WO2014162910A1 - 生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法 - Google Patents

生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法 Download PDF

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WO2014162910A1
WO2014162910A1 PCT/JP2014/058108 JP2014058108W WO2014162910A1 WO 2014162910 A1 WO2014162910 A1 WO 2014162910A1 JP 2014058108 W JP2014058108 W JP 2014058108W WO 2014162910 A1 WO2014162910 A1 WO 2014162910A1
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cells
cell
organ
stem
biological material
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PCT/JP2014/058108
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加藤　文法
清三 藤川
昇 本村
綾 齋藤
正吾 嶋田
晋一 尾崎
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石原産業株式会社
国立大学法人東京大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/06—Freezing; Subsequent thawing; Cooling
    • A23B4/08—Freezing; Subsequent thawing; Cooling with addition of chemicals or treatment with chemicals before or during cooling, e.g. in the form of an ice coating or frozen block
    • A23B4/09—Freezing; Subsequent thawing; Cooling with addition of chemicals or treatment with chemicals before or during cooling, e.g. in the form of an ice coating or frozen block with direct contact between the food and the chemical, e.g. liquid N2, at cryogenic temperature
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/04—Freezing; Subsequent thawing; Cooling
    • A23B7/05—Freezing; Subsequent thawing; Cooling with addition of chemicals or treatment with chemicals other than cryogenics, before or during cooling, e.g. in the form of an ice coating or frozen block
    • A23B7/055—Freezing; Subsequent thawing; Cooling with addition of chemicals or treatment with chemicals other than cryogenics, before or during cooling, e.g. in the form of an ice coating or frozen block with direct contact between the food and the chemical, e.g. liquid nitrogen, at cryogenic temperature

Definitions

  • the present invention relates to a preservative for cryopreserving biological materials, and a preservation solution for cryopreserving biological materials containing the preservatives. Furthermore, the present invention relates to a method for preserving biological materials at low temperatures.
  • the present invention also relates to a preservative for cryopreserving the organ for transplantation, a preservation solution for the organ for transplantation containing the preservative, and a method for preserving the organ for transplantation.
  • the cells have different ion compositions inside and outside the cell membrane, and the difference in the distribution of ions having this charge brings about a potential difference.
  • the intracellular potential is negative with respect to the outside of the cell (membrane potential), and this membrane potential exists as a basic principle common to living organisms regardless of animals or plants.
  • the regulation mechanism of membrane potential is indispensable for life support and cell function, and its failure directly leads to life or cell death.
  • ion pumps and ion channels on the inner and outer membranes there are various ion pumps and ion channels on the inner and outer membranes, and ion balance is constantly adjusted.
  • the most important regulatory mechanism includes a sodium pump (Na + -K + ATPase) in animal cells and a proton pump (H + -ATPase) in plant cells.
  • Na + -K + ATPase sodium pump
  • H + -ATPase proton pump
  • These ion pumps are membrane proteins that actively transport specific ions using ATP energy. If ATP is depleted for some reason or the ambient temperature deviates from the optimum range, the function of the ion pump will be reduced or stopped.
  • the sodium pump mainly pumps out three intracellular sodium ions each time, and conversely, two potassium ions are pumped into the cell from the outside. Therefore, normally, intracellular potassium concentration is high (sodium concentration is low), and extracellular sodium concentration is high (potassium concentration is low).
  • intracellular potassium concentration is high (sodium concentration is low)
  • extracellular sodium concentration is high (potassium concentration is low).
  • the temperature of the cell falls below a certain temperature
  • the function of the sodium pump declines, so that sodium cannot be pumped out of the cell, and the intracellular sodium concentration increases.
  • the intracellular osmotic pressure rises, and the inflow of water molecules causes the cells to swell and eventually lead to cell rupture (cytotoxicity).
  • the above mechanism is considered to be one of the main causes of cell damage when organs for transplantation are cryopreserved at the time of organ transplantation in the medical field, and the basic composition of the electrolyte is intracellular low sodium and high potassium Organ preservation solutions have been developed. Typical examples are Euro Collins (EC) solution and UW (University Wisconsin) solution. Compared with the extracellular type (high sodium, low potassium) preservation solution centered on Ringer's solution up to now, these have made it possible to greatly extend the preservation period of transplanted organs. It is applied clinically as a preservation solution. However, these intracellular storage solutions have a risk of reversing and causing cytotoxicity when the storage temperature rises. Moreover, these cannot be applied to all organs for transplantation, and further improvement in performance is expected, including further extension of the storage period.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • MEF embryonic fibroblast
  • bovine in vitro fertilization technology made it possible to produce high quality in vitro fertilized embryos from ovaries derived from slaughterhouses.
  • bovine in vitro fertilization technology made it possible to produce high quality in vitro fertilized embryos from ovaries derived from slaughterhouses.
  • eggs for bovine in vitro fertilization are collected from bovine living bodies, there is a problem that viability cannot be maintained unless they are cultured immediately under appropriate conditions after being collected from bovine living bodies.
  • Patent Document 1 discloses that immature eggs collected by using a medium containing a protein synthesis inhibitor typified by cycloheximide is stored at room temperature and in the air. A method is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a method for preserving bovine ovary by immersing bovine ovary in a preservation solution and preserving it at 10 to 20 ° C.
  • Patent Document 3 discloses a method for preserving a biological material by adding a preservation solution containing one or more polyphenols to the biological material and cooling.
  • catechins are disclosed as polyphenols. Only.
  • Patent Document 4 discloses a method of refrigerated storage of cells at a temperature at which water does not crystallize, for example, a temperature around 4 ° C., by adding an enkephalin derivative to the cell culture medium.
  • Patent Document 5 discloses a medical polyphenol solution containing polyphenol and 0.0001 to 0.05% by weight of ascorbic acid or a metal salt of ascorbic acid for use as a cell preservative, tissue preservative, or the like. It is disclosed that decomposition is suppressed and generation of hydrogen peroxide is suppressed. In Examples, only epigallocatechin gallate (EGCg) is disclosed as a polyphenol.
  • Patent Document 6 discloses a composition for a preservative containing 90% by mass or more of epigallocatechin gallate as an active ingredient, and the effect of preserving cells is more constant by using purified epigallocatechin gallate with high purity. It is described that it can be.
  • Patent Document 7 discloses a flavonoid glycoside having an ability to promote the supercooling ability of an aqueous solution.
  • an antifreeze liquid that can be used at about -15 ° C with water. Therefore, it is described that biological materials and the like can be stored in the antifreeze liquid.
  • the following patent documents 8 to 10 also report on the method of using the supercooling promoting substance flavonoid glycoside disclosed in Patent Document 7.
  • Patent Document 8 discloses a beverage that can maintain a supercooled state containing the flavonoid glycoside.
  • Patent Document 9 discloses a cryopreservation solution in which the above flavonoid glycoside is contained in a vitrification solution, which is less toxic than conventional vitrification solutions and increases the viability of cells and the like by storage. It describes what you can do.
  • Patent Document 10 discloses that by using an organ preservation solution containing the flavonoid glycoside, it is possible to preserve an animal organ at a temperature of 0 ° C. or lower without freezing. Has been.
  • Patent Documents 1 to 6 do not substantially disclose the use of a compound having a flavonol structure in a solution for preserving cells and organs.
  • Patent Documents 7 and 10 disclose that by using a flavonoid glycoside, cells can be stored at 0 ° C. or less without freezing injury because they can be supercooled to a temperature below freezing point without freezing. However, there is no disclosure of reduction of cold injury under normal cold conditions. Moreover, there is no such disclosure about a flavonol compound containing no sugar.
  • the present invention provides a preservative for cryopreserving biological materials, a preservation solution for cryopreserving biological materials containing the preservative, and a method for preserving biological materials at low temperatures in order to reduce these low temperature injuries.
  • another object of the present invention is to provide a preservative for cryopreserving an organ for transplantation, a preservation solution for an organ for transplantation containing the preservative, and a method for preserving an organ for transplantation.
  • the present inventors use a specific compound having a flavonol structure having no sugar in combination with a specific flavonoid glycoside compound having a supercooling ability, and a normal refrigeration temperature from a low temperature before and after freezing without freezing. It was found that by preserving the cells at a low temperature up to, the viability of the cells was increased by a synergistic effect and a cold injury protection effect was obtained.
  • the present invention has been completed based on these findings, and provides the following preservatives, preservatives, and storage methods.
