CN107058213A - 一种兔正常角膜上皮细胞及其用途 - Google Patents
一种兔正常角膜上皮细胞及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107058213A CN107058213A CN201710388499.1A CN201710388499A CN107058213A CN 107058213 A CN107058213 A CN 107058213A CN 201710388499 A CN201710388499 A CN 201710388499A CN 107058213 A CN107058213 A CN 107058213A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- epithelial cell
- normal cornea
- rabbit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 title claims abstract description 82
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 79
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 title claims abstract description 65
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 67
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000006160 differential media Substances 0.000 claims description 5
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 abstract description 9
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 abstract description 8
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 abstract description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 abstract description 3
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 14
- XUYJLQHKOGNDPB-UHFFFAOYSA-N phosphonoacetic acid Chemical compound OC(=O)CP(O)(O)=O XUYJLQHKOGNDPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-morpholinyl)-6-(1-thianthrenyl)-4-pyranone Chemical compound O1C(C=2C=3SC4=CC=CC=C4SC=3C=CC=2)=CC(=O)C=C1N1CCOCC1 XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LEEIJTHMHDMWLJ-CQSZACIVSA-N ethyl (6r)-6-[(2-chloro-4-fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohexene-1-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=CCCC[C@H]1S(=O)(=O)NC1=CC=C(F)C=C1Cl LEEIJTHMHDMWLJ-CQSZACIVSA-N 0.000 description 7
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 5
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 5
- 229960001425 deferoxamine mesylate Drugs 0.000 description 5
- IDDIJAWJANBQLJ-UHFFFAOYSA-N desferrioxamine B mesylate Chemical compound [H+].CS([O-])(=O)=O.CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN IDDIJAWJANBQLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 5
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 3
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 2
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001886 cortisols Chemical class 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 2
