CN105861425A - 透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用。本发明将透明质酸应用在促人羊膜干细胞增殖的药物中，通过一系列的试验，充分证明了它能显著缩短人羊膜干细胞（hASCs)倍增时间，促hASCs增殖，安全性好,且不影响hASCs的多向分化的干细胞潜能。可以单独使用透明质酸，或者含有透明质酸的组合物，用于促进hASCs增殖或制造用于相同目的的医药品。本发明具有材料来源广泛，成本低廉，副作用小等优点。

Description

透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用

技术领域

本发明涉及制药领域，特别是一种透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用。

背景技术

透明质酸，又称为玻尿酸或玻璃质酸，英文名为hyaluronan或hyaluronate或hyaluronic acid (HA)，是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为双糖单位通过-1,4-糖苷键和-1,3-糖苷键交替连接而成的一种链状高分子酸性粘多糖，分子量范围为5至20,000kDa。在自然界中，透明质酸是由透明质酸合成酶所合成，广泛分布于动物和人体组织的细胞外基质中（如皮肤、软骨及眼睛玻璃体和微生物胞外荚膜等），以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。透明质酸因其优异的保水功能，而广泛用于精细化工领域的高端化妆品中。尤为重要的是透明质酸具有良好的生物可降解性和组织相容性等重要特点，在医学上也有广泛用途，如用作骨关节炎患者的关节填充剂、眼科手术的润滑剂、组织工程的生物支架材料、药物靶向传递及缓释的载体等。

透明质酸生理功能研究的报道日益增多，但其在生物医学方面的应用潜力有待进一步挖掘。透明质酸与人乳腺癌耐药细胞（MCF-7/Adr）的耐药作用相关。透明质酸与CD44受体结合，然后作用于肿瘤细胞的ErbB2基因，促使磷酸肌醇-3激酶在MCF-7/Adr中表达，进一步促进Akt蛋白的活性，同时增强肿瘤细胞抗凋亡作用，而导致耐药（The Journal of Biological Chemistry, 280(20): 20310-20315, 2005）；透明质酸可抑制新血管的生成。透明质酸通过血管内皮表面受体或透明质酸结合蛋白激活信号传导通路中的激酶，触发信号传导，从而发挥其功能（Gene, 226(1): 41-50, 1999）；透明质酸还具有良好的免疫调节作用（Trends in Immunology, 24(3): 112-114, 2003）。除此之外，研究也发现透明质酸可以促人肿瘤细胞、脐静脉血管内皮细胞、角质细胞、小鼠骨髓间充质细胞等多种细胞的增殖，并维持细胞活力（重庆医学, 35(9): 811-812，2006；Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 43: 930-939, 2011；Biomaterials, 32(1): 39-47, 2011; Journal of Dermatological Science, 72(1): 32-44, 2013）。但是，其对人羊膜干细胞等人源性成体干细胞增殖的影响未见国内外报告。

通过国家知识产权局网站搜索及PATENTSCOPE检索，目前与透明质酸相关的发明专利主要包括以下内容：透明质酸的功能开发，包括作为生物材料、药物预致敏剂、化妆品和保健食品的功能成分等；透明质酸的检测、提取分离方法及生产工艺优化，以及通过传统诱变方法获得透明质酸高产菌株等。近几年也有专利涉及透明质酸基因工程菌株的构建。

组织器官的损伤与修复是困扰人类健康的一大难题。随着科学的发展，以干细胞移植为核心的再生医学，作为一种新型的人类疾病治疗技术，克服了常规治疗的局限性，在治疗组织器官创伤领域发挥越来越重要的作用。在临床应用和生物学研究领域，干细胞的主要来源有胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）、成体干细胞（adult stem cells, ASCs）和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。这些细胞都具有自我更新及定向分化的能力，但是也存在有效性、安全性与伦理问题等诸多颇受争议的问题。因此，寻找一种新的干细胞来源具有重要意义。研究表明，来源于人羊膜的干细胞（human amniotic stem cells, hASCs），拥有向三个胚层组织分化的能力，可塑性强，无免疫原性，无致瘤性，是干细胞再生医学领域理想的种子细胞（Natural Biotechnology 25(1):100-106, 2007），且hASCs可从分娩废弃的胎盘中获得，来源丰富、获取简单、不受医学伦理学限制。近年来，hASCs临床前研究取得较大进展，其治疗神经损伤及退行性疾病、糖尿病、血管性疾病、心肌疾病、肺和肝纤维化等疾病方面展示出巨大潜力（中国细胞生物学学报 33(5):590-593/33(6):720-723/33(7):830-834, 2011; Molecular Medicine Reports, 6(3): 625-630, 2012; Circulation Research, 106: 1613-1623, 2010; Cell and Tissue Research, 349(2): 447-458, 2012），是最有临床应用前景的干细胞种子资源。