  • R 1 to R 9 are the same or different and are —H, —OH or an alkoxy group]
  • a preservative for cryopreservation of a biological material comprising a flavonoid glycoside compound represented by (I-2)
  • the flavonoid compound represented by the formula (I) is at least one selected from the group consisting of myricetin, quercetin, kaempferol, galangin, isorhamnetin, fisetin and flavonol, and is represented by the formula (II)
  • the preservative according to (I-1) wherein the flavonoid glycoside compound is at least one selected from the group consisting of quercetin-3-glucoside, kaempferol-7-glucoside and apigenin-7-glucoside.
  • the animal or plant cell, tissue or organ is an egg cell, fertilized egg cell, sperm cell, embryonic stem cell, iPS cell, adult stem cell, hematopoietic stem cell, tissue stem cell, fibroblast, feeder cell, vascular endothelial cell , Bone marrow (stem) cells, dental pulp (stem) cells, immune cells, hepatocytes, kidney cells, neurons, pancreatic cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, myoblasts, corneal cells, retinal cells, bone cells, osteoclasts Cells, chondrocytes, cartilage progenitor cells, synovial cells, synovial stem cells, osteoblasts, odontocytes, periodontal ligament cells, oral mucosa cells, nasal mucosa cells, mesenchymal stem cells, adipocytes, adipose
  • (I-5) The preservative according to (I-1) or (I-2), wherein the biological material is beef, pork, chicken, fish, shellfish, cereals, vegetables or fruits, or flowers as food.
  • (I-6) The preservative according to (I-1) or (I-2), wherein the biological material is an organ for transplantation.
  • (I-7) The preservative according to (I-6), wherein the organ for transplantation is a heart or a kidney.
  • the low temperature is a temperature at which the biological material does not completely freeze, that is, a temperature of -15 ° C to 20 ° C, according to any one of (I-1) to (I-7) Preservatives.
  • (I-9) A cryoprotective agent comprising a flavonoid compound represented by formula (I) and a flavonoid glycoside compound represented by formula (II).
  • (II) Stock solution
  • (II-1) A preservation solution for low-temperature preservation of a biological material containing the preservative according to (I-1) or (I-2).
  • (II-2) The preservation solution according to (II-1), wherein the biological material is an animal or plant cell, a cultured cell sheet, a tissue or an organ.
  • (II-3) The preservation solution according to (II-1), wherein the biological material is beef, pork, chicken, fish, shellfish, cereals, vegetables or fruits, or flowers as food.
  • (II-4) An organ preservation solution containing the preservative according to (I-6) or (I-7).
  • the flavonoid compound represented by the formula (I) is at least one selected from the group consisting of myricetin, quercetin, kaempferol, galangin, isorhamnetin, fisetin and flavonol, and is represented by the formula (II)
  • III-3 The method according to (III-1) or (III-2), wherein the biological material is an animal or plant cell, tissue or organ.
  • the animal or plant cell, tissue or organ is egg cell, fertilized egg cell, sperm cell, embryonic stem cell, iPS cell, adult stem cell, hematopoietic stem cell, tissue stem cell, fibroblast, feeder cell, vascular endothelial cell , Bone marrow (stem) cells, dental pulp (stem) cells, immune cells, hepatocytes, kidney cells, neurons, pancreatic cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, myoblasts, corneal cells, retinal cells, bone cells, osteoclasts Cells, chondrocytes, cartilage progenitor cells, synovial cells, synovial stem cells, osteoblasts, odontocytes, periodontal ligament cells, oral mucosa cells, nasal mucosa cells, mesenchymal stem cells, adipocytes, adipose stem cells, epithelium
  • the method according to (III-3) which is a cell, endothelial cell, muscle cell, epidermal cell,
  • the low temperature is a temperature at which the biological material does not completely freeze, that is, a temperature of -15 ° C to 20 ° C, according to any one of (III-1) to (III-5) the method of.
  • (III-7) A preservation solution containing a flavonoid compound represented by the formula (I) defined by (I-1) and a flavonoid glycoside compound represented by the formula (II) is injected into an organ for transplantation and / or Or the preservation
  • (III-8) The method according to (III-7), wherein the organ for transplantation is a heart or a kidney.
  • the present invention can be expected to be applied in fields such as blood transfusion medicine, regenerative medicine, livestock breeding, and food preservation. Further, the present invention can be expected to be applied in the field of organ transplantation.
  • FIG. 2 is a graph showing the combined effect of compound (I) and compound (II) on low temperature (4 ° C.) storage of HL-60 cells in physiological saline in Test Example 1.
  • A Combined use of quercetin and A7G
  • FIG. 2 is a graph showing the combined effect of Compound (I) and Compound (II) on low temperature (4 ° C.) storage of HL-60 cells in UW solution in Test Example 1.
  • A Combined use of quercetin and A7G
  • B Combined use of quercetin and Q3G
  • C Combined use of quercetin and K7G.
  • (1) The number of viable cells when compound (II) is used in combination
  • FIG. 6 is a graph showing the combined effect of compound (I) (quercetin) and compound (II) (K7G) on low temperature ( ⁇ 5 ° C.) preservation of HAEC cells in physiological saline in Test Example 2.
  • the plots in the figure are (1) the number of living cells of compound (II) alone, (2) the number of living cells when compound (I) and compound (II) are used in combination, and (3) the survival of compound (I) alone.
  • the preservative for cryopreservation of biological materials such as cells, tissues, organs, foods, florets and transplanted organs of the present invention is represented by the formula (I):
  • R 1 to R 9 are the same or different and are —H, —OH or an alkoxy group]
  • R 10 and R 11 are —H, —OH or a glucose residue, at least one of which is a glucose residue, and R 12 to R 18 are the same or different and represent —H, —OH Or an alkoxy group].
  • the biological material storage method of the present invention includes immersing the biological material in a storage solution containing the flavonoid compound represented by the above formula (I) and the flavonoid glycoside compound represented by the formula (II), and the solution Is maintained at a low temperature.
  • R 1 to R 4 , R 12 and R 13 are preferably the same or different and are —H or —OH.
  • the alkoxy group is preferably an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and particularly preferably —OCH 3 .
  • the alkyl part of the alkoxy group may be linear or branched. Examples of the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentyloxy, isopentyloxy, hexyloxy and the like.
  • flavonoid compound (I) examples include myricetin, quercetin, kaempferol, galangin, isorhamnetin, fisetin, and flavonol.
  • flavonoid glycoside compound (II) examples include quercetin-3-Glucoside (Q3G), kaempferol-7-glucoside (K7G), apigenin-7- Examples include glucoside (Apigenin-7-Glucoside) (A7G).
  • the flavonoid compound (I) and the flavonoid glycoside compound (II) can be chemically synthesized by known methods, and are contained in living organisms such as plants, and therefore extracted from these by known methods. You can also get it. Moreover, it is also possible to obtain with a commercial item.
  • the low temperature is a temperature at which biological materials such as cells, tissues, organs, foods, florets, transplanted organs and the like are not completely frozen, that is, ⁇ 15 ° C. or higher, preferably ⁇ 10 ° C. or higher, more preferably ⁇
  • the temperature is 5 ° C or higher and 20 ° C or lower, preferably 15 ° C or lower, more preferably 10 ° C or lower.
  • low temperature injury means cell injury caused by low temperature
  • low temperature injury protection effect means an effect of protecting cells from the low temperature injury. Therefore, taking this meaning into consideration, the preservative of the present invention can also be referred to as a low-temperature injury protective agent.
  • the biological material used in the present invention is not limited as long as the effects of the present invention are obtained, but any biological material can be used.
  • animal or plant cells, tissues, organs, foods, florets, transplants Examples include organs for use.
  • the tissue, organ, food, etc. may be derived from any animal or plant. Mammals (humans, monkeys, cows, pigs, horses, dogs, cats, rabbits, mice, rats, etc.) are desirable as animals targeted by the present invention.
  • the tissues and organs are not extracted from the animal body for the purpose of organ transplantation, such as those obtained by tissue culture of cells, those extracted from the animal body for the purpose of livestock breeding, etc. Is mentioned.
  • Animal cells include egg cells, fertilized egg cells, sperm cells, embryonic stem cells, iPS (induced pluripotent stem) cells, adult stem cells, hematopoietic stem cells, tissue stem cells, fibroblasts, feeder cells, bone marrow (stem) cells, dental pulp ( Stem) cells, immune cells, hepatocytes, kidney cells, pancreas cells, blood cells (blood cells) (red blood cells, white blood cells and platelets), cardiomyocytes, osteoblasts, neurons, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, bone cells, Osteoclasts, chondrocytes, cartilage progenitor cells, adipocytes, adipose stem cells, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, epidermis cells, myoblasts, corneal cells, retinal cells, synovial cells, synovial stem cells, tooth buds Examples include cells, periodontal ligament cells, oral mucosal cells, nasal mucosal cells, and mesen
  • An immune cell means a cell involved in an immune response, and examples of such a cell include T cell, B cell, NK cell, NKT cell, monocyte, dendritic cell, macrophage, eosinophil, Examples include neutrophils and basophils.
