CN107012119B - 一种从骨髓中提取免疫细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：（1）采集人骨髓，用含胎牛血清的α‑MEM培养液稀释，离心，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；（2）将人体外周血移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含所述上层血浆的α‑MEM培养液制成细胞悬液；（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，冻存。本发明的方法能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。

Description

一种从骨髓中提取免疫细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从骨髓中提取免疫细胞的方法。
背景技术
骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫细胞，在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的免疫细胞。目前主要是利用低温冻存技术保存免疫细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但在分离、冻存过程中，会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。
另一方面，骨髓中含有较多的脂肪，影响分离效果，不能获得足够的免疫细胞，再加上冻存过程中对细胞产生的损伤，使免疫细胞冻存复苏后的存活率不高。细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的淋巴细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。现有技术中，常规的Ficoll 400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用。
因此，有必要提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的提取方法。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种从骨髓中提取免疫细胞的方法,该方法能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
（1）采集人骨髓，用含质量分数为10%-14％胎牛血清的α-MEM培养液稀释2-4倍，200-400rpm转速下离心2-4min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，500-700rpm转速下离心5-9min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为10%-14％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，600-800rpm转速下离心10-20min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
优选的，所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为4×105-8×105个/mL。
优选的，所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1-3重量份，海藻糖1-2重量份，超低粘度海藻酸钠1-2重量份，泛影葡胺3-5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.4-0.8重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
本发明采用的右旋糖酐是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
优选的，所述步骤（3）中，分离液的密度为1.050-1.070g/cm3，渗透压为250-270smol/kg，pH为7-8，粘度为1.0-3.0cp。
优选的，所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 4-8mL
右旋糖酐 2-6mL
细胞培养基 10-30mL
人血清白蛋白 1-5mL
人自体血浆 60-100mL。
所述二甲基亚砜为SIGMA型号为472301的二甲基亚砜。二甲基亚砜能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
右旋糖酐可以维持渗透压和pH值，提供适宜细胞存活的介质环境。
本发明采用在免疫细胞冻存液中添加人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性，避免由于细胞存储供者血质问题导致过程储存活性不稳定或细胞复苏率下降。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用上述原料，并严格控制各原料的重量配比，制得的免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
优选的，所述细胞培养基为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、GT-T561培养基和Stemspan培养基中的任意一种。
所述细胞培养基的种类为本领域技术人员熟知的细胞培养基即可，并无特殊的限制，本发明中优选为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基或RPMI-1640培养基。AIM-V培养基购于美国Invitrogen公司，其中主要含有L-谷氨酰胺、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素等，用以保持免疫细胞活性，使得免疫细胞复苏后能够维持其细胞活性，并延长免疫细胞存活期。细胞培养基具有保持细胞渗透压、酸碱平衡体系和提供营养等作用。
优选的，所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500-2000rpm转速下离心4-8min，取上层血浆在56-60℃温度下灭活28-32min后，转移至新的离心管中，2500-3500rpm转速下离心15-25min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
人自体血浆为营养保护剂，其中包括血清蛋白、葡萄糖、无机盐离子、胰岛素、肾上腺皮质激素，类固醇激素等，不仅能够为免疫细胞提供所需的营养物质，而且血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤。
本发明的细胞冻存液添加人自体血浆，人自体血浆与血清成分相似，亦含有免疫细胞生长所需的各种细胞因子及营养物质，且属于免疫细胞分离的副产物，方便获取，不存在异源性，避免了外源血清存在的安全隐患。
本发明中所述免疫细胞冻存液中含有的重组人白介素-2和人自体血浆具有显著的协同作用，可以显著提高免疫细胞的活性和复苏后的存活率。
本发明所述免疫细胞冻存液中采用人自体血浆作为血清替代物，不含有动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括糖类1-3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4组成的混合物。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用海藻糖，可以减少二甲基亚砜的使用，保证细胞在接近冰点时胞内的水分不会结晶，能有效的保护细胞，并有效降低细胞毒性。
本发明添加α-1 ,4-葡聚糖能够有效的降低冻存、复苏中细胞的损伤，并能够保证复苏后细胞增殖的活力。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用香菇多糖和葡萄糖，可以保证复苏后细胞增殖活力不受影响。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2-0.6g和维生素C 0.1-0.5g。
所述非必须氨基酸为本领域技术人员熟知的非必须氨基酸即可，并无特殊的限制，本发明优选为多种非必需氨基酸组合而成，更优选为购买自GIBCO试剂的非必须氨基酸。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用非必须氨基酸和维生素C，可以保证复苏后细胞增殖活力不受影响。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和1,2-丙二醇，可以替代现用的二甲基亚砜为基础的冻存液，减少二甲基亚砜的用量，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素4000-8000U。所述重组人白介素可以采用注射用重组人白介素-2。