hASCs来源广，但因产妇个体差异也易导致所制备的干细胞质量参差不齐，影响临床使用效果。因此，类似其它来源干细胞的临床应用，hASCs也无法回避的一个瓶颈问题，即临床再生医学所需的干细胞数量。由此，能保持干细胞特性的体外扩增方法的探索已成为再生医学领域的热点问题。如，Chen等通过添加干细胞因子SFC、IL-3和IL-6，扩增人骨髓间充质干细胞（BMSCs），研究结果证明BMSCs在8 d后可扩增9倍（Stem Cells, 24(9): 2052-2059, 2006）。Kocaoemer等用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板的血浆扩增人脂肪来源间充质干细胞，证明该方法增殖倍率是胎牛血清的2倍（Stem Cells, 25(5): 1270-1278, 2007）。Tamama 等也证实表皮细胞生长因子EGF可刺激BMSCs 增殖（Stem Cells, 24(3): 686-695, 2006）。这些能促进间充质干细胞增殖的外源因子，其临床应用存在较大的风险性，譬如，免疫原性、化学毒性等安全性问题，另外许多因子价格极其昂贵，限制了其用于临床。另外，目前尚未见hASCs体外高效扩增的相关报道。因而，发掘价廉易得、安全可靠、低毒高效的“hASCs促生长剂”，具有巨大的医疗与商业价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用，它能促进hASCs增殖，作用显著，安全性好。

本发明是这样实现的：透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法， 将培养的第二代人羊膜干细胞收集，并以3000-5000个细胞/孔接种于96孔板中，24 h后更换L-DMEM全培养基；然后在培养液中加入透明质酸，使透明质酸的浓度达到0.01-20 mg/mL；将培养板放置在饱和湿度、质量百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，在37℃下培养12 -168 h后终止。

所述的透明质酸的分子量为20-2200 kDa。

所述的人羊膜干细胞包括人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞。

透明质酸在制备促人羊膜干细胞增殖药物中的应用。

将透明质酸作为唯一有效成分单独使用，或将透明质酸作为有效组分之一的组合物用于促人羊膜干细胞增殖或制造相同目的的生物医药品。

透明质酸促hASCs增殖的作用机制涉及Wnt/-catenin信号通路。使用经典Wnt/β-catenin信号通路阻断剂Wnt-C59预处理hASCs，然后用透明质酸作用，观察阻断和未阻断条件下，透明质酸促细胞增殖的情况。添加阻断剂的实验组，透明质酸促hASCs增殖的作用明显减弱。且Wnt/-catenin通路上β-catenin、Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、cyclin D1等基因蛋白也有明显变化。

透明质酸可保持hASCs的干细胞生物学特性。hASCs添加透明质酸后培养12-168h，细胞表型特征没有变化，且在换用成骨或软骨分化培养基后，仍可诱导hASCs向成骨或软骨细胞分化，不影响hASCs的多向分化的干细胞潜能。

为了验证本发明的技术效果，进行了如下实验。

一、hAMSCs和hAECs的分离、培养及形态学特征:

从新鲜胎盘组织无菌剥离羊膜，用含青霉素和链霉素的D-Hank’s液反复冲洗以去除残留血渍，剪碎羊膜，加入0.05%胰蛋白酶-0.2%EDTA-2Na消化液，37 °C，200 rpm消化10 min，弃上清。再加入新鲜消化液，37 °C，200 rpm旋转消化30 min，300目不锈钢滤网过滤。同法重复消化2次，合并细胞滤液，加入等体积含10%FBS的培养基终止消化，1500rpm离心10min，条件培养基（ LG-DMEM+10%胎牛血清+1%GlutaMAX+1%非必需氨基酸+1% β-巯基乙醇+10 ng/ml EGF）重悬细胞，接种于T25培养瓶中，48 h后换液，得到原代（P0）的hAECs。