  • Plant cells include callus, protoplasts, hybrid cells in which different protoplasts are fused together, and the like.
  • Animal or plant cells may be in a free state in a preservation solution, in an adherence state on a culture dish, or in a cell sheet state.
  • Animal or plant cells may be artificially produced dedifferentiated cells, tumor cells, hybridoma cells or differentiated cells, or naturally occurring dedifferentiated cells, tumor cells or differentiated cells, which are It may be a cell.
  • tissue examples include epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, nerve tissue and the like.
  • the tissue may be in a tissue state in a preservation solution or may be in a tissue-slided state.
  • Organs include esophagus, stomach, intestine, liver, pancreas, spleen, lung, trachea, heart, blood vessel, lymphatic vessel, lymph node, kidney, bladder, ovary, testis, oviduct, vas deferens, uterus, placenta, umbilical cord, skin, Examples include the diaphragm, cornea, retina, eyeball, and nerve.
  • the organ for transplantation referred to in the present invention is an organ removed from an animal body for the purpose of organ transplantation (for example, esophagus, stomach, intestine, liver, pancreas, lung, trachea, heart, blood vessel, kidney, bladder, skin, (Diaphragm, cornea, retina, eyeball, nerve, etc.), preferably heart and kidney.
  • Mammals humans, monkeys, cows, pigs, horses, dogs, cats, rabbits, mice, rats, etc. are desirable as animals.
  • the biological material used in the present invention may be meat, seafood and plants used as food, and examples thereof include beef, pork, chicken, fish, shellfish, cereals, vegetables, fruits and the like. It is done. Other biological materials include flower buds, which are ornamental plants.
  • the preservative of the present invention may contain known additives as appropriate.
  • the preservation solution for low temperature preservation of the biological material of the present invention is characterized by containing the above preservative.
  • the preservation solution contains a liquid in addition to the flavonoid compound (I) and the flavonoid glycoside compound (II), and the flavonoid compound (I) and the flavonoid glycoside compound (II) are completely dissolved in the liquid. You don't have to.
  • the preservation solution may be in a solution state, a frozen state, or a slurry ice state, and the preservation solution may be mixed with another frozen or slurry ice state product.
  • the liquid when cryopreserving animal or plant cells, tissues and organs as biological materials, the liquid is not particularly limited, but examples thereof include physiological saline, infusions (electrolyte infusion, nutritional infusion, sugar Infusion solution, amino acid infusion solution, glucose solution, Ringer's solution, Ringer's acetate solution, Ringer's acetate solution, buffer solution (PBS, Tris buffer solution, Hepes buffer solution, MOPS buffer solution, PIPES buffer solution, etc.), cell culture solution (RPMI1640, DMEM, etc.) ), Organ preservation solution (EC solution, UW solution, etc.), modena solution, etc. are used.
  • physiological saline infusions (electrolyte infusion, nutritional infusion, sugar Infusion solution, amino acid infusion solution, glucose solution, Ringer's solution, Ringer's acetate solution, Ringer's acetate solution, buffer solution (PBS, Tris buffer solution, Hepes buffer solution, MOPS buffer solution, PIPES buffer solution,
  • the concentration of the flavonoid compound (I) in the preservation solution for animal or plant cells, tissues and organs of the present invention is usually 0.001 to 1000 ⁇ g / ml, preferably 0.01 to 100 ⁇ g / ml.
  • the concentration of the flavonoid glycoside compound (II) in the preservation solution of the present invention is usually 0.001 to 1000 ⁇ g / ml, preferably 0.01 to 100 ⁇ g / ml.
  • the animal or plant cell, tissue and organ preservation solution of the present invention contains other conventional components such as buffers, antibiotics, antibacterial agents, antioxidants, serum, saccharides, lipids, vitamins, proteins, peptides. , Amino acids, pH indicators, pH regulators, chelating agents, osmotic pressure regulators and the like.
  • preservation of animal or plant cells, tissues and organs can be performed by immersing a biological material in a preservation solution.
  • the preservation solution may be cooled to a low temperature before immersing the animal or plant cell, tissue or organ, or may be cooled to a low temperature after immersing.
  • the preservation solution containing animal or plant cells, tissues, and organs is cooled to a low temperature, it is kept at a low temperature. However, it is not always necessary to maintain a constant temperature. It may be at temperature.
  • a biological material when meat, fish and shellfish and plants used as food are stored at a low temperature, water, seawater, saline, physiological saline, buffer, etc. are used as the liquid. In addition, two or more of these may be mixed and used at an appropriate ratio.
  • the concentration of the flavonoid compound (I) in the food preservation solution of the present invention is usually 0.001 to 1000 ⁇ g / ml, preferably 0.01 to 100 ⁇ g / ml.
  • the concentration of the flavonoid glycoside compound (II) in the food preservation solution of the present invention is usually 0.001 to 1000 ⁇ g / ml, preferably 0.01 to 100 ⁇ g / ml.
  • the food preservation solution of the present invention has other conventional ingredients such as phosphates, preservatives, natural flavors, enzymes, filter aids, fat eluents, antifoaming agents, pH adjusters, colorants, Coloring agents, bleaches, flavors, sweeteners, seasonings, emulsifiers, thickening stabilizers, antioxidants, bactericides, fungicides, quality improvers, sugar, lipids, vitamins, minerals, amino acids and other food additives , Food ingredients such as saccharides, lipids, proteins, peptides and the like.
  • food can be preserved by immersing the individual or a part extracted from the individual in a preservation solution. Once the preservative containing the food is cooled to a low temperature, it is kept at a low temperature. However, it is not always necessary to maintain a constant temperature, and the temperature may be outside the low temperature range for a short time.
  • the flavonoid compound (I) and the flavonoid glycoside compound (II) can be particularly preferably used as components of an organ preservation solution for transplantation.
  • the liquid is not particularly limited.
  • physiological saline infusions (electrolyte infusion, Nutrient infusion, carbohydrate infusion, amino acid infusion, glucose infusion, Ringer's solution, Ringer's acetate, Ringer's lactate, etc.), buffer (PBS, Tris buffer, Hepes buffer, MOPS buffer, PIPES buffer, etc.), cell culture ( RPMI1640, DMEM, etc.), organ preservation solution (EC solution, UW solution, etc.), modena solution, etc. are used.
  • the concentration of the flavonoid compound (I) in the preservation solution for organ for transplantation of the present invention is usually 0.001 to 1000 ⁇ g / ml, preferably 0.01 to 100 ⁇ g / ml.
  • the concentration of the flavonoid glycoside compound (II) in the organ preservation solution for transplantation of the present invention is usually 0.001 to 1000 ⁇ g / ml, preferably 0.01 to 100 ⁇ g / ml.
  • transplanted organ preservation solution of the present invention other conventional components such as antibiotics, antibacterial agents, antioxidants, serum, saccharides, lipids, vitamins, proteins, peptides, amino acids, pH indicators, pH control Agents, chelating agents, osmotic pressure regulators and the like can also be included.
  • the preservation of the organ for transplantation can be performed by injecting a preservation solution into the organ for transplantation and / or immersing the organ for transplantation removed from the animal body in the preservation solution.
  • the preservation solution may be cooled to a low temperature before immersing the organ for transplantation, or may be cooled to a low temperature after immersing the organ for transplantation.
  • the flavonoid glycoside compound (II) can be used as a supercooling accelerator.
  • a synergistic effect is exerted, and it is possible to obtain a low-temperature injury protection effect exceeding the total effect obtained by each compound alone. For the first time.
  • the survival rate is significantly preserved by preserving cells, tissues, organs, organs for transplantation, etc. at low temperatures.
  • the low temperature injury protection effect can be obtained.
  • the present invention can be stored at a low temperature suitable for storage of cells, tissues, organs, organs for transplantation, and the like, and can suppress low-temperature injury caused thereby, so that cells, tissues, organs, organs for transplantation, etc. are in an appropriate state. It can be saved. Further, the present invention can be stored at a low temperature suitable for storage of foods and florets and can suppress low-temperature injuries resulting therefrom, so that the freshness of foods and florets can be maintained.
  • the preservation solution of the present invention having the above-described features includes a preservation solution for blood cell components in the field of transfusion medicine, a preservation solution for ES cells, iPS cells, tissue stem cells and feeder cells in the field of regenerative medicine, an ovary in the field of livestock breeding, It is expected to be used as a preservation solution for egg cells, fertilized eggs and sperm cells, a preservation solution for fruits and vegetables (vegetables and fruits), seafood and meat in the field of fresh foods, a preservation solution for florets in the field of ornamental plants, etc.
