［実施例２］リンパ球洗浄工程における洗浄液の比較
（１）NK細胞の調製
　実施例１で得られたNK細胞を300xgで5分間遠心後、培地上清を除いて回収し、さらに2.2 x 106cells/mLとなるように、5種の生理的水溶液［(1) 生理食塩水（大塚製薬工場社製）、(2) ヴィーンF（酢酸リンゲル液；扶桑薬品社製）、(3) ヘスパンダー（ヒドロキシエチルデンプン・ブドウ糖添加 乳酸リンゲル液；大塚製薬工場社製）、(4) HBSS（+）（平衡塩溶液）、(5) HBSS（-）（平衡塩溶液）］に懸濁した（各生理的水溶液の電解質組成を表１に示す）。NK細胞懸濁液は15 mL遠沈管に入れて、室温で静置した。静置処理は濃縮洗浄工程のプロセス時間の模擬とし、0時間は比較例、2時間及び4時間は実施例として設定した。
　表１に示されるとおり、平衡塩溶液HBSS組成中の炭酸水素イオンは、「生理食塩水」、「酢酸リンゲル液」、「ヒドロキシエチルデンプン・ブドウ糖添加 乳酸リンゲル液」の中には含まれていない。
（２）静置処理後NK細胞サンプルの凍結保存
　静置0時間（懸濁直後）、2時間、4時間後に、NK細胞懸濁液を300xgで5分間遠心処理し、上清を除き、5.0 x 106 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKER（登録商標）GMP grade（SCB、ゼノジェンファーマ社製）に再懸濁し、細胞懸濁液を凍結容器に分取し、凍結保存容器のBICELL（日本フリーザー社製）に移し、-80℃で凍結保存した。
（３）解凍及び回復培養後の細胞回収率及び細胞生存率の測定
　NK細胞を解凍し、NK細胞の製造に用いた培地（AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific)にFBSを5%濃度で加えた培地に、IL-15,IL-7,SCF,およびFlt3Lを終濃度50 ng/mLとなるように添加した培地）を用いて、6-wellプレートに1.0 x 106 cells/mLとなるように再播種し、37℃、5％ CO2の条件下、インキュベーター中で4日間の回復培養を行った。その後well内の生細胞密度を測定し、生細胞回収率（式(I)参照）及び細胞生存率を算出した。
　生細胞回収率＝（解凍後・培養終了後の総生細胞数／凍結保存総生細胞数）x100　(I)
　結果を表２に示す。
　表２の結果から、生理食塩水に懸濁したNK細胞では、4時間静置処理における解凍直後と培養終了後NK細胞の生細胞回収率及び細胞生存率は、0時間（静置処理なし）と2時間静置処理より顕著に低下することがわかった。なお、実務上において、細胞回収及び洗浄工程のプロセス時間は約2時間以内に設定するが、さらに凍結保存液を加えて、凍結保存処理までのプロセス時間は約4時間と想定される。4時間静置処理したNK細胞の回復培養終了後の生細胞回収率及び細胞生存率を比較すると、生理食塩水に懸濁したNK細胞に対し、HBSS等平衡塩溶液に懸濁したNK細胞は高い生細胞回収率及び細胞生存率を有することを確認した。
　上記の結果により、回収後のNK細胞を含む懸濁液のバッファー置換あるいは洗浄工程では、炭酸水素イオンを有する溶液がNK細胞の回収及び生存率の維持に適していると考えられた。
［実施例３］リンパ球濃縮洗浄工程における洗浄液の比較
（１）NK細胞懸濁液の調製及び静置処理
　実施例１で得られたNK細胞を300xgで5分間遠心後、培地上清を除いて回収し、さらに2.2 x106cells/mLとなるように、3種の生理的水溶液［(1) 生理食塩水、(2) ラクテック（乳酸リンゲル液；大塚製薬工場社製）、(3) ビカネイト（重炭酸リンゲル液；大塚製薬工場社製）］に懸濁した（各生理的水溶液の電解質組成を表３に示す）。NK細胞懸濁液は15mL遠沈管に入れて、室温で静置した。静置処理は濃縮洗浄工程のプロセス時間の模擬とし、0時間は比較例、2時間及び4時間は実施例として設定した。