上述剩余的组织用D-Hank’s液冲洗，加入0.5 mg/ml II型胶原酶-0. 05 mg/ml DNaseI消化液，37 °C、200 rpm旋转消化1.5-2 h，使组织消化成薄絮状，用300目不锈钢网过滤，收集细胞悬液。将细胞悬液于1500 rpm离心10 min，重悬于含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基，种于T25培养瓶，于37 °C、5% CO₂、饱和湿度下培养，得原代（P0）hAMSCs。

上述P0的hAECs和hAMSCs，48 h后更换培养液，每天均用倒置显微镜观察细胞生长情况，当细胞生长至80%或以上融合度时，用0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化（约1-3 min，37°C），加入等体积培养基终止消化，于1000 rpm离心5 min，弃去上清，将细胞重悬于培养基中，以5×10⁵ /瓶的密度种于T25培养瓶，得P1代hAECs和hAMSCs，依此类推。将hAECs和hAMSCs传代至P3，种于T25培养瓶（5×10⁵/瓶），传代后24 h后更换培养液，设对照组和HA组（0.6 mg/mL），继续培养48 h后倒置显微镜下观察细胞形态。

结果如图1所示，hAMSCs呈典型的贴壁生长特性，原代细胞形态不一，呈梭形、多边形等（图1A、B）。传至P3后hAMSCs形态呈成纤维样，放射状或漩涡状生长（图1C、D）。经HA（0.6 mg/mL，本实施例使用30 kDa分子量的HA，以下实验同）处理后的P3代hAMSCs，其形态特征与对照组一致（图1E、F）。以上实验证明，hAMSCs传代至P3细胞形态与原代保持一致，并且培养基添加HA不影响hAMSCs形态；hAECs的原代细胞多呈卵圆形和三角形，传代细胞易贴壁，呈铺路石样排列（图2A、B）。

二、hAMSCs和hAECs表型分析及免疫细胞化学染色：

将hAMSCs传代至P3，种于T25培养瓶（5×10⁵/瓶），传代后24 h后更换培养液，设对照组和HA组（0.6 mg/mL），继续培养48 h，将各组细胞消化并重悬后用含0.1% BSA的D-PBS清洗2次，调整细胞密度至1×10⁶/mL，将细胞悬液加至流式管（200μL/管），并按组合方案加入小鼠抗人荧光标记抗体（CD44-PE、IgG2b-PE、CD29-PE、IgG1-FITC/PerCP-Cy5.5/APC/PE/IgG2a-PE、CD90-FITC/CD105-PerCP-Cy5.5/CD73-APC/CD34-PE/CD11b- PE/CD19-PE/CD45-PE/HLA-DR-PE）混匀，室温避光孵育25 min，每管加入2mL含0.1%NaN₃的PBS，混匀，1000rpm离心5 min，弃上清，200μL D-PBS重悬细胞，用流式细胞仪（FCM）分析各组样品，每份样品的采集细胞数须大于2×10⁴个，用Cell Quest软件进行结果的分析。

将hAMSCs传代至P3，种于6孔板（2×10⁵ /孔），24 h后更换培养液，设对照组和HA组（0.6 mg/ml），继续培养48 h，进行波形蛋白和CK19免疫细胞化学染色。具体步骤如下：4%多聚甲醛固定30 min；用0.3%Triton-X100室温作用15 min，增加细胞的通透性；滴加山羊血清室温作用30 min，封闭非特异性抗原；滴加鼠抗人CK19或鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，4 °C孵育过夜；滴加3% H₂O₂作用10 min，封闭非特异性抗原；滴加鼠兔通用型二抗，37 °C孵育30 min；DAB显色3-5 min，D-PBS清洗；苏木素复染30s，D-PBS清洗，于倒置显微下镜观察并拍照。

