CN107693849B - 一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶及其制备方法，该生物胶的主要组分包括透明质酸钠凝胶、CMRL‑1066培养基、细胞生长因子、HAX‑1、胰岛素和肝素钠。本发明的生物胶将所有能够协同细胞生长因子起效的组分有效结合起来，形成一种制剂，应用于细胞和器官移植，使操作过程更便捷、安全和高效，在延长细胞生长因子发挥促微血管重建等组织修复作用时间的同时降低细胞生长因子诱发肿瘤的潜在风险。该生物胶用于细胞和器官的移植，特别适用于胰岛移植。

Description

一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物胶及其制备方法，具体涉及一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶及其制备方法。

背景技术

透明质酸钠是从牛眼玻璃体中分离出的一种含糖醛酸和氨基己糖的高分子多糖物质，不同工艺制备的透明质酸钠的分子量也不一样，天然性状的透明质酸钠分子量通常在80～250万之间。一般认为分子量越大则其弹性增加，具有较好的粘连性。透明质酸钠作为一种天然的多糖物质，其凝胶具有无种属特异性、无毒性、生物相容性好、溶解性较高的特性。作为一种新型的生物材料，透明质酸钠凝胶被广泛用于各种临床及科学的研究，比如作为外科手术的相应辅助材料，防止骨关节炎、防止妇产科及宫腔等手术的各种粘连、预防术后的外伤性退变以及用于药物释放的载体，所以透明质酸钠凝胶在临床上的广泛应用也验证了其安全性和有效性。透明质酸钠凝胶的粘连性随分子量的增大而增大，一般为80～250万分子量，常用160万分子量。

细胞生长因子对于创伤组织修复起到重要作用，其中以酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)等成纤维细胞生长因子的作用最为明显。FGF1主要分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨等器官或组织内。人酸性成纤维细胞生长因子是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多重类型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子。近年研究表明，FGF1可促进血管生长、创伤愈合、骨骼修复、溃疡愈合、神经组织修复及胚胎的发育与分化。FGF2有50％的氨基酸序列与FGF1相同。FGF2是一种已被广泛证实的血管生长的刺激因子，可促进细胞增殖，趋化血管的内膜细胞，刺激各类细胞的增殖、分化与迁移。此外，FGF2还有促毛细血管出芽、抗胰岛凋亡、诱导增殖分化为多种细胞等作用。

随着人类医学技术的进步，细胞和器官的移植治疗已逐渐成为挽救危重病人的重要手段，目前，骨髓移植、干细胞移植和胰岛细胞移植在临床治疗中取得了显著的疗效。作为根治临床1型糖尿病和2型糖尿病终末期患者的好方法，胰岛细胞移植对胰腺供体要求低、移植操作简单，几乎不需要手术、副作用小，逐渐成为替代全胰腺移植的最佳疗法。

细胞和器官的移植技术的关键是要保证移植后的组织微观结构和生物活性的快速恢复。在细胞和器官从在体到离体的处理过程中，原组织内部丰富的微血管结构被破坏，因此移植后的细胞和器官生物活性有所下降，因此需要添加必要的活性因子，促进移植部位组织微血管结构的重建。

目前报道的促进细胞和器官移植后血管重建的方法都是通过加入各类细胞生长因子，促进移植部位组织微血管结构的重建。作为生物活性大分子，各类细胞生长因子都存在生物半衰期短、活性不持久等问题，并且单靠细胞生长因子的作用，不能良好地协调再生细胞的增殖、黏附及转移等过程，容易形成肿瘤，从而得不偿失，极大限制了细胞和器官移植技术在临床上的应用和发展。尽管有人加入一些亲水大分子试剂，保护细胞生长因子的活性，延长其释放速度。但是该技术没有从根本上解决细胞生长因子诱发肿瘤的潜在风险，反而因延长细胞生长因子的作用，增加了诱发肿瘤的风险。已有的各类抗肿瘤药物的毒性大，并且拮抗细胞生长因子促微血管重建等组织修复作用，因此不能与细胞生长因子联合应用于细胞和器官的移植治疗中。

