CN108949669A - 一种用于治疗i型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法及应用 - Google Patents

一种用于治疗i型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法及应用，属于再生医学与糖尿病学领域，包括以下步骤：A、获取人羊膜上皮细胞(hAECs)组织；B、恒温体外培养；C、诱导分化及收集细胞；D、传代培养；E、调配透明质酸溶液；F、将hAECs细胞加入到透明质酸溶液中并调整；G、静脉注射移植。通过动物实验可以明确得出，联合用药的模型组，可以极大程度的改善小鼠体内的血糖水平、胰岛素水平，移植8周后，小鼠体内的血糖水平、胰岛素水平、腹腔糖耐量的数值极为接近正常组数值；血浆中炎性因子水平均明显下调，综上，基于hAECs和透明质酸的良好生物学特性，本发明首次建立了hAECs联合透明质酸移植治疗I型糖尿病的方法，并取得显著疗效。

Description

一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法及应用
技术领域
本发明属于再生医学与糖尿病学领域，涉及到人羊膜上皮细胞与透明质酸组合细胞制剂移植治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法及应用及应用。
背景技术
糖尿病是世界范围内最常见的代谢性疾病之一，近二十年来，患病率呈高发态势。国际糖尿病联合会（international Diabetes Federation, IDF）在2018年发布的全球糖尿病概览中提到：目前全球有4.25亿糖尿病患者，预计到2045年，患病人数将增至近7亿（Diabetes Res Clin Pract. 2018, 138:271-281.）。糖尿病主要包括I型糖尿病（type Idiabetes mellitus, T1DM）和II型糖尿病（type II diabetes mellitus, T2DM）。T1DM常见于青少年和儿童，其主要由自身免疫介导的胰岛β细胞进行性死亡，导致胰岛素分泌绝对缺乏，而引起血糖升高的一类代谢性疾病。
目前，T1DM主要通过注射胰岛素来控制血糖，但是受饮食、身体活动和代谢模式等诸多因素的影响，胰岛素注射不能稳定体内胰岛素水平的动态平衡，因而不能理想的控制体内血糖水平。随着器官移植技术的发展，人们试图通过胰腺或胰岛细胞移植，为糖尿病患者提供新的胰岛素分泌细胞（insulin producing cells, IPCs），达到控制血糖，乃至治愈糖尿病。但是，供体的稀缺、异种移植的免疫排斥反应和受体长期服用免疫抑制药物等诸多不利因素，限制了其临床应用（Cell Transplant, 2013, 22( 8): 1309-23.）。令人欣喜的是，近年来，干细胞移植治疗心血管疾病、骨损伤、神经系统及恶性肿瘤等疾病的研究取得了明显进展（Circ Res, 2011, 108(7): 792-6. 遵义医学院学报 2015, 38(5):439-49.Arthroscopy, 2013, 29(12): 2001-2011.），这为糖尿病的治疗提供了新思路。
近来，胎盘组织作为再生医学干细胞来源引起了广泛关注（Exp Mol Med, 2018,50(1): e425.），从该组织分离的许多类型细胞具有良好的可塑性。来自足月胎盘的人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells, hAECs）（Stem Cells, 2005, 23(10):1549-59.）具有典型的胚胎干细胞的干性特征，现有技术表明，体外试验hAECs经过诱导分化后可以得到IPCs，且采用hAECs进行移植治疗无伦理问题、无配型成功率的障碍问题，取材方便，免疫原性低，移植入体内后无致瘤风险，是用于临床的理想种子细胞资源。
透明质酸（hyaluronic acid, HA）是一种酸性粘多糖，广泛存在于胞外基质中，由重复的二糖单元（N-乙酰葡糖胺和D-葡萄糖醛酸）组成，能增强细胞迁移、粘附、增殖和分化能力（Biomaterials, 2009, 30(26): 4287-96.），可被视为胞外信号分子（ActaBiomater, 2013, 9(7): 7081-92.）。HA具有独特的分子结构和理化性质，具有免疫调节、抗氧化、抗衰老等广泛生物活性。我们前期的研究表明，HA在体外可协同促进hAECs分化成IPCs。HA也是构建干细胞组织工程支架材料的重要原料，具有良好的生物相容性。另外，HA可作为药物载体，产生的新型给药系统，能有效地刺入皮肤，溶解，并迅速释放胰岛素到体内（J Control Release, 2012, 161(3): 933-41.）。而且，HA与皮肤源祖细胞复合使用可促进糖尿病大鼠创面的愈合（中华烧伤杂志,2007, 23(1): 20-24）。在临床方面，透明质酸对糖尿病引起的足创面亦有良好治疗效果（华西医学, 2011, 26(6) :845-847; 实用糖尿病杂志, 2007, 3(6):19-20）。不过，目前尚未见HA用于治疗糖尿病的报道。