  • the preservation solution for organs for transplantation of the present invention is expected to be applied as a preservation solution for organs for transplantation (especially the heart) extracted from living animals in the field of organ transplantation.
  • Test Example 1 Combination effect 1 of Compound (I) and Compound (II) in in vitro test 1
  • the protective effect against cold injury of human promyelocytic leukemia cell line HL-60 (HL-60 cells) when compound (I) and compound (II) were used in combination was evaluated by the following method.
  • RPMI-1640 (SIGMA, No.R8758) containing 10% fetal calf serum (Thermo, No.SH3D396.03) in a 5% carbon dioxide, 37 ° C. incubator (Sanyo Electric Co., MCO-17AIC) (10% FBS-RPMI) HL-60 cells cultured in the culture solution were collected, centrifuged at 4 ° C, 1,000 rpm, 5 minutes (TOMY, EIX-135), and the supernatant was removed to 2 ⁇ 10 6 The suspension was resuspended in physiological saline to a unit / ml. 0.25 ml of this cell suspension and 0.25 ml of the test compound preparation solution were mixed in a 2 ml sterilized microtube.
  • Compound (I) and Compound (II) were dissolved in 100 mg / ml with dimethyl sulfoxide (Nacalai Tesque, No. 13407-45) (DMSO) before the test, and further Compound (II) was Dilution solutions (DMSO) of 10, 1, and 0.1 mg / ml were prepared at a 10-fold common ratio. Each compound was added singly or mixed to physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Otsuka raw food injection) to give a 500-fold dilution to prepare a test compound preparation solution.
  • physiological saline Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Otsuka raw food injection
  • the mixture of the cell suspension and the test compound preparation solution was allowed to stand for about 24 hours in a cooling vessel (No. SC-DF25, manufactured by TWINBIRD) set at 4 ° C. Thereafter, 2.5 ml of 10% FBS-RPMI culture solution was added and centrifuged at 4 ° C. and 1,000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, it is suspended in 2.5 ml of 10% FBS-RPMI culture solution, added to a 96-well microplate (IWAKI, No. 3860-096) at 0.1 ml / well, 5% carbon dioxide, 37 ° C. The cells were cultured for about 24 hours in an incubator.
  • a cooling vessel No. SC-DF25, manufactured by TWINBIRD
  • FIG. 1 (A) shows the results of combining quercetin and A7G
  • FIG. 1 (B) shows the combination of quercetin and K7G.
  • the compound (II) alone has little or no low-temperature injury protection effect, or in a concentration range (0.1 to 100 ⁇ g / ml) where a sufficient effect cannot be obtained. It was confirmed that by using Compound (II) and Compound (I) in combination, both act synergistically, and a low-temperature injury protection effect that is higher than expected can be obtained.
  • FIG. 2 shows the results of combining quercetin and A7G, (B) quercetin and Q3G, and (C) quercetin and K7G.
  • the compound (II) and the compound (I) are in a concentration range (0.1 to 100 ⁇ g / ml) in which the compound (II) alone has almost no low-temperature injury protection effect. ) In combination, it was confirmed that the two acted synergistically and that the cold injury protection effect surpassed expectations was obtained.
  • Test Example 2 Combination effect 2 of Compound (I) and Compound (II) in in vitro test
  • the protective effect against cold injury of human aorta-derived vascular endothelial cells (HAEC) (Lonza, No. CC-2535) when compound (I) and compound (II) were used in combination was evaluated by the following method.
  • Figure 3 shows the results of using quercetin and K7G together.
  • the compound (II) alone and the compound (II) act synergistically in the concentration range (0.01 to 1 ⁇ g / ml) at which a sufficient low temperature injury protection effect cannot be obtained with the compound (II) alone.
  • a low-temperature injury protection effect exceeding the expectation was obtained.
  • Test Example 3 Combination effect in in vivo test
  • the protective effect against cold injury in the allogeneic heart transplantation model when compound (I) and compound (II) were used in combination was evaluated by the following method.
  • the median sternum was incised to expose the heart, and after exfoliation, the aorta was cut immediately after the branch of the brachiocephalic artery, and about 6 ⁇ m of the above-mentioned heart preservation solution was injected through the cut hole to obtain cardiac arrest.
  • the pulmonary artery was cut immediately before bifurcation, the inferior vena cava was ligated individually, and the superior vena cava and pulmonary vein were ligated together to take out the heart. Blood inside and outside the heart was thoroughly washed away, immersed in 15 ml of the above-mentioned heart preservation solution, and stored at ⁇ 5 ° C. for 24 hours using a program freezer. Subsequently, reperfusion was performed by establishing an allogeneic heart transplantation model in which the donor aorta and the recipient abdominal aorta were unilaterally anastomosed to the recipient's inferior vena cava.
  • Visual evaluation is performed at 15 minutes and 2 hours after reperfusion for the contracted state of the transplanted heart, and scored by visual observation with “0” indicating no contraction and “6” indicating normal contraction. I took a video.
  • the heart was removed after contraction evaluation 2 hours after reperfusion, fixed with formalin for 24 hours, and myocardial tissue was embedded in paraffin to prepare a tissue section. Tissue sections were stained with DAPI for nuclear staining (counter-staining), and TUNEL staining was used to count apoptosis-positive cells.