　表３に示されるように、重炭酸リンゲル液であるビカネイトは炭酸水素イオンを有する。
（２）静置処理後NK細胞サンプルの凍結保存
　静置0時間（懸濁直後）、2時間、4時間後に、NK細胞懸濁液を300xgで5分間遠心処理し、上清を除き、5.0 x 106 cells/mLとなるようにSTEM-CELLBANKER（登録商標）GMP grade（SCB）に再懸濁した。細胞懸濁液を凍結容器に分取し、凍結保存容器のBICELLに移し、-80℃で凍結保存した。
（３）解凍及び回復培養後の生細胞回収率及び細胞生存率の測定
　NK細胞を解凍し、実施例１におけるNK細胞の製造に用いた培地（AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific)にFBSを5%濃度で加えた培地に、IL-15, IL-7, SCFおよびFlt3Lを終濃度50 ng/mLとなるように添加した培地）で6-wellプレートに1.0 x 106 cells/mLとなるように再播種し、37℃、5％ CO2の条件下、インキュベーター中で3日間の回復培養を行った。その後well内の生細胞密度を測定し、生細胞回収率（式(I)参照）及び細胞生存率を算出した。結果を表４に示す。
　表４に示された結果から、生理食塩水に懸濁したNK細胞では、4時間静置処理における解凍直後と培養終了後NK細胞の生細胞回収率及び細胞生存率は、0時間（静置処理なし）と2時間静置処理より顕著に低下することがわかった。
　4時間静置した場合において、回復培養終了後の生細胞回収率及び細胞生存率について比較すると、生理食塩水に懸濁したNK細胞に対し、重炭酸リンゲル液であるビカネイトに懸濁したNK細胞は、高い生細胞回収率及び細胞生存率を有することを確認した。
　上記の結果により、緩衝作用がない生理食塩水、炭酸水素イオンを含まない乳酸リンゲル液と比較し、緩衝作用を有しかつ炭酸水素イオンを含む重炭酸リンゲル液によるNK細胞懸濁液のバッファー置換、あるいは洗浄によって、NK細胞の生細胞回収率及び生存率が最適化されることがわかった。
［実施例４］リンパ球用の凍結保存液
（１）NK細胞懸濁液と凍結保存液の混合と凍結
　実施例1で得られたNK細胞を含有する培養液を300xgで5分間遠心後、培地上清を除いた。NK細胞の沈殿をタッピングにより解して生理食塩水もしくは重炭酸リンゲル液に懸濁した後、表５又は表6に示した各組成の凍結保存液を加えてよく混合した。凍結保存液を加えた後、それぞれの細胞懸濁液を凍結容器に分取し、Mr. Frosty（Nalgene社製）もしくはBICELLなどの凍結保存容器に移して、-80℃で凍結した。凍結保存液の性能比較のために、STEM-CELLBANKER（登録商標）GMP grade（SCB）に懸濁した細胞を調製し、対照サンプルとして凍結保存した。
（２）凍結保存後のNK細胞の解凍及び回復培養
　上記工程（１）で得られた凍結NK細胞を解凍した後、実施例１におけるNK細胞の製造に用いた培地（AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific)にFBSを5%濃度で加えた培地に、IL-15,IL-7,SCF,およびFlt3Lを終濃度50 ng/mLとなるように添加した培地）に懸濁し、12-wellプレートに1.0 x 106 cells/mLとなるように再播種した。次いで37℃、5％ CO2の条件下、インキュベーター中で3日間の回復培養を行った。その後well内の生細胞密度及び細胞生存率を測定し、それぞれの凍結保存液における生細胞回収率（式(I)参照）を、SCBを用いて凍結した細胞の生細胞回収率に対する相対値(SCB相対値)として算出した。
　生理食塩水を含む凍結保存液で行った結果を表５（培養終了Day3 SCB相対値）に、また重炭酸リンゲル液を含む凍結保存液で行った結果を表６（培養終了Day3 SCB相対値）に示した。