结果如图2和图3所示，P3代hAMSCs对照组和HA处理组都高表达CD44、CD29、CD90、CD105和CD73等细胞表面分子，不表达CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR (图2A、B)。免疫细胞化学染色结果显示，hAMSCs对照组和HA处理组都表达间充质细胞标志物波形蛋白（图3A、C），不表达CK19（图3B、D）。因此，所分离的目标细胞具有典型的hAMSCs表型特征。以上实施例说明，hAMSCs传代至P3代仍保持间充质干细胞的表型特征，并且培养基添加HA不影响hAMSCs的表型特征。

同样，测得和hAECs高表达CD29、CD73和CD166，低表达CD44，不表达CD34、CD45、CD71和CD86等细胞表面分子（图5）。另外，hAECs角蛋白CK19呈阳性（图5A、B）。

三、HA对hAMSCs和hAECs增殖的影响：

(1) 标准曲线的绘制

取处于对数生长期的P2 hAMSCs，消化并重悬后进行细胞计数，分别以1、2、4、8、16、32、64×10³/孔种于96孔板，各4孔，于培养箱内培养6 h后，更换新鲜培养基（100μl/孔），再于每孔加入10 μl的CCK-8试剂，继续培养1 h后将板取出，用酶标仪于450 nm处检测各孔的吸光度值OD（此检测方法简称CCK法），绘制标准曲线。

（2）HA药物的制备

精确称取一定分子量的纯HA干粉，溶于一定体积的LG-DMEM培养液中，微孔滤膜过滤灭菌，所得溶液在无菌条件下装入安剖瓶中备用。

精确称取一定分子量的纯HA干粉，溶于一定体积的LG-DMEM培养液中，并加入一定量的碱性成纤维细胞生长因子bFGF或表皮生长因子EGF，混匀后微孔过滤灭菌，所得溶液在无菌条件下装入安剖瓶中备用。

(3) 量效实验

取处于对数生长期的P2 hAMSCs，消化并重悬后进行细胞计数，以3000/孔种于96孔板，24 h后更换培养液，设对照组、各浓度HA组（0.01、0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1 mg/ml）和阳性组（LiCl，4 mM），各4孔，继续培养48 h后用CCK法进行检测。根据OD值、标准曲线和下列公式计算各组细胞量和增殖率。

(4) 时效实验

取处于对数生长期的P2 hAMSCs，消化并重悬后进行细胞计数,以3000/孔种于96孔板，共6板。24 h后更换培养液，每板均设对照组、HA组（0.6 mg/ml）和阳性组（LiCl，4 mM），各5孔，分别于换液后继续培养12、24、36、48、60和72 h各取1板用CCK法进行检测，绘制各组细胞的生长曲线并按公式计算倍增时间。

T＝tlog2/Log(N/No)

T：倍增时间；t：接种至检测细胞数时间；N：t时刻细胞数；No：接种细胞数。

量效实验结果如图6A所示，0.01-1.0 mg/mL范围内，HA能促进hAMSCs增殖。当HA剂量为0.6 mg/mL时，其增殖率达到最大为31.9%，高于LiCl阳性药物组的增殖率（23.7%）。时效结果如表1所示，在加药后36-60 h，HA处理组和阳性药物组的增殖速率明均显高于对照组，HA处理组在36-48 h增殖速率最快；并且hAMSCs经0.6 mg/mL HA处理后，其倍增时间由24.8 h缩短至23.4 h。以上实施例说明，HA可以有效的诱导hAMSCs增殖，并呈剂量和时间依赖的关系。

同上述，测得HA在0.01-1.0 mg/mL剂量范围内对hAECs增殖的影响。如图6B所示，HA促hAECs增殖的作用略低于对hAMSCs的效果，但是在高于0.06-1.0 mg/mL剂量时仍然有统计学显著差异。特别是在剂量0.6mg/mL时，增殖率提高20.7%。0.06-1.0mg/mL剂量范围的增殖率均高于LiCl阳性对照药物组。