基于hAECs和透明质酸的良好生物学特性和潜在的生物学活性，本发明首次建立了hAECs联合透明质酸移植治疗I型糖尿病的方法，但以人羊膜上皮细胞（hAECs）作为干细胞移植来源治疗治疗I型糖尿病，还需要解决以下问题：1、稳定、成熟的体外干细胞诱导分化处理技术；2、干细胞移植后可能的排异反应；3、科学、有效的移植方法；4、干细胞在体内的迁移、归巢及其与内环境的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全、有效的治疗I型糖尿病的细胞组合制剂，所述的细胞组合制剂以hAECs和透明质酸为有效成分，对治疗I型糖尿病有显著疗效。
一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、获取人羊膜上皮细胞hAECs组织；
B、以低糖DMEM完全培养基为应用基质，恒温体外培养人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次；
C、当细胞生长融合度达到规定数值，用胰蛋白酶溶液消化，终止消化后，离心后用D-PBS洗涤，再离心，收集细胞；
D、将步骤C中收集的细胞接种含低糖DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达规定值时，进行传代培养，收集适当代数hAECs细胞；
E、利用无血清低糖DMEM培养基调配透明质酸溶液；
F、取步骤D中的hAECs细胞加入到步骤E配制的透明质酸溶液中，调整hAECs细胞在溶液中的个数达到规定数值，混匀；
G、通过静脉注射的方式将步骤F中得到的细胞组合制剂输入到I型糖尿病患者的体内。
本发明通过人羊膜上皮细胞的诱导分化后，联合透明质酸移植入I型糖尿病患者体内，通过动物实验可以明确得出，联合用药的模型组，可以极大程度的改善小鼠体内的血糖水平、胰岛素水平，移植8周后，小鼠体内的血糖水平、胰岛素水平、腹腔糖耐量的数值极为接近正常组数值；模型组的胰腺组织病理变化、胰岛素免疫组织化学染色、胰岛素与胰高血糖素免疫荧光双染色指标，相比于传统的治疗方式均有质的改善与提高，已经极为接近正常组的形态，且血浆中炎性因子IFN-γ和TNF-α水平均明显下调（P<0.01），尤其是血浆IFN-γ水平，P<0.05，综上，基于hAECs和透明质酸的良好生物学特性，本发明首次建立了hAECs联合透明质酸移植治疗I型糖尿病的方法，并取得显著疗效。
附图说明
本发明专利的附图说明如下
表1为造模5天时，正常组和模型组血糖值变化；
图1为造模5天时，正常组和模型组HE染色病理变化（×200）；
图2为治疗过程中血糖水平的变化情况；
图3为各组小鼠血浆胰岛素水平的变化情况；
图4为腹腔糖耐量实验；
图5为腹腔糖耐量实验曲线对应的药时曲线下面积（AUC）；
图6为治疗4周时，胰腺组织病理变化（×200）；
图7为治疗8周时，胰腺组织病理变化（×200）；
图8为胰岛素免疫组织化学染色（×200）；
图9为治疗4周时，胰岛素与胰高血糖素免疫荧光双染色（×200）；
图10为治疗8周时，胰岛素与胰高血糖素免疫荧光双染色（×200）；
图11为治疗8周时，血浆细胞因子含量水平的变化情况。
具体实施方式
本发明通过如下实施例和附图作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于 ，包括以下步骤：
A、获取人羊膜上皮细胞hAECs组织；
B、以低糖DMEM完全培养基为应用基质，恒温体外培养人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次；
C、当细胞生长融合度达到规定数值，用胰蛋白酶溶液消化，终止消化后，离心后用D-PBS洗涤，再离心，收集细胞；
D、将步骤C中收集的细胞接种含低糖DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达规定值时，进行传代培养，收集适当代数hAECs细胞；
E、利用无血清低糖DMEM培养基调配透明质酸溶液；
F、取步骤D中的hAECs细胞加入到步骤E配制的透明质酸溶液中，调整hAECs细胞在溶液中的个数达到规定数值，混匀；
G、通过静脉注射的方式将步骤F中得到的细胞组合制剂输入到I型糖尿病患者的体内。
进一步的，当步骤A中采集从健康足月剖宫产新鲜胎盘剥离羊膜组织后，所述步骤B中的羊膜上皮细胞的培养及诱导的各项具体技术参数如下：以LG-DMEM完全培养基为应用基质，在37°C，含5% CO2及85-100%空气饱和湿度条件下，恒温体外培养所分离的人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次。