（３）結果
（３－１）生理食塩水を含む凍結保存液の場合
　生理食塩水を含む凍結保存液を用いて実施例１で調製したNK細胞の凍結保存を行う場合、既存の凍結保存液であるSCBやCryoStor CS10（CS10; Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc社製）に比べて、解凍後の生細胞回収率が顕著に高い組成を複数得ることができた。好ましい組成は、生理食塩水；32.7～40.8% (v/v)、Dextran40（Dex40; 名糖産業社製）；8.06～9.68% (w/v)、Glucose（テルモ社製）；0.045～0.675% (w/v)、CryoSure DMSO (DMSO; WAK-Chemie Medical GmbH社製)；6.0～10.0% (v/v)、ヒト血清アルブミン；（HuSA；日本血液製剤機構製）；1.75～2.75% (w/v)であった。（表５）
（３－２）重炭酸リンゲル液を含む凍結保存液の場合
　重炭酸リンゲル液を含む凍結保存液を用いて実施例１で調製したNK細胞の凍結保存を行う場合、既存の凍結保存液であるSCBに比べて、解凍後の生細胞回収率が顕著に高い組成を複数得ることができた。好ましい組成は、重炭酸リンゲル液；44.0～66.1% (v/v)、Dextran40；3.60～7.44% (w/v)、Glucose；0.09～0.25% (w/v)、DMSO；8.5～11.0% (v/v)、HuSA；1.875～3.375% (w/v)であった。（表６）
［実施例５］NK細胞の時間安定性における凍結保存液検討
（１）NK細胞懸濁液と凍結保存液の混合と凍結作業
　実施例１で調製したNK細胞を含有する培養液を300xgで5分間遠心後、培地上清を除いた。NK細胞の沈殿をタッピングにより溶解して生理食塩水もしくは重炭酸リンゲル液に懸濁した後、表７に示す各組成の凍結保存液を加えてよく混合した。凍結保存液を加えた細胞懸濁液を凍結容器に分取し、目的の時間（1, 2, 4時間）室温で静置した後、凍結保存容器（Mr. FrostyもしくはBICELL）に移して、-80℃で凍結した。
（２）凍結保存後のNK細胞の解凍及び回復培養
　NK細胞を解凍した後、実施例１のNK細胞拡大培養用の培地を用いて、12-wellプレートに1.0 x 106 cells/mLとなるように再播種し、37℃、5％ CO2の条件下、インキュベーター中で3日間の回復培養を行った。その後well内の生細胞密度及び細胞生存率を測定し、生細胞回収率（式(I)参照）をSCB相対値として算出した。結果を表７（培養終了Day3 SCB相対値）に示す。
　凍結保存液との混合後に室温で0h～4hの間静置したときの経時的な生細胞回収率の低下に対し、重炭酸リンゲル液を含む凍結保存液を用いて凍結保存を行う場合、既存の凍結保存液であるSCBに比べて顕著に高い生細胞回収率を維持できた。特に、好ましい組成は、重炭酸リンゲル液；43.2～66.10% (v/v)、Dextran40；3.60～10.06% (w/v)、Glucose；0.05～0.41% (w/v)、DMSO；6.0～11.0% (v/v)、HuSA；1.50～2.95% (w/v)であった。（表７）
［実施例６］NK細胞の凍結融解後の希釈液
　NK細胞を解凍した後、0.1 mLの細胞懸濁液を10倍量のそれぞれの生理的水溶液に希釈懸濁し、室温で1、2、4時間静置後の安定性を評価した。生理的水溶液の対照として回復培養用の培地を用いた。静置後の細胞懸濁液は300xg、5分の遠心分離で上清を除去後、実施例１のNK細胞拡大培養用の培地2 mLに再懸濁し、12-wellプレートに1.9 mL播種し、37℃、5％ CO2の条件下、インキュベーター中で3日間の回復培養を行った。その後well内の生細胞密度を測定し、生細胞数を計測した。生理的水溶液として、生理食塩水（大塚製薬工場社製）、ヴィーンD（酢酸リンゲル液；扶桑薬品社製）、ヴィーンF（酢酸リンゲル液；扶桑薬品社製）、ビカネイト（重炭酸リンゲル液；大塚製薬工場社製）、ビカーボン（重炭酸リンゲル液；エイワイファーマ社製）を用いて検討した（各生理的水溶液の組成を表８に示す）。
