CN105147722A - 硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，尤其涉及硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂。本发明提供了硫酸化白芨多糖在制备治疗眼表损伤的制剂中的应用，并提供了包括硫酸化白芨多糖和脐带间充质干细胞的制剂及其在治疗眼表损伤中的应用。本发明将脐带间充质干细胞与硫酸化白芨多糖复配，所得制剂经试验证明能够显著促进角膜上皮细胞的增殖，其效果显著优于单独使用硫酸化白芨多糖或脐带间充质干细胞。细胞迁移试验表明，本发明提供的制剂、硫酸化白芨多糖皆能够显著促进角膜上皮细胞的迁移，但本发明提供制剂的效果显著优于单独使用硫酸化白芨多糖或脐带间充质干细胞。说明，本发明提供的制剂能够具有修复角膜损伤的作用。

Description

硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂。

背景技术

严重眼表损伤是眼科最常见、治疗最棘手的一类疾病，发病率高，患病人群广，而在这些严重的眼表致角膜盲的疾病中，化学伤、热烧伤和机械外伤引起者占了60％以上。目前临床多采用异体角膜移植和人工角膜移植手段治疗眼表损伤。但是，异体角膜移植面临移植排斥、供体不足等问题；而人工角膜构建材料具有的异物性不支持角膜上皮细胞的生长，同时其透明性，可塑性以及拉伸力等等因素依然是限制其发展的重要因素。

为此，近年来大量临床研究开始尝试采用种子细胞配合细胞生长基质来实现眼角膜上皮重建。其中细胞生长基质多采用特殊手段处理过的羊膜基质，从目前临床研究结果来看，具有一定的修复角膜上皮的效果。但是此疗法是采用组织块联合种子细胞的手段，仍不能很好解决累及角膜深层基质助损伤和烧伤后角膜瘢痕和血管化的问题，且可操作性相对较弱。

白芨(Bletillastriata)为兰科白芨属多年生草本植物，以干燥的块茎入药。白芨多糖具有的良好吸湿性和亲水性，能促进氧气、营养物质和其它水溶性代谢产物的通透作用，同时还能加强上皮和基质细胞的粘附性。但目前未见将其用于治疗眼角膜损伤的报道。

脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)为脐带组织来源间充质干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，可作为种子细胞促进组织损伤的修复和再生，因此，hUC-MSCs能够具有修复角膜上皮修复的功能。但是，现有的研究结果却表明，hUC-MSCs在体外的存活能力较差，将其直接用于角膜上皮的修复效果并不理想。将hUC-MSCs应用于角膜上皮的修复仍是目前亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂。本发明通过实验证实硫酸化白芨多糖具有修复

硫酸化白芨多糖在制备治疗眼表损伤的药物中的应用。

在本发明的实施例中，硫酸化白芨多糖所能治疗的眼表损伤为眼角膜损伤。

在本发明的实施例中，硫酸化白芨多糖的分子量为30000D～50000D。

在本发明的实施例中，硫酸化白芨多糖的制备方法为：将白芨粉碎后经水提醇沉，所得沉淀以水重悬，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，经30000D～50000D透析，干燥、纯化、硫酸化，制得硫酸化白芨多糖。

在一些实施例中，水提醇沉具体为：将白芨粉以水浸提后，提取液与乙醇水溶液混合，静置过夜制得沉淀。

在一些实施例中，浸提的温度为80℃，浸提的时间为4h。

在一些实施例中，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为95％。

在一些实施例中，乙醇水溶液与提取液的体积比为1:3。

经过氯仿和丁醇的混合液抽提后，提取物中的蛋白被去除。离心后取水相。

在一些实施例中，氯仿和丁醇的混合物中，氯仿和丁醇的体积比为5:1。

在一些实施例中，沉淀溶于水后溶液的体积是氯仿和丁醇混合物的3倍。

在一些实施例中，透析采用的透析液为蒸馏水。

在一些实施例中，干燥为冻干。

在一些实施例中，干燥后的白芨多糖还经过纯化。

在一些实施例中，纯化为将冻干后的白芨多糖溶解后，过交联葡聚糖G-100柱。

在本发明的实施例中，硫酸化的方法为氯磺酸-吡啶法。

在一些实施例中，硫酸化的试剂为氯磺酸与吡啶。

在一些实施例中，氯磺酸与吡啶的体积比为1:6。

在本发明的实施例中，白芨多糖的硫酸化具体为：将白芨多糖溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌30min后，加入硫酸化试剂，置于60℃水浴搅拌反应3h。