四、HA诱导hAMSCs增殖通过Wnt/-catenin信号通路

取处于对数生长期的P2代 hAMSCs，消化并重悬后进行计数，以2×10⁵/孔密度种于6孔板。24 h后更换培养液，设置对照组、HA组（0.6 mg/mL）。继续培养24 h和36 h后将细胞取出，提取总RNA和总蛋白，通过实时荧光定量PCR检测Wnt/-catenin信号通路β-catenin、Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、c-myc、cyclin D1、PCNA和Ki-67的基因表达情况；通过Western-blot检测关键因子β-catenin和c-myc的蛋白表达情况。分别使用GAPDH和-actin作为内参。

基因响应结果如表2所示，经HA处理的hAMSCs，在24 h和36 h，Wnt1和Wnt3a基因表达均上调，明显高于对照组，尤其是Wnt3a在加药早期（24 h）转录水平增加了2倍。而β-catenin、Wnt8a、cyclin D1和Ki-67等基因的转录水平在24 h时，与对照组相比无显著差异。但在36 h，HA组的表达均明显高于对照组。c-myc和PCNA两个基因的转录水平在所测定的两个时间点，与对照组相比无明显差异。关键因子β-catenin和c-myc的蛋白表达情况如图5和表3所示，HA处理24 h后，β-catenin蛋白的表达量与对照组相比无显著差异，但在36 h时表达水平明显高于对照组；Wnt/β-catenin通路靶蛋白c-myc的表达基本不受HA的影响（图7和表3），与RT-qPCR的检测结果相符。以上结果证明HA可通过Wnt/-catenin信号通路诱导hAMSCs增殖。

五、Wnt通路阻断剂Wnt-C59（C59）对HA诱导hAMSCs增殖的影响：

取处于对数生长期的P2 hAMSCs消化并重悬后进行细胞计数,以3000/孔种于96孔板，24 h后更换培养液，设对照组、HA（0.6 mg/ml）组、Wnt-C59（100 nM）组和Wnt-C59+HA组，各5孔，继续培养72 h后用CCK法检测各细胞的增殖情况。根据标准曲线和公式分别计算各组细胞量和增殖率。

实验结果如图8所示，经典Wnt/-catenin信号通路的阻断剂Wnt-C59（100 nM）能抑制hAMSCs的增殖。与对照组相比，Wnt-C59组增殖率为-13.3%，C59+HA组的增殖率则为2.7%，而HA组的增殖率则为8.2%，细胞量显明高于上述两组。以上实施例说明，当经典Wnt/-catenin信号通路受到阻断或抑制时，HA促进hAMSCs增殖的效应明显降低，进一步表明HA对hAMSCs促进增殖的作用通过经典的Wnt/-catenin信号通路。

六、HA作用后的hAMSCs可向成骨细胞和软骨细胞分化

将hAMSCs传代至P3，种于6孔板（2×10⁵ /孔），24 h后更换含HA（0.6 mg/ml）的培养液，继续培养48 h。再换用成骨诱导培养基或成软骨诱导培养基继续培养21 d，显微镜下观察hAMSCs向成骨或软骨细胞分化的情况。

成骨诱导培养基：LG-DMEM培养基，含10%胎牛血清、10^-7 M地塞米松、50g/ml维生素c和10 mM甘油磷酸钠，每三天换一次培养基。

成软骨诱导培养基：LG-DMEM培养基，含1%胎牛血清、10^-7 M地塞米松、50g/ml维生素c和10g/ml TGF-3，每三天换一次培养基。

实验结果如图7所示，hAMCs经HA作用48 h后，换成骨诱导培养基继续培养21 d，hAMCs形态由梭形变成呈多角形，局部细胞聚集成团，形成较大的细胞集落和钙化结节，证明HA作用后的hAMCs仍保留向成骨细胞分化的能力（图9A）。hAMCs经HA作用48 h，换成软骨诱导培养基继续培养21 d，使用阿尔辛蓝染色，

hAMCs胞质内出现紫蓝色的异染物质，呈弥漫性分布，提示经诱导后hAMCs分泌了大量的蛋白聚糖，证明HA作用后的hAMCs仍保留向软骨细胞分化的能力（图9B）。

lP < 0.05, **P < 0.01 vs 对照组

l*P < 0.05 vs 对照组

七、结论

本发明证明透明质酸是良好的人羊膜干细胞增殖促进剂，其促增殖活性优于阳性药物氯化锂，且不会影响人羊膜干细胞的形态和分子表型等细胞生物特性及其向成骨和软骨细胞分化的干细胞特性。本发明还证明透明质酸促人羊膜干细胞增殖过程中可上调Wnt/-catenin信号通路相关信号分子β-catenin、Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、cyclin D1和Ki-67的基因表达，并上调β-catenin的蛋白表达，添加Wnt/-catenin信号通路抑制剂Wnt-C59可减弱透明质酸的促人羊膜干细胞增殖活性，上述结果表明透明质酸促人羊膜干细胞增殖作用机制涉及Wnt/-catenin信号通路。

