CN109464465A - 一种胰岛细胞移植用水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种胰岛细胞移植用水凝胶，水凝胶是由氨基化芦荟多糖‑甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素‑泊洛沙姆凝胶、胰岛细胞团组成，通过改变组分配比，控制胰岛细胞移植用水凝胶的力学强度和降解速度。该胰岛细胞移植用水凝胶克服现有材料来源有限且免疫源性高的缺点和不足，提供一种免疫源性低且具备维持胰岛细胞团活力和力学支持多项功能的新型胰岛细胞移植用水凝胶，为胰岛细胞团发挥作用提供最佳的理化和生物学微环境。

Description

一种胰岛细胞移植用水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种胰岛细胞移植用水凝胶，特别涉及一种胰岛细胞移植用水凝胶的组成、制备及其用途。

背景技术

胰岛(pancreatic islets)是许多大小不等和形状不定的细胞团，散布在胰腺的各处，构成胰腺的内分泌部分，可控制碳水化合物的代谢。胰岛能分泌胰岛素和胰高血糖素等激素。每个胰岛大约由2000个细胞组成，主要分为α细胞、β细胞、γ细胞及PP细胞。

胰岛移植是指为患者移植活的胰岛细胞团，用于恢复患者精确的血糖调节能力，达到治疗或预防胰岛素绝对缺乏型糖尿病的一种细胞替代治疗方法，是目前唯一微创治疗即可实现稳定控制血糖的临床治疗方法。由于胰岛是由α细胞、β细胞、γ细胞及PP细胞共同组成并起效，因此单独的一种细胞都不具备响应机体血糖变化分泌胰岛素的能力。

胰岛移植用于治疗糖尿病，无需皮下注射胰岛素的同时又能改善血糖控制水平，以及预防极端不稳定糖尿病患者末期的并发症。

目前，现有针对胰岛细胞移植应用的制剂报道，有人研究水溶液或水凝胶最为胰岛细胞团的制剂，临床应用疗效不佳，主要原因在于现有这些制剂无法保证胰岛细胞团长时间维持有效活性。此外，由于胰岛细胞移植部位血供环境也影响胰岛细胞的存活，目前常用经门静脉内输注定植于肝脏内的移植方法，但该部位移植存在众多缺陷，如急性血液介导的炎症反应、出血、血栓的形成、免疫抑制剂浓度高、胰高血糖素对低血糖的无反应性等。而如肌肉、皮下、大网膜等部位血供环境不佳，严重影响移植后的胰岛细胞团的存活。这些因素成为阻碍目前制剂在胰岛细胞移植应用的瓶颈。

从临床应用角度出发，理想的胰岛细胞移植制剂首先应同时满足以下条件：①生物相容性好，所用材料应安全无毒无刺激，且生物可降解；②力学强度和弹性等理化参数适宜，不引起胰岛细胞团的二次损伤；③提供良好的局部营养环境；④具有很好的胰岛细胞团亲和性，不受胰岛细胞团黏液快速分泌的影响。⑤制剂降解速度慢，可维持6个月。目前尚缺乏一种能够同时满足以上要求的胰岛细胞移植制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服“现有制剂不能同时满足胰岛细胞移植所有要求”的不足，提供一种免疫源性低且具备维持胰岛细胞团活力和力学支持多项功能的胰岛细胞移植用水凝胶，为胰岛细胞团发挥作用提供最佳的理化和生物学微环境。

申请人发现，水凝胶是一类具有力学强度、弹性模量的半固体制剂，温敏型HP水凝胶联合原位给药注射技术为胰岛细胞移植应用提供良好的基础。但已有报道的水凝胶制剂在胰岛细胞团亲和性、营养因子的释放速度等方面存在明显不足，不能满足胰岛细胞移植特殊需要。为了解决现有制剂的这些问题，申请人经过大量研究发现，芦荟中具有多种成分，其中芦荟多糖具有很好的维持胰岛细胞团活力作用。申请人通过氨基化修饰，制备氨基化芦荟多糖，可以与甘油醛交联形成力学性质良好的凝胶，不仅没有已报道的醛基交联剂的毒性，还具有很好的生物相容性和可控的降解速度，充分发挥芦荟多糖对于胰岛细胞团活性的稳定作用、促进微血管再生、改善局部营养环境等作用。此外，申请人发现肝素修饰的泊洛沙姆凝胶具有多重特点，包括：肝素的抗疤痕和抗纤维化的作用；保证肝素高亲和性细胞因子的控制释放和长效作用；保持泊洛沙姆的温敏型水凝胶性质，在体温时形成弹性好的固体凝胶，从而保证肝素高亲和性细胞因子不流失等。申请人研究发现，只有胰岛细胞团层的去细胞基质生物相容性最好，包含很多胰岛细胞团，可以为胰岛细胞移植提供良好的营养环境。