  • DAPI nuclear staining
  • TUNEL staining was used to count apoptosis-positive cells.
  • the UW solution treated group containing K7G and quercetin was compared with the UW solution treated group containing only K7G. The value was significantly higher, confirming that cardiac function was maintained in a more normal state. The score of the treatment group with only the UW solution was “0”.
  • the UW solution treated group containing K7G and quercetin showed a significantly lower value than the UW solution treated group containing only K7G, It was confirmed that the apoptosis induction of cardiomyocytes after reperfusion was suppressed to a low level.

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Abstract

開示されているのは、式（Ｉ）：〔式中、R1～R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物、及び 式（ＩＩ）：〔式中、R10及びR11は、-H、-OH又はグルコース残基であって、少なくとも一方はグルコース残基であり、R12～R18は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む生物材料の低温保存用の保存剤、保存液、並びに生物材料の保存方法である。

Description

生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法
　本発明は、生物材料の低温保存用の保存剤、並びに該保存剤を含む生物材料の低温保存用の保存液に関する。さらに、本発明は、低温での生物材料の保存方法に関する。
　また、本発明は、移植用臓器の低温保存用の保存剤、該保存剤を含む移植用臓器の保存液、及び移植用臓器の保存方法にも関する。
　細胞は細胞膜を挟んで細胞内外でイオンの組成が異なっており、この電荷を持つイオンの分布の差が、電位差をもたらす。通常、細胞内は細胞外に対して負の電位にあり(膜電位)、この膜電位は生物共通の基本原理として動植物を問わず存在している。膜電位の調節機構は生命維持や細胞の機能を発揮するのに必須であり、その破綻は生命あるいは細胞の死に直結する。
　このため、細胞内外の膜上には様々なイオンポンプやイオンチャンネルがあり、恒常的にイオンバランスの調節が行われている。その最も重要な調節機構として、動物細胞ではナトリウムポンプ(Na+-K+ ATPase)が、植物細胞ではプロトンポンプ(H+-ATPase)が挙げられる。これらのイオンポンプはATPエネルギーを利用して特定のイオンを能動輸送する膜タンパク質である。何らかの原因によりATPが枯渇あるいは環境温度が至適範囲から逸脱するとイオンポンプの機能は低下あるいは停止することになる。
　動物細胞では生理的条件下では主にナトリウムポンプの働きによって、1回毎に細胞内のナトリウムイオン3つが細胞外に汲み出され、逆にカリウムイオン2つが細胞外から細胞内に汲み入れられる。したがって、通常は細胞内はカリウム濃度が高く(ナトリウム濃度は低く)、細胞外はナトリウム濃度が高く(カリウム濃度は低く)維持されている。細胞は一定の温度以下の低温になるとナトリウムポンプの機能が低下し、ナトリウムを細胞外に汲み出すことができなくなり、細胞内のナトリウム濃度が上昇する。ナトリウム濃度の上昇に伴い細胞内浸透圧が上昇し、水分子の流入により細胞が膨潤、最終的に細胞破裂(細胞傷害)に至る。
　医療現場での臓器移植に際し、移植用臓器を低温保存した場合の細胞傷害は、上記のメカニズムが主要な原因の一つと考えられ、電解質の基本組成を細胞内型の低ナトリウム、高カリウムとした臓器保存液が開発された。その代表例がユーロコリンズ(EC)液やUW (University of Wisconsin)液である。これらは、それまでのリンゲル液を中心とした細胞外型(高ナトリウム、低カリウム)の保存液と比べ、大幅な移植用臓器の保存期間の延長を可能とし、国内外において主要な移植用臓器の保存液として臨床応用されている。しかしながら、これら細胞内型保存液は保存温度が上昇した場合には一転して細胞傷害性を起こす危険性を持っている。また、これらが全ての移植用臓器に適用できるわけではなく、更なる保存期間の延長も含め、より一層の性能向上が待望されている。
　近年、再生医療の発展は著しく、胚性幹細胞(ES細胞)並びに人工多能性幹細胞(iPS細胞)の医療応用が期待されているが、これらの幹細胞の最も効果的な維持培養法は、マウス胚性線維芽(MEF)細胞フィーダー細胞層での共培養とされている。このMEF細胞の長期保存は-80℃ディープフリーザーあるいは液体窒素内での凍結保存が一般的であるが、短期保存では細胞を凍結することは必ずしも好ましいことではなく、凍結せず低温で保存することができれば、その応用範囲が広がることが期待される。
　一方、ウシ体外受精技術は、屠畜場由来の卵巣から良質な体外受精胚の作製を可能とした。しかし、食肉処理場でのBSE検査開始に伴って、検査結果が陰性と判明するまで採取した卵巣を持ち出すことが困難となっている。そのため、屠畜から体外受精卵を作製するまでの間、生存性への影響を最小限にした形で卵巣を保存することが必要とされている。また、ウシ体外受精用の卵子はウシ生体からも採取されているが、ウシ生体より採取した後、直ぐに適切な条件で培養を行わなければ生存性を保持できないという問題がある。
　家畜育種の分野でも卵巣(卵子細胞)、受精卵、精子などの低温保存に関しては現在もなお、様々な課題が残されており、成功率が高く且つ簡便な保存及び輸送方法の開発は、家畜育種産業の発展に大きく寄与することが可能となる。
　このような問題に対応するための方法として、特許文献１には、シクロヘキシミドに代表されるタンパク質合成阻害剤を含有する培地を用いることにより採取した未成熟卵子を室温条件下且つ大気中で保存する方法が開示されている。また、特許文献２には、ウシ卵巣を保存液に浸漬し、10～20℃で冷却保存することによりウシ卵巣を保存する方法が開示されている。
　さらに、上記のような細胞や臓器を保存する技術としては、例えば、次の特許文献３～６に開示がある。
　特許文献３には、一以上のポリフェノールを含む保存溶液を生物学的材料に添加し、冷却することによる生物学的材料の保存方法が開示され、実施例においてはポリフェノールとしてはカテキン類が開示されているのみである。
　特許文献４には、細胞培養液中にエンケファリン誘導体を添加することによる、水が結晶化しない温度、例えば4℃前後の温度で細胞を冷蔵保存する方法が開示されている。
　特許文献５には、ポリフェノールと0.0001～0.05重量%のアスコルビン酸又はアスコルビン酸金属塩とを含有する、細胞保存剤、組織保存剤等として使用するための医用ポリフェノール溶液、当該医用ポリフェノール溶液によりポリフェノールの分解が抑制され、過酸化水素の発生が抑制されることが開示されている。そして、実施例においてはポリフェノールとしてはエピガロカテキンガレート(EGCg)が開示されているのみである。
　特許文献６には、有効成分としてエピガロカテキンガレートを90質量%以上含有する保存剤用組成物が開示され、エピガロカテキンガレートを高純度に精製して用いることで細胞の保存効果をより一定にできることが記載されている。
　また、特許文献７では、水溶液の過冷却能力を促進する能力があるフラボノイド配糖体について開示され、この過冷却促進物質を用いることにより水が約-15℃程度で利用できる不凍性液体となるので当該不凍性液体中で生物材料等を保存できることが記載されている。特許文献７で開示されている過冷却促進物質のフラボノイド配糖体の使用方法としては、次の特許文献８～１０にも報告がある。
　特許文献８には、上記フラボノイド配糖体を含んだ過冷却状態を維持できる飲料が開示されている。また、特許文献９には、ガラス化溶液に上記フラボノイド配糖体を含んだ凍結保存液が開示され、従来のガラス化溶液よりも毒性が低く、保存による細胞等の生存性を上昇させることができることが記載されている。
　さらには、特許文献１０には、上記フラボノイド配糖体を含む臓器保存液を用いることにより、凍結が起こらない状態で0℃以下の温度で動物の臓器を保存することが可能となることが開示されている。
特開2001-89302号公報 特開平5-112401号公報 特表2007-519712号公報 特開2002-335954号公報 特開2006-188436号公報 特開2003-267801号公報 国際公開第2008/007684号 特開2009-219394号公報 特開2009-219395号公報 特開2009-221128号公報
　特許文献１～６には細胞や臓器を保存する溶液にフラボノール構造を有する化合物を使用することは実質的には開示されていない。特許文献７、１０には、フラボノイド配糖体を用いることにより、凍結することなく、氷点下の温度にまで過冷却できるため、凍結による傷害を伴うことなく0℃以下で細胞などを保存できることが開示されているが、通常の低温条件での低温傷害の軽減については開示されていない。また、糖を含まないフラボノール化合物について、このような開示はない。
　細胞、組織や器官、食品、花卉、移植用臓器などを低温下で簡便に保存することは、一般に実施されている方法である。しかしながら、対象物の凍結を伴わない場合でも、その低温条件に起因する傷害が発生することも知られている。
　本発明では、これらの低温傷害を軽減すべく、生物材料の低温保存用の保存剤、該保存剤を含む生物材料の低温保存用の保存液、及び低温での生物材料の保存方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、移植用臓器の低温保存用の保存剤、該保存剤を含む移植用臓器の保存液、及び移植用臓器の保存方法を提供することも目的とする。
　本発明者らは、糖を有していないフラボノール構造を有する特定の化合物を、過冷却能力を有する特定のフラボノイド配糖体化合物と併用し、凍結を伴わない氷点下前後の低温から通常の冷蔵温度までの低温で細胞を保存することで、相乗効果により細胞の生存率が高められ低温傷害保護効果が得られるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき完成されたものであり、次の保存剤、保存液、及び保存方法を提供するものである。
　(I) 保存剤
(I-1) 式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
〔式中、R1～R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物、及び
式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
〔式中、R10及びR11は、-H、-OH又はグルコース残基であって、少なくとも一方はグルコース残基であり、R12～R18は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む生物材料の低温保存用の保存剤。
(I-2) 前記式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物がクエルセチン-3-グルコシド、ケンペロール-7-グルコシド及びアピゲニン-7-グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種である、(I-1)に記載の保存剤。
(I-3) 前記生物材料が動物若しくは植物細胞、組織又は器官である、(I-1)又は(I-2)に記載の保存剤。