因此，如何保证细胞生长因子在细胞和器官移植后血管重建中的作用，同时避免活性因子的自身缺点和诱发肿瘤的风险，已成为制约当前细胞和器官移植技术发展的瓶颈。目前尚未见到有效技术，能够协同细胞生长因子在细胞和器官的移植治疗中起效，一方面延长细胞生长因子发挥促微血管重建等组织修复作用时间，另一方面降低细胞生长因子诱发肿瘤的潜在风险。

发明内容

为了克服现有细胞和器官的移植治疗中的瓶颈，本发明的目的在于提供一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶及其制备方法。

通过大量实验，本发明人发现具有良好的生物相容性和缓释作用的透明质酸钠具有较好的粘连性，结合CMRL-1066培养基应用，可以形成一种生物胶，提高和延长细胞生长因子在细胞和器官的移植治疗中的作用活性。

通过大量实验，本发明人发现HAX-1(HS1-associated protein X-1，HS1相关蛋白X-1)是细胞生长因子良好的协同试剂。HAX-1自1997年首次被Suzuki等人证实为酪氨酸激酶的底物HS1的结合蛋白，在淋巴细胞的增殖与凋亡中起着信号转换的作用。本发明人研究发现，HAX-1联合细胞生长因子应用时，可以调节再生细胞的增殖、黏附及转移等过程，抑制肿瘤细胞的形成。

本发明人还发现，胰岛素和肝素钠，也是细胞生长因子良好的协同试剂，更好地促进组织的微血管重建。

由此，本发明的一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶，其主要组分包括透明质酸钠凝胶、CMRL-1066培养基、细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠。

上述的透明质酸钠凝胶是由透明质酸钠、磷酸缓冲盐和注射用水组成，每1000ml透明质酸钠凝胶中含有20g～60g透明质酸钠和5～10g磷酸缓冲盐，其余为注射用水。

上述的CMRL-1066培养基中含有胎牛血清、青霉素、链霉素和稳定剂。

上述的稳定剂包括聚乙二醇、聚维酮、右旋糖酐、丙三醇、海藻糖、1，2，4-丁三醇、赤藓糖醇、苏阿糖醇、季戊四醇、环戊五醇、木糖醇、来苏糖醇、阿拉伯糖醇、环己六醇、山梨醇、阿洛糖醇、阿卓糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、艾杜糖醇、半乳糖醇、太罗糖醇及果糖醇中的一种或几种的任意组合。

上述的细胞生长因子优选酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。

上述的生物胶中的透明质酸钠凝胶的质量百分含量为50％～80％、CMRL-1066培养基的质量百分含量为15％～45％、细胞生长因子的质量百分含量为0.2％～5％、胰岛素的质量百分含量为0.20％～0.35％、HAX-1的质量百分含量为0.10％～0.25％、肝素钠的质量百分含量为0.10％～0.25％。

上述的生物胶中的透明质酸钠凝胶的质量百分含量为65％～75％、CMRL-1066培养基的质量百分含量为23％～33％、细胞生长因子的质量百分含量为0.2％～1.5％、胰岛素的质量百分含量为0.25％～0.30％、HAX-1的质量百分含量为0.15％～0.20％、肝素钠的质量百分含量为0.15％～0.20％。

一种上述生物胶的制备方法：将所述的细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠加入透明质酸钠凝胶中，混匀，加入CMRL-1066培养基，混匀，置于4℃保存12小时，除去配制过程中产生的气泡。

另一种上述生物胶的制备方法：将所述的细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠加入CMRL-1066培养基中，混匀，加入透明质酸钠凝胶，混匀，置于4℃保存12小时，除去配制过程中产生的气泡。