因此，本申请保护的一种胰岛细胞移植用水凝胶，该水凝胶的基质是由包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、维生素P组成，通过改变组分配比，控制胰岛细胞移植用水凝胶基质的力学强度和降解速度，分离纯化后的胰岛细胞团根据临床需要选取剂量，分散于胰岛细胞移植用水凝胶基质中，形成胰岛细胞移植用水凝胶。

上述水凝胶的基质中氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为64％-74％、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为25％-35％、维生素P的质量百分含量为0.01％-1％。

上述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。

上述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。

上述的肝素高亲和性细胞生长因子优选血管内皮生长因子。

上述的胰岛细胞团包括不同种动物的胰岛细胞团和同种动物的胰岛细胞团。

上述的胰岛细胞团优选同种动物的胰岛细胞团。

上述胰岛细胞移植用水凝胶的一种制备方法：取氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀，加入维生素P，混匀，形成均匀的水凝胶基质，加入分离纯化后的胰岛细胞团，分散均匀即得。

上述胰岛细胞移植用水凝胶的另一种制备方法：取包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，加入维生素P，混匀，加入到氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶中，混匀，形成均匀的水凝胶基质，加入分离纯化后的胰岛细胞团，分散均匀即得。

上述的胰岛细胞移植用水凝胶用于糖尿病的胰岛细胞移植治疗。

与现有技术相比，本发明的胰岛细胞移植用水凝胶发挥“氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、维生素P”各组分的优势，实现优势互补，在保证免疫源性低的前提下为胰岛细胞团发挥作用提供最佳的力学和生物学微环境，具体包括：①氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，提供良好的免疫微环境，降低胰岛细胞移植用水凝胶的免疫源性，同时保证水凝胶的力学性能，提供胰岛细胞移植所需的力学强度。②包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，具有多重优点，包括：防止胰岛细胞移植部位的纤维形成、体温时形成弹性好的固体凝胶保证肝素高亲和性细胞因子不流失、保证肝素高亲和性细胞因子的缓慢释放和长效作用、引导和促进微血管的快速生成等。③维生素P，具有抗氧化、营养增强和降低免疫排斥细胞等作用，维护胰岛细胞团的生存活性。④本发明的胰岛细胞移植用水凝胶降解速度慢，可维持6个月，满足胰岛细胞移植治疗需求。⑤本申请保护的技术方案中各组分是协同互补和必要的关系，共同发挥作用。

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1胰岛细胞移植用水凝胶的制备

(1)胰岛细胞团的分离纯化

正常小鼠胰岛的消化、分离和纯化：取小鼠持续吸入异氟烷麻醉后，用止血钳夹住胆总管与十二指肠连接处，体视显微镜下逆行胰管灌注胶原酶V；37℃恒温水浴消化，用新的纯化溶液纯化，吸取胰岛介质/纯化交界面的组织，并在体视显微镜下用手工进一步挑选，即得纯化后的胰岛细胞团，测算效价，平均分成若干份同效价的胰岛细胞团备用。

其它动物的胰岛细胞团的分离纯化参照上述方法进行。

(2)实验组的胰岛细胞移植用水凝胶的制备

制备方法1：按照表1的胰岛细胞移植用水凝胶各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法取氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀，加入维生素P，混匀，形成均匀的水凝胶基质，加入分离纯化后的胰岛细胞团，分散均匀即得

制备方法2：按照表1的胰岛细胞移植用水凝胶各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法取包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，加入维生素P，混匀，加入到氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶中，混匀，形成均匀的水凝胶基质，加入分离纯化后的胰岛细胞团，分散均匀即得。

各对照组的胰岛细胞移植用水凝胶制备参照实验组的制备方法进行。

表1胰岛细胞移植用水凝胶各实验组的组成

注：“胰岛细胞团”项下括号内的动物是指胰岛细胞团的来源动物；VitP：维生素P；TGF：转化生长因子；IGF：胰岛素样生长因子；KGF：角质细胞生长因子；bFGF：碱性成纤维细胞因子；VEGF：血管内皮生长因子；EGF：表皮生长因子；NGF：神经生长因子。

表2胰岛细胞移植用水凝胶各对照组的组成

注：Vit E：维生素E；Vit C：维生素C；各列括号内的材料是指该类材料的来源；英文缩写的生长因子全称见表1的注解。

实施例2在体评价各组胰岛细胞移植用水凝胶应用效果

(1)小鼠糖尿病模型的建立

应用用链脲佐菌素制备小鼠I型糖尿病模型：造模前小鼠禁食不禁水，按体重单次腹腔注射STZ 55mg/kg，1周后小鼠表现多饮、多食、多尿和体重减轻，血糖值≥13.88mmol·L^-1。

