CN105524879A - 从骨髓中提取免疫细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；将外周血移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；将细胞悬液平铺到所述离心液上，离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中进行冻存。本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从骨髓中提取免疫细胞的方法。
背景技术
骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫细胞，在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的免疫细胞。目前主要是利用低温冻存技术保存免疫细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但在分离、冻存过程中，会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。
另一方面，骨髓中含有较多的脂肪，影响分离效果，不能获得足够的免疫细胞，再加上冻存过程中对细胞产生的损伤，使免疫细胞冻存复苏后的存活率不高。细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的淋巴细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。现有技术中，常规的Ficoll400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用。
因此，有必要提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的提取方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的从骨髓中提取免疫细胞的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，提供一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将所述细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将所述免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
本发明可以使用外周血的自体血浆用于骨髓免疫细胞的分离、冻存，外周血的下层细胞也可以用来分离淋巴细胞用于提高患者免疫力；本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明使用外周血的上层血浆用于骨髓细胞的悬浮液制备，并作为冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应；本发明的分离液对骨髓细胞进行离心处理后，免疫细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离。
进一步地，所述步骤5)中冻存液的配方为10％DMSO+5％右旋糖酐+5％海藻糖+18％所述上层血浆+62％注射用生理盐水的混合溶液。
进一步地，所述步骤2)细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3～5重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～0.8重量份，泛影葡胺1～3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1～0.15重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3.5～4.5重量份，海藻糖2.5～3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4～0.8重量份，泛影葡胺1.5～2.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12～0.15重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
优选地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
进一步地，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
进一步地，所述右旋糖酐为Dextran70。
综上所述，本发明的有益效果表现为：
本发明可以使用外周血的自体血浆用于骨髓免疫细胞的分离、冻存，外周血的下层细胞也可以用来分离淋巴细胞用于提高患者免疫力；本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明使用外周血的上层血浆用于骨髓细胞的悬浮液制备，并作为冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应；本发明的分离液对骨髓细胞进行离心处理后，免疫细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离。
具体实施方式
为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例一
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.15g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例二
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐5g，海藻糖2g，超低粘度海藻酸钠0.3g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例三
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.5g，海藻糖3.5g，超低粘度海藻酸钠0.4g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.15g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例四
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4.5g，海藻糖2.5g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例五
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，海藻糖3.3g，超低粘度海藻酸钠0.5g，泛影葡胺2.2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.14g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例六
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4.2g，海藻糖2.8g，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺1.8g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例七
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4.5g，海藻糖3.4g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例八
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖3g，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例一
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)骨髓细胞中加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有右旋糖酐、羟乙基淀粉和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例二
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)骨髓细胞中加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有右旋糖酐，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例三
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)骨髓细胞中加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有葡聚糖，羟乙基淀粉和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的葡聚糖T50020g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例四
从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)骨髓细胞中加入含15％胎牛血清的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将常规Ficoll400分离液加入到离心管中；
4)将细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
在上述实施例中，分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。对比例一至四的分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.065～1.090g/cm3，渗透压为275～320smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。可以将本发明配制的分离液贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
为了验证本发明的冻存的免疫细胞复苏后的存活率，将冻存的免疫细胞从液氮罐中取出一管已冻存的免疫细胞，迅速置于37℃水浴中1min，使之完全融化，取少量细胞检测免疫细胞的存活率，结果表明实施例一至八的免疫细胞存活率均在95％以上，纯度在93％以上，而对比例一至四的免疫细胞存活率均在82％以下，纯度低于90％；而分离过程中实施例一至八的免疫细胞分离率95％以上，对比例一至四的免疫细胞分离率均在87％以下，而对比例2比对比例1的淋巴细胞分离率低40％。
将冻存复苏后的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上，通过典型的CIK细胞培养流程进行培养，培养持续14至28天。期间，对培养过程中的细胞增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标进行测试，结果表明，本发明实施例一至八分离而得的淋巴细胞，在经过典型的CIK细胞培养后，在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中明显优于对比例一至四，尤其是杀瘤活性测试中，本发明冻存复苏后的免疫细胞的杀瘤活性与对比例获得的免疫细胞相比至少提高了15％，实施例八的效果尤其显著，提高了18％。说明本发明冻存复苏后的分离液在分离淋巴细胞方面产生了意料不到的效果，是一种安全、有效的产品。
上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，1％的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效。
本发明可以使用外周血的自体血浆用于骨髓免疫细胞的分离、冻存，外周血的下层细胞也可以用来分离淋巴细胞用于提高患者免疫力；本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明使用外周血的上层血浆用于骨髓细胞的悬浮液制备，并作为冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应；本发明的分离液对骨髓细胞进行离心处理后，免疫细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)采集人骨髓，用含15％胎牛血清的α-MEM培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含15％上述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
4)将所述细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25℃，500g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
5)将所述免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
2.根据权利要求1所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述步骤5)中冻存液的配方为10％DMSO+5％右旋糖酐+5％海藻糖+18％所述上层血浆+62％注射用生理盐水的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述步骤2)细胞悬液的浓度为1～6×106细胞/ml。
4.根据权利要求1所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3～5重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3～0.8重量份，泛影葡胺1～3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1～0.15重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
5.根据权利要求4所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3.5～4.5重量份，海藻糖2.5～3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4～0.8重量份，泛影葡胺1.5～2.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12～0.15重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
6.根据权利要求5所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
7.根据权利要求4所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
8.根据权利要求1至7任一所述的从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
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