CN105685017B

CN105685017B - 一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液

Info

Publication number: CN105685017B
Application number: CN201610240000.8A
Authority: CN
Inventors: 罗天恩; 杨志华; 刘虎; 赵含梅
Original assignee: Dongguan Boalai Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Boalai Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2016-04-18
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2036-04-18
Also published as: CN105685017A

Abstract

本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液，包括以下步骤：外周血单个核细胞分离和收集、加入细胞冻存液和细胞冻存；细胞冻存液按照体积百分比，包含以下组分：无血清液体培养基0～62%，青霉素和链霉素双抗溶液0.5～1.5%，二甲基亚砜5～10%，自体血浆30～92%。本发明免疫细胞储存方法简单有效，避免了外源血清存在的传染病的风险，免疫细胞冻存复苏后经诱导培养的存活率在90%以上，各项生物学指标均满足需求，储存效果好；本发明能对细胞库样本进行实时监控及追踪，能正确记录细胞存储位置、温度以及细胞来源等信息，且细胞具有唯一标识符信息，使用方便，安全可靠。

Description

一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液

技术领域

本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术应用于临床，可通过自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力。免疫细胞治疗主要来自患者自身外周血，通过分离和收集得到外周血单个核细胞。但一般说来，接受免疫细胞治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染人群，此类人群其本身的免疫细胞机能已十分低下，分离出免疫细胞活性较低。因此人们可在自身免疫细胞活性强时，提前将健康细胞储存起来，以备将来治病之需。

目前常用的做法是利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞，但冻存过程会显著改变细胞化学及物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。现有技术使得复苏的细胞活性不高，细胞存活率低，且目前冻存细胞的细胞冻存液，大都含有动物血清，即含有相对人体来说的异种蛋白，增加了传染病的风险；现有技术对储存免疫细胞的细胞库进行管理和追踪，存在样本数据信息易丢失及混乱等弊端，容易造成免疫细胞样本与数据信息不匹配，存在一定的安全隐患。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种简单有效、安全可靠、细胞复苏活力高的免疫细胞的储存方法及细胞冻存液。本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种细胞冻存液，按照体积百分比，包含以下组分：

无血清液体培养基 0～62%

青霉素和链霉素双抗溶液 0.5～1.5%

二甲基亚砜 5～10%

自体血浆 30～92%，

上述体积百分比的总和为100%。

进一步地，所述细胞冻存液，按照体积百分比，包括以下组分：

无血清液体培养基 7～55%

青霉素和链霉素双抗溶液 0.8～1.2%

二甲基亚砜 5～10%

自体血浆 35～85%，

上述体积百分比的总和为100%。

无血清液体培养基 52%

青霉素和链霉素双抗溶液 1%

二甲基亚砜 7%

自体血浆 40%。

进一步地，所述无血清液体培养基为GIBCO的AIM-V培养基。

进一步地，所述自体血浆的制备包括以下步骤：将人体外周血离心后，取出上层血浆放入容器内，在55～60℃温度下灭活后，置于-18～-22℃温度下冻存；然后在3～5℃条件下离心即得到细胞冻存液用的自体血浆。

进一步地，所述青霉素和链霉素双抗溶液为GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液。GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液每毫升包含10000单位青霉素（碱）和 10000µg链霉素（碱），利用0.85%盐液形式的青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素，其抗菌谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。青霉素和链霉素双抗溶液可保证细胞储存过程中处于无菌状态，且对免疫细胞无不良影响，安全可靠。

进一步地，所述二甲基亚砜为SIGMA型号为472301的二甲基亚砜。二甲基亚砜能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

本发明的细胞冻存液添加人自体血浆，人自体血浆与血清成分相似，亦含有免疫细胞生长所需的各种细胞因子及营养物质，且属于免疫细胞分离的副产物，方便获取，不存在异源性，避免了外源血清存在的安全隐患；细胞冻存液中加入青霉素和链霉素双抗溶液，可保证免疫细胞储存过程的无菌状态，提高安全性。

一种免疫细胞的储存方法，包括以下步骤：

（1）外周血单个核细胞分离和收集：取Ficoll淋巴细胞分离液，然后将事先制备的细胞悬液加入到Ficoll淋巴细胞分离液的上层进行离心处理；吸取白膜层细胞，加入PBS混匀后，计算单个核细胞总数与细胞活力并进行离心处理；弃上清液，加入PBS混匀后再次离心，弃上清液后，收集得外周血单个核细胞；