(2)小鼠糖尿病模型肾被膜下胰岛细胞移植

将各组分离纯化后的胰岛经肾被膜下移植至糖尿病小鼠肾脏，方法为：(i)移植工具的制备：将一次性带加长头的250μl移液枪头剪去尖头，剪取一段6号不锈钢针头，稍弯折后接到剪去尖头的移液枪头上，剪去移液枪头尾端直径较大部分，使其能密封连接1ml注射器针筒。(ii)胰岛准备：将350±50 IEQ胰岛混悬至培养液中，吸至1ml移植工具中，待胰岛沉淀后，弃去部分上清溶液，使溶剂量达约0.3ml，翻转注射器，使胰岛混悬聚集至移植工具头部。(iii)移植手术操作：糖尿病小鼠术前15min皮下注射50μl头孢唑啉钠(浓度：50mg/ml)，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，固定小鼠，剃去腹部毛发，用酒精消毒手术野，暴露小鼠肾脏，移植前将胰岛再次混悬，在体视显微镜下推注胰岛至肾被膜下，推注完毕，用棉签和止血棉花压迫出血点约1-2min，观察无出血后，关闭腹腔，并注射2ml生理盐水补液。

(3)移植后小鼠糖尿病模型疗效评价

(i)组织病理检查相关炎症指标：取移植后3d每组3只受体鼠尾静脉血的血清，用ELISA法测IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β等，染色观察炎症细胞浸润情况。

(ii)新生微血管的评价：石蜡或冰冻切片，用鼠抗人CD31单克隆抗体，免疫组织化学染色试剂盒；用改进的Weidner方法计数微血管密度(MVD)；也可参考文献，在安乐死之前，大鼠静脉注射FITC标记的番茄lectin至需灌注的血管系统，组织用ImmunoBed包被后用冰冻切片，切片同时用胰岛素免疫荧光染色，血管化程度为在图像软件下用凝集素阳性面积和胰岛素染色阳性区面积的比值计算。

(iii)移植后β细胞活性评价：应用TUNEL原位末端标记法检测β细胞凋亡和增生情况。

(iv)胰岛功能评价：移植起效后，在移植后第四周测定各组大鼠的口服糖耐量试验(OGTT)：灌胃葡萄糖溶液后定期测定尾静脉血糖，并同时收集尾静脉血，分离血清，评价胰岛素的分泌、C肽含量。

(v)一般疗效评价：检测移植前后大鼠饮食、体重、血糖等指标变化情况。

基于以上结果，采用双盲法评价各组水凝胶的应用效果，给出综合评分(满分10分)，分数越高代表综合效果越好。

实验结果：大鼠胰岛细胞移植用水凝胶的实验结果见表3。从表3数据可见，各个实验组炎症指标、新生微血管、β细胞、胰岛功能、一般疗效等指标良好，验证了实验组对于大鼠胰岛细胞移植具有良好的作用效果。各对照组中，炎症指标、新生微血管、β细胞、胰岛功能、一般疗效等指标很差，综合评分明显区别于实验组结果。由上可知，各实验组对于大鼠胰岛细胞移植具有良好的作用效果，可以作为胰岛细胞移植的水凝胶。

表3各组胰岛细胞移植用水凝胶的应用效果

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种胰岛细胞移植用水凝胶及其制备方法，其特征在于，所述水凝胶的基质是由包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、维生素P组成，通过改变组分配比，控制胰岛细胞移植用水凝胶基质的力学强度和降解速度，分离纯化后的胰岛细胞团根据临床需要选取剂量，分散于胰岛细胞移植用水凝胶基质中，形成胰岛细胞移植用水凝胶。

2.根据权利要求1所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征在于：所述水凝胶的基质中氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为64％-74％、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为25％-35％、维生素P的质量百分含量为0.01％-1％。

3.根据权利要求1所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。

4.根据权利要求1所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。

5.根据权利要求4所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子优选血管内皮生长因子。

6.根据权利要求1所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征是：所述的胰岛细胞团包括不同种动物的胰岛细胞团和同种动物的胰岛细胞团。

7.根据权利要求1所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征是：所述的胰岛细胞团优选同种动物的胰岛细胞团。

8.一种根据权利要求1～7任一项所述胰岛细胞移植用水凝胶的制备方法，其特征是：取氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀，加入维生素P，混匀，形成均匀的水凝胶基质，加入分离纯化后的胰岛细胞团，分散均匀即得。

9.一种根据权利要求1～7任一项所述胰岛细胞移植用水凝胶的制备方法，其特征是：取包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，加入维生素P，混匀，加入到氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶中，混匀，形成均匀的水凝胶基质，加入分离纯化后的胰岛细胞团，分散均匀即得。

10.根据权利要求1～9所述的胰岛细胞移植用水凝胶，其特征是：所述的胰岛细胞移植用水凝胶用于糖尿病的胰岛细胞移植治疗。