通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2(IL-2)受体，IL-2与其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成；促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用于免疫细胞的扩增培养，而本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到免疫细胞冻存液中，可大幅度提高所述免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接应用和进一步扩展的关键问题。
本发明添加重组人白介素-2能够有效维持细胞的活性，保证细胞复苏后正常的生物学功能。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用白酒草皂苷R与二甲基亚砜结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低二甲基亚砜的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用勃脉力A，可以维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近于体内环境的溶液中。
优选的，所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1-0.5mL和氯化钠0.4-0.8g。
所述青霉素和链霉素双抗溶液为GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液每毫升包含10000单位青霉素（碱）和 10000µg链霉素（碱），利用0.85%盐液形式的青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素，其抗菌谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。青霉素和链霉素双抗溶液可保证细胞储存过程中处于无菌状态，且对免疫细胞无不良影响，安全可靠。
本发明的免疫细胞冻存液通过采用氯化钠，可以维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近于体内环境的溶液中。
优选的，所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为5×106-5×107个/mL。
优选的，所述步骤（4）中，程序降温先以1-2℃/min的降温速度降温至-23～-27℃，再以5-7℃/min的降温速度降温至-78～-82℃。
优选的，所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为36-38℃、CO2浓度为4%-6%的培养箱中培养16-18d。
优选的，所述抗CD3单抗培养前的终浓度为2-5μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为8-12μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为500-900IU/mL。
优选的，所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子6-8%、肝素2-4%、海藻酸钠8-12%、碳酸锌0.4-0.8%，余量为生物相容性聚合物。
海藻酸钠为一种天然多糖，具良好的稳定性、溶解性、粘性和安全性，可作为IFN-γ因子依附的载体，具有羧基，是β-D-甘露糖醛酸的醛基以苷键形成的高聚糖醛酸，亲水性强，能形成非常粘稠的均匀的溶液。具有其他类似物难于获得的柔软性、均一性及其他优良特性。
IFN-γ是具有多种功能的活性蛋白质在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，可作为IFN-γ稳定剂。碳酸锌可促进分化淋巴细胞和细胞免疫功能，并可与肝素，提高IFN-γ稳定性。
本发明将IFN-γ因子加入缓释微囊制备液中，利用其缓释特性使IFN-γ因子在培养基中能够持续平稳释放，提高工作效率、降低成本使免疫细胞平稳扩增，可 5-7天添加一次。传统方法将IFN-γ因子直接添加到培养基中， IFN-γ因子浓度减少过快，浓度差异大，需频繁添加，且工作效率低，影响细胞增殖速率和细胞性状的稳定性。
用于制作微囊的囊材包括海藻酸盐、多聚赖氨酸、壳聚糖、2-甲基丙烯酸、羟乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙二酸盐、琼脂糖，聚丙烯胺及羟甲基纤维素等；在本发明中，优先采用壳聚糖或海藻酸盐-聚赖氨酸制作微囊，这两种材料不仅来源方便，而且无生物毒性及免疫原性，制作而成的微囊的膜具有良好的生物相容性、通透性，以及较强的机械稳定性，为免疫细胞提供一个稳定的三维附着空间，此外，在细胞经冻存-复苏后，可起到免疫隔离屏障的作用，能够降低免疫细胞移植引起的免疫排斥反应。
本发明将免疫细胞包裹于囊材中形成直径数十微米至数百微米的微囊，由于免疫细胞的贴壁性，因此微囊为免疫细胞提供了一个良好的附着基质，使免疫细胞相互接触形成一种三维结构；此外，该微囊能够防止生物大分子和细胞从微囊中逸出，而小分子物质、培养基的营养物质、细胞冻存液及代谢物可以自由出入微囊，达到培养和冻存的目的等。
所述生物相容性聚合物为聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸 - 聚乙二醇（PLA-PEG）或聚羟基乙酸 - 聚乙二醇（PLGA-PEG）中的一种或几种。上述组分为生物相容性材料，具有环境友好性和良好的缓释效果。
本发明的有益效果在于：本发明可以使用外周血的自体血浆用于骨髓免疫细胞的分离、冻存，外周血的下层细胞也可以用来分离淋巴细胞用于提高患者免疫力；本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明使用外周血的上层血浆用于骨髓细胞的悬浮液制备，并作为冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥应；本发明的分离液对骨髓细胞进行离心处理后，免疫细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带。
本发明的方法能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
（1）采集人骨髓，用含质量分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液稀释2倍，200rpm转速下离心4min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，500rpm转速下离心9min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为10%所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，600rpm转速下离心20min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为4×105个/mL。
所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1重量份，海藻糖1重量份，超低粘度海藻酸钠1重量份，泛影葡胺3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.4重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
所述步骤（3）中，分离液的密度为1.050g/cm3，渗透压为250smol/kg，pH为7，粘度为1.0cp。
所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 4mL
右旋糖酐 2mL
细胞培养基 10mL
人血清白蛋白 1-mL
人自体血浆 60mL。
所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为5×106个/mL。
所述步骤（4）中，程序降温先以1℃/min的降温速度降温至-23℃，再以5℃/min的降温速度降温至-78℃。
所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为36℃、CO2浓度为4%的培养箱中培养16d。
所述抗CD3单抗培养前的终浓度为2μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为8μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为500IU/mL。
所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子6%、肝素2%、海藻酸钠8%、碳酸锌0.4%，余量为生物相容性聚合物。