在一些实施例中，硫酸化试剂为氯磺酸与吡啶的混合物，其中氯磺酸与吡啶的体积比为1:6。

在一些实施例中，经硫酸化后，调整pH值为7.5，减压浓缩后以蒸馏水为透析液透析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。

本发明制得硫酸化白芨多糖的分子量为30000D～50000D。

本发明应用体外细胞划痕法建立上皮细胞损伤模型，人角膜上皮细胞以硫酸化白芨多糖处理24小时后倒置显微镜下照相记录计算迁移率。结果表明硫酸化白芨多糖与能促进角膜上皮细胞的迁移，说明其能够起到修复角膜损伤的作用。

本发明还提供了一种多糖-干细胞制剂，包括脐带间充质干细胞和硫酸化白芨多糖。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞的数量为1×10⁵个/mL～5×10⁵个/mL。

在一些实施例中，脐带间充质干细胞的密度为1×10⁵个/mL～3×10⁵个/mL。

在一些实施例中，脐带间充质干细胞的密度为1.0×10⁵个/mL。

在本发明的实施例中，硫酸化白芨多糖的质量分数为50μg/mL～300μg/mL。

在一些实施例中，硫酸化白芨多糖的质量分数为200μg/mL。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞为P3代～P5代的脐带间充质干细胞。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞的分离方法为组织块培养法。

具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括以下步骤：

步骤1：将脐带用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次，以体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡1min～2min后，去除脐带外膜和血管；

步骤2：以人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5％CO₂、37℃、湿度95％；第5～7天半量换培养基，继续培养12～14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。

本发明将脐带间充质干细胞与硫酸化白芨多糖复配，所得制剂经试验证明能够显著促进角膜上皮细胞的增殖，其效果显著优于单独使用硫酸化白芨多糖或脐带间充质干细胞。细胞迁移试验表明，本发明提供的制剂能够显著促进角膜上皮细胞的迁移，其效果显著优于单独使用硫酸化白芨多糖或脐带间充质干细胞。说明本发明提供的制剂能够具有修复角膜损伤的作用。

本发明提供的脐带间充质干细胞制剂作为作为治疗眼表损伤的药物中的应用。

在本发明的实施例中，眼表损伤为眼角膜损伤。

本发明提供的脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脐带间充质干细胞以生理盐水重悬后，与0℃～4℃预冷的硫酸化白芨多糖溶液混合。

在本发明的实施例中，白芨多糖溶液为硫酸化白芨多糖的PBS溶液。

在本发明的实施例中，生理盐水的体积为硫酸化白芨多糖溶液体积的1/20。

本发明提供了硫酸化白芨多糖在制备治疗眼表损伤的制剂中的应用，并提供了包括硫酸化白芨多糖和脐带间充质干细胞的制剂及其在治疗眼表损伤中的应用。本发明将脐带间充质干细胞与硫酸化白芨多糖复配，所得制剂经试验证明能够显著促进角膜上皮细胞的增殖，其效果显著优于单独使用硫酸化白芨多糖或脐带间充质干细胞。细胞迁移试验表明，本发明提供的制剂、硫酸化白芨多糖皆能够显著促进角膜上皮细胞的迁移，但本发明提供制剂的效果显著优于单独使用硫酸化白芨多糖或脐带间充质干细胞。说明，本发明提供的制剂能够具有修复角膜损伤的作用。

具体实施方式

本发明提供了一种脐带间充质干细胞制剂及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

白芨饮片研成粉末在80℃蒸馏水中分散溶解4h后过滤，滤去杂质。

滤液经由3倍体积的95％乙醇浸泡过夜，沉淀物用蒸馏水重悬。

加入1/3体积的氯仿和丁醇的混合液(体积比5:1。)混均离心抽提蛋白成分，提取水相层的液体。

经30000D-50000D透析柱透析(透析液为蒸馏水)，制成冻干粉，得到白芨多糖粗品。将白芨多糖粗品溶解后经交联葡聚糖G-100进一步纯化制得白芨多糖。

将白芨多糖氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰。具体步骤为：

将0.2g多糖粉末溶于35ml无水N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌30min后，加入17.5ml硫酸化试剂(氯磺酸与吡啶的体积比为1:6)，置于60℃水浴搅拌反应3h。反应结束后冷却至室温，反应液加入100ml冰水，用1mol/LNaOH中和至pH7.5，减压浓缩至一定浓度，用蒸馏水透析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。