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100001252 long-term toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5058—Neurological cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种兔正常角膜上皮细胞及其用途。该细胞命名为兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL‑032，保藏编号为CCTCC NO：C201677。其原代分离培养的方法为：新西兰兔正常角膜缘组织样品，经过消化后加入分散酶和DNase I作用，通过过滤、离心收集细胞，再用HL培养基重悬细胞，接种培养。其传代培养的方法为：细胞增殖至70～90%丰度时，用胰酶‑EDTA消化，再用DMEM中和；离心收集细胞，用HL培养基重悬细胞，接种培养。本发明的细胞建立的2D和3D培养系统，可用于角膜药物的动物替代实验，对药物的药理、毒理进行检测,建立一种新的角膜药物研究的实验动物替代模型。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种兔正常角膜上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途。
背景技术
现代医学是建立在动物实验的基础上发展而来。无论是疫苗研发，器官移植、生理学、药理学、毒理学的研究，还是化妆品的开发，都是伴随实验动物的牺牲而来。如果取消动物实验，现代医学的发展将停滞不前，人类将不可能战胜疾病。目前，国际上对于动物实验公认的一个原则就是“替代、减少、优化”。首先，研究人员要尽量寻求动物活体实验的替代方案，例如，利用计算机动态仿真及细胞组织培养等离体技术。其中，细胞组织培养是目前应用最广泛的替代方法，特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关，如肺的气体交换功能、肾的过滤功能、肝的解毒及中和功能、胰腺细胞产生胰岛素、皮肤具有保护机体免受外界环境的伤害。目前，分离来自哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用目前的无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养（存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞），有的只能进行有限的传代培养，有的甚至根本不能体外培养（如肝、结肠、前列腺等上皮细胞），只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。这种只能短期培养的细胞并不能真正意义上替代动物实验。
为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒（SV40T或HPV16E6E7）或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，如p53 和pRB信号通路常常被抑制。而且，这些经遗传修饰的细胞是不可能重新再移植进机体的。但是由于目前缺乏有效的体外培养上皮细胞的技术，上述这些细胞在当今世界的医学和生命科学研究中仍然备受青睐。在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官。现阶段，国内外还从未有过“正常细胞”可以应用于基础和临床医学研究。
兔正常角膜上皮细胞主要功能：（1）角膜表面的上皮细胞构成了非角化的复层上皮。（2）组成物理屏障，可有效防止多种物理和化学损伤。（3）产生和分泌化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。角膜上皮细胞与主要病理生理疾病有关，如角膜损伤、病毒性角膜炎。目前，国际上没有应用于体外药物药敏与毒性检测的兔角膜上皮细胞模型，已有的研究也只是在原代兔角膜上皮细胞的基础上开展实验，不能传代和扩增，因此就无法避免重复地进行实验动物创伤性地组织分离甚至处死实验动物。如果能获得体外稳定传代的兔正常角膜上皮细胞，并建立体外兔角膜3D模型，将有希望取代角膜相关药物临床与基础研究的活体动物实验，建立一种新的研究角膜药物药理与毒理的替代方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明公开了一种兔正常角膜上皮细胞，并建立体外兔角膜3D模型，将有希望取代角膜相关药物临床与基础研究的活体动物实验，建立一种新的研究角膜药物药理与毒理的替代方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种兔正常角膜上皮细胞，命名为兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032，拉丁文为：Rabbit Normal Corneal Epithelial Cells RNCEC/HL-032，已于2016年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉. 武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:C201677；该细胞是分离培养自新西兰兔的正常角膜缘组织的正常角膜上皮细胞。
所述的兔正常角膜上皮细胞的培养条件优选为用HL培养基于37℃、5% CO2培养；所述的HL培养基为：DMEM与无血清培养基SFM按体积比1 : 3混合，同时添加5%（v/v）的FBS（胎牛血清），以及0.4 μg/mL皮质醇（hydrocortisone），5 μg/mL胰岛素（insulin），8.4 ng/mL霍乱毒素（cholera toxin），10 ng/mL表皮生长因子（epithelial growth factor(EGF)），24 μg/mL腺嘌呤（adenine），100 U/mL青霉素（penicillin），100 μg/mL链霉素（streptomycin），0.25 µg/mL两性霉素B（Fungizone），30 μM法舒地尔（Fasudil），上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
上述兔正常角膜上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：
（1）收集新西兰大白兔正常角膜缘细胞组织样品；
（2）配制消化液：所述消化液为含胶原酶 / 透明质酸酶混合液；