（2）加入细胞冻存液：根据所得外周血单个核细胞总数与细胞活力计算结果，在步骤（1）收集得到的外周血单个核细胞中加入细胞冻存液后混匀，处理后得到细胞重悬液，取样做微生物检测；

（3）细胞冻存：将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。经检测合格后出具储存合格报告。

进一步地，所述步骤（3）中，细胞重悬液的细胞密度为5×10⁶～2×10⁷/mL。

进一步地，所述免疫细胞的储存方法，还包括以下步骤：

（4）细胞库样本的监控和追踪：采用同体芯片智能系统记录细胞储存位置、温度及细胞来源信息，建立细胞库，对细胞库样本进行实时监控和追踪。

进一步地，所述步骤（4）具体为：当所述步骤（3）将细胞重悬液分装入冻存袋后，于冻存袋上贴上记录细胞信息的标签，并置于已负载芯片的冻存袋盒中，应用芯片读取器读取芯片并录入同体芯片智能系统，且对芯片负载的细胞样本在系统中进行信息编辑以确保细胞样本与芯片信息正确对应，将冻存袋盒置于程序化冷冻仪内进行程序降温后，再将冻存袋盒置于同样已负载芯片的冻存架，放入液氮罐中储存。采用该方法能对细胞库样本进行实时监控及追踪。

进一步地，所述免疫细胞的储存方法，还包括以下步骤：

（5）复苏细胞的培养：将液氮冻存的细胞重悬液的单个核细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和retronectin包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；之后置于37℃，5%CO2培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为5×10⁵～2×10⁶/mLmL；视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数；共培养16～18天。优选地，培养时间为17天，有利于CIK细胞的扩增和成熟，以获得足够多的细胞，减少因不同受试者细胞活性差异因起细胞扩增数目不足。

进一步地，所述CIK细胞培养基为AIM-V培养基，含有浓度为1000IU/mL的 IL-2，浓度为160IU/mL的硫酸庆大霉素。IL-2可刺激和维持T细胞的分化增殖，刺激自然杀伤(NK)细胞的增殖和活化，诱导淋巴因子活化杀伤（LAK）细胞。硫酸庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，对各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有良好的抗菌作用，可使诱导增殖的细胞符合微生物检测指标符合要求且不影响细胞的生长。

抗CD3单抗和retronectin联合包被培养CIK细胞，retronectin可参与细胞的分增殖化以及附着、伸展，抵抗淋巴细胞增殖过程中由于高度活化所诱发的的细胞凋亡，并进一步促进了抗CD3单抗与CIK细胞的附着和接触，提高了CIK细胞的培养效率。

进一步地，所述缓释微囊的粒径为20-50μm，可使IFN-γ因子的结构得到较好的保护。

进一步地，所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子9-11%、肝素1-2%、海藻酸钠14-16%、碳酸锌1-3%，余量为生物相容性聚合物。

海藻酸钠为一种天然多糖，具良好的稳定性、溶解性、粘性和安全性，可作为IFN-γ因子依附的载体，具有羧基，是β-D-甘露糖醛酸的醛基以苷键形成的高聚糖醛酸，亲水性强，能形成非常粘稠的均匀的溶液，具有其他类似物难于获得的柔软性、均一性及其他优良特性。

IFN-γ是具有多种功能的活性蛋白质在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，可作为IFN-γ稳定剂。碳酸锌可促进分化淋巴细胞和细胞免疫功能，并可与肝素，提高IFN-γ稳定性。

本发明将IFN-γ因子加入缓释微囊制备液中，利用其缓释特性使IFN-γ因子在培养基中能够持续平稳释放，提高工作效率、降低成本使免疫细胞平稳扩增，可 5-7天添加一次。传统方法将IFN-γ因子直接添加到培养基中， IFN-γ因子浓度减少过快，浓度差异大，需频繁添加，且工作效率低，影响细胞增殖速率和细胞性状的稳定性。

进一步地，所述生物相容性聚合物为聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸 - 聚乙二醇（PLA-PEG）或聚羟基乙酸 - 聚乙二醇（PLGA-PEG）中的一种或几种。上述组分为生物相容性材料，具有环境友好性和良好的缓释效果。