上述的生物胶用于细胞和器官的移植，特别适用于胰岛移植。

本发明的一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶及其制备方法与现有技术相比，具有以下优点：1)将所有能够协同细胞生长因子起效的组分有效结合起来，形成一种制剂，立用于细胞和器官移植，使操作过程更便捷、安全和高效。2)本发明的生物胶能够同时发挥两种作用：①延长细胞生长因子发挥促微血管重建等组织修复作用时间；②降低细胞生长因子诱发肿瘤的潜在风险。3)本发明的生物胶具有良好的生物相容性、生物可降解性、无免疫原性、安全无毒等优点。4)本发明的生物胶制备方法简单可控，成品低温放置时保质期长，运输和使用方便。

因此相比现有技术，本发明的一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶同时解决现有细胞和器官的移植治疗中的所有问题，尤其适用于胰岛移植治疗。

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1 生物胶的制备

本实施例按照表1的配方制备各实验组和对照组的生物胶，CMRL-1066培养基中含有胎牛血清、青霉素、链霉素和稳定剂。生物胶的制备方法：将所需的细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠加入灭菌处理后的透明质酸钠凝胶(每1000ml透明质酸钠凝胶中含有40g透明质酸钠和10g磷酸缓冲盐)中，混匀，加入CMRL-1066培养基，混匀形成半流动性凝胶状，封口后置于4℃冰箱中放置12h，除去配制过程中产生的气泡。

表1 生物胶各实验组的组成

注：对照组1～7中“/”代表该项组分为0，该项组分用注射用水替代，注射用水用量等同于相同序号实验组的质量百分含量。对照组8：以赫赛汀代替HAX-1，赫赛汀在终产品中的质量百分含量为0.15％。

实施例2 生物胶的应用效果

本实施例通过以下指标，考察实施例1所制备的各组生物胶的质量。

(1)内皮细胞的修复作用

将实施例1各实验组和对照组制得的生物胶分别涂抹于大鼠子宫移植后血管缝合处，两周后取组织进行HE染色、免疫组化等，考察其对内皮细胞修复的效果。

将实施例1各实验组和对照组制得的生物胶和小鼠胰岛混合在体外共培养，每隔4h后收集细胞样品，以透射电镜观察胰岛细胞内部结构及内分泌颗粒的释放情况，考察其对内皮细胞修复的效果。

(2)胰岛活性

将实施例1中各实验组和对照组制得的生物胶与小鼠胰岛共培养，分别于0h、8h、16h、24h取样进行FDA-PI染色，初步评价细胞生长因子对胰岛的活性的影响。胰岛活性以百分数计算。

(3)对减量胰岛移植的作用

将实施例1中各实验组和对照组制得的生物胶分别与200IEQ共移植、400IEQ单独移植至糖尿病小鼠肾被膜下，通过对移植后小鼠的血糖监测及移植后口服糖耐量实验，评价生物胶与胰岛共移植对减量胰岛移植所起的作用。

(4)促进移植后胰岛微血管重建的作用

将上述(3)中移植后两周的小鼠肾脏取出进行HE染色、免疫组化及western-blot多个相关蛋白检测，综合评价生物胶促进移植后胰岛微血管重建的作用。

(5)促进肿瘤细胞增殖作用

收集C6细胞，以5000个细胞/孔的密度铺于96孔板，在5％CO₂和37℃培养箱中孵育过夜。将实施例1各实验组和对照组制得的生物胶和细胞混合，在培养箱中共培养12h。每孔加入10ul CCK-8，继续培养2h后，酶标仪450nm处测吸光值，用以评价生物胶的促进肿瘤细胞增殖作用。

注：除“胰岛活性”外，以上各指标均分为10级，级数越高，表示该项作用越强。

实验结果：以上各组的生物胶质量评价结果见表2。

从表2数据可见，各实验组在对内皮细胞的修复作用、胰岛活性、对微血管重建作用等方面相差不明显，各项性能指标优异，尤其以实验组8的各项指标为最佳。实验组3和实验组5的一些指标稍逊其他实验组，证明相比其它细胞生长因子，酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对于移植组织的微血管重建的效果最好。