（3）依次用95-100％的乙醇清洗分离的正常细胞组织样品1次，PBS 缓冲液清洗分离的正常细胞组织样品2次，然后将正常细胞组织样品放入含预冷 PBS 缓冲液的无菌培养皿中；
（4）将正常细胞组织样品放入含步骤（2）所配制消化液的离心管中消化37℃，时长 1-3小时；将消化后的正常细胞组织样品低速离心1000prm，时长为 5 分钟去除上清；
（5）将步骤（4）处理后的正常细胞组织样品沉淀重悬于2-5ml，0.25％胰酶 /EDTA中，置于冰上 1 小时或室温 10 分钟消化；然后再行加入含10% FBS 的 DMEM 培养基，低速离心1000prm，时长为 5 分钟去除上清；
（6）加入分散酶和200μL 的 1mg/mL DNase I，用无菌的一次性塑料枪头反复吹打正常细胞组织样品1 分钟；
（7）再行加入含 10％FBS 的 DMEM，用过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速离心1000prm，时长为 5 分钟，去除上清；重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶中，于37℃，5％ CO2培养箱中培养。
上述兔正常角膜上皮细胞的传代培养方法，包括如下步骤：
S1、当兔的正常角膜上皮细胞增殖至 70 － 90％丰度时，用 1xPBS 缓冲液洗涤细胞2次，再用0.05％，消化时长 2-5 分钟胰酶 /EDTA 消化单层细胞；
S2、再用 DMEM 培养基中和消化反应；
S3、1000prm，时长为 5 分钟低速离心去除上清；
S4、以1:2比例重悬细胞沉淀于HL培养基中接种培养。
本发明的第二方面，提供一种基于兔正常角膜上皮细胞的气 - 液 3D 培养方法，包括如下步骤：
步骤 S1、将插入式细胞培养皿内置物放入培养皿；
步骤S2、用HL培养基重悬2x105上述正常角膜上皮细胞，然后接种到插入式细胞培养皿内置物中；
步骤 S3、培养皿中加入HL培养基；
步骤 S4、将放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中培养，37℃，5％CO2，培养时长为48 小时；
步骤 S5、将内置物内部及外围培养皿中的培养基更换为分化培养基(CELLnTEC，Switzerland) ；
步骤 S6、将步骤 S5 中放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中使细胞之间形成紧密连接，培养时长为 15-17 小时；
步骤 S7、移除内置物内部及外围所有的培养基，外围培养皿中加入分化培养基，开始3D 分化培养；
步骤 S8、在37℃，5％ CO2湿热培养箱中培养细胞 14 至 21 天，每 2-3 天更换内置物外围的培养基。
在本发明的一个实施例中，将兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032经过Act D处理后，结果如图3所示，其p53蛋白的表达量上调，说明该细胞对DNA损伤具有正常的应答能力。
在本发明的一个实施例中，对兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的组织特性进行鉴定，结果如图4所示，经染色后荧光显微镜，兔正常角膜上皮细胞表达角膜上皮特异性分子CK14、CK19和干性分子p63。
在本发明的一个实施例中，将兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032用于基质胶 3D培养，结果经显微镜观察如图5所示，人正常角膜上皮细胞在基质胶分化条件下，可正常分化形成表面光滑的球形。
在本发明的一个实施例中，兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032用于气-液界面3D培养，气-液界面3D培养物，经常规组织固定、包埋、切片、免疫组化（DAB染色），显微镜观察如图6所示，兔正常角膜上皮细胞在气-液界面3D分化培养条件下，可正常分化形成角膜上皮结构，并表达干性分子p63。
在本发明的一个实施例中，进行了兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的八种抗病毒药物毒性检测，检测结果如图7，更昔洛韦作用48h时，浓度为14.9uM才能引起50%细胞死亡；IFNa2β作用48h时，浓度为5877IU/ml才能引起50%细胞死亡；5-fluorouracil 对新西兰大白兔正常角膜上皮细胞存活率的影响在小浓度范围存在剂量-反应关系，5-fluorouracil作用48h时，浓度为7.8125uM引起50%细胞死亡；TAK-242和KU-55933对新西兰大白兔正常角膜上皮细胞存活率的影响在小浓度范围内不存在剂量-反应关系。TAK-242作用48h时，浓度为300ug／uL时才能引起50%细胞死亡；KU-55933作用48h时，浓度为30uM时才能引起50%细胞死亡；Acyclovir、Deferoxamine mesylate、Phosphonoacetic acid长期毒性试验均未发现其病理学变化。
本发明的第三方面，提供兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032在药物药敏及毒性检测系统中的应用。
本发明的第四方面，提供兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032气-液界面3D培养物作为动物替代模型在药理学、药物毒理学、角膜相关疾病的发病机制研究中的应用。本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
1. 本发明提供的兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032，原代分离培养自新西兰兔的正常角膜组织，未导入任何外源基因，该细胞表达角膜上皮特异性分子CK14、CK19和干性分子p63，在基质胶分化条件下，可正常分化形成表面光滑的球形，该细胞对DNA损伤具有正常的应答能力。