　生理食塩水、ヴィーンF及びヴィーンDを用いた実験の結果を表９に、生理食塩水及びビカネイトを用いた実験の結果を表１０に、生理食塩水、ビカネイト及びビカーボンを用いた実験の結果を表１１に、それぞれ示した。
　表９－１１に示されるとおり、実施例4の方法により凍結保存NK細胞を融解後、生理的水溶液に10倍希釈懸濁し、静置した後、経時的な生細胞数の回収の低下を評価したところ、重炭酸リンゲル液であるビカネイトやビカーボンを用いた場合、生理食塩水、ヴィーンDやヴィーンFを用いた場合に比べて顕著に高い生細胞数の回収を得た。重炭酸リンゲル液はNK細胞凍結製剤の患者への投与時の希釈液として、高い生細胞数の維持効果を有していることが明らかとなった。
　本発明の洗浄方法及び凍結保存方法によれば、凍結・解凍後も高い細胞の回収率及び生存率を維持し、かつ高い生理活性を維持した移植用リンパ球（例、NK細胞、T細胞等）を製造することができる。また、本発明のリンパ球含有組成物と移植用希釈液によれば、解凍後、移植までの間、室温保存しても高い細胞生存率を維持することができ、移植により適したリンパ球製剤を提供することができる。従って、本発明は、がん免疫療法をはじめとするリンパ球による細胞免疫療法において極めて有用である。
（関連出願の相互参照）
　本出願は、2022年11月18日付で日本国に出願された特願2022-185201を基礎としており、ここで参照することによってその内容全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (13)

  1. 　リンパ球を炭酸水素イオン含有生理的水溶液で洗浄することを含む、リンパ球の洗浄方法。
  2. 　リンパ球がT細胞又はNK細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　炭酸水素イオン含有生理的水溶液が重炭酸リンゲル液である、請求項１に記載の方法。
  4. 　請求項１に記載の方法により処理されたリンパ球を、生理的水溶液を含有する凍結保存液に懸濁し凍結することを含む、リンパ球の凍結保存方法。
  5. 　生理的水溶液が炭酸水素イオン含有生理的水溶液である、請求項４に記載の方法。
  6. 　炭酸水素イオン含有生理的水溶液が重炭酸リンゲル液である、請求項５に記載の方法。
  7. 　炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有してなる、リンパ球用洗浄液。
  8. 　炭酸水素イオン含有生理的水溶液、デキストラン、グルコース、DMSO及びヒト血清アルブミンを含有してなる、リンパ球用凍結保存液。
  9. 　炭酸水素イオン含有生理的水溶液で処理されたリンパ球と、請求項８に記載の凍結保存液とを含有してなる、リンパ球含有組成物。
  10. 　請求項９に記載のリンパ球含有組成物と、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液とを含む、移植用リンパ球の調製用キット。
  11. 　請求項９に記載のリンパ球含有組成物のための移植用希釈液であって、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有してなる、移植用希釈液。
  12. 　凍結保存後解凍した請求項９に記載のリンパ球含有組成物を、炭酸水素イオン含有生理的水溶液を含有する移植用希釈液で希釈することを含む、移植用リンパ球の調製方法。
  13. 　請求項１２に記載の方法により得られる、移植用リンパ球製剤。
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