(I-4) 前記動物若しくは植物細胞、組織又は器官が卵子細胞、受精卵細胞、精子細胞、胚性幹細胞、iPS細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、組織幹細胞、線維芽細胞、フィーダー細胞、血管内皮細胞、骨髄(幹)細胞、歯髄(幹)細胞、免疫細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、膵臓細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、歯芽細胞、歯根膜細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、表皮細胞、卵巣、赤血球、白血球又は血小板である、(I-3)に記載の保存剤。
(I-5) 前記生物材料が食品としての牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜若しくは果実、又は花卉である、(I-1)又は(I-2)に記載の保存剤。
(I-6) 前記生物材料が移植用臓器である、(I-1)又は(I-2)に記載の保存剤。
(I-7) 前記移植用臓器が心臓又は腎臓である、(I-6)に記載の保存剤。
(I-8) 前記低温は前記生物材料が完全な凍結をしない温度、すなわち、-15℃～20℃の温度である、(I-1)～(I-7)のいずれか一項に記載の保存剤。
(I-9) 式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物及び式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む低温傷害保護剤。
　(II) 保存液
(II-1) (I-1)又は(I-2)に記載の保存剤を含む生物材料の低温保存用の保存液。
(II-2) 前記生物材料が動物若しくは植物細胞、培養細胞シート、組織又は器官である、(II-1)に記載の保存液。
(II-3) 前記生物材料が食品としての牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜若しくは果実、又は花卉である、(II-1)に記載の保存液。
(II-4) (I-6)又は(I-7)に記載の保存剤を含む移植用臓器の保存液。
　(III)保存方法
(III-1) (I-1)で規定される式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物及び式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む保存液に生物材料を浸漬し、該生物材料を低温に保持することを特徴とする生物材料の保存方法。
(III-2) 前記式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物がクエルセチン-3-グルコシド、ケンペロール-7-グルコシド及びアピゲニン-7-グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種である、(III-1)に記載の方法。
(III-3) 前記生物材料が動物若しくは植物細胞、組織又は器官である、(III-1)又は(III-2)に記載の方法。
(III-4) 前記動物若しくは植物細胞、組織又は器官が卵子細胞、受精卵細胞、精子細胞、胚性幹細胞、iPS細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、組織幹細胞、線維芽細胞、フィーダー細胞、血管内皮細胞、骨髄(幹)細胞、歯髄(幹)細胞、免疫細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、膵臓細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、歯芽細胞、歯根膜細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、表皮細胞、卵巣、赤血球、白血球又は血小板である、(III-3)に記載の方法。
(III-5) 前記生物材料が食品としての牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜若しくは果実、又は花卉である、(III-1)又は(III-2)に記載の方法。
(III-6) 前記低温は前記生物材料が完全な凍結をしない温度、すなわち、-15℃～20℃の温度である、(III-1)～(III-5)のいずれか一項に記載の方法。
(III-7) (I-1)で規定される式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物及び式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む保存液を移植用臓器に注入及び／又は該保存液に、生体から摘出された移植用臓器を浸漬することを特徴とする移植用臓器の保存方法。
(III-8) 前記移植用臓器が心臓又は腎臓である、(III-7)に記載の方法。
　本発明の保存剤及び方法により、完全に凍結をしない-15℃から20℃の通常の冷蔵保管の低温で細胞、組織、器官、食品、花卉、移植用臓器等の生物材料を保存することで、2種類の化合物の相乗効果により生物材料の生存率を高めることができ低温傷害保護効果が得られる。したがって、細胞、組織、器官、食品、花卉、移植用臓器等の生物材料の保存に適した低温下で且つそれに起因する低温傷害を抑制することができる条件で、生物材料を保存することが可能となるので、細胞、組織、器官、移植用臓器等の更なる生存率の向上や、食品及び花卉の鮮度保持が期待できる。
　そのため、本発明は、輸血医療、再生医療、家畜育種などの分野や、食品保存の分野における応用が期待できる。また、本発明は、臓器移植の分野における応用も期待できる。
試験例１における生理食塩水中でのHL-60細胞の低温(4℃)保存に対する化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との併用効果を示すグラフである。(A)クエルセチンとA7Gの併用、(B)クエルセチンとK7Gの併用、図中のプロットはそれぞれ(1)化合物（ＩＩ）単独の生存細胞数、(2)化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）を併用した場合の生存細胞数、(3)化合物（Ｉ）単独の生存細胞数と化合物（ＩＩ）単独の生存細胞数の合計値の平均値及び標準偏差値(n=3)を表す。 試験例１におけるUW液中でのHL-60細胞の低温(4℃)保存に対する化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との併用効果を示すグラフである。(A)クエルセチンとA7Gの併用、(B)クエルセチンとQ3Gの併用、(C)クエルセチンとK7Gの併用、図中のプロットはそれぞれ(1)化合物（ＩＩ）単独の生存細胞数、(2)化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）を併用した場合の生存細胞数、(3)化合物（Ｉ）単独の生存細胞数と化合物（ＩＩ）単独の生存細胞数の合計値の平均値及び標準偏差値(n=3)を表す。 試験例２における生理食塩水中でのHAEC細胞の低温(-5℃)保存に対する化合物（Ｉ）(クエルセチン)と化合物（ＩＩ）(K7G)との併用効果を示すグラフである。図中のプロットはそれぞれ(1)化合物（ＩＩ）単独の生存細胞数、(2)化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）を併用した場合の生存細胞数、(3) 化合物（Ｉ）単独の生存細胞数と化合物（ＩＩ）単独の生存細胞数の合計値の平均値及び標準偏差値(n=3)を表す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の細胞、組織、器官、食品、花卉、移植用臓器等の生物材料の低温保存用の保存剤は、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
〔式中、R1～R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物、及び
式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
〔式中、R10及びR11は、-H、-OH又はグルコース残基であって、少なくとも一方はグルコース残基であり、R12～R18は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド配糖体化合物を含むことを特徴とする。
　また、本発明の生物材料の保存方法は、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物及び式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む保存液に生物材料を浸漬し、該溶液を低温に保持することを特徴とする。
　R1～R4、R12及びR13は、好ましくは、同一又は異なって、-H又は-OHである。
　上記アルコキシ基は、好ましくは炭素数1～6のアルコキシ基、より好ましくは炭素数1～3のアルコキシ基、特に好ましくは-OCH3である。当該アルコキシ基のアルキル部分は、直鎖状又は分枝状のいずれであってもよい。炭素数1～6のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、tert－ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
　上記フラボノイド化合物（Ｉ）としては、例えば、ミリセチン(Myricetin)、クエルセチン(Quercetin)、ケンペロール(Kaempferol)、ガランギン(Galangin)、イソラムネチン(Isorhamnetin)、フィセチン(Fisetin)、フラボノール(Flavonol)などが挙げられる。
　上記フラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）としては、例えば、クエルセチン-3-グルコシド(Quercetin-3-Glucoside)(Q3G)、ケンペロール-7-グルコシド(Kaempferol-7-Glucoside)(K7G)、アピゲニン-7-グルコシド(Apigenin-7-Glucoside)(A7G) などが挙げられる。
　上記フラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）は、公知の方法により化学的に合成することができるし、植物等の生物に含まれているので、これらから公知の方法により抽出することで入手することもできる。また、市販品により入手することも可能である。
　本発明において低温とは、細胞、組織、器官、食品、花卉、移植用臓器等の生物材料が完全な凍結をしない温度、すなわち、-15℃以上、好ましくは-10℃以上、より好ましくは-5℃以上且つ20℃以下、好ましくは15℃以下、より好ましくは10℃以下の温度である。
　本明細書で使用する低温傷害とは、低温により引き起こされる細胞傷害を意味し、低温傷害保護効果とは、該低温傷害から細胞を保護する効果を意味する。したがって、この意味を勘案すると、本発明の保存剤は低温傷害保護剤と称することもできる。
　本発明で使用する生物材料としては、本発明の効果が得られる限り、どのような生物由来のものであっても制限されないが、例えば、動物又は植物細胞、組織、器官、食品、花卉、移植用臓器などが挙げられる。当該組織、器官、食品などは動物及び植物の何れに由来するものであってもよい。本発明が対象とする動物としては、哺乳類(ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど)が望ましい。また、当該組織及び器官は、臓器移植の目的で動物生体から摘出されたものではなく、例えば、細胞を組織培養することにより得られたもの、家畜育種の目的で動物生体から摘出されたものなどが挙げられる。