2. 本发明提供的兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032，显微镜下观察细胞的形态为、细胞较小、多角型的上皮细胞。可以体外快速增殖，保持稳定增殖状态，增殖1代大概可以获得4x106个细胞，因此可以获得大量的细胞用于不同药物的平行实验和重复实验，从而建立一个稳定的药物药敏、毒性检测系统。
3. 本发明提供的兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032，通过 3D 培养显示具有正常分化的生理功能，可应用于实验动物替代研究中药理学、药物毒理学、角膜相关疾病的发病机制等研究，提供一种新的实验动物替代模型。
附图说明
图 1 是兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的细胞形态
图 2 是兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的生长曲线；
图 3 是兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032DNA损伤应答实验；
图4 兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的组织特异性鉴定实验（p63、 CK14、 CK19的表达）；
图 5 是兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032在基质胶3D 培养条件下可正常分化；
图 6 是兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032在气-液界面3D 培养条件下可正常分化；
图 7 是8种抗病毒药物对兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032药物毒性检测。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例 1】兔正常角膜上皮细胞的原代分离培养方法
1) 严格遵循ARRIVE(Animal Research:Reporting of In Vivo Experiments) 的动物实验操作流程和条例，收集兔正常角膜样品；
2) 消化液的配制：含胶原酶和分散酶均0.2 mg/mL的 HL培养基；其中，HL培养基为：DMEM（GIBCO # 11965-092）与无血清培养基SFM （GIBCO # 10744-019）按体积比1 : 3混合，同时添加5%（v/v）的胎牛血清，以及0.4 μg/mL皮质醇（hydrocortisone），5 μg/mL胰岛素（insulin），8.4 ng/mL霍乱毒素（cholera toxin），10 ng/mL表皮生长因子（epithelialgrowth factor (EGF)），24 μg/mL腺嘌呤（adenine），100 U/mL青霉素（penicillin），100 μg/mL链霉素（streptomycin），0.25 µg/mL两性霉素B（Fungizone），30 μM法舒地尔（Fasudil），上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤）。
3) 用 95-100％的乙醇洗分离的新鲜组织 1 次，再用 PBS 洗 2 次，然后将组织放入含预冷 PBS 的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。
4) 将组织样品放入含上述消化液的 14ml 或 50ml 离心管中，37℃消化 1-3 小时。
5) 将消化后的组织低速离心 (1000rpm)5 分钟，去除上清。
6) 将细胞沉淀重悬于 2-5mL 的 0.25％胰酶 /EDTA 中，置于冰上 1 小时或室温 10分钟。
7) 然后加入 10ml 含 10％ FBS 的 DMEM 培养基，低速 1000rmp 离心 5 分钟，尽量将上清去除干净。
8) 加入 2ml 温浴的 5mg/mL 分散酶和 200μL 的 1mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品 1 分钟。
9) 加入 10ml 含 10％ FBS 的 DMEM，用 40-70μm 孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速 1000rmp 离心 5 分钟，去除上清。
10) 重悬细胞沉淀于上述培养基中，接种于 T25 或 T75 的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％ CO2。
按照上述方法分离培养成功的原代兔正常角膜上皮细胞，显微镜下观察细胞的形态见图1（细胞较小，排列紧密、多角型的上皮细胞）。该细胞命名为“兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032”，已于2016年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：C201677。
【实施例 2】兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的传代培养方法
1) 当兔正常角膜上皮细胞增殖至 70 － 90％丰度时，用 1xPBS 洗涤细胞两次，0.05％胰酶 /EDTA 消化单层细胞 2 － 5 分钟。
2)10ml 完全的 DMEM 中和消化反应。
3)1000rmp 离心 5 分钟去上清。
4) 以1:2比例，只要可以维持细胞贴壁和正常生长) 重悬细胞沉淀于 10ml 实施例 1 中的培养基接种培养。
5) 必要时可将 1x106角膜上皮细胞重悬于 1 － 2ml 的细胞冻存液 (90％胎牛血清和10％ DMSO) 中 , 储存于液氮中备用。
按照上述方法传代培养的兔正常角膜上皮细胞，生长曲线如图2，细胞保持稳定增殖状态。
【实施例 3】兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的DNA损伤应答实验