实施例2
一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
（1）采集人骨髓，用含质量分数为11％胎牛血清的α-MEM培养液稀释2.5倍，250rpm转速下离心3.5min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，550rpm转速下离心8min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为11％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，650rpm转速下离心18min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-79℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为5×105个/mL。
所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1.5重量份，海藻糖1.2重量份，超低粘度海藻酸钠1.2重量份，泛影葡胺3.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.5重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
所述步骤（3）中，分离液的密度为1.055g/cm3，渗透压为255smol/kg，pH为7.5，粘度为1.5cp。
所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 5mL
右旋糖酐 3mL
细胞培养基 15mL
人血清白蛋白 2mL
人自体血浆 70mL。
所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为8×106个/mL。
所述步骤（4）中，程序降温先以1.5℃/min的降温速度降温至-24℃，再以6℃/min的降温速度降温至-79℃。
所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养17d。
所述抗CD3单抗培养前的终浓度为3μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为9μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为600IU/mL。
所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子6.5%、肝素2.5%、海藻酸钠9%、碳酸锌0.5%，余量为生物相容性聚合物。
实施例3
一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
（1）采集人骨髓，用含质量分数为12％胎牛血清的α-MEM培养液稀释3倍，300rpm转速下离心3min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，600rpm转速下离心7min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为12％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，700rpm转速下离心15min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-80℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为6×105个/mL。
所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2重量份，海藻糖1.5重量份，超低粘度海藻酸钠1.5重量份，泛影葡胺4重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.6重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
所述步骤（3）中，分离液的密度为1.060g/cm3，渗透压为260smol/kg，pH为7.5，粘度为2.0cp。
所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 6mL
右旋糖酐 4mL
细胞培养基 20mL
人血清白蛋白 3mL
人自体血浆 80mL。
所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为1×107个/mL。
所述步骤（4）中，程序降温先以1.5℃/min的降温速度降温至-25℃，再以6℃/min的降温速度降温至-80℃。
所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养17d。
所述抗CD3单抗培养前的终浓度为3.5μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为10μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为700IU/mL。
所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子7%、肝素3%、海藻酸钠10%、碳酸锌0.6%，余量为生物相容性聚合物。
实施例4
一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
（1）采集人骨髓，用含质量分数为13％胎牛血清的α-MEM培养液稀释3.5倍，350rpm转速下离心2.5min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，650rpm转速下离心6min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为13％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，750rpm转速下离心12min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-81℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为7×105个/mL。
所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5重量份，海藻糖1.8重量份，超低粘度海藻酸钠1.8重量份，泛影葡胺4.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.7重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
所述步骤（3）中，分离液的密度为1.065g/cm3，渗透压为265smol/kg，pH为7.5，粘度为2.5cp。
所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 7mL
右旋糖酐 5mL
细胞培养基 25mL
人血清白蛋白 4mL
人自体血浆 90mL。
所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为3×107个/mL。
所述步骤（4）中，程序降温先以1.5℃/min的降温速度降温至-26℃，再以6℃/min的降温速度降温至-81℃。
所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养17d。
所述抗CD3单抗培养前的终浓度为4μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为11μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为800IU/mL。
所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子7.5%、肝素3.5%、海藻酸钠11%、碳酸锌0.7%，余量为生物相容性聚合物。
实施例5
一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
（1）采集人骨髓，用含质量分数为14％胎牛血清的α-MEM培养液稀释4倍，400rpm转速下离心2min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，700rpm转速下离心5min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为14％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，800rpm转速下离心10min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。
