CN111449053A - 一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明本提供的免疫细胞储存液中不含有冻存保护剂DMSO，未引入外源动物源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，冻存单位细胞数量更高，并且充分保证免疫细胞的冻存活性和免疫细胞的复苏率。

Description

一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞储存领域，具体的说，涉及了一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法。
背景技术
免疫细胞是一类参与免疫应答或免疫应答相关的细胞，主要包括淋巴细胞群、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，统称为外周血单个核细胞。它们在人体内发挥着稳定机体健康、良态重要的作用，是人体的免疫防御、免疫稳定和免疫监视的角色。
近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术应用于临床，可通过自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力。但是，人体的免疫力在20岁到达最巅峰后，免疫系统便随著年龄老化而逐渐走下坡，当40岁时，免疫力只有巅峰时的1/2；等到了70岁，更是只剩下巅峰期的1/10。在无法顺利取得健康免疫细胞的情况下，治疗效果势必大打折扣。如果预先将健康的免疫细胞储存起来，越有可能寻找到精准细胞来对抗癌症风险，同时可以抗衰老美容。
免疫细胞治疗主要来自患者自身外周血，通过分离和收集得到外周血单个核细胞。但一般说来，接受免疫细胞治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染人群，此类人群其本身的免疫细胞机能已十分低下，分离出免疫细胞活性较低。因此人们可在自身免疫细胞活性强时，提前将健康细胞储存起来，以备将来治病同时可以抗衰老美容之需。
为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种免疫细胞储存液，每1000ml储存液包括以下成份及含量：25-75g蔗糖；50-150ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
基于上述，每1000ml储存液包括以下成份及含量：50g蔗糖；100ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
基于上述，每1000ml储存液包括以下成份及含量：75g蔗糖；150ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
基于上述，每1000ml储存液包括以下成份及含量：25g蔗糖；50ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
一种免疫细胞储存液制备方法，其包括以下步骤，按照上述的配比备料，混合均匀，得到免疫细胞储存液。
基于上述，该免疫细胞储存液制备方法，其还包括以下步骤，将抗凝外周血在2000-3000r/min离心10-20min，然后取上清液，得到人自体血浆。
一种免疫细胞储存方法，其包括以下步骤，将免疫细胞与上述的免疫细胞储存液混合；进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
基于上述，混合后免疫细胞储存液中的细胞数量3×107/ml。
基于上述，先将免疫细胞储存液预冷至4℃，然后沿壁缓慢加入，吹打混匀。
基于上述，所述免疫细胞为外周血单个核细胞。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著进步，具体的说，本发明本提供的免疫细胞储存液中不含有冻存保护剂DMSO，未引入外源动物源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，冻存单位细胞数量更高，并且充分保证免疫细胞的冻存活性和免疫细胞的复苏率；具体的，添加外周血血浆中均富含各种矿物质离子和蛋白因子，可提供细胞代谢所述物质并维持细胞所述的渗透压，是外周血免疫细胞的天然营养体系和缓冲体系；采用来自外周血血浆结合其他组分作为外周血免疫细胞的细胞储存液，不仅可以避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，使得免疫细胞的冻存更加安全有效，更有利于免疫细胞恢复活性后进行临床应用；另外，采用非渗透性冷冻保护剂甘油和渗透性冷冻保护剂蔗糖，避免免疫细胞过度失水，减少冰晶的产生，降低免疫细胞的冷冻损伤，并且对蔗糖和甘油的用量和配比进行优化，使两者结合起到增益效果，提高保护效果的同时也降低冻存成本；同时，添加银耳多糖、维生素E避免免疫细胞在冻存过程中凋亡或氧化，保证其增殖活性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
以下实验中：无血清培养基采用GT-T551免疫细胞无血清培养基，上海联逊生物科技有限公司；选取健康的志愿者，取其外周血，将抗凝外周血(可以采用柠檬酸钠或EDTA等其它抗凝方式)在2000-3000r/min离心10-20min，然后取上清液，得到人自体血浆；取制备供体血浆时离心后的下部细胞成分，加生理盐水至原体积，混匀铺到2个预先加入了20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，保持界面清晰无相互渗透，离心机升降速均调至最低，室温，离心15min；取中间白膜层的单个核细胞，补充适量的无血清培养基混匀，2000r/min离心5min，弃上清充适量的无血清培养基混匀，1000r/min离心8min，并摇匀，并离心弃上清液；补充适量的无血清培养基，摇匀；再吸取细胞悬浮液并用台盼蓝染料进行染色和计数。
一种免疫细胞储存方法，其包括以下步骤，将免疫细胞与制得的免疫细胞储存液混合；进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存；混合后免疫细胞储存液中的细胞数量约为3×107/ml。先将免疫细胞储存液预冷至4℃，然后沿壁缓慢加入，吹打混匀。
免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在2min内；将解冻后进行台盼蓝染色计算活性。
实施例1
一种免疫细胞储存液，每1000ml储存液包括以下成份及含量：25g蔗糖；50ml甘油；8g银耳多糖；10g维生素E；270ml人自体血浆；余量为无血清培养基，按照上述的配比备料，混合均匀，得到免疫细胞储存液，于4℃保存备用。
实施例2
一种免疫细胞储存液，每1000ml储存液包括以下成份及含量：50g蔗糖；100ml甘油；6g银耳多糖；6g维生素E；300ml人自体血浆；余量为无血清培养基，按照上述的配比备料，混合均匀，得到免疫细胞储存液，于4℃保存备用。
实施例3
一种免疫细胞储存液，每1000ml储存液包括以下成份及含量：75g蔗糖；150ml甘油；11g银耳多糖；10g维生素E；250ml人自体血浆；余量为无血清培养基，按照上述的配比备料，混合均匀，得到免疫细胞储存液，于4℃保存备用。
实施例4
一种免疫细胞储存液，每1000ml储存液包括以下成份及含量：25g蔗糖；50ml甘油；8g银耳多糖；8g维生素E；280ml人自体血浆；余量为无血清培养基，按照上述的配比备料，混合均匀，得到免疫细胞储存液，于4℃保存备用。
检测数据
表1利用实施例1-4提供的免疫细胞储存液冻存后细胞活性检测结果
冻存时间(10d) 冻存时间(30d) 冻存时间(60d)
实施例1 94.2％ 93.5％ 93.3％
实施例2 94.7％ 94.1％ 93.7％
实施例3 98.2％ 97.8％ 97.5％
实施例4 94.1％ 93.9％ 93.6％
对比实验