本发明的有益效果在于：本发明采用的免疫细胞储存方法简单有效，在细胞冻存液添加人自体血浆，避免了外源血清存在的传染病的风险，不会对人体过继免疫治疗产生影响；细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求；本发明的免疫细胞冻存复苏后经诱导培养的存活率在90%以上，细胞保持无菌状态，各项生物学指标均满足需求，与未冻存的单个核细胞诱导成免疫细胞培养增殖状态相比无明显差异，储存效果良好，可应用于临床治疗。

本发明的免疫细胞冻存方法采用同体芯片智能系统，能对细胞库样本进行实时监控及追踪，克服样本数据信息丢失以及混乱等弊端，能够正确记录细胞存储位置、温度以及细胞来源等基本信息，并且细胞具有唯一标识符信息，使用方便，安全可靠。

本发明将IFN-γ因子加入缓释微囊中，利用其缓释特性使IFN-γ因子在培养基中能够持续平稳释放，无需频繁添加，可防止培养基中IFN-γ因子浓度变化快给细胞带来损害，提高工作效率、降低成本，使免疫细胞能平稳扩增，提高产品稳定性。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

本发明的实施例1-9中，细胞冻存液的各组分配比如表1所示：

表1 细胞冻存液的各组分配比

实施例1

从健康受试者外周血中采血，自体血浆的制备包括以下步骤：将人体外周血离心20min，取出上层血浆放入容器内，在56℃温度下灭活30min后，置于-20℃温度下冻存10min；然后在4℃条件下以2500rpm的速度离心15min离心，取上清液即可得到细胞冻存液用的自体血浆。

人体外周血离心时间短或离心力过低导致外周血血浆分离得到的血浆量少，离心时间长或离心力过高会使得下层血细胞活率低，从而导致下层 PBMC 诱导培养得到的免疫细胞量少。本实施例的离心时间、离心转速和离心温度，不仅能较大量的获得血浆，并能保证血浆中蛋白含量的稳定和活性因子成分的不缺失。

采用一种免疫细胞的储存方法进行储存，储存方法包括以下步骤：

（1）外周血单个核细胞分离和收集：取上述700g离心下层的血细胞，用PBS1:1稀释，吹匀，得到细胞悬液；取Ficoll淋巴细胞分离液，然后将细胞悬液加入到Ficoll淋巴细胞分离液的上层，800g，15min离心处理；吸取白膜层细胞，加入PBS混匀后，计算单个核细胞总数与细胞活力并进行离心处理；弃上清液，加入PBS混匀后再次离心，弃上清液后，收集得外周血单个核细胞；

（3）细胞冻存：将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-80℃后转至-196℃液氮罐冻存。经检测合格后出具储存合格报告。

进一步地，所述步骤（3）中，细胞重悬液的细胞密度为1×10⁷/mL。

进一步地，所述免疫细胞的储存方法，还包括以下步骤：

进一步地，所述步骤（4）具体为：当所述步骤（3）将细胞重悬液分装入冻存袋后，于冻存袋上贴上记录细胞信息的标签，并置于已负载芯片的冻存袋盒中，应用芯片读取器读取芯片并录入同体芯片智能系统，且对芯片负载的细胞样本在系统中进行信息编辑以确保细胞样本与芯片信息正确对应，将冻存袋盒置于程序化冷冻仪内进行程序降温后，再将冻存袋盒置于同样已负载芯片的冻存架，放入液氮罐中储存。

采用该方法能对细胞库样本进行实时监控及追踪，细胞样本的信息按照层级关系通过芯片依次录入同体芯片智能系统后，可在该系统中快速查找细胞样本的位置及样本信息。

进一步地，所述免疫细胞的储存方法，还包括以下步骤：

（5）复苏细胞的培养：将液氮冻存的细胞重悬液的单个核细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和retronectin包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊，通过计算和调整缓释微囊的加入量，使IFN-γ因子的终浓度为1000IU/ mL；；之后置于37℃，5%CO2培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为5×10⁵～2×10⁶/mL；视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数；共培养17天。培养17天有利于CIK细胞的扩增和成熟，获得足够多的细胞，减少因不同受试者细胞活性差异因起细胞扩增数目不足。

进一步地，本实施例采用bluechiip的全生命周期监控和溯源系统及芯片技术，对细胞库样本进行实时监控及追踪，可克服样本数据信息丢失以及混乱等弊端，正确记录细胞存储位置、温度以及细胞来源等基本信息，并且细胞具有唯一标识符信息，使用方便，安全可靠。