　動物細胞としては、卵子細胞、受精卵細胞、精子細胞、胚性幹細胞、iPS(induced pluripotent stem)細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、組織幹細胞、線維芽細胞、フィーダー細胞、骨髄(幹)細胞、歯髄(幹)細胞、免疫細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、血液細胞(血球)(赤血球、白血球及び血小板)、心筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、表皮細胞、筋芽細胞、角膜細胞、網膜細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、歯芽細胞、歯根膜細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。免疫細胞とは、免疫反応に関与する細胞のことを意味し、そのような細胞としては、T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、好酸球、好中球、好塩基球などが挙げられる。
　植物細胞としては、カルス、プロトプラスト、異種プロトプラスト同士を細胞融合した雑種細胞なども含まれる。
　動物又は植物細胞は、保存液中で、遊離状態であってもよく、培養皿上に接着状態であってもよく、或いは細胞シート化された状態であってもよい。動物又は植物細胞は、人工的に作製された脱分化細胞、腫瘍細胞、ハイブリドーマ細胞若しくは分化細胞、又は自然に発生した脱分化細胞、腫瘍細胞若しくは分化細胞であってもよく、これらが株化された細胞であってもよい。
　組織としては、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などが挙げられる。組織は保存液中で組織状態であってもよく、又は組織スライド化された状態であってもよい。
　器官としては、食道、胃、腸、肝臓、膵臓、脾臓、肺、気管、心臓、血管、リンパ管、リンパ節、腎臓、膀胱、卵巣、精巣、輸卵管、輸精管、子宮、胎盤、臍帯、皮膚、隔膜、角膜、網膜、眼球、神経などが挙げられる。
　本発明で言う移植用臓器とは、臓器移植の目的で、動物生体から摘出される臓器(例えば、食道、胃、腸、肝臓、膵臓、肺、気管、心臓、血管、腎臓、膀胱、皮膚、隔膜、角膜、網膜、眼球、神経など)を意味し、好ましくは心臓及び腎臓である。動物としては、哺乳類(ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど)が望ましい。
　また、本発明で使用する生物材料としては、食品として使用される食肉類、魚介類及び植物であってもよく、例えば、牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜、果実などが挙げられる。その他の生物材料としては、観賞用の植物である花卉が挙げられる。
　本発明の保存剤は、フラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）以外にも、公知の添加剤が適宜配合されていてもよい。
　本発明の生物材料の低温保存用の保存液は、上記保存剤を含むことを特徴とする。該保存液には、フラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）に加えて、液体を含有し、フラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）は当該液体に完全に溶解していなくてもよい。該保存液は溶液状態、凍結状態又はスラリーアイス状態であってもよく、該保存液は別の凍結状態又はスラリーアイス状態の物と混合して用いてもよい。
　本発明において、生物材料として、動物又は植物細胞、組織及び器官を低温保存する際には、上記液体としては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、輸液類(電解質輸液、栄養輸液、糖質輸液、アミノ酸輸液、ブドウ糖液、リンゲル液、酢酸リンゲル液、乳酸リンゲル液等)、緩衝液(PBS、トリス緩衝液、Hepes緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液等)、細胞培養液(RPMI1640、DMEM等)、臓器保存液(EC液、UW液等)、モデナ液などが使用される。
　本発明の動物又は植物細胞、組織及び器官の保存液におけるフラボノイド化合物（Ｉ）の濃度としては、通常、0.001～1000μg/ml、好ましくは0.01～100μg/mlである。本発明の保存液におけるフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）の濃度としては、通常、0.001～1000μg/ml、好ましくは0.01～100μg/mlである。なお、本発明の動物又は植物細胞、組織及び器官の保存液には従来の他の成分、例えば、緩衝剤、抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、糖類、脂質、ビタミン、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、pH指示薬、pH調節剤、キレート剤、浸透圧調節剤などを含むこともできる。
　本発明において、動物又は植物細胞、組織及び器官の保存は、保存液に生物材料を浸漬することにより行うことができる。その際、該保存液は動物又は植物細胞、組織、器官を浸漬する前に低温に冷却されてもよいし、また浸漬した後に低温に冷却されてもよい。動物又は植物細胞、組織、器官を含む該保存液が一旦低温まで冷却された後は、低温に保持されるが、常に一定の温度に維持される必要はなく、短時間なら低温の範囲外の温度になってもよい。
　本発明において、生物材料として、食品として使用される食肉類、魚介類及び植物を低温保存する際には、上記液体としては、水、海水、食塩水、生理食塩水、緩衝液などが使用され、更にこれらを適当な割合で2種以上混合して使用することもできる。
　本発明の食品の保存液におけるフラボノイド化合物（Ｉ）の濃度としては、通常、0.001～1000μg/ml、好ましくは0.01～100μg/mlである。本発明の食品の保存液におけるフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）の濃度としては、通常、0.001～1000μg/ml、好ましくは0.01～100μg/mlである。なお、本発明の食品の保存液には従来の他の成分、例えば、リン酸塩、保存料、天然香料、酵素、ろ過助剤、油脂溶出剤、消泡剤、pH調節剤、着色料、発色剤、漂白剤、香料、甘味料、調味料、乳化剤、増粘安定剤、酸化防止剤、殺菌剤、防かび剤、品質改良剤、糖類、脂質、ビタミン、ミネラル、アミノ酸などの食品添加物、糖類、脂質、タンパク質、ペプチドなどの食品成分などを含むこともできる。
　本発明において、食品の保存は、保存液に個体又は個体から摘出した一部を浸漬することにより行うことができる。食品を含む保存液が一旦低温まで冷却された後は、低温に保持されるが、常に一定の温度に維持される必要はなく、短時間なら低温の範囲外の温度になってもよい。
　上記フラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）は、移植用臓器保存液の成分として特に好適に使用することができる。フラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）を移植用臓器の保存液の成分として使用する場合、上記液体としては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、輸液類(電解質輸液、栄養輸液、糖質輸液、アミノ酸輸液、ブドウ糖液、リンゲル液、酢酸リンゲル液、乳酸リンゲル液等)、緩衝液(PBS、トリス緩衝液、Hepes緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液等)、細胞培養液(RPMI1640、DMEM等)、臓器保存液(EC液、UW液等)、モデナ液などが使用される。
　本発明の移植用臓器の保存液におけるフラボノイド化合物（Ｉ）の濃度としては、通常、0.001～1000μg/ml、好ましくは0.01～100μg/mlである。本発明の移植用臓器の保存液におけるフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）の濃度としては、通常、0.001～1000μg/ml、好ましくは0.01～100μg/mlである。なお、本発明の移植用臓器の保存液には従来の他の成分、例えば、抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、糖類、脂質、ビタミン、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、pH指示薬、pH調節剤、キレート剤、浸透圧調節剤などを含むこともできる。
　移植用臓器の保存は、保存液を移植用臓器に注入及び／又は保存液に動物生体から摘出された移植用臓器を浸漬することにより行うことができる。移植用臓器の保存において、該保存液は移植用臓器を浸漬する前に低温に冷却されてもよいし、また移植用臓器を浸漬した後に低温に冷却されてもよい。移植用臓器を含む該保存液が一旦低温まで冷却された後は、低温に保持されるが、常に一定の温度に維持される必要はなく、短時間なら低温の範囲外の温度になってもよい。
　フラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）は、特許文献７に過冷却促進剤として使用できることが記載されている。当該フラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）を、フラボノイド化合物（Ｉ）と併用することで相乗効果を発揮し、各々の化合物単独で得られる効果の合計を上回る低温傷害保護効果を得られることが本発明により初めて明らかになった。
　本発明のフラボノイド化合物（Ｉ）及びフラボノイド配糖体化合物（ＩＩ）を含む保存液を使用することにより、低温で細胞、組織、器官、移植用臓器等を保存することで、その生存率を有意に高めることができ低温傷害保護効果が得られる。本発明は、細胞、組織、器官、移植用臓器等の保存に適した低温下で保存でき且つそれに起因する低温傷害を抑制できるので、細胞、組織、器官、移植用臓器等を適切な状態で保存することが可能となる。また、本発明は、食品や花卉の保存に適した低温下で保存でき且つそれに起因する低温傷害を抑制できるので、食品や花卉の鮮度保持が可能となる。
　上記のような特徴を有する本発明の保存液は、輸血医療分野における血球成分の保存液、再生医療分野におけるES細胞、iPS細胞、組織幹細胞及びフィーダー細胞の保存液、家畜育種の分野における卵巣、卵子細胞、受精卵及び精子細胞の保存液、生鮮食品の分野における青果(野菜及び果物)、魚介類及び食肉類の保存液、観賞用植物の分野における花卉の保存液などとしての応用が期待される。また、本発明の移植用臓器の保存液は、臓器移植の分野における、動物生体から摘出された移植用臓器(特に心臓)の保存液としての応用も期待される。
　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
　試験例１(インビトロ試験における化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との併用効果１)
　化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）を併用した時のヒト前骨髄性白血病細胞株HL-60(HL-60細胞)の低温傷害に対する保護作用を以下の方法により評価した。
　5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター(三洋電機社製、MCO-17AIC)内において10%ウシ胎仔血清(Thermo社、No.SH3D396.03)を含有したRPMI-1640(SIGMA社、No.R8758) (10%FBS-RPMI)培養液中で培養したHL-60細胞を回収し、4℃、1,000rpm、5分間遠心(TOMY社製、EIX-135)後、上清を除去し2×106個/mlとなるよう生理食塩水にて再懸濁した。この細胞懸濁液0.25 mlと供試化合物調製液0.25 mlを2 ml滅菌済マイクロチューブ内にて混合した。なお、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）は試験前にジメチルスルフォキサイド(ナカライテスク社、No.13407-45)(DMSO)にて100 mg/mlに溶解し、さらに化合物（ＩＩ）は10倍公比にて10、1、0.1mg/ml希釈液(DMSO)を調製した。それぞれの化合物は生理食塩水(大塚製薬、大塚生食注)に500倍希釈となるよう単独あるいは混合添加し、供試化合物調製液とした。