对比实验所采用的实验原料和方法与实施例1-4相同，每1000ml储存液包括以下成份及含量：A g蔗糖；B ml甘油；C g银耳多糖；D g维生素E；270ml人自体血浆；余量为无血清培养基，具体配方参见表2；采用对比实验得到的细胞储存液冻存30d后活性检测结果参见表2。
表2对比实验配方活及性检测结果
Figure BDA0002498630760000041
Figure BDA0002498630760000051
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种免疫细胞储存液，其特征在于：每1000 ml储存液包括以下成份及含量：25-75 g蔗糖；50-150 ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300 ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞储存液，其特征在于：每1000 ml储存液包括以下成份及含量：50 g蔗糖；100 ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300 ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞储存液，其特征在于：每1000 ml储存液包括以下成份及含量：75 g蔗糖；150 ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300 ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞储存液，其特征在于：每1000 ml储存液包括以下成份及含量：25 g蔗糖； 50 ml甘油；6-11g银耳多糖；6-11g维生素E；200-300 ml人自体血浆；余量为无血清培养基。
5.一种免疫细胞储存液制备方法，其包括以下步骤，按照权利要求1-4任一项中的配比备料，混合均匀，得到免疫细胞储存液。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞储存液制备方法，其还包括以下步骤，将抗凝外周血在2000-3000 r/min离心10-20 min，然后取上清液，得到人自体血浆。
7.一种免疫细胞储存方法，其包括以下步骤，将免疫细胞与权利要求1-6任一项所述的免疫细胞储存液混合；进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
8.根据权利要求7所述的免疫细胞储存方法，其特征在于：混合后免疫细胞储存液中的细胞数量3×107/ml。
9.根据权利要求7所述的免疫细胞储存方法，其特征在于：先将免疫细胞储存液预冷至4℃，然后沿壁缓慢加入，吹打混匀。
10.根据权利要求7所述的免疫细胞储存方法，其特征在于：所述免疫细胞为外周血单个核细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112369408A (zh) * 2020-11-11 2021-02-19 青岛中德华大细胞科技有限责任公司 一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102669087A (zh) * 2012-05-15 2012-09-19 深圳市博泰生物医疗机构管理有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法
CN104082277A (zh) * 2014-07-25 2014-10-08 成都清科生物科技有限公司 一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法
WO2014162910A1 (ja) * 2013-04-03 2014-10-09 石原産業株式会社 生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法
CN105543168A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 北京弘润天源生物技术股份有限公司 免疫细胞的储存及运输方法
CN106818710A (zh) * 2017-02-10 2017-06-13 深圳市合康生物科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其制备方法和应用
CN107372461A (zh) * 2017-04-10 2017-11-24 东营凤起生物科技发展有限公司 一种经黄芪提取物fqr‑8诱导的dc‑cik细胞的高效活性保存方法
CN109526943A (zh) * 2018-12-30 2019-03-29 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种免疫细胞冻存方法
CN110447636A (zh) * 2019-08-07 2019-11-15 广东万海细胞生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法
CN110881459A (zh) * 2019-11-14 2020-03-17 武汉济源高科技有限公司 一种人外周血单个核细胞冻存方法
CN110934134A (zh) * 2019-12-31 2020-03-31 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102669087A (zh) * 2012-05-15 2012-09-19 深圳市博泰生物医疗机构管理有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法
WO2014162910A1 (ja) * 2013-04-03 2014-10-09 石原産業株式会社 生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法
CN104082277A (zh) * 2014-07-25 2014-10-08 成都清科生物科技有限公司 一种人外周血单个核细胞的冻存保护剂及保存方法
CN105543168A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 北京弘润天源生物技术股份有限公司 免疫细胞的储存及运输方法
CN106818710A (zh) * 2017-02-10 2017-06-13 深圳市合康生物科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其制备方法和应用
CN107372461A (zh) * 2017-04-10 2017-11-24 东营凤起生物科技发展有限公司 一种经黄芪提取物fqr‑8诱导的dc‑cik细胞的高效活性保存方法
CN109526943A (zh) * 2018-12-30 2019-03-29 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种免疫细胞冻存方法
CN110447636A (zh) * 2019-08-07 2019-11-15 广东万海细胞生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法
CN110881459A (zh) * 2019-11-14 2020-03-17 武汉济源高科技有限公司 一种人外周血单个核细胞冻存方法
CN110934134A (zh) * 2019-12-31 2020-03-31 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112369408A (zh) * 2020-11-11 2021-02-19 青岛中德华大细胞科技有限责任公司 一种免疫细胞储存液及其制备与应用方法

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