进一步地，缓释微囊包括以下质量百分比的组分： IFN-γ因子9-11%、肝素1-2%、海藻酸钠14-16%、碳酸锌1-3%、余量为生物相容性聚合物。优选地，本实施例中缓释微囊包括以下质量百分比的组分： IFN-γ因子10%、肝素1.5%、海藻酸钠15%、碳酸锌2%，余量为生物相容性聚合物。

本实施例中，所述生物相容性聚合物为聚羟基乙酸，为生物相容性材料，具有环境友好性和良好的缓释效果。

本实施例中，缓释微囊的制备包括以下步骤：将聚羟基乙酸（Mw为50000-60000）500mg溶于乙酸乙酯10mL中，按比例加入IFN-γ因子、肝素、碳酸锌和海藻酸钠微粉，将其匀化后形成油相；取1wt%聚乙烯醇（Mw为28000-32000）水溶液 1000mL，制成水相；在微量注射泵作用下通过内径为200-400μm喷嘴将油相匀速喷入涡旋运动的水相中，搅拌，经离心，洗涤和真空冷冻干燥，制得缓释微囊。缓释微囊的制备工艺简单，颗粒均匀，包封率在80%以上，可较少添加频率，提高细胞性状稳定性。

1、储存时间对细胞冻存效果的影响

取两组冻存的外周血单个核细胞（PBMC），分别标记为A、B组，经1个月、3个月、6个月冻存后依次取出复苏，检测细菌、真菌、内毒素、支原体、细胞存活率，并进行复苏诱导成CIK细胞培养，测定细胞增殖情况。通过上述实验来分析PBMC冻存效果。

1.1冻存1个月后从液氮罐中取A、B组PBMC复苏，进行如下实验：

测定的细菌、真菌、内毒素、支原体、细胞存活率结果分析如表2所示：

表2 冻存1个月后细胞的微生物指标及存活率

取A、B组PBMC各一份，复苏诱导CIK细胞培养，另取未冻存的1份PBMC作为对照组，分别测定细胞增殖倍数。

取复苏后外周血单个核细胞的细胞重悬液2 mL，用10mL CIK细胞培养基（即1000mLAIM-V培养基中，含有IL-2浓度为1000IU/mL，硫酸庆大霉素浓度为160IU/mL）重悬加入到已预先用抗CD3单抗和retronectin包被好的培养容器中，培养容器中抗CD3单抗的终浓度为5μg/mL， retronectin的终浓度为12.5μg/mL，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊，通过计算和调整缓释微囊的加入量，使IFN-γ因子的终浓度为1000IU/ mL；之后置于37℃，5%CO2培养箱中培养。视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数；共培养17天。实验结果统计如表3所示：

表3 冻存1个月后细胞的增殖结果

1.2 冻存3个月后从液氮罐中取A、B组PBMC复苏，进行如下实验：

测定的细菌、真菌、内毒素、支原体、细胞存活率结果分析如表4所示：

表4 冻存3个月后细胞的微生物指标及存活率

取A、B组PBMC各一份复苏诱导CIK细胞培养，另取未冻存的1份PBMC作为对照组，分别测定细胞增殖倍数。实验结果统计如表5所示：

表5 冻存3个月后细胞的增殖结果

1.3冻存6个月后从液氮罐中取A、B组PBMC复苏，进行如下实验：

测定的细菌、真菌、内毒素、支原体、细胞存活率结果分析如表6所示：

表6 冻存6个月后细胞的微生物指标及存活率

取A、B组PBMC各一份，复苏诱导CIK细胞培养，另取未冻存的1份PBMC作为对照组，分别测定细胞增殖倍数。实验结果统计如表7所示：

表7 冻存6个月后细胞的增殖结果

经上述实验，比较不同冻存时间下的单个核细胞复苏后微生物及细胞存活率情况，实验结果说明复苏后的细胞都保持无菌状态，且细胞存活率无明显差异；此外还比较不同冻存时间下的细胞复苏诱导CIK细胞的生长增殖情况，实验结果说明冻存时间的长短对单个核细胞活性无明显影响，性状稳定，诱导CIK细胞增殖效率高，与不冻存的单个核细胞诱导CIK细胞培养无明显差异。因此， 6个月内单个核细胞的质量未受到冻存时间长短的影响，冻存效果良好。本发明同样适用于其他免疫细胞的储存。

本发明将IFN-γ因子加入缓释微囊中，利用其缓释特性使IFN-γ因子在培养基中能够持续平稳释放，无需频繁添加，提高工作效率、降低成本使免疫细胞能平稳扩增，提高产品稳定性。