1) 将兔正常角膜上皮细胞用0.05%胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种到6孔板中，每孔1x106个细胞，于37℃、5% CO2培养箱培养。
2) 加入10 μM浓度放线菌素D(Act D)，于37℃、5% CO2培养箱培养24小时。
3) 收集细胞，用200μl RIPA裂解液冰上裂解30分钟，4℃ 12000rpm离心30分钟，收集上清。
4) 对收集到的蛋白样品进行western blot 检测。
结果如图3所示，兔正常角膜上皮细胞经过Act D处理后，其p53蛋白的表达量上调，说明该细胞对DNA损伤具有正常的应答能力。
【实施例 4】兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的组织特性鉴定
1) 将兔正常角膜上皮细胞用0.05%胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种到6孔板中，每孔5x105个细胞，于37℃、5% CO2培养箱培养。
2) 第二天加4%多聚甲醛固定，并用0.5% Triton-X100/PBS透化后，3%小牛血清/PBS封闭30 分钟。一抗1：1000作用4℃过夜，二抗1：100作用37℃ 2小时，DAPI作用10分钟。
3) 荧光显微镜观察并拍照。
结果如图4所示，经染色后荧光显微镜，兔正常角膜上皮细胞表达角膜上皮特异性分子CK14、CK19和干性分子p63。
【实施例 5】兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的基质胶 3D 培养
1) 将基质胶 (BD，BD Biosciences) 放置 4℃的条件下过夜融化。
2) 在预冷的 6 孔板表面铺一薄层基质胶，将 120μl 的基质胶加入表面并用枪头均匀涂抹。
3) 将 6 孔板放置 37℃约 15-30 分钟，使基质胶凝固。
4) 消化正常角膜上皮细胞至单个并离心。
5) 轻轻将细胞重悬至 1.2ml 的基质胶中。
6) 用枪头轻轻将基质胶与细胞混匀后将混合物加入到预先铺有基质胶的 6 孔板中，建议细胞数为 1x105/ 孔。将 6 孔板在 37℃条件下放置约 30 分钟使基质胶凝固。再加入 1ml 实施例 1 中的培养基。
将上述 6 孔板放置于 37℃，5％ CO2湿热培养箱恒温培养 10 天，每 2 天更换1 次培养基。
结果经显微镜观察，如图 5所示，人正常角膜上皮细胞在基质胶分化条件下，可正常分化形成表面光滑的球形。
【实施例 6 】兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的气-液界面3D 培养
1) 将 0.4μm 的 Millicell PCF 内置物 (12mm size,Millipore) 放入 60mm 的培养皿。
2) 用 400μl 的实施例 1 中的培养基重悬 2x105细胞，然后接种到每个内置物中。
3) 每个培养皿中加入 11ml 合适的生长培养基。
4) 将放有内置物的培养皿放入 37℃，5％ CO2湿热培养箱中培养 48 小时。
5) 将内置物内部及外围培养皿中的培养基更换为分化培养基(CELLnTEC，Switzerland)
6) 将放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中约 16 小时使细胞之间形成紧密连接。
7) 移除内置物内部及外围所有的培养基，外围培养皿中加入 3.2ml 的分化培养基，开始 3D 分化培养。
8) 在 37℃，5％ CO2湿热培养箱中培养细胞 14 至 21 天。每 2-3 天更换内置物外围的培养基。
气-液界面3D培养物，经常规组织固定、包埋、切片、免疫组化（DAB染色），显微镜观察如图6所示，兔正常角膜上皮细胞在气-液界面3D分化培养条件下，可正常分化形成角膜上皮结构，并表达干性分子p63。
【实施例7 】兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的抗病毒药物毒性检测
（1）将兔正常角膜上皮细胞用0.05%胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100 μL，每孔约为5000个细胞，于37℃、5% CO2培养箱培养。
（2）第二天加药（更昔洛韦、干扰素、Acyclovir、5-Fluorouracil、Deferoxaminemesylate、Phosphonoacetic acid、KU-55933、TAK-242）处理，每孔加入100 μL不同浓度药物，药物浓度梯度为更昔洛韦（由高到低）：300、100、30、10、3、1、0.3、0.1μg/μl 干扰素（由高到低）：20、6.6、2、0.66、0.2、0.066、0.02、0.0066 万IU；Acyclovir（由高到低）： 3000、1500、750、375、187.5、93.75、46.87、23.4375、11.71875、5.859375μM；5-fluorouracil（由高到低）： 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625μM；Deferoxamine mesylate（由高到低）： 5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.0625、19.53125、9.7656 μM ；Phosphonoacetic acid（由高到低）: 5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.0625、19.53125、9.7656μM ；KU-55933（由高到低）: 300、100、30、10、3、1、0.3、0.1μM ；TAK-242（由高到低）:1000、300、100、30、10、3、1、0.3μg/ml。每种药物的每个梯度设置6个复孔，同时设置细胞对照组（接种细胞不加药处理）及只加HL培养基的空白对照组，每组设置6个复孔。