进一步的，所述步骤C中的诱导分化技术如下：当细胞生长融合度达80%以上，用0.02% EDTA-2Na 0.25%胰蛋白酶溶液消化5-8分钟，终止消化后，离心，D-PBS洗涤，再离心收集细胞。
进一步的，步骤D中的接种培养，是以1×105 -1×107个/mL的密度接种到含LG-DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达80%以上时，进行传代培养，选取第2-4代的hAECs细胞，用于移植治疗。
进一步的，步骤E中的透明质酸选用分子量为20-2200KD。
进一步的，根据所需配制的浓度，称取透明质酸，用无血清低糖DMEM培养基溶解，配制要求透明质酸溶液浓度为0.01-2mg/mL，用于移植治疗。hAECs细胞与透明质酸的调配复合使用是本专利申请的技术方案的关键技术之一。在本发明的验证实验中，透明质酸单独应用于I型糖尿病，其改善的效果极其轻微，hAECs单独应用于I型糖尿病时，其效果比透明质酸或其他干预方式略好，但效果并不是非常理想。反而是hAECs和透明质酸复合联用可以起到1+1大于2的条件触发式的效果，本专利申请中，透明质酸不仅作为药物载体、调节免疫的辅料制剂使用，更重要的作用是作为hAECs持续改善I型糖尿病患者其自身胰岛功能的触发效果的作用，这也是本技术方案的核心贡献所在（具体干预效果见验证实验图2）。鉴于步骤D中是将hAECs细胞加入到透明质酸的溶液中，细胞的存在并不影响透明质酸的浓度，所以，所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂中透明质酸的终浓度也为0.01-2mg/mL。
进一步的，本发明所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂中hAECs细胞浓度为1×105-1×1010个/mL。
进一步的，本发明所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂静脉注射量为0.01-10mL。
进一步的，本发明所述hAECs联合透明质酸用于治疗I型糖尿病，也包括在其中加入药学上可接受的载体。
进一步的，本发明中各项操作的最佳参数数据为：用含1％双抗（终浓度为青霉素：100 IU/mL，链霉素:100 IU/mL，临用前新鲜配制）的D-PBS溶液反复冲洗残留血渍及粘液。按1 cm2左右大小剪碎羊膜后，分装于50 mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02%EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于37℃恒温水浴箱中，130~200 rpm旋转消化约30min，300目不锈钢滤网过滤，收集滤液，按体积比1:1在滤液中加入含10％ FBS的LG-DMEM培养基终止消化，1500 rmp，离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为hAECs。用含10% FBS的低糖DMEM完全培养基重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在37℃，含5% CO2及85~100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞汇合度达80%以上进行传代培养，收集第2~4代用于治疗。
一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的应用，其特征在于：每2周进行静脉注射等量的hAECs细胞组合制剂，连续移植2次以上。
实施例1：人羊膜上皮细胞联合透明质酸治疗I型糖尿病的方法及应用
1. 人羊膜上皮细胞的分离培养
从健康足月剖宫产新鲜胎盘剥离羊膜组织，用含1％双抗（终浓度为青霉素：100 IU/mL，链霉素:100 IU/mL，临用前新鲜配制）的D-PBS溶液反复冲洗残留血渍及粘液。按1 cm2左右大小剪碎羊膜后，分装于50 mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于37℃恒温水浴箱中，130~200 rpm旋转消化约30 min，300目不锈钢滤网过滤，收集滤液，按体积比1:1在滤液中加入含10％ FBS的LG-DMEM培养基终止消化，1500 rmp，离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为hAECs。用含10% FBS的低糖DMEM完全培养基重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在37℃，含5% CO2及85~100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞汇合度达80%以上进行传代培养，收集第2~4代用于实验。
2. I型糖尿病模型的制备
SPF级昆明小鼠，体重：20±5g，适应性喂养一周后，造模组一次性腹腔快速注射1％STZ液（注射的数量与患者/模型的体重比例吗。150 mg/kg，柠檬酸盐缓冲液，pH=4.44），正常组腹腔注射等体积柠檬酸盐缓冲液，72 h后，断尾测血糖。连续2 d血糖值≥16.7 mmol/L为判断造模组小鼠T1DM模型的标准（Curr Protoc Pharmacol, 2008, Chapter 5: Unit5.47.）。造模5 d后，正常组与模型组随机取6只，进行大体观察及血糖监测；对胰腺组织进行HE染色；模型组小鼠表现为多饮多食多尿，体重减轻，血糖水平升高，HE染色胰岛体积萎缩，岛内细胞减少，出现大量细胞坏死与空泡样变的现象（表1、图1）。
3. 实验分组与hAECs联合透明质酸移植治疗
实验动物分为正常对照组（NG）、模型组（MG）、透明质酸治疗组（HA：每隔一天经尾静脉注射一次）、hAECs治疗组（hAECs：分别在造模成功后第0，15和29天尾静脉移植1×106个hAECs），hAECs+透明质酸联用治疗组（CG：hAECs分别在第0，15和29天移植，HA每隔一天注射一次），胰岛素治疗组（Insulin治疗：0.5单位Insulin，隔天注射，其注射时间与HA组保持一致）。无血清低糖DMEM配制的细胞悬液中加入0.01-1mg/mL透明质酸溶液，混匀。调整细胞悬液为1×106/200µL，经尾静脉注射治疗，并在首次治疗后的第3、5周进行第2、3次注射治疗。
4. hAECs联合透明质酸移植治疗I型糖尿病效果评价
（1）血糖及血浆胰岛素变化
在模型构建成功后立即给予治疗。图2结果表明，hAECs组与联用组（CG）在治疗过程中，与模型组和Insulin治疗组相比，血糖水平显著降低（P<0.01），且CG组血糖水平低于hAECs组；相比于hAECs组和CG组，HA组治疗效果较差。移植治疗4周和8周后，各组血浆胰岛素水平检测结果提示（图3），hAECs组血浆胰岛素水平为8.85±1.61 mIU/L与8.55±2.03 mIU/L（P<0.05），与模型组相比（6.33±1.46与6.13±0.99 mIU/L），分别增加了39.8％和39.5％；CG组血浆胰岛素水平为10.46±2.72 mIU/L与9.24±1.74 mIU/L（P<0.01），与模型组相比，分别增加了65.2％和50.7％。CG组明显高于hAECs组，且接近于正常组（11.94±1.97与10.52±1.84mIU/L。另外，HA组与模型组相比无明显区别。
（2）腹腔糖耐量及组织病理变化
腹腔糖耐量结果提示：hAECs组和CG组明显缓解I型糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量异常（图4和图5）。胰腺组织病理切片HE染色结果显示(图6和图7)，hAECs组和CG组小鼠胰岛结构较完整，胰岛内细胞数量较模型组多且分布均匀。说明hAECs或HA联合hAECs治疗I型糖尿病小鼠，能有效缓解或减轻胰腺胰岛组织病变的发生。
（3）胰腺组织胰岛素蛋白的表达情况
为了检测hAECs或HA联合hAECs对β细胞产生胰岛素的影响，通过免疫组织化学染色法对胰岛素阳性细胞进行染色，从HE染色和Insulin免疫组织化学染色的胰腺组织病理切片上可以发现，hAECs组和CG组小鼠胰腺内insulin阳性细胞数量多于模型组，胰腺结构较完整，且CG组效果较hAECs组明显（图8）。这说明，hAECs或HA联合hAECs移植治疗能促使T1DM小鼠体内胰岛素阳性细胞数量显著增加。胰岛素与胰高血糖素双染结果显示：在治疗后4周后，hAECs组和CG组观察到胰岛中胰岛素阳性细胞数量比例增多，出现大量胰岛素与胰高血糖素共染现象（图9）。治疗8周后，与治疗4周时相比，hAECs组和CG组胰岛素阳性细胞占胰岛比例均显著提高，胰岛素阳性细胞较模型组明显增多，且CG组效果较为明显，并可观察到胰岛素与胰高血糖素共染现象减弱，α细胞由破坏时的胰岛中心移至胰岛四周位置（图10）。
（4）炎性因子、抗炎因子的表达情况
I型糖尿病与机体免疫机能紊乱有密切关系。为此分析了hAECs或HA联合hAECs治疗对糖尿病模型体内免疫应答相关的炎性与抗炎因子的影响。利用ELISA法检测了治疗8周后各组小鼠血浆炎性与抗炎因子水平，结果如图11所示，与模型组相比，治疗8w后，hAECs组和CG组血浆中抗炎因子IL-10和TGF-β水平均明显上调（P<0.05），血浆中炎性因子IFN-γ和TNF-α水平均明显下调（P<0.01）。CG组效果好于hAECs组，尤其是血浆IFN-γ水平，有更显著的差异（P<0.05）。
上述验证实验结果显示，人羊膜上皮细胞和透明质酸联用，能明显降低I型糖尿病血糖水平，增加血浆胰岛素水平，减轻胰岛病理损伤，增加胰腺组织中β细胞数量。因此其对中晚期胰腺组织受损的II型糖尿病也具有潜在的治疗作用。更重要的是，人羊膜上皮细胞和透明质酸联用，用于异种昆明小鼠静脉移植，亦不发生免疫排斥反应。因此，批量生产应用于临床具有先天优势，是一种有效、安全治疗糖尿病的方法。
本发明的保护范围不仅仅限于具体实施方式所公开的技术方案，凡利用了本发明的人羊膜上皮细胞与透明质酸联合应用于I型糖尿病的的技术方案，以及在该技术方案上的细微改进、等同替换，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于 ，包括以下步骤：
A、获取人羊膜上皮细胞hAECs组织；
B、以低糖DMEM完全培养基为应用基质，恒温体外培养人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次；
C、当细胞生长融合度达到规定数值，用胰蛋白酶溶液消化，终止消化后，离心后用D-PBS洗涤，再离心，收集细胞；
D、将步骤C中收集的细胞接种含低糖DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达规定值时，进行传代培养，收集适当代数hAECs细胞；
E、利用无血清低糖DMEM培养基调配透明质酸溶液；
F、取步骤D中的hAECs细胞加入到步骤E配制的透明质酸溶液中，调整hAECs细胞在溶液中的个数达到规定数值，混匀；
G、通过静脉注射的方式将步骤F中得到的细胞组合制剂输入到I型糖尿病患者的体内。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B中的羊膜上皮细胞的培养及诱导的各项具体技术参数如下：以LG-DMEM完全培养基为应用基质，在37°C，含5% CO2及85-100%空气饱和湿度条件下，恒温体外培养所分离的人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次。
3.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤C中的诱导分化技术如下：当细胞生长融合度达80%以上，用0.02% EDTA-2Na0.25%胰蛋白酶溶液消化5-8分钟，终止消化后，离心，D-PBS洗涤，再离心收集细胞。
4.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：步骤D中的接种培养，是以1×105 -1×107个/mL的密度接种到含LG-DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达80%以上时，进行传代培养，选取第2-4代的hAECs细胞，用于移植治疗。
5.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：步骤E中的透明质酸选用分子量为20-2200KD。
6.根据权利要求4所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：根据所需配制的溶液体积，称取透明质酸，用无血清LG-DMEM培养基溶解，配制要求透明质酸溶液浓度为0.01-2mg/mL，用于移植治疗。
7.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂中hAECs细胞浓度为1×105-1×1010个/mL。
8.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂的静脉注射量为0.01-10mL。
9.根据权利要求1-7任一权利要求所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述hAECs联合透明质酸用于治疗I型糖尿病，还包括在其中加入药学上可接受的载体。
10.根据权利要求1-9制备的任一用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的应用，其特征在于：每2周进行静脉注射等量的hAECs细胞组合制剂，连续移植2次以上。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120083445A1 (en) * 2009-04-24 2012-04-05 Tissuetech, Inc. Compositions Containing HC-HA Complex and Methods of Use Thereof
CN102492651A (zh) * 2011-12-08 2012-06-13 遵义医学院附属医院 一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法
CN105861425A (zh) * 2015-01-23 2016-08-17 遵义医学院 透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用
CN106244521A (zh) * 2016-08-31 2016-12-21 吉林省中科生物工程股份有限公司 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途
CN106604739A (zh) * 2014-05-30 2017-04-26 韩美药品株式会社 包括胰岛素和glp‑1/胰高血糖素双重激动剂的用于治疗糖尿病的组合物
CN106834217A (zh) * 2017-04-18 2017-06-13 遵义医学院附属医院 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120083445A1 (en) * 2009-04-24 2012-04-05 Tissuetech, Inc. Compositions Containing HC-HA Complex and Methods of Use Thereof
CN102492651A (zh) * 2011-12-08 2012-06-13 遵义医学院附属医院 一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法
CN106604739A (zh) * 2014-05-30 2017-04-26 韩美药品株式会社 包括胰岛素和glp‑1/胰高血糖素双重激动剂的用于治疗糖尿病的组合物
CN105861425A (zh) * 2015-01-23 2016-08-17 遵义医学院 透明质酸促人羊膜干细胞增殖的方法及其应用
CN106244521A (zh) * 2016-08-31 2016-12-21 吉林省中科生物工程股份有限公司 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途
CN106834217A (zh) * 2017-04-18 2017-06-13 遵义医学院附属医院 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN GI RHOA等: "Self-assembled hyaluronic acid nanoparticles: Implications as a nanomedicine for treatment of type 2 diabetes", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *
RU-MINGLIU等: "Hyaluronic acid enhances proliferation of human amniotic mesenchymal stem cells through activation of Wnt β-catenin signaling pathway", 《EXPERIMENTAL CELL RESEARCH》 *
YA-BING TIAN等: "Hyaluronic acid ameliorates the proliferative ability of human amniotic epithelial cells through activation of TGF/BMP signaling", 《BIOCHEMISTRY, BIOPHYSICS AND MOLECULAR BIOLOGY》 *
YI LUO等: "Effects of hyaluronic acid on differentiation of human amniotic epithelial cells and cell-replacement therapy in type 1 diabetic mice", 《EXPERIMENTAL CELL RESEARCH》 *
YUPINGLI等: "The effect of hyaluronic acid on insulin secretion in HIT-T15 cells through the enhancement of gap-junctional intercellular communications", 《BIOMATERIALS》 *
王一: "透明质酸寡糖促进糖尿病大鼠伤口愈合的研究", 《中国硕士学位论文全文数据库》 *
程亚伟等: "透明质酸联合人羊膜上皮细胞对人外周血单个核细胞及移植治疗1型糖尿病大鼠的免疫调节作用", 《中国硕士学位论文全文数据库》 *

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