所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为8×105个/mL。
所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3重量份，海藻糖2重量份，超低粘度海藻酸钠2重量份，泛影葡胺5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.8重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
所述步骤（3）中，分离液的密度为1.070g/cm3，渗透压为270smol/kg，pH为8，粘度为3.0cp。
所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 8mL
右旋糖酐 6mL
细胞培养基 30mL
人血清白蛋白 5mL
人自体血浆 100mL。
所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为5×107个/mL。
所述步骤（4）中，程序降温先以2℃/min的降温速度降温至-27℃，再以7℃/min的降温速度降温至-82℃。
所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为38℃、CO2浓度为6%的培养箱中培养18d。
所述抗CD3单抗培养前的终浓度为5μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为12μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为900IU/mL。
所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子8%、肝素4%、海藻酸钠12%、碳酸锌0.8%，余量为生物相容性聚合物。
实施例6
本实施例与上述实施例1的不同之处在于：
所述细胞培养基为X-VIVO15培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1500rpm转速下离心8min，取上层血浆在56℃温度下灭活32min后，转移至新的离心管中，2500rpm转速下离心15min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类1g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8：1.5：2组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.2g和维生素C 0.1g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2mL和聚乙二醇0.4mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素4000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3g和勃脉力A 0.8g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.1mL和氯化钠0.4g。
实施例7
本实施例与上述实施例2的不同之处在于：
所述细胞培养基为AIM-V培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1600rpm转速下离心7min，取上层血浆在57℃温度下灭活31min后，转移至新的离心管中，2800rpm转速下离心22min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类1.5g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.9：1.8：2.5组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.3g和维生素C 0.2g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.2-0.6mL和聚乙二醇0.4-0.8mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素5000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.4g和勃脉力A 0.9g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.2mL和氯化钠0.5g。
实施例8
本实施例与上述实施例3的不同之处在于：
所述细胞培养基为DMEM/F12培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1800rpm转速下离心6min，取上层血浆在58℃温度下灭活30min后，转移至新的离心管中，3000rpm转速下离心20min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类2g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1：2：3组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.4g和维生素C 0.3g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.4mL和聚乙二醇0.6mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素6000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.5g和勃脉力A 1g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.3mL和氯化钠0.6g。
实施例9
本实施例与上述实施例4的不同之处在于：
所述细胞培养基为RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或GT-T561培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中，1900rpm转速下离心5min，取上层血浆在59℃温度下灭活29min后，转移至新的离心管中，3200rpm转速下离心18min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类2.5g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.1：2.2：3.5组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.4g和维生素C 0.3g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.4mL和聚乙二醇0.6mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素6000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.3-0.7g和勃脉力A 0.8-1.2g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.3mL和氯化钠0.6g。
实施例10
本实施例与上述实施例5的不同之处在于：
所述细胞培养基为Stemspan培养基。
所述人自体血浆的制备方法为：将人体外周血置于无菌离心管中， 2000rpm转速下离心4min，取上层血浆在60℃温度下灭活28min后，转移至新的离心管中，3500rpm转速下离心15min，吸取上清，即为冻存用人自体血浆。
所述免疫细胞冻存液还包括糖类3g，所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.2：2.5：4组成的混合物。
所述免疫细胞冻存液还包括非必须氨基酸0.6g和维生素C 0.5g。
所述免疫细胞冻存液还包括丙二醇0.6mL和聚乙二醇0.8mL。
所述免疫细胞冻存液还包括重组人白介素8000U。
所述免疫细胞冻存液还包括白酒草皂苷R 0.7g和勃脉力A 1.2g。
所述免疫细胞冻存液还包括青霉素-链霉素双抗溶液0.5mL和氯化钠0.8g。
将实施例1-5的方法从骨髓中提取免疫细胞，经1个月、3个月、6个月、12个月冻存后依次取出复苏，检测免疫细胞存活率，实验结果如下表所示：
细胞存活率 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8 实施例9 实施例10
1个月（%） 97.18 97.21 97.32 97.26 97.22 97.23 97.26 97.37 97.31 97.27
3个月（%） 96.85 96.92 97.05 96.94 96.88 96.90 96.97 97.10 96.99 96.93
6个月（%） 96.42 96.48 96.53 96.51 96.45 96.47 96.53 96.58 96.56 96.50