实施例2

将脐带(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性)置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75％酒精，浸泡1-2min，期间不停翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉，一条静脉)，同时去除脐带外膜；将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液(LonzaUltraCULTURE^TM)，5％CO₂、37℃、湿度为95％的CO₂培养箱中培养。第5天～7天半量换培养基，继续培养12天～14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养。

经传递3～5代的hUC-MSCs细胞生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。

取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD105、CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000～8000个细胞。结果如表1所示：

表1第3代hUC-MSCs细胞表面标志物表达阳性率

细胞表型

CD29

CD31

CD34

CD40

CD44

CD45

CD105

HLA-DR

阳性表达率(％)

94.94±1.06

3.27±0.39

2.13±0.35

1.24±0.06

91.8±1.27

1.22±0.05

99.84±0.17

2.93±0.21

经流式细胞术检测，如表1所示，第3代hUC-MSCs高表达CD105、CD44和CD29，低表达或不表达HLA-DR、CD31、CD45、CD40和CD34等标记物。

实施例3

将实施例1制得的硫酸化白芨多糖溶解于PBS中，配制成50μg/ml～400μg/ml的多糖溶液。对不同浓度多糖溶液与人角膜上皮细胞生物相容性进行实验研究。方法为：取6孔板，分别标记24h，48h，72h，人角膜上皮细胞(购自中科院上海细胞库)悬液按1×10⁴个细胞/孔种植，培养第二天每孔加入不同浓度(0、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml)的硫酸化白芨多糖溶液，分别于24小时、48小时、72小时后行MTT法检测各组细胞增殖变化并进行统计分析结果如表2：

表2不同浓度硫酸化白芨多糖对角膜上皮细胞的生物相容性

结果表明在多糖浓度<300μg/ml时，不影响人角膜上皮细胞的形态和增殖能力，不同浓度多糖与角膜上皮细胞均具有良好的生物相容性，而多糖浓度超过400ul/ml则引起角膜上皮细胞脱水而逐渐死亡。

实施例4～6

以PBS溶液配制浓度为50μg/ml～300μg/ml的硫酸化白芨多糖溶液，放置4℃预冷备用。

选取P3-P5代生长对数期的hUC-MSCs，消化收集，细胞计数后取1×10⁵个～5×10⁵个细胞，以50μL～250μL生理盐水重悬；

将细胞悬液加入到预冷的硫酸化白芨多糖溶液；混匀即可制得多糖-干细胞制剂。实施例4～6配方如表3：

表3实施例4～6

实施例7

将实施例4～6制得的多糖-干细胞制剂与人角膜上皮细胞以transwell体系共培养，检测本发明提供的制剂对角膜上皮细胞增殖的影响。

实验设置不共培养的阴性对照组；与硫酸化白芨多糖溶液共培养(浓度为200μg/mL，以PBS缓冲液配制)的阳性对照组1；与hUC-MSCs共培养的阳性对照组2。

实验方法为：

阴性对照组：取三块6孔板，分别标记24h，48h，72h，人角膜上皮细胞以生理盐水重悬，悬液按1×10⁴个细胞/孔种植，分别于24、48、72小时后行MTT法检测各组细胞增殖变化并进行统计分析。

阳性对照组1：取三块6孔板，分别标记24h，48h，72h，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植，每孔加入200ug/ml多糖溶液，分别于24、48、72小时后行MTT法检测各组细胞增殖变化并进行统计分析。

阳性对照组2：取三块6孔板，分别标记24h，48h，72h，采用Transwell共培养体系，hUC-MSCs按1×10⁴个细胞/孔种植于下室，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植于上室，分别于24、48、72小时后行MTT法检测各组细胞增殖变化并进行统计分析。

实验组(以实施例5为例)：取三块6孔板，分别标记24h，48h，72h，采用Transwell共培养体系，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植于下室，实施例5制得的制剂接种于上室，分别于24、48、72小时后行MTT法检测各组细胞增殖变化并进行统计分析。

实验结果如表4所示：

表4各实验组角膜上皮细胞的光密度

实验表明，阳性对照组2、实验组作用于角膜上皮细胞72h后，与阴性对照组相比有显著性差异(p﹤0.01，**)，实验组与阳性对照组2作用于角膜上皮细胞72h后两者之间有显著性差异(p﹤0.05，※)，其余时间点各组之间无显著性差异(p﹥0.01)。