（3）药物处理（37℃、5% CO2培养箱培养）24小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10 μLCKK-8检测试剂（碧云天，上海），即10 μL CCK-8 + 90 μL HL培养基。
（4）在37℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育0.5～2个小时，孵育时间跟细胞量的多少相关，具体时间根据预实验确定（可根据液体颜色变化来初步确定），吸光度范围控制在1.0～1.5之间最好。
（5）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
兔正常角膜上皮细胞对八种抗病毒药物，更昔洛韦、干扰素、Acyclovir、5-fluorouracil、Deferoxamine mesylate、Phosphonoacetic acid、KU-55933、TAK-242的敏感性（毒性）检测结果如图7，更昔洛韦作用48h时，浓度为14.9μM才能引起50%细胞死亡；IFNa2β作用48h时，浓度为5877IU/ml才能引起50%细胞死亡；5-fluorouracil 对新西兰大白兔正常角膜上皮细胞存活率的影响在小浓度范围存在剂量-反应关系，5-fluorouracil作用48h时，浓度为7.8125μM引起50%细胞死亡；TAK-242和KU-55933对新西兰大白兔正常角膜上皮细胞存活率的影响在小浓度范围内不存在剂量-反应关系。TAK-242作用48h时，浓度为300μg／μL时才能引起50%细胞死亡；KU-55933作用48h时，浓度为30uM时才能引起50%细胞死亡；Acyclovir、Deferoxamine mesylate、Phosphonoacetic acid长期毒性试验均未发现其病理学变化。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
Claims (4)
1.一种兔正常角膜上皮细胞，其特征在于，分类命名为兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201677。
2.一种基于兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032的气 - 液 3D 培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤 S1、将插入式细胞培养皿内置物放入培养皿 ；
步骤S2、用HL培养基重悬2x105上述正常角膜上皮细胞，然后接种到插入式细胞培养皿内置物中 ；
步骤 S3、培养皿中加入HL培养基 ；
步骤 S4、将放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中培养，37℃，5％CO2，培养时长为 48小时；
步骤 S5、将内置物内部及外围培养皿中的培养基更换为分化培养基(CELLnTEC，Switzerland) ；
步骤 S6、将步骤 S5 中放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中使细胞之间形成紧密连接，培养时长为 15-17 小时；
步骤 S7、移除内置物内部及外围所有的培养基，外围培养皿中加入分化培养基，开始3D 分化培养 ；
步骤 S8、在37℃，5％ CO2湿热培养箱中培养细胞 14 至 21 天，每 2-3 天更换内置物外围的培养基。
3.权利要求1所述的兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032在药物药敏及毒性检测系统中的应用。
4.权利要求2的气 - 液 3D 培养方法获得的兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032气-液界面3D培养物作为动物替代模型在药理学、药物毒理学、角膜相关疾病的发病机制研究中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710388499.1A CN107058213A (zh) | 2017-05-27 | 2017-05-27 | 一种兔正常角膜上皮细胞及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710388499.1A CN107058213A (zh) | 2017-05-27 | 2017-05-27 | 一种兔正常角膜上皮细胞及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107058213A true CN107058213A (zh) | 2017-08-18 |
Family
ID=59610902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710388499.1A Pending CN107058213A (zh) | 2017-05-27 | 2017-05-27 | 一种兔正常角膜上皮细胞及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107058213A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115044538A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-13 | 武汉大学 | 一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用 |
| CN115322952A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-11-11 | 元道生命科技(武汉)有限公司 | 一种分离兔正常角膜上皮细胞的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694460A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-10 | 武汉大学深圳研究院 | 人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用 |