2、本发明的细胞冻存液与其他细胞冻存液的比较

本实施例将本发明的细胞冻存液与市场上销售的细胞冻存液冻存效果比较，进一步说明本发明的细胞冻存液冻存效果。实验方案采用市场上销售的TBD、KM Banker II，分别命名为细胞冻存液A、B，作为对照组，本发明的细胞冻存液命名为细胞冻存液C。

设计实验比较三种细胞冻存液冻存细胞后1个月、3个月、6个月细胞存活率。实验结果分析如表7所示：

表8 实施例1的细胞冻存液与市场其他细胞冻存液的比较

由实验结果可以看出，本发明的细胞冻存液分别冻存1个月、3个月和6个月后，细胞存活率均优于市场上销售的其他两种细胞冻存液，冻存效果良好。

实施例2

本实施例与实施例1的储存方法不同之处在于：

取复苏后外周血单个核细胞的细胞重悬液2 mL，用10mL CIK细胞培养基（即1000mLAIM-V培养基中，含有IL-2浓度为1000IU/mL，硫酸庆大霉素160IU/mL）重悬加入到已预先用抗CD3单抗和retronectin包被好的培养容器中，其中培养容器中抗CD3单抗的终浓度为5μg/mL，retronectin的终浓度为12.5μg/mL，并添加未被微胶囊包裹的IFN-γ因子，IFN-γ因子的终浓度为1000IU/ mL，之后置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数；共培养17天。

实施例3

本实施例与实施例1的储存方法不同之处在于：

本实施例中，自体血浆的制备包括以下步骤：将人体外周血离心，取出上层血浆放入容器内，在55℃温度下灭活32min后，置于-22℃温度下冻存；然后在5℃条件下以离心，取上清液得到细胞冻存液用的自体血浆。

本实施例中，所述步骤（3）为：将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78℃后转至-196℃液氮罐冻存。经检测合格后出具储存合格报告。

进一步地，所述缓释微囊的材料为聚乳酸 - 聚乙二醇。

实施例4

本实施例与实施例1的储存方法不同之处在于：

本实施例中，自体血浆的制备包括以下步骤：将人体外周血离心，取出上层血浆放入容器内，在60℃温度下灭活28min后，置于-18℃温度下冻存；然后在3℃条件下离心，取上清液得到细胞冻存液用的自体血浆。

本实施例中，所述步骤（3）为：将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。经检测合格后出具储存合格报告。其中，细胞重悬液的细胞密度为5×10⁶。

进一步地，缓释微囊包括以下质量百分比的组分： IFN-γ因子11%、肝素1%、海藻酸钠16%、碳酸锌3%，余量为生物相容性聚合物。

实施例5

本实施例与实施例1的储存方法不同之处在于：

取复苏后外周血单个核细胞的细胞重悬液2 mL，用10mL CIK细胞培养基重悬加入到已预先用抗CD3单抗和retronectin包被好的培养容器中，其中培养容器中抗CD3单抗的终浓度为5μg/mL， retronectin的终浓度为12.5μg/mL，并添加IFN-γ因子1000IU/ mL，之后置于37℃，5%CO2培养箱中培养。视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数；共培养17天。

本实施例中，缓释微囊包括以下质量百分比的组分： IFN-γ因子10%，肝素2%，海藻酸钠15%，碳酸锌3%，卵磷脂2%，余量为聚羟基乙酸。卵磷脂可作为稳定剂和乳化剂，并提供免疫培养基中所需营养物，环境友好。

本实施例中，缓释微囊的制备包括以下步骤：将聚羟基乙酸500mg溶于乙酸乙酯3mL中，按比例加入IFN-γ因子、肝素、碳酸锌，和海藻酸钠微粉，经水浴超声波混悬后添加50mL植物油，并加入卵磷脂，超声波乳化，加入分散相萃取乳滴中的乙酸乙酯使其固化成微囊，并加入二氯甲烷不断搅拌使其固化完全，经离心、洗涤、冷冻干燥后制得缓释微囊。

实施例6

本实施例与实施例1的储存方法不同之处在于：

本实施例中，自体血浆的制备包括以下步骤：将人体外周血离心20min后，取出上层血浆放入容器内，在58℃温度下灭活32min后，置于-18℃温度下冻存；然后在3℃条件下离心，得到细胞冻存液用的自体血浆。