　この細胞懸濁液と供試化合物調製液との混合液を4℃に設定した冷却容器(TWINBIRD社製、No.SC-DF25)内にて約24時間静置した。その後10%FBS-RPMI培養液2.5 mlを添加して4℃、1,000rpm、5分間遠心した。上清除去後、2.5 mlの10%FBS-RPMI培養液にて懸濁し、96穴マイクロプレート(IWAKI社、No.3860-096)に0.1 ml/ウェル添加し、5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター内で約24時間培養した。続いてWST-8液(ナカライテスク社、Cell Count Reagent SF、No.07553-44)10μl/ウェルを添加し、更にインキュベーター内にて3時間培養した後、450 nmの波長にて吸光度を測定した(WAKO社、SPECTRA MAX250)。この吸光度の値から、前もって作成した細胞数と吸光度との標準線(生存細胞数=56375×吸光度、R2＝0.9995)により生存細胞数として算定した。図１の(A)にクエルセチンとA7G、(B)にクエルセチンとK7Gを併用した結果を示す。
　その結果、図１(A)及び(B)に示すように化合物（ＩＩ）単独では低温傷害保護効果がほとんど認められないか、十分な効果が得られない濃度範囲(0.1～100μg/ml)で、化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）を併用することにより両者が相乗的に作用し、予想を上回る低温傷害保護効果が得られることが確認された。
　また、低温保存時に検討化合物を調製する溶媒を生理食塩水から、UW液(ビアスパン；アステラス製薬製)に変更して同様の試験を行った。図２の(A)にクエルセチンとA7G、(B)にクエルセチンとQ3G、(C)にクエルセチンとK7Gを併用した結果を示す。
　その結果、図２(A)～(C)に示すように化合物（ＩＩ）単独では低温傷害保護効果がほとんど認められない濃度範囲(0.1～100μg/ml)で、化合物（ＩＩ）と化合物（Ｉ）を併用することにより両者が相乗的に作用し、予想を上回る低温傷害保護効果が得られることが確認された。
　試験例２(インビトロ試験における化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）との併用効果２)
　化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）を併用した時のヒト大動脈由来血管内皮細胞(HAEC)(Lonza、No.CC-2535)の低温傷害に対する保護作用を以下の方法により評価した。
　EGM-2培地(Lonza、No.CC-3162)に細胞を懸濁し、1×104個/0.1 ml/ウェルとなるように96穴マイクロプレートに播種し、5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター内で2時間培養した。その後、上清を削除し、生理食塩水で1000倍希釈して濃度調整した化合物（Ｉ）(最終濃度0.01μg/ml)と化合物（ＩＩ）(最終濃度10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、又は0.01μg/ml)を単独あるいは混合液として細胞に0.1 ml/ウェル添加した。この96穴マイクロプレートを-5℃に設定した冷却容器内にて3日間保存した。続いて上清を除去しEGM-2培地に置き換え、5%炭酸ガス、37℃のインキュベーター内で約24時間培養した後、WST-8液10μl/ウェルを添加し、更に3時間培養した。450 nmの波長にて吸光度を測定し、前もって作成した細胞数と吸光度との標準線(生存細胞数=5170×吸光度、R2＝0.999)から生存細胞数を算定した。
　図３にクエルセチンとK7Gを併用した結果を示す。その結果、化合物（ＩＩ）単独では低温傷害保護効果が十分得られない濃度範囲(0.01～1μg/ml)で、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）を併用することにより両者が相乗的に作用し、予想を上回る低温傷害保護効果が得られることが確認された。
　試験例３(インビボ試験における併用効果)
　化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）を併用した時の同種異所性心移植モデルにおける低温傷害に対する保護作用を以下の方法により評価した。
　心筋保護、心臓保存液としてUW液のみ、K7G(100μg/ml)を含有したUW液、及びK7G(100μg/ml)とクエルセチン(1μg/ml)を含有したUW液を用いた。
　Lewisラットを麻酔下、胸骨正中切開し心臓を露出、剥離後、大動脈を腕頭動脈分岐直後で切断し、切断孔より前記心臓保存液約6 mlを注入し、心停止を得た。肺動脈を分岐直前で切断し、下大静脈は個別に結紮後、上大静脈及び肺静脈を一括して結紮し心臓を取り出した。心内外の血液を十分に洗い流し、前記心臓保存液15 mlに浸漬後プログラムフリーザーを用いて、-5℃で24時間保存した。その後ドナーの大動脈とレシピエントの腹部大動脈を、ドナーの肺大動脈をレシピエントの下大静脈に単側吻合するという同種異所性心移植モデルを確立し再灌流を行った。
　視覚的評価は、移植した心臓の収縮状態の評価を再灌流後15分及び2時間に行い、全く収縮しないものを「０」、正常収縮を「６」として肉眼観察にてスコア化し、その様子をビデオ撮影した。
　また、病理学的評価には再灌流2時間後の収縮評価後に心臓を摘出し、24時間ホルマリン固定後、心筋組織をパラフィン包埋し組織切片を作製した。組織切片をDAPIにて核染色(対比染色)するとともに、TUNEL染色にてアポトーシス陽性細胞をカウントした。カウントには短軸切片で、左室自由壁の5～7時の部位の任意の20箇所を選定し、蛍光顕微鏡を用いて400倍視野で蛍光を発する核を持つ細胞をアポトーシス陽性細胞と判断しカウントした。
　2群間の比較はノンパラメトリック検定(Mann-Whitney test)で行い、P<0.05を統計的に有意差ありと判定した。
　その結果、表１に示すとおり再潅流15分後及び2時間後の視覚的評価のスコアにおいて、K7G及びクエルセチンを含有するUW液処理群は、K7Gのみを含有するUW液処理群と比較して有意に高い値を示し、心臓機能がより正常に近い状態で維持されていることが確認された。なお、UW液のみの処理群のスコアは「０」であった。また、表２に示すとおり病理学的評価のアポトーシス陽性細胞数において、K7G及びクエルセチンを含有するUW液処理群は、K7Gのみを含有するUW液処理群と比較して有意に低い値を示し、再灌流後の心筋細胞のアポトーシス誘導が低く抑えられていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008

Claims (18)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、R1～R9は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド化合物、及び
    式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式中、R10及びR11は、-H、-OH又はグルコース残基であって、少なくとも一方はグルコース残基であり、R12～R18は、同一又は異なって、-H、-OH又はアルコキシ基である〕で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む生物材料の低温保存用の保存剤。
  2. 　前記式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物がクエルセチン-3-グルコシド、ケンペロール-7-グルコシド及びアピゲニン-7-グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の保存剤。
  3. 　前記生物材料が動物若しくは植物細胞、組織又は器官である、請求項１又は２に記載の保存剤。
  4. 　前記動物若しくは植物細胞、組織又は器官が卵子細胞、受精卵細胞、精子細胞、胚性幹細胞、iPS細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、組織幹細胞、線維芽細胞、フィーダー細胞、血管内皮細胞、骨髄(幹)細胞、歯髄(幹)細胞、免疫細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、膵臓細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、歯芽細胞、歯根膜細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、表皮細胞、卵巣、赤血球、白血球又は血小板である、請求項３に記載の保存剤。
  5. 　前記生物材料が食品としての牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜若しくは果実、又は花卉である、請求項１又は２に記載の保存剤。
  6. 　前記生物材料が移植用臓器である、請求項１又は２に記載の保存剤。
  7. 　前記移植用臓器が心臓又は腎臓である、請求項６に記載の保存剤。
  8. 　請求項１又は２に記載の保存剤を含む生物材料の低温保存用の保存液。
  9. 　前記生物材料が動物若しくは植物細胞、組織又は器官である、請求項８に記載の保存液。
  10. 　前記生物材料が食品としての牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜若しくは果実、又は花卉である、請求項８に記載の保存液。
  11. 　請求項１又は２に記載の保存剤を含む移植用臓器の保存液。
  12. 　請求項１で規定される式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物及び式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む保存液に生物材料を浸漬し、該生物材料を低温に保持することを特徴とする生物材料の保存方法。
  13. 　前記式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物がミリセチン、クエルセチン、ケンペロール、ガランギン、イソラムネチン、フィセチン及びフラボノールからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物がクエルセチン-3-グルコシド、ケンペロール-7-グルコシド及びアピゲニン-7-グルコシドからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記生物材料が動物若しくは植物細胞、組織又は器官である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　前記動物若しくは植物細胞、組織又は器官が卵子細胞、受精卵細胞、精子細胞、胚性幹細胞、iPS細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、組織幹細胞、線維芽細胞、フィーダー細胞、血管内皮細胞、骨髄(幹)細胞、歯髄(幹)細胞、免疫細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、膵臓細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、歯芽細胞、歯根膜細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、表皮細胞、卵巣、赤血球、白血球又は血小板である、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記生物材料が食品としての牛肉、豚肉、鶏肉、魚肉、貝類、穀類、野菜若しくは果実、又は花卉である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  17. 　請求項１で規定される式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物及び式（ＩＩ）で表されるフラボノイド配糖体化合物を含む保存液を移植用臓器に注入及び／又は該保存液に生体から摘出された移植用臓器を浸漬することを特徴とする移植用臓器の保存方法。
  18. 　前記移植用臓器が心臓又は腎臓である、請求項１７に記載の方法。
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