相比以上各实验组，各对照组在内皮细胞修复作用、微血管重建作用等评价指标上与实验组存在明显差距，综合应用效果方面明显劣于实验组。各对照组中，对照组3和对照组8各项评价指标最差，对照组3未加入任何细胞生长因子，对照组8加入了赫赛汀代替HAX-1，结果证明了HAX-1和细胞生长因子的组合是协同互补的，两者组合是不可随意替换的。对照组1、对照组5和对照组7的各项评价指标也较差，尤其是对照组5和对照组7的生物胶促进肿瘤细胞增殖，具有较大的诱发肿瘤的风险。对照组2、对照组4和对照组6相对而言较好，但与实验组对比，还是具有显著差异。

由上可知，本发明的一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶主要组分缺一不可，共同协同发挥作用，同时解决现有细胞和器官的移植治疗中的所有问题，可以应用于细胞和器官的移植，特别适用于胰岛组织的细胞和器官移植。

表2 生物胶的质量评价结果

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，所有实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种促进细胞和器官移植后血管重建的生物胶，其特征在于：所述的生物胶是由透明质酸钠凝胶、CMRL-1066培养基、细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠组成。

2.根据权利要求1所述的生物胶，其特征是：所述的透明质酸钠凝胶是由透明质酸钠、磷酸缓冲盐和注射用水组成，每1000ml透明质酸钠凝胶中含有20g～60g透明质酸钠和5～10g磷酸缓冲盐，其余为注射用水。

3.根据权利要求1所述的生物胶，其特征是：所述的CMRL-1066培养基中含有胎牛血清、青霉素、链霉素和稳定剂。

4.根据权利要求3所述的生物胶，其特征是：所述的稳定剂包括聚乙二醇、聚维酮、右旋糖酐、丙三醇、海藻糖、1，2，4-丁三醇、赤藓糖醇、苏阿糖醇、季戊四醇、环戊五醇、木糖醇、来苏糖醇、阿拉伯糖醇、环己六醇、山梨醇、阿洛糖醇、阿卓糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、艾杜糖醇、半乳糖醇、太罗糖醇及果糖醇中的一种或几种的任意组合。

5.根据权利要求1所述的生物胶，其特征是：所述的细胞生长因子为酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。

6.根据权利要求1所述的生物胶，其特征在于：所述的生物胶中的透明质酸钠凝胶的质量百分含量为50％～80％、CMRL-1066培养基的质量百分含量为15％～45％、细胞生长因子的质量百分含量为0.2％～5％、胰岛素的质量百分含量为0.20％～0.35％、HAX-1的质量百分含量为0.10％～0.25％、肝素钠的质量百分含量为0.10％～0.25％。

7.根据权利要求6所述的生物胶，其特征在于：所述的生物胶中的透明质酸钠凝胶的质量百分含量为65％～75％、CMRL-1066培养基的质量百分含量为23％～33％、细胞生长因子的质量百分含量为0.2％～1.5％、胰岛素的质量百分含量为0.25％～0.30％、HAX-1的质量百分含量为0.15％～0.20％、肝素钠的质量百分含量为0.15％～0.20％。

8.一种根据权利要求1～7任一项所述生物胶的制备方法，其特征是：将所述的细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠加入透明质酸钠凝胶中，混匀，加入CMRL-1066培养基，混匀，置于4℃保存12小时，除去配制过程中产生的气泡。

9.一种根据权利要求1～7任一项所述生物胶的制备方法，其特征是：将所述的细胞生长因子、HAX-1、胰岛素和肝素钠加入CMRL-1066培养基中，混匀，加入透明质酸钠凝胶，混匀，置于4℃保存12小时，除去配制过程中产生的气泡。

10.根据权利要求1～7任一项所述的生物胶，其特征是：所述的生物胶用于细胞和器官的移植。