进一步地，所述缓释微囊的材料为聚羟基乙酸 - 聚乙二醇，具有良好的缓释效果。

实施例7

本实施例与实施例1的储存方法不同之处在于：

进一步地，所述缓释微囊的材料为聚乳酸。

实施例8-9的储存方法同实施例1，这里不再赘述。

分别采用实施例1-8的细胞冻存液，因冻存时间长短对冻存效果无明显影响，因此本次实验采用冻存1个月后，复苏细胞及测定细胞存活率。实验方法及其他实验条件同1.1。本发明的浓度百分比为体积浓度百分比。实验结果分析如表9所示：

表9 9个实施例中的细胞存活率

将实施例1-9的细胞重悬液的细胞密度均设为1×10⁷/mL，冻存6个月后，诱导培养17天，分别测定细胞增殖倍数。实验结果分析如表10所示：

表10 9个实施例中的细胞增殖结果

由表9-10可知，9个实施例中的免疫细胞冻存复苏后经诱导培养的存活率均在90%以上，可以确保细胞的持续活性。实施例2未采用缓释微囊，需频繁添加IFN-γ因子，在其他条件相同的情况下，实施例1的细胞存活率和细胞增殖倍数均高于实施例2，且工作效率也更高。因此本发明使用缓释微囊，具有良好的效果。

本发明采用的免疫细胞储存方法简单有效，在细胞冻存液添加人自体血浆，避免了外源血清存在的传染病的风险，不会对人体过继免疫治疗产生影响；细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，经诱导培养后细胞存活率高，细胞保持无菌状态，各项生物学指标均满足需求，与未冻存的单个核细胞诱导成免疫细胞培养增殖状态相比无明显差异，储存效果良好，可应用于临床治疗。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种免疫细胞的储存方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)外周血单个核细胞分离和收集：人体外周血离心后，取下层的血细胞，用PBS稀释，得到细胞悬液；取Ficoll淋巴细胞分离液，然后将细胞悬液加入到Ficoll淋巴细胞分离液的上层进行离心处理；吸取白膜层细胞，加入PBS混匀后，计算单个核细胞总数与细胞活力并进行离心处理；弃上清液，加入PBS混匀后再次离心，弃上清液后，收集得外周血单个核细胞；

(2)加入细胞冻存液：根据所得外周血单个核细胞总数与细胞活力计算结果，在步骤(1)收集得到的外周血单个核细胞中细胞冻存液后混匀，处理后得到细胞重悬液，取样做微生物检测；

(3)细胞冻存：将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存，细胞重悬液的细胞密度为5×10⁶～2×10⁷/mL；

(4)细胞库样本的监控和追踪：采用同体芯片智能系统记录细胞储存位置、温度及细胞来源信息，建立细胞库，对细胞库样本进行实时监控和追踪；

(5)复苏细胞的培养：将液氮冻存的细胞重悬液的外周血单个核细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和retronectin包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；之后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为5×10⁵～2×10⁶/mL；视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数；共培养16-18天；所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子9-11％、肝素1-2％、海藻酸钠14-16％、碳酸锌1-3％，余量为生物相容性聚合物；

其中，步骤(2)中所述细胞冻存液，按照体积百分比，包含以下组分：

上述体积百分比的总和为100％；

所述无血清液体培养基为GIBCO的AIM-V培养基。

2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞的储存方法，其特征在于：所述自体血浆的制备包括以下步骤：将人体外周血离心后，取出上层血浆放入容器内，在55～60℃温度下灭活28-32min后，置于-18～-22℃温度下冻存；然后在3～5℃条件下离心，取上清液，得到细胞冻存液用的自体血浆。

3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞的储存方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：当所述步骤(3)将细胞重悬液分装入冻存袋后，于冻存袋上贴上记录细胞信息的标签，并置于已负载芯片的冻存袋盒中，应用芯片读取器读取芯片并录入同体芯片智能系统，且对芯片负载的细胞样本在系统中进行信息编辑以确保细胞样本与芯片信息正确对应，将冻存袋盒置于程序化冷冻仪内进行程序降温后，再将冻存袋盒置于同样已负载芯片的冻存架，放入液氮罐中储存。

4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞的储存方法，其特征在于：培养前抗CD3单抗的终浓度为5μg/mL，retronectin的终浓度为12.5μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为1000IU/mL。

5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞的储存方法，其特征在于：所述CIK细胞培养基为AIM-V培养基，添加有浓度为1000IU/mL的IL-2和浓度为160IU/mL的硫酸庆大霉素。