说明：硫酸化白芨多糖溶液与hUC-MSCs联合，能够对人角膜上皮细胞的增殖起到明显促进作用。实施例4和实施例6的试验结果与实施例5相似，与阴性对照、阳性对照2相比皆具有显著性差异(p＜0.01)。

实施例8

将实施例4～6制得的多糖-干细胞制剂与人角膜上皮细胞以transwell体系共培养，检测本发明提供的制剂对角膜上皮细胞迁移的影响。

实验设置不共培养的阴性对照组；与硫酸化白芨多糖溶液共培养(浓度为200μg/mL，以PBS缓冲液配制)的阳性对照组1；与hUC-MSCs共培养的阳性对照组2。

阴性对照组：取一块6孔板，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植，待细胞单层融合后，用无菌200ul移液器枪头在细胞层垂直划痕，PBS冲洗2-3遍，至划痕区域干净，倒置显微镜下照相记录。培养24小时后倒置显微镜下照相再次记录。按细胞迁移率＝(1-测量时划痕宽度/初始划痕宽度)×100％计算结果并统计分析。

阳性对照组1：取一块6孔板，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植，待细胞单层融合后，用无菌200ul移液器枪头在细胞层垂直划痕，PBS冲洗2-3遍，至划痕区域干净，倒置显微镜下照相记录。每孔加入200ug/ml多糖溶液，培养24小时后倒置显微镜下照相再次记录。按细胞迁移率＝(1-测量时划痕宽度/初始划痕宽度)×100％计算结果并统计分析。

阳性对照组2：取一块6孔板，采用Transwell共培养体系，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植于下室，待细胞单层融合后，用无菌200ul移液器枪头在细胞层垂直划痕，PBS冲洗2-3遍，至划痕区域干净，倒置显微镜下照相记录。hUC-MSCs按1×10⁴个细胞/孔种植于上室，培养24小时后倒置显微镜下照相再次记录。按细胞迁移率＝(1-测量时划痕宽度/初始划痕宽度)×100％计算结果并统计分析。

实验组(以实施例5为例)：取一块6孔板，采用Transwell共培养体系，人角膜上皮细胞悬液按1×10⁴个细胞/孔种植于下室，待细胞单层融合后，用无菌200ul移液器枪头在细胞层垂直划痕，PBS冲洗2-3遍，至划痕区域干净，倒置显微镜下照相记录。实施例5制得的制剂接种于上室，联合培养24小时后倒置显微镜下照相再次记录。按细胞迁移率＝(1-测量时划痕宽度/初始划痕宽度)×100％计算结果并统计分析。

实验结果如表5所示：

表5各实验组角膜上皮细胞的迁移率

结果表明，阳性对照组1、2和实验组与对比例相比均有显著性差异(p﹤0.01，*)；实验组与阳性对照组1、2相比有显著性差异(p﹤0.01,#)。结果表明：多糖与hUC-MSCs均能促进角膜上皮细胞的迁移，且两者联合处理效果更为显著。实施例4和实施例6的试验结果与实施例5相似，与阴性对照、阳性对照1和阳性对照2相比皆具有显著性差异(p＜0.01)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.硫酸化白芨多糖在制备治疗眼表损伤的制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述眼表损伤为眼角膜损伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硫酸化白芨多糖的分子量为30000D～50000D。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硫酸化白芨多糖的制备方法为：将白芨粉碎后经水提醇沉，所得沉淀以水重悬，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，经30000D～50000D透析，干燥、纯化、硫酸化，制得硫酸化白芨多糖。

5.一种多糖-干细胞制剂，其特征在于，包括脐带间充质干细胞和硫酸化白芨多糖。

6.根据权利要求5所述的多糖-干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为1×10⁵个/mL～5×10⁵个/mL。

7.根据权利要求5所述的多糖-干细胞制剂，其特征在于，所述硫酸化白芨多糖的质量分数为50μg/mL～300μg/mL。

8.根据权利要求5所述的多糖-干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为P3代～P5代的脐带间充质干细胞。

9.权利要求5～8任一项所述的多糖-干细胞制剂作为治疗眼表损伤的药物中的应用。

10.权利要求5～8任一项所述的多糖-干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脐带间充质干细胞以生理盐水重悬后，与0℃～4℃预冷的硫酸化白芨多糖溶液混合。