12个月（%） 96.01 96.04 96.12 96.08 96.06 96.06 96.09 96.17 96.13 96.11
从上表可以看出，本发明的方法能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）人骨髓用含质量分数为10%-14％胎牛血清的α-MEM培养液稀释2-4倍，200-400rpm转速下离心2-4min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；
（2）将人体外周血移入离心管中，500-700rpm转速下离心5-9min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为10%-14％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，600-800rpm转速下离心10-20min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存；
所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：
二甲基亚砜 4-8mL
右旋糖酐 2-6mL
细胞培养基 10-30mL
人血清白蛋白 1-5mL
人自体血浆 60-100mL
糖类 1-3g
非必须氨基酸 0.2-0.6g
维生素C 0.1-0.5g
丙二醇 0.2-0.6mL
聚乙二醇 0.4-0.8mL
重组人白介素 4000-8000U
白酒草皂苷R 0.3-0.7g
勃脉力A 0.8-1.2g
青霉素-链霉素双抗溶液 0.1-0.5mL
氯化钠 0.4-0.8g；
所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4组成的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为4×105-8×105个/mL。
3.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1-3重量份，海藻糖1-2重量份，超低粘度海藻酸钠1-2重量份，泛影葡胺3-5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.4-0.8重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
4.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，分离液的密度为1.050-1.070g/cm3，渗透压为250-270smol/kg，pH为7-8，粘度为1.0-3.0cp。
5.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为5×106-5×107个/mL。
6.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，程序降温先以1-2℃/min的降温速度降温至-23～-27℃，再以5-7℃/min的降温速度降温至-78～-82℃。
7.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）之后还包括步骤（5）将液氮冻存的免疫细胞复苏后，用CIK细胞培养基重悬，加入到已预先用抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊；然后置于温度为36-38℃、CO2浓度为4%-6%的培养箱中培养16-18d。
8.根据权利要求7所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述抗CD3单抗培养前的终浓度为2-5μg/mL，重组人纤维连接蛋白培养前的终浓度为8-12μg/mL，添加IFN-γ因子的终浓度为500-900IU/mL。
9.根据权利要求7所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子6-8%、肝素2-4%、海藻酸钠8-12%、碳酸锌0.4-0.8%，余量为生物相容性聚合物。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108513973A (zh) * 2018-05-30 2018-09-11 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液
CN109526943A (zh) * 2018-12-30 2019-03-29 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种免疫细胞冻存方法
US11697799B2 (en) 2019-04-15 2023-07-11 Ossium Health, Inc. System and method for extraction and cryopreservation of bone marrow
US20220288121A1 (en) * 2019-08-29 2022-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Cell cryopreservation medium
WO2022020210A1 (en) 2020-07-18 2022-01-27 Ossium Health, Inc. Permeation of whole vertebral bodies with a cryoprotectant using vacuum assisted diffusion
AU2021360590A1 (en) 2020-10-14 2023-06-15 Ossium Health, Inc. Systems and methods for extraction and cryopreservation of bone marrow
EP4262831A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Ossium Health, Inc. Methods of cell therapies
CN115644168B (zh) * 2022-11-09 2024-03-01 湖南开启时代生物科技有限责任公司 一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016007506A1 (en) * 2014-07-07 2016-01-14 Targazyme, Inc. Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104719282B (zh) * 2015-02-13 2017-01-11 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法
CN105123671B (zh) * 2015-07-24 2017-10-13 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法
CN105524879A (zh) * 2015-12-31 2016-04-27 北京弘润天源生物技术股份有限公司 从骨髓中提取免疫细胞的方法
CN105685017B (zh) * 2016-04-18 2019-02-12 东莞市保莱生物科技有限公司 一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液
CN105994253A (zh) * 2016-07-15 2016-10-12 广州姿生生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存液
CN106665559B (zh) * 2016-12-28 2018-01-09 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞冻存液及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016007506A1 (en) * 2014-07-07 2016-01-14 Targazyme, Inc. Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cryopreservation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells with Reduced Dimethylsulfoxide and Well-Defined Freezing Solutions;Yang Liu等;《Biotechnol. Prog.》;20100622;第26卷(第6期);第1635-1643页，参见全文 *
不同冻存保护剂对外周血单个核细胞的影响;王桂喜等;《中国输血杂志》;20100531;第23卷(第5期);第384-386页，参见全文 *

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