本发明将透明质酸应用在促人羊膜干细胞增殖的药物中，通过一些列的试验，充分证明了它能显著缩短人羊膜干细胞（hASCs)倍增时间，促hASCs增殖，安全性好,且不影响hASCs的多向分化的干细胞潜能。可以单独使用透明质酸，或者含有透明质酸的组合物，用于促进hASCs增殖或制造用于相同目的的医药品。本发明具有材料来源广泛，成本低廉，副作用小等优点。

附图说明

附图1为hAMSCs形态学特征；

A：P0代hAMSCs（×40）; B：P0代hAMSCs（×100）; C：P3代hAMSCs (对照组, ×40）; D：P3代hAMSCs（对照组, ×100）; E: P3代hAMSCs (透明质酸组, ×40）; F: P3代hAMSCs (透明质酸组, ×100）；

附图2为对照组和HA组hAMSCs表型；

A：对照组hAMSCs表型；B：HA处理组hAMSCs表型；

附图3为hAMSCs 波形蛋白及CK19免疫细胞化学染色（×400）

A：对照组波形蛋白; B: 对照组CK19; C: HA处理组波形蛋白; D: HA处理组CK19；

附图4为hAECs形态学特征；

A: P0代hAECs（×40）；B: P3代hAECs (×40）；

附图5为hAECs的细胞表型分子及CK19蛋白表达情况；

A: CK表达阳性，B:阴性对照；

附图6为不同浓度HA对hAMSCs（A）和hAECs（B）增殖的影响；

*P < 0.05, **P < 0.01 vs 对照组；

附图7为HA对-catenin和c-myc蛋白表达的影响；

附图8为Wnt-C59 (C59)对HA诱导hAMSCs增殖的影响；

*P < 0.05 vs 对照组；#P < 0.05 vs HA组；

附图9为hAMSCs经HA作用后仍可向成骨和软骨细胞分化；

A: hAMSCs向成骨细胞分化（×40）；B: hAMSCs向软骨细胞分化（×100）。

具体实施方式

本发明的实施例1：透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法，将培养的第二代人羊膜上皮细胞收集，并以3000-5000个细胞/孔接种于96孔板中，24 h后更换L-DMEM全培养基；然后在培养液中加入透明质酸，使透明质酸的浓度达到0.01-20 mg/mL；将培养板放置在饱和湿度、质量百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，在37℃下培养12 -168 h后终止；所述的透明质酸的分子量为20-2200 kDa。

本发明的实施例2：透明质酸在制备促人羊膜干细胞增殖药物中的应用，透明质酸可单用，亦可与细胞生长因子按常规方法制成粉剂或水剂。

Claims (5)

1.一种透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法，其特征在于：将分离培养的人羊膜干细胞收集，并以3000-5000个细胞/孔接种于96孔板中，24 h后更换L-DMEM全培养基；然后在培养液中加入透明质酸，使透明质酸的浓度达到0.01-20.00mg/mL；将培养板放置在饱和湿度、质量百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，在37℃下培养12 -168 h后终止。

2.根据权利要求1所述的透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法，其特征在于：所述的透明质酸的分子量为20-2200 kDa。

3.根据权利要求1所述的透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法，其特征在于：所述的人羊膜干细胞包括人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞。

4.一种透明质酸在制备促人羊膜干细胞增殖药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的透明质酸在制备促人羊膜干细胞增殖药物中的应用，其特征在于：将透明质酸作为唯一有效成分单独使用，或将透明质酸作为有效组分之一的组合物用于促人羊膜干细胞增殖或制造相同目的的生物医药品。