| CN106591216A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-04-26 | 深圳市眼科医院 | 一种人正常角膜上皮细胞及其用途 |
-
2017
- 2017-05-27 CN CN201710388499.1A patent/CN107058213A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694460A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-10 | 武汉大学深圳研究院 | 人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用 |
| CN106591216A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-04-26 | 深圳市眼科医院 | 一种人正常角膜上皮细胞及其用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 任玫卿等: "兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究", 《东南大学学报（医学版）》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115044538A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-13 | 武汉大学 | 一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用 |
| CN115322952A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-11-11 | 元道生命科技(武汉)有限公司 | 一种分离兔正常角膜上皮细胞的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104694460A (zh) | 人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用 | |
| CN106635962B (zh) | 一种人正常阴道上皮3d分化培养物模型的构建方法与用途 | |
| CN105296426B (zh) | 一种nk细胞的诱导培养方法 | |
| CN107974429A (zh) | 一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基 | |
| CN106367393B (zh) | 小鼠前列腺癌循环肿瘤细胞系及前列腺癌循环肿瘤细胞分离和培养方法 | |
| CN107058213A (zh) | 一种兔正常角膜上皮细胞及其用途 | |
| CN107177551A (zh) | 一种具有高成瘤能力的人肝内胆管癌细胞系及其应用 | |
| CN105861425A (zh) | 透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用 | |
| CN110106150A (zh) | 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用 | |
| CN110090227A (zh) | 人羊膜上皮细胞在治疗移植物抗宿主病中的用途 | |
| CN106591216B (zh) | 一种人正常角膜上皮细胞及其用途 | |
| CN103184188A (zh) | 中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法 | |
| CN109963939A (zh) | 多能细胞的衍生和自我更新及其用途 | |
| CN112210538A (zh) | 一种人食管鳞癌细胞系ncce1、建立方法及其应用 | |
| CN103074300A (zh) | 间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系建立及肿瘤微环境中间充质干细胞遗传稳定性变化特征 | |
| CN103173407A (zh) | 利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法 | |
| CN107206028A (zh) | 使用祖细胞治疗眼部病症 | |
| CN107828729A (zh) | 一种人肺癌a549衍生细胞株及其制备方法和应用 | |
| ES2345867B1 (es) | Celulas madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio. | |
| CN110121362A (zh) | 具有疏水侧链的聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)(plp)聚合物 | |
| CN105147722A (zh) | 硫酸化白芨多糖的新用途及一种治疗眼表损伤的制剂 | |
| CN102206583A (zh) | 一种细胞共培养用芯片及共培养方法 | |
| CN105219732B (zh) | 一种永生化人肝癌血管内皮细胞系及其制备方法和应用 | |
| CN104208066B (zh) | 哌嗪衍生物作为p53分子调节剂的用途 | |
| CN118272312B (zh) | 一种微重力环境培养癌细胞用培养基和相关试剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170818 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |