CN105764538A - 用于无免疫抑制剂的移植的装置、方法和使用 - Google Patents

用于无免疫抑制剂的移植的装置、方法和使用 Download PDF

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CN105764538A CN201480051643.7A CN201480051643A CN105764538A CN 105764538 A CN105764538 A CN 105764538A CN 201480051643 A CN201480051643 A CN 201480051643A CN 105764538 A CN105764538 A CN 105764538A
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Abstract

本发明提供一种装置，其是用于埋入到皮下而形成不会发生排斥的移植空间的装置，所述装置由包含血管诱导因子的生物相容性结构体构成。

Description

用于无免疫抑制剂的移植的装置、方法和使用
技术领域
本发明涉及用于无免疫抑制剂的移植的装置，详细地说，本发明涉及实现不需要施用免疫抑制剂的同种细胞或同种微小组织(以下称为移植材料)的移植的装置。
另外，本发明涉及在皮下形成免疫排斥受到抑制的空间的方法。
此外，本发明涉及在无免疫抑制剂的条件下对移植材料进行移植的方法。
此外，本发明涉及用于使若不实施特别的处置就可能产生免疫排斥的移植材料在无免疫抑制剂的条件下在皮下成活的装置的使用。
在本说明书中，有时将作为移植材料的特别是具有胰岛素产生能力的朗格汉斯岛移植物(isletgraft)仅记载为胰岛。
背景技术
目前，为了治疗胰岛素依赖性糖尿病，进行胰岛素的皮下注射。由于血糖值的控制进行得不以充分，因而从长期来看，会出现血管系并发症的发病，例如糖尿病性视网膜病所致的失明、糖尿病性肾病所致的肾衰竭、以及由于血液循环障碍而需要截肢等。特别是对于糖尿病性肾病所致的肾衰竭来说，进入到透析医疗状态的患者的最大原发疾病为糖尿病，需要超过1兆7千亿日元的透析医疗费，成为健康保险体制的巨大负担。从短期来看，由于血糖值不稳定，也有在睡眠中陷于低血糖以致死亡的患者。鉴于这样的现状，长年进行了由尸体供者提供的胰腺中分离出胰岛并将其移植给糖尿病患者的研究，近年来，在世界范围内尝试进行了每年2-3百人左右的临床应用。在胰岛移植的临床应用中，胰岛经门静脉被移植到肝脏内，移植后为了防止排斥反应而进行免疫抑制剂的施用。向肝脏内移植的技法的手术侵袭性稍大，另外，移植后在移植部位发生异变时，难以将移植胰岛除去。此外，为了防止排斥反应而进行免疫抑制剂的施用，但有人指出其并发症例如容易感染、以及癌症的发生概率增高等。另外，与胰岛素相比较，免疫抑制剂价格昂贵，因而术后患者的经济负担增加。
作为能够尽可能低侵袭地进行移植、并且在万一的情况下能够容易地将移植胰岛除去的部位，期望进行向皮下移植的研究。另外，作为不需要施用免疫抑制剂的移植法，尝试了将胰岛包在半透膜中而使胰岛与受体的免疫系统隔离之后进行移植的生物人工胰腺、为了除去引起胰岛内的免疫反应的树突细胞等而进行胰岛的紫外线照射或低温培养等，但存在技术性困难，并且具有重现性的问题。迫切期望进行没有这些问题的胰岛移植。
专利文献1公开了为了将胰岛以及其他细胞移植到皮下而在皮下诱导小口径血管床的技术，但专利文献1研究的是不存在排斥反应的问题的同种同系间的胰岛移植，完全未进行涉及同种异系间的胰岛移植中的排斥反应的研究。需要说明的是，“同种异系”是指“种相同、遗传组成不同”。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2000-178180
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种在不使用免疫抑制剂的情况下将细胞、组织等移植到皮下的技术。
用于解决课题的手段
本发明提供下述装置、方法和使用。
项1.一种装置，其是用于埋入到皮下从而形成不会发生排斥的移植空间的装置，上述装置由包含血管诱导因子的生物相容性结构体构成。
项2.如项1所述的装置，其中，移植到上述移植空间的材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
项3.如项2所述的装置，其中，移植到上述移植空间的材料为胰岛。
项4.如项2所述的装置，其中，移植到上述移植空间的材料为由成体干细胞、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化诱导出的细胞。
项5.如项4所述的装置，其中，分化诱导出的细胞为胰岛素分泌细胞。
项6.如项1～5中任一项所述的装置，其中，血管诱导因子为选自由成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子和表皮生长因子组成的组中的至少一种。
项7.如项1～6中任一项所述的装置，其中，上述结构体选自由水凝胶、海绵和多孔体组成的组。
项8.如项1～7中任一项所述的装置，其中，进一步包含肝素或硫酸乙酰肝素。
项9.如项2所述的装置，其中，移植到上述移植空间的材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
项10.如项1～9中任一项所述的装置，其中，换算成血红蛋白量，包含能够诱导2mg/g组织～50mg/g组织的血管生成的量的上述血管诱导因子。
项11.一种在无免疫抑制剂的条件下在皮下形成免疫排斥受到抑制的空间的方法，其包括下述步骤：在哺乳动物的皮下埋入项1～10中任一项所述的装置从而在上述装置的周围形成小口径血管的步骤；取出上述装置的步骤。
项12.一种在无免疫抑制剂的条件下将移植材料移植到哺乳动物中的方法，其下述步骤：在哺乳动物的皮下埋入项1～10中任一项所述的装置从而在上述装置的周围形成小口径血管的步骤；取出上述装置从而在无免疫抑制剂的条件下形成免疫排斥受到抑制的空间的步骤；将选自由同种异系细胞和同种异系微小组织组成的组中的移植材料移植到上述空间中的步骤。
项13.如项12所述的方法，其中，上述移植材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
项14.一种用于使可能产生免疫排斥的移植材料在无免疫抑制剂的条件下在皮下成活的装置的使用，其特征在于，
上述装置由包含血管诱导因子的生物相容性结构体构成，
将上述装置埋入皮下从而在上述装置的周围形成血管，然后将上述装置从皮下取出从而形成不会发生排斥的移植空间，将可能产生免疫排斥的移植材料移植到上述移植空间内，使其在无免疫抑制剂的条件下在皮下成活。
项15.如项14所述的使用，其中，移植到上述移植空间的材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
项16.一种疾病的治疗方法，其包括下述步骤：在哺乳动物的皮下埋入项1～10中任一项所述的装置从而在上述装置的周围形成小口径血管的步骤；取出上述装置从而在无免疫抑制剂的条件下形成免疫排斥受到抑制的空间的步骤；将选自由同种异系细胞和同种异系微小组织组成的组中的疾病治疗用移植材料移植到上述空间中的步骤。
项17.如项16所述的治疗方法，其中，疾病为糖尿病，移植材料为胰岛。
发明的效果
为了治疗胰岛素依赖性糖尿病，在临床上也进行了胰岛的移植。但是，仍留有移植时的侵袭大、并且在移植后需要施用免疫抑制剂这两个应该解决的问题。本发明涉及用于制作能够在不使用免疫抑制剂的情况下将胰岛等移植材料移植到皮下的空间的装置。
在棒状、平板状、片状、筒状、杆状等各种形状的生物相容性结构体上负载成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等促进血管生成的因子(血管诱导因子)并且根据需要负载肝素，将其埋入到糖尿病大鼠的皮下时，在约5-15天后在生物相容性结构体的周围组织中诱导出大量微细血管。将胰岛移植到除去水凝胶后的空间内时，令人惊讶的是，即使在胰岛移植后不施用免疫抑制剂，移植胰岛也不会被排斥而可长期成活，进而可分泌胰岛素而使血糖值长期正常化。
对于胰岛以外的移植材料，也同样可在不伴有排斥反应的情况下在生物体内成活。
附图说明
图1是在糖尿病ACI大鼠的背部皮下移植F344大鼠的胰岛后的血糖值的变动。同种异系的胰岛移植导致血糖值降低，表示胰岛以能够分泌胰岛素的状态成活。
图2是组织图像。图2(a)为诱导出微细血管的皮下组织。图2(b-1)为移植后第94天的胰岛移植部位的组织切片的苏木精-伊红染色图像；图2(b-2)为大致相同部位的胰岛素的免疫染色图像；图2(b-3)为图2(b-1)的移植胰岛所存在的部分的放大图。移植后的胰岛保持形状，表示处于能够分泌胰岛素的状态。
图3是在糖尿病ACI大鼠的肝脏中移植F344大鼠的胰岛后的血糖值的变动。血糖值暂时下降，然后立刻上升，因而可知胰岛受到了排斥。
图4是在糖尿病ACI大鼠中移植Leis大鼠的胰岛后的血糖值的变动。在箭头所示的那天将移植胰岛与皮肤一起摘除。在摘除胰岛后血糖值迅速上升，可知血糖值的降低是由于由所移植的胰岛分泌出的胰岛素而产生的。
图5是在FITC-凝集素的生物体内灌流后有血管生成的皮下部位。血管系统作为绿色的荧光色素-凝集素阳性血管而鉴定出来。比例尺为100μm。
图6(A)是正常ACI大鼠(▲，n＝3)以及移植了3000个F344胰岛(■，n＝3)或3000个Lewis胰岛(●，n＝3)的STZ-ACI大鼠的腹腔内葡萄糖耐量试验。在全部的受体中，在移植后1～3个月进行了腹腔内葡萄糖耐量试验。图6(B)是非糖尿病ACI大鼠(I)、糖尿病ACI大鼠(II)以及在有血管生成的皮下空间移植了3000个Lewis胰岛(III)或3000个F344胰岛(IV)的STZ-ACI大鼠的血浆胰岛素水平。在移植后1～3个月对于各组中的同种异系胰岛的3个受体进行了研究。在三组间没有显著差异。
图7是移植到有血管生成的皮下部位的同种异系胰岛的成活和血管再生成。是在移植到有血管生成的皮下空间94天后、102天后和130天后所回收的(A)F344-ACI胰岛移植物、(B)Lewis-ACI胰岛移植物和(C)F344-Wistar胰岛移植物的胰岛素和核的苏木精和伊红(HE)染色以及免疫荧光染色。比例尺：100μm(左柱和右柱)、50μm(中央柱)。(D)同种异系移植30天后的皮下部位的胰岛移植物和(E)正常ACI胰腺的胰岛中的血管系统试验所进行的FITC-凝集素的生物体内灌流。比例尺：50μm。将直径4mm、长度25mm的4.5％的琼脂糖凝胶杆冷冻干燥。向其中添加50μg的成纤维细胞生长因子(bFGF)，用于血管诱导。使用8周龄的雄性ACI大鼠作为受体。在ACI大鼠的腹腔内施用60mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。使用STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠作为糖尿病受体大鼠。在施用STZ3天后，在ACI大鼠后背两侧的皮下分别移植1根血管诱导用琼脂糖凝胶。利用胶原酶法从F344大鼠的胰腺中分离出胰岛。关于该胰岛，胰岛的供体F344与糖尿病ACI大鼠为同种异系的关系。在埋入琼脂糖杆1周后切开皮肤，除去琼脂糖凝胶杆，在所形成的空隙中，分别在背部皮下的2个空隙中各移植1500个胰岛。琼脂糖杆无组织附着，可容易地除去。在移植后每2-3天测定一次血糖值。如图8所示，使用5只糖尿病ACI大鼠进行了研究，结果5只全部血糖值正常化达100天以上。血糖值正常化表示同种异系的胰岛以能够分泌胰岛素的状态成活，表示形成了排斥反应得到适当抑制的移植空间。
图8是在糖尿病ACI大鼠的背部皮下移植F344大鼠的胰岛后的血糖值的变动。同种异系的胰岛移植导致血糖值降低，表示胰岛以能够分泌胰岛素的状态成活。即使使用未添加肝素的琼脂糖凝胶杆，血糖值也正常化。
图9是成活的皮下胰岛移植物的排斥。成活的胰岛是将包含bFGF的琼脂糖杆埋入皮下1周后取出并进行胰岛的移植而得到的。全部的受体在左侧和右侧的背部皮下分别移植了1500个胰岛。在91-109天回收受体的左侧的皮下胰岛(n＝6)。即使除去单侧的胰岛，血中葡萄糖水平也维持正常血糖。(A)在通过移植胰岛而使血糖值正常化的ACI大鼠中经由门静脉向肝脏中移植3000个F344胰岛后的具有胰岛移植物的糖尿病ACI大鼠的血中葡萄糖水平(n＝2)。2个箭头表示将F344胰岛移植到肝脏中的那天。在移植后10天左右，任意2只大鼠的血糖值上升，表示皮下及肝脏内的胰岛受到了排斥。(B)在由于F344胰岛移植物而使血糖值正常化的ACI大鼠中在腹腔内移植107个F344脾细胞后。在移植后5天左右血糖值上升(n＝4)。表示在皮下成活的F344大鼠的胰岛受到了排斥。箭头表示F344脾细胞移植的那天。(C)在F344胰岛的门静脉内移植14天后所回收的包含同种异系胰岛移植物的皮下组织(C-1)和肝脏(C-2)的苏木精和伊红(HE)染色。无胰岛组织，观察到白细胞的聚集。比例尺：(C-1)100μm，(C-2)50μm。(D)F344脾细胞的腹腔内注射的HE染色(D-1)以及胰岛素的免疫荧光染色和核染色(D-2)。比例尺：50μm。存在极少数胰岛素阳性细胞，但其周围聚集有大量的白细胞，是胰岛正在受到排斥的组织图像。
具体实施方式
本发明的装置由包含血管诱导因子的生物相容性结构体构成，其埋入到皮下使用。将该装置埋入到皮下时，在由生物相容性结构体缓慢地放出的血管诱导因子的作用下，在周围形成大量的微细血管。需要说明的是，关于装置，将皮肤切开，将装置埋入皮下后缝合切开部，使装置以埋入状态保持一定期间。然后，在按所需要的程度形成小口径血管后再次切开皮肤，将装置取出，将移植材料移植到被小口径血管包围的移植空间中。通过将本发明的装置在哺乳动物的皮下埋入1天以上(例如1～25天)，能够制作出以可使同种异系细胞或同种异系微小组织长期成活、发挥功能的程度使免疫排斥受到抑制的空间，因而血管诱导因子只要在装置中保留约12小时就可充分发挥出效果。作为哺乳动物，可以举出人、猿、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、牛、猪、羊、兔等，优选人。通过将本发明的装置从皮下取出，能够形成无免疫排斥的移植空间。在将本来会产生排斥反应的细胞(同种异系细胞等)、微小组织(同种异系微小组织)等移植材料埋入该移植空间时，令人惊讶的是，即使在不使用免疫抑制剂的状态下，免疫反应也得到抑制，移植材料成活。移植材料可以为同种同系、也可以为同种异系。
将本发明的装置以规定期间埋入到皮下而在周围形成小口径血管，之后将装置取出而得到的空间是在无免疫抑制剂的条件下使免疫排斥受到抑制的空间。基于适合于移植的空间的含义，在本说明书中有时将该空间称为“移植空间”。
本发明的移植空间能够使胰岛等移植材料在移植后长期成活。在皮下成活的移植物由于周围存在小口径血管，因而可接受充分的氧和营养成分的供给。在小口径血管内存在大量的白细胞，因而认为来源于小口径血管的白细胞被供给到移植空间内。令人意外的是，尽管与无处置的组织相比白细胞在移植物的周围存在得稍多，但并没有那么多。认为在移植空间的周围组织存在抑制性的白细胞、淋巴细胞，因而免疫排斥受到了抑制。
移植材料优选为细胞，在对组织进行移植的情况下，优选微小组织。作为移植材料，可以举出同种异系细胞、同种异系微小组织，以及同种同系细胞、同种同系微小组织。同种异系细胞、同种异系微小组织通常在不实施特别处置而移植到皮下时，会迅速受到排斥，但通过移植到本发明的移植空间内，排斥受到抑制，能够避免该排斥。即，根据本发明，能够提供对于同种异系、同种同系均优选的移植用部位。此处，“微小组织”是厚度为10μm～500μm左右的组织，其面积可以较大，没有特别限制。皮下本来不怎么会形成血管。通过埋入本发明的装置，在周围形成微细血管，但若移植材料过大，则无法对移植材料的内部供给充分的氧和营养。另一方面，可以通过扩大用于埋入本发明的装置的皮下部分的面积来适应移植材料的面积。
移植材料只要可分泌生理活性物质就没有特别限定。作为生理活性物质，可以举出激素、细胞因子、神经递质、蛋白质(酶等)等。作为激素，可以举出胰岛素、胰高血糖素、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、降钙素、甲状旁腺激素(PTH)、皮质醇、醛固酮、性类固醇激素、儿茶酚胺、雄激素、雌激素、黄体酮、生长激素、催乳素、血管加压素、催产素等。作为细胞因子，可以举出白细胞介素、干扰素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、淋巴毒素(TNF-β)、瘦素、神经生长因子(NGF)等。作为蛋白质，可以举出白蛋白、血红蛋白、酯酶、蛋白酶、转移酶、脱氢酶、氧化酶、还原酶、异构酶、合成酶等酶等。
作为分泌这些生理活性物质的移植材料，可以举出例如胰岛、神经系统的分泌细胞、甲状腺细胞、肾上腺(皮质、髄质)细胞、甲状旁腺细胞、肾脏细胞、肝脏细胞、或者含有这些细胞的微小组织。此外，移植材料还可以举出由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞诱导出的任意细胞。移植材料包含对于下述遗传病的治疗有效的细胞，在该遗传病中，不会由于基因缺损或基因变异而产生特定的基因产物、或者仅得到功能降低的基因产物。
作为血管诱导因子，可以举出血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胎盘生长因子、表皮生长因子、骨粘连蛋白(Osteonectin)、促血管生成素1(Ang1)、促血管生成素2(Ang2)等，这些因子可以使用1种或组合使用2种以上。通过在结构体中进一步包含肝素或硫酸乙酰肝素，能够促进血管的诱导。血管诱导因子的混配量根据各因子而不同，没有特别限定，换算成血红蛋白量优选为能够诱导2mg/g组织～50mg/g组织的血管生成的量，换算成血红蛋白量更优选为能够诱导3mg/g组织～40mg/g组织的血管生成的量，换算成血红蛋白量进一步优选为能够诱导4mg/g组织～30mg/g组织的血管生成的量，特别优选为能够诱导5mg/g组织～25mg/g组织的血管生成的量。另外，血管诱导因子的混配量根据各因子而不同，没有特别限定，换算成血红蛋白量，优选为通过将本发明的装置在皮下组织中埋入1周而能够使血红蛋白量增加至埋入前的皮下组织中的血红蛋白量的5倍～150倍的量，更优选为能够使血红蛋白量增加至10倍～100倍的量，进一步优选为能够使血红蛋白量增加至15倍～70倍的量。另外，血管诱导因子的混配量根据各因子而不同，没有特别限定，换算成血红蛋白量，优选为通过将本发明的装置在皮下组织中埋入1周而能够使血红蛋白量增加至在相同的条件下埋入不包含血管诱导因子的装置时的血红蛋白量的2倍～15倍的量，更优选为能够使血红蛋白量增加至2倍～10倍的量，进一步优选为能够使血红蛋白量增加至2倍～5倍的量。另外，例如在碱性成纤维细胞生长因子的情况下，在每一装置中为20μg/cm3～500μg/cm3左右、优选为30μg/cm3～300μg/cm3左右、更优选为40μg/cm3～150μg/cm3左右。
本发明的生物相容性结构体由水凝胶、海绵、多孔体高分子块等构成。作为构成水凝胶的材料，可以举出羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羟乙基纤维素(HEC)等纤维素衍生物、明胶、海藻酸、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、淀粉、琼脂糖、琼脂、葡聚糖、支链淀粉、果胶、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、壳多糖、壳聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚-2-甲基丙烯酸羟乙酯、聚-2-丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等合成高分子的化学交联体或由放射照射所得到的交联体，此外可以举出构成上述高分子的单体的共聚物的交联体、聚阴离子与聚-L-赖氨酸等聚阳离子的聚离子复合物膜等。这些生物相容性结构体可以通过凝胶状物的冷冻干燥来制造。
作为海绵，可以举出上述高分子的多孔体，例如纤维素、琼脂糖、壳聚糖或胶原蛋白的海绵。作为构成多孔体的材料，可以举出明胶、有机硅、磷灰石等有机或无机材料。优选的生物相容性结构体为水凝胶，特别优选琼脂糖凝胶。
作为生物相容性结构体的形状，可以举出膜状、片状、板状、棒状、筒状(圆筒、椭圆筒、方筒等)等。上述结构体可以为中空状，在上述结构体的表面或内部包含血管诱导因子。上述结构体只要表面为生物相容性且该体液可通过即可，可以具有细胞能够侵入到内部的网状或海绵状等多孔的空隙，进而也可以具有血管能够侵入到内部的比较大孔径的空隙。在诱导出的微细血管侵入到结构体的内部的情况下，在不摘出结构体的情况下将移植材料导入到其内部即可；在诱导出的微细血管限于结构体的表面的情况下，将移植材料导入到摘出结构体后的空间内即可。
可以为如下结构体：本发明的结构体的内部具有多孔体等支撑体，该多孔体具有氧化铝、氧化锆等陶瓷、不锈钢、钛合金等金属的网眼或连通孔，其外表面被构成水凝胶、海绵、多孔体的生物相容性材料包覆。
作为在上述结构体内负载血管诱导因子的方法，可以举出单纯地浸渗到结构体中的方法、利用静电相互作用或疏水相互作用等物理化学相互作用进行负载的方法、使结构体中包含与新生血管诱导物质具有生物学特异性相互作用的物质并利用与其的相互作用进行负载的方法、若为中空状结构体则在中空部置入血管诱导因子的溶液的方法等。在单纯地浸渗到结构体中的情况下，为了控制血管诱导因子的释放速度，优选对结构体的分子网眼密度进行调节。在利用静电相互作用或疏水相互作用等物理化学相互作用进行负载的情况下，需要充分考虑血管诱导因子在生物体内的物理化学状态来进行负载。例如血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子在生物体内作为分子整体带正电，因而若像由丙烯酸、甲基丙烯酸制作的结构体那样结构体本身带负电，则可利用静电相互作用进行负载，还可以控制释放速度。在利用生物学特异性相互作用的情况下，优选预先使结构体负载血管诱导因子和能够提高其活性的物质。例如，由于血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子与肝素或硫酸乙酰肝素等粘多糖发生生物学特异性相互作用，因而通过制作负载有肝素等粘多糖的凝胶并使生长因子浸渗到其中，能够达成目的。根据结构体制作中使用的材料，也可以将3者同时混合来制作目的结构体。
作为缓释血管诱导因子的方法，可以利用与DDS相关的各种技术。
将本发明的装置埋入到皮下。具体地说，在皮肤上切开小切口，在皮肤下利用压板(ヘラ)等在几乎没有血管的皮下组织中设置空隙，在该空隙部分埋入装置，将切开部缝合，由此将装置埋入到皮下。在该状态下经过1～35天、优选2～28天、更优选3～21天、特别优选4～14天左右时，在装置的周围部形成了血管(小口径血管)。血管的形成通过肉眼也能够观察，可以使用近红外成像装置、血管成像装置等医疗器械来确认。
通过以规定的期间埋入本发明的装置，在除去装置后，在埋入过装置的空间内移植细胞或微小组织，能够得到可长期成活和发挥功能的程度的免疫抑制状态。即，根据本发明的装置，在移植胰岛后，能够形成在例如30天以上、60天以上、90天以上、100天以上、110天以上、120天以上可维持正常范围的血糖值的空间。而且，若将移植材料移植到这样的空间中，则移植材料在移植后能够立即发挥功能，例如若埋入胰岛，则在移植后能够立即产生胰岛素，当天或第二天血糖值即可正常化。移植材料过厚时，无法供给充分的营养，因而其具有适当的厚度；关于移植面积没有特别限制，可以大面积进行移植。另外，移植可以为1处，也可以为多处。所移植的细胞、组织可以根据需要容易地取出部分或全部。
使用本发明的装置形成的上述空间可以用于各种组织的移植。特别适合于在发挥其功能时对于移植部位并无限制的组织的移植。作为这样的组织，可以举出分泌激素、细胞因子、神经递质、酶等生理活性物质的组织。具体地说，可以举出肝细胞或胰岛、肾上腺、甲状旁腺等的细胞。此外还可以用于由成体干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞等分化诱导而制作的组织的移植。
将组织移植到使用本发明的装置形成的移植部位对于各种疾病的治疗是有用的。特别是对于产生胰岛素的能力绝对不足、需要通过从外部注射等来施用胰岛素的胰岛素依赖性糖尿病患者而言，与其他内分泌疾病相比，由移植带来的症状减轻效果和生活质量的改善效果大。因此，本发明的移植部位形成剂在用于治疗胰岛素依赖性糖尿病的胰岛移植部位的形成中使用的情况下其有用性特别大。这样的糖尿病的主要病例为I型糖尿病。但是，在II型糖尿病的治疗中也是有用的。即，在II型糖尿病进展时，胰腺β细胞容积降低，作为目前的治疗法是施用胰岛素，在这样的情形下，通过使用本发明的移植部位形成剂，也能够进行治疗，不仅如此，关于II型糖尿病，如果考虑到是由于体内的胰岛素抵抗性大于胰腺的胰岛素产生能力而导致糖尿病，则从必须进行胰岛素施用之前的阶段开始进行预防意义上的移植也是有效的。
此外，根据本发明的装置，即使在移植他人的组织的情况下，也能够形成排斥反应受到抑制的移植部位。因此，例如，在胰岛素依赖性糖尿病的治疗中，在胰岛移植中由于使用由他人提供的组织而在移植后需要持续服用免疫抑制剂，通过使用本发明的移植部位形成剂，能够实现降低或省略了免疫抑制剂的服用的胰岛移植。胰岛素依赖性糖尿病的主要患者群为I型糖尿病，其发病原因为自身免疫反应。能够形成可抑制免疫反应的移植部位还有望保护其免受自身免疫反应的伤害，从长期保持移植胰岛的功能的方面出发，本方法的有用性也是很高的。
实施例
下面使用实施例和比较例更详细地说明本发明，但本发明当然不限定于这些实施例。
在实施例中，如下进行(1)免疫染色、(2)FITC-凝集素的生物体内灌流、(3)统计分析。
(1)组织染色
将包含胰岛移植物的回收组织利用磷酸缓冲生理盐水(PBS)中的4％多聚甲醛溶液进行固定，制备薄组织切片(厚度4μm)以便进行下述操作。胰岛素、CD4T细胞与CD8T细胞进行免疫染色。进行针对巨噬细胞和粒细胞的苏木精和伊红(HE)染色以及免疫荧光染色(LuanNM,IwataH.Biomaterials2013；34:5019-5024.)。为了进行免疫染色，分别使用脾脏组织和无一次抗体的样品作为阳性对照和阴性对照。购入针对CD4T细胞的抗体(兔多克隆；NovusBiologicals，利特尔顿，CO)、针对CD8T细胞的抗体(小鼠单克隆；OX-8；NovusBiologicals)、针对巨噬细胞的抗体(CD68)(小鼠单克隆；ED1，NovusBiologicals)和针对粒细胞的抗体(小鼠单克隆；HIS48，NovusBiologicals)。薄组织切片利用BlockingOne溶液(NacalaiTesque)进行1小时处理，封闭抗体的非特异性吸附，接着将针对CD4T细胞的一次抗体(1:50BlockingOne溶液中)、针对CD8T细胞的一次抗体(1:50BlockingOne溶液中)、针对巨噬细胞的一次抗体(1:50BlockingOne溶液中)和针对粒细胞的一次抗体(1:50BlockingOne溶液中)在4℃温育过夜。利用含有0.05％Tween-20的PBS清洗后，将切片利用AlexaFluor594抗兔IgG抗体或AlexaFluor488抗小鼠IgG抗体(1:200BlockingOne溶液中；Invitrogen，LifeTechnologies，卡尔斯巴德，CA)在室温下处理1小时，利用含有0.05％Tween-20的PBS进行清洗。将核利用Hoechst33258(Dojindo，熊本，日本)进行对比染色。
(2)用于测定血管系统的荧光素异硫氰酸酯(FITC)-凝集素的生物体内灌流
在通过埋入1周琼脂糖杆而产生了血管生成的ACI大鼠或移植30天后的F344胰岛的ACI受体中静脉内注射含有200μg的FITC-凝集素(VectorLabs，伯灵格姆，CA)和1000IU肝素的1mL生理盐水。循环15分钟后，迅速切除皮下组织和胰腺。利用生理盐水溶液简单清洗2次，进行固定，利用液氮急速冷冻。制备薄组织切片(厚度4μm)，按照常规方法进行胰岛素的免疫荧光染色。
(3)统计分析
通过学生t检验对2组进行比较。将p<0.05作为有显著差异。所有统计计算使用JMPver.5.1.1(http://www.jmp.com/)进行。
实施例1
将直径4mm、长度25mm的4.5％的琼脂糖凝胶杆冷冻干燥。向其中添加50μg的成纤维细胞生长因子(bFGF)和25μg的肝素，用作血管诱导用装置。使用8周龄的雄性ACI大鼠作为受体。向ACI大鼠腹腔内施用60mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。将STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠用作糖尿病受体大鼠。在施用STZ3天后，在ACI大鼠后背两侧的皮下分别移植1根血管诱导用琼脂糖凝胶。利用胶原酶法从F344大鼠的胰腺中分离出胰岛。关于该胰岛，胰岛的供体F344与糖尿病ACI大鼠为同种异系的关系。在埋入装置1周后切开皮肤，除去装置，在所形成的空隙中，分别在背部皮下的2个空隙中各移植1500个胰岛。装置无组织附着，可容易地除去。在移植后每2-3天测定一次血糖值。如图1所示，使用10只糖尿病ACI大鼠进行了研究，结果10只中的9只血糖值正常化达100天以上。血糖值正常化表示同种异系的胰岛以能够分泌胰岛素的状态成活，表示形成了排斥反应得到适当抑制的移植空间。
图2中示出了组织图像。(a)是在琼脂糖杆中添加50μg的成纤维细胞生长因子和25μg的肝素并在大鼠背侧的皮下埋入7天后的移植部位的组织图像。诱导出了大量的微细血管。(b)是从血糖值正常化的ACI大鼠中取出移植部位并研究其组织图像而得到的图。(b-1)是胰岛移植部位的组织切片的苏木精-伊红染色图像。观察到大量被认为是胰岛的细胞团块，另外，在该细胞团块中贯穿有大量的微细血管。这表示被移植到埋入了装置的移植空间内的F344大鼠来源的同种异系的胰岛未受到排斥，在移植空间内由微细血管进行氧和营养的供给，以能够长期生存的状态成活。(b-2)是大致相同部位的胰岛素的免疫染色图像。被染色为绿色的部分是分泌胰岛素的细胞所存在的部分。利用荧光显微镜对胰岛素的免疫荧光染色切片进行观察，结果在苏木精-伊红染色切片中，在与被认为是胰岛的细胞团块重叠的位置存在胰岛素阳性细胞。由此明确，所移植的胰岛保持了胰岛素产生功能。(b-3)是将(b-1)的移植胰岛所存在的部分进行放大表示。存在移植胰岛，完全没有炎症性细胞。无炎症性细胞这一点证实了，通过将本发明的装置埋入到皮下，形成了免疫系统受到抑制的空间(移植空间)。
接着，对于移植1～3个月后的具有F344胰岛或Lewis胰岛的正常ACI大鼠和STZ-ACI大鼠进行腹腔内葡萄糖耐量试验。结果示于图6A。关于曲线下的面积，在正常ACT大鼠、具有3000个F344胰岛的STZ-ACI大鼠和具有3000个Lewis胰岛的STZ-ACI大鼠中分别为19867±1897、22835±2023和20180±1286mgmin/dL。此外，将测定血浆胰岛素水平的结果示于图6B。在胰岛移植40天后和90天后测定将3000个F344胰岛移植到有血管生成的皮下空间的STZ-ACI大鼠(IV)或将3000个Lewis胰岛移植到有血管生成的皮下空间的STZ-ACI大鼠(III)的血浆胰岛素水平，结果分别为1.56±0.23(IV)和1.73±0.140ng/mL(III)。正常ACI大鼠(I)和糖尿病ACI大鼠(II)的血浆胰岛素水平分别为1.39±0.32和0.31±0.06ng/mL。受体的血浆胰岛素水平通过胰岛移植物得到了充分维持(图6B)。
比较例1
与实施例1同样地使用8周龄的雄性ACI大鼠作为受体。向ACI大鼠腹腔内施用60mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。将STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠用作糖尿病受体大鼠。利用胶原酶法从F344大鼠的胰腺中分离出胰岛。在未进行血管诱导的受体的背部两侧皮下分别移植同种异系的胰岛各1500个。在移植后每2-3天测定一次血糖值。使用4只糖尿病ACI大鼠进行了研究，结果所有大鼠的血糖值均未正常化。认为这是由于大鼠皮下的微小血管极少，因而皮下氧浓度低，因而对移植胰岛的氧供给不充分，胰岛由于氧不足而死亡。
比较例2
与实施例1同样地使用8周龄的雄性ACI大鼠作为受体。向ACI大鼠腹腔内施用60mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。将STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠用作糖尿病受体大鼠。利用胶原酶法从F344大鼠的胰腺中分离出胰岛。将分离出的3000个胰岛经门静脉移植到肝脏内。在移植后每2-3天测定一次血糖值。使用3只糖尿病ACI大鼠进行了研究，结果如图3所示，3只的血糖值均暂时正常化，但均在10天以内恢复到术前的高血糖值。这表明在将同种异系的胰岛经门静脉移植到肝脏内时，胰岛最初以能够产生胰岛素的状态存在，但在10天以内受到排斥，丧失其功能。
实施例2
将直径4mm、长度25mm的4.5％的琼脂糖凝胶冷冻干燥。向其中添加50μg的成纤维细胞生长因子(bFGF)和25μg的肝素，用于血管诱导。使用8周龄的雄性ACI大鼠作为受体。向ACI大鼠腹腔内施用60mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。将STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠用作糖尿病受体大鼠。在STZ施用3天后，在ACI大鼠后背两侧的皮下分别移植1根血管诱导用琼脂糖凝胶。利用胶原酶法从Lewis大鼠的胰腺中分离出胰岛。在埋入装置1周后切开皮肤，除去装置，在所形成的空隙中，分别在背部皮下的2个空隙(移植空间)中各移植1500个胰岛。在移植后每2-3天测定一次血糖值。在图4中箭头的那天将两侧的皮肤与移植胰岛一起除去。如图4所示，使用4只糖尿病ACI大鼠进行了研究，结果4只的血糖值全部正常化直至从背部除去移植胰岛的那天为止，随着胰岛的除去，均恢复至术前的高血糖值。这表示所移植的胰岛分泌胰岛素，使血糖值正常化。
将大鼠间同种移植汇总示于下述表1。
[表1]
表1.不同的供体与受体的组合、移植部位的不同对血糖值正常化期间带来的影响
*：在血糖值正常化的大鼠中向肝脏中追加移植F344大鼠的胰岛的那天。
**：在血糖值正常化的大鼠的腹腔中移植F344大鼠的脾细胞的那天。
***：向肝脏中追加移植F344大鼠的胰岛后，血糖值上升直至达到糖尿病状态为止的期间。
从背部除去移植胰岛的那天。血糖值正常化至那天为止.
具有显著差异(P<0.01)
实施例3
将直径4mm、长度20mm的4.5％的琼脂糖凝胶冷冻干燥。向其中添加50μg的成纤维细胞生长因子(bFGF)和25μg的肝素，用于血管诱导。使用6周龄的雄性BALB/c小鼠作为受体。向BALB/c小鼠腹腔内施用200mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。将STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠用作糖尿病受体小鼠。在施用STZ3天后，在BALB/c小鼠后背两侧的皮下分别移植1根血管诱导用琼脂糖凝胶。利用胶原酶法从C57BL/6小鼠的胰腺中分离出胰岛。在埋入装置1周后切开皮肤，除去装置，在所形成的空隙中，分别在背部皮下的2个空隙中各移植250个朗格汉斯岛(胰岛)。在移植后每2-3天测定一次血糖值。使用8只糖尿病BALB/c小鼠进行了研究，结果在5只小鼠中，血糖值正常化达30天以上。
[实施例4～5]
除了使成纤维细胞生长因子(bFGF)的添加量为表2记载的量以外，在与实施例1相同的条件下实施实施例4～5和比较例3～4，对于在皮下组织中诱导出的微细血管的量和血糖值正常化效果进行了研究。
将结果合并示于下述表2。需要说明的是，在皮下组织中诱导出的微细血管的量利用1g组织中所含有的血红蛋白量(mg/g组织)进行评价。
对于在糖尿病大鼠背部的皮下部位移植了1周具有bFGF(50μg)-肝素的装置的实施例4的大鼠，进行FITC-凝集素的生物体内灌流，如图5所示研究了有血管生成的皮下部位的血管系统。在皮下部位观察到大量的凝集素-阳性血管，这表示在该部位形成了密集的血管分布，可期待对生存的胰岛移植物供给充足的营养成分和氧。
由于血管含有血红蛋白，因而为了半定量地比较血管诱导，使用了皮下组织的血红蛋白含量(KawakamiY,IwataH,GuYJ,etal.pancreas2001；23:375-381.)。未处理皮下组织的血红蛋白含量为0.35±0.55mg/g组织。组织的血红蛋白含量依赖于导入到琼脂糖杆中的bFGF量。向杆中添加10μg的bFGF时，组织的血红蛋白含量为3.30±1.35mg/g，这与未利用bFGF处理的组织没有显著差异。使bFGF增加至50μg/杆时，组织的血红蛋白含量显著增加至9.40±2.84mg/g。在增加bFGF的量或使其更长期地缓释时，血红蛋白量可能会增加。
此外，为了对具有长期成活的胰岛移植物的实施例5的大鼠的左侧皮下胰岛移植物进行组织学测定，在91-130天进行了回收。在除去一侧移植物后仍维持正常血糖，对组织切片进行HE和Alexa488标记的抗胰岛素抗体染色(图7A、图7B、图7C)。在全部的3组供体-受体的组合的组中，在HE切片中清晰地观察到胰岛，在免疫荧光染色的切片中清晰地观察到胰岛素阳性细胞。在胰岛移植物中观察到大量的小血管，但几乎没有淋巴细胞浸润。另外，本发明人通过使用FITC-凝集素的生物体内灌流法对皮下胰岛移植物中的血管进行了评价。如胰岛素细胞周围的FITC-凝集素染色的细胞所示，在胰岛移植物中清晰地检测出小口径血管(图7D)。图7E是正常胰腺组织的染色图像。图7D、图7E中的胰岛的形态和血管分布彼此相似。这些数据表示，在有血管生成的皮下部位所移植的同种异系胰岛建立了与宿主血管系统连接的血管网络。
[表2]
实施例6
将直径4mm、长度25mm的4.5％的琼脂糖凝胶杆冷冻干燥。向其中添加50μg的成纤维细胞生长因子(bFGF)，用于血管诱导。使用8周龄的雄性ACI大鼠作为受体。向ACI大鼠腹腔内施用60mg/kg的链脲佐菌素(STZ)，诱导糖尿病。将STZ施用后连续2次血糖值超过400mg/dl的大鼠用作糖尿病受体大鼠。在施用STZ3天后，在ACI大鼠后背两侧的皮下分别移植1根血管诱导用琼脂糖凝胶。利用胶原酶法从F344大鼠的胰腺中分离出胰岛。关于该胰岛，胰岛的供体F344与糖尿病ACI大鼠为同种异系的关系。在埋入装置(琼脂糖杆)1周后切开皮肤，除去装置，在所形成的空隙中，分别在背部皮下的2个空隙中移植各1500个胰岛。装置无组织附着，可容易地除去。在移植后每2-3天测定一次血糖值。如图8所示，使用5只糖尿病ACI大鼠进行了研究，结果5只全部血糖值正常化达100天以上。血糖值正常化表示同种异系的胰岛以能够分泌胰岛素的状态成活，表示形成了排斥反应得到适当抑制的移植空间。
实施例7
在与实施例1同样得到的通过F344胰岛的移植而使血糖正常化100天以上的STZ-ACI受体的肝脏中，经由门静脉移植3000个F344胰岛。血中葡萄糖水平在胰岛注入后7～10天增加到350mg/dL(n＝2，图9A)。肝脏和皮下的胰岛均丧失了胰岛素产生功能。大量的淋巴细胞浸润到在胰岛注入14天后回收的肝脏和皮下的胰岛周围，胰岛受到严重损伤(图9C-1和C-2)。此外，对于与实施例1同样得到的通过F344胰岛的移植而使血糖正常化100天以上的STZ-ACI受体，腹腔内施用F344脾细胞。血中葡萄糖水平增加，在F344脾细胞施用后4-7天超过350mg/dL(n＝4，图9B)。大量的淋巴细胞浸润到胰岛周围，胰岛素阳性细胞数在脾细胞注射4天后回收的组织中减少(图9D-1和D-2)。
实施例7的结果暗示出，由与胰岛供体相同的系统的大鼠的细胞引起的免疫应答使胰岛移植物的成活失败，带来致命的影响；另一方面，通过使用本发明的装置的方法，形成了适合于同种异系细胞的移植、成活的免疫抑制部位。
另外可知，利用本发明的方法，在无免疫抑制剂的情况下移植的胰岛移植物可长期稳定成活，可持续分泌胰岛素直至达到正常血糖的水平。该胰岛移植物会由于移植被免疫排斥的同种异系的移植材料使免疫系统剧烈活化而受到排斥，但只要不进行这样的特殊操作，所移植的胰岛以与胰腺内同样的状态成活，可知其对于糖尿病治疗是非常有效的。
工业实用性
将由尸体供体得到的胰岛移植给糖尿病患者作为胰岛素依赖性糖尿病的治疗法是优异的方法。但是，尸体供体的提供数有限，预料其无法固定作为一般性的治疗法。另一方面，近年来有如下报道：由诱导性多能干细胞(iPS细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞)分化诱导出胰岛素分泌细胞、以及假胰岛，将其封入到半透膜制的袋中使其不会受到排斥反应，之后移植到糖尿病模型动物中，由此能够使血糖值正常化。若能够由诱导性多能干细胞(iPS细胞等)或胚胎干细胞(ES细胞)简便地分化诱导出胰岛素分泌细胞以及假胰岛，则在使用本发明的方法进行移植时，能够在不施用免疫抑制剂并且不使用半透膜制的袋的情况下通过细胞移植实施糖尿病治疗。本发明是提供糖尿病的理想治疗法的极为有力的方法。对于胰岛以外的移植材料，不需要施用免疫抑制剂也是一大优点。

Claims (17)

1.一种装置，其是用于埋入到皮下从而形成不会发生排斥的移植空间的装置，所述装置由包含血管诱导因子的生物相容性结构体构成。
2.如权利要求1所述的装置，其中，移植到所述移植空间的材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
3.如权利要求2所述的装置，其中，移植到所述移植空间的材料为朗格汉斯岛即胰岛。
4.如权利要求2所述的装置，其中，移植到所述移植空间的材料为由成体干细胞、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化诱导出的细胞。
5.如权利要求4所述的装置，其中，分化诱导出的细胞为胰岛素分泌细胞。
6.如权利要求1～5中任一项所述的装置，其中，血管诱导因子为选自由成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子和表皮生长因子组成的组中的至少一种。
7.如权利要求1～6中任一项所述的装置，其中，所述结构体选自由水凝胶、海绵和多孔体组成的组。
8.如权利要求1～7中任一项所述的装置，其中，进一步包含肝素或硫酸乙酰肝素。
9.如权利要求2所述的装置，其中，移植到所述移植空间的材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
10.如权利要求1～9中任一项所述的装置，其中，换算成血红蛋白量，包含能够诱导2mg/g组织～50mg/g组织的血管生成的量的所述血管诱导因子。
11.一种在无免疫抑制剂的条件下在皮下形成免疫排斥受到抑制的空间的方法，其包括下述步骤：在哺乳动物的皮下埋入权利要求1～10中任一项所述的装置从而在所述装置的周围形成小口径血管的步骤；取出所述装置的步骤。
12.一种在无免疫抑制剂的条件下将移植材料移植到哺乳动物中的方法，其包括下述步骤：在哺乳动物的皮下埋入权利要求1～10中任一项所述的装置从而在所述装置的周围形成小口径血管的步骤；取出所述装置从而在无免疫抑制剂的条件下形成免疫排斥受到抑制的空间的步骤；将选自由同种异系细胞和同种异系微小组织组成的组中的移植材料移植到所述空间中的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述移植材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
14.一种用于使可能产生免疫排斥的移植材料在无免疫抑制剂的条件下在皮下成活的装置的使用，其特征在于，
所述装置由包含血管诱导因子的生物相容性结构体构成，
将所述装置埋入皮下从而在所述装置的周围形成血管，然后将所述装置从皮下取出从而形成不会发生排斥的移植空间，将可能产生免疫排斥的移植材料移植到所述移植空间内，使其在无免疫抑制剂的条件下在皮下成活。
15.如权利要求14所述的使用，其中，移植到所述移植空间的材料为同种异系细胞或同种异系微小组织。
16.一种疾病的治疗方法，其包括下述步骤：在哺乳动物的皮下埋入权利要求1～10中任一项所述的装置从而在所述装置的周围形成小口径血管的步骤；取出所述装置从而在无免疫抑制剂的条件下形成免疫排斥受到抑制的空间的步骤；将选自由同种异系细胞和同种异系微小组织组成的组中的疾病治疗用移植材料移植到所述空间中的步骤。
17.如权利要求16所述的治疗方法，其中，疾病为糖尿病，移植材料为胰岛。
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