CN110037010A - 一种温敏凝胶制剂及低温长期保存胰岛细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于凝胶制剂技术领域，具体涉及一种温敏凝胶制剂及低温长期保存胰岛细胞的方法，其中，温敏凝胶制剂在现有配方含有明胶作为基础凝胶成分的基础上，增加了脱细胞基质、芦荟提取物和胆红素，基于肺脱细胞基质、芦荟提取物、明胶凝胶因子在低温自组装形成超分子凝胶，可低温长期保存胰岛细胞，维持胰岛细胞的活性，生物相容性好，且便于运输，方便实用，解冻后可以直接用于体内的胰岛细胞移植。

Description

一种温敏凝胶制剂及低温长期保存胰岛细胞的方法

技术领域

本发明属于凝胶制剂技术领域，具体涉及一种温敏凝胶制剂及低温长期保存胰岛细胞的方法。

背景技术

糖尿病是常见的内分泌疾病，据国际糖尿病联盟公布数据显示，全球糖尿病患者目前已达3.82亿人，而我国糖尿病患病人数居全球之首，占全球患者总数的三分之一。胰岛细胞移植就是摘取人或动物的胰腺器官，经过消化、分离和提取纯化胰岛细胞以后将具有胰岛素分泌功能的细胞，经过血管移植到糖尿病患者的肝脏内，在药物的保护下控制排斥反应，当这些细胞在患者体内存活后，便能发挥正常的胰岛素分泌功能，从而达到勿需注射或仅少量注射胰岛素，便能控制血糖的目的，是治疗糖尿病的有效手段，但是由于每一次分离得到的活体细胞数量很难满足一次临床移植的需要，因此胰岛细胞的保存是胰岛移植需要研究的重要课题。

低温冻存是目前保存细胞或组织最普遍的方法，即往含有活细胞或组织的培养液中加入一定量的冻存保护剂，然后以一定的速率降至某一温度，并将活细胞或组织保存在该温度下一定时间。在冻存过程中，细胞内的新陈代谢被抑制，细胞或组织的活性“暂停”，所以细胞或组织得以长期保存，待需要使用时再将其复温，细胞或组织的活性和功能可恢复正常。目前的方法主要有玻璃化冷冻保存和慢速冷冻保存两种。在低温冻存过程中，细胞内外形成的冰晶会对小鼠胰岛细胞造成损伤，而且在冻存保护剂添加过程细胞内外渗透压的变化也会对细胞造成伤害。虽然这两种方法能在一定程度上降低细胞受到的冰晶损伤，但是在冻存过程中细胞直接或间接地暴露在冻存保护剂中，所以细胞毒性较大，细胞的存活率和功能受到了一定的影响。

超分子凝胶是一类由低分子量的凝胶因子聚集而形成的软物质，它是低分子量凝胶因子在一定环境条件下自组装形成的超分子化合物。凝胶因子自组装形成超分子凝胶的驱动力包括氢键、π-π堆积、亲疏水相互作用、静电相互作用等非共价相互作用。当外界刺激(如pH变化、环境温度、磁信号)发生变化时，超分子凝胶能够快速且自发地对外界刺激做出响应，由于这些非共价相互作用具有可逆性，所以超分子凝胶对外界刺激的响应变化通常都是可逆的。而且，生物体中的凝胶体系多由弱相互作用构成，所以与聚合物凝胶相比，超分子凝胶的结构更接近于生物体，具有更好的生物相容性，因而被广泛用于生物医用材料、生物传感器等领域。但是，鲜有超分子凝胶制剂应用于低温长期保存胰岛细胞的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种温敏凝胶制剂及低温长期保存胰岛细胞的方法。

本发明所采取的技术方案如下：本发明提供一种温敏凝胶制剂，包括以下质量份数的组分：

肺脱细胞基质 20~50份；

芦荟提取物 5~50份；

明胶 30~50份；

胆红素 1~10份；

还包括溶解液，所述肺脱细胞基质在制剂中的含量为20~50 mg/ml。

所述芦荟提取物由以下方法制备得到：将新鲜芦荟叶洗净、去皮、灭菌，放入细胞破碎机粉碎，加入果胶酶（优选2%）进行酶解（在37°C恒温水浴搅拌30分钟），加入活性炭进行吸附（搅拌30分钟），冷冻离心过滤得到澄清液体后，冷冻干燥得到的干燥粉末为所述芦荟提取物。

细胞外基质是组织中除细胞外的所有成分，包括均质状态的基质（蛋白多糖和糖蛋白）和细丝状的胶原纤维，具有连接和支持细胞的作用，还是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。脱细胞基质是将同种异体组织经过脱细胞工艺处理后，去除能够引起免疫排斥反应的抗原成分，同时完整地保留细胞外基质的三维空间结构及一些对细胞分化有重要作用的生长因子，如成纤维细胞生长因子2、转化生长因子β、血管内皮生长因子等。芦荟提取物对细胞组织具有较好的保护作用，且对受损的细胞具有复活再生作用，可修复胃溃疡、口腔溃疡的创面组织，迅速促进细胞再生。胆红素是一种衰老红细胞分泌出来的血红蛋白，具有抗氧剂以及有效的过氧化氢基清除剂的功能,保护细胞膜脂质免于这些活性基的氧化作用。

优选地，所述温敏凝胶制剂包括以下质量份数的组分：

肺脱细胞基质 40份；

芦荟提取物 20份；

明胶 35份；

胆红素 10份；

还包括溶解液，所述肺脱细胞基质在制剂中的含量为40 mg/ml。

优选地，所述溶解液为复方电解质注射液或氨基酸注射液或生理盐水注射液。

本发明还提供一种通过上述的温敏凝胶制剂低温长期保存胰岛细胞的方法。

所述胰岛细胞加入到所述温敏凝胶制剂，于2-6℃保存。

每毫升温敏凝胶制剂中含有0.5×10⁵～2×10⁷个胰岛细胞。

肺脱细胞基质可以来源于与胰岛细胞同种动物，也可以来源于异种动物，可以包括鼠、兔、狗。

本发明的有益效果如下：在现有配方含有明胶作为基础凝胶成分的基础上，本发明的凝胶制剂的组成上增加了脱细胞基质、芦荟提取物和胆红素，基于肺脱细胞基质、芦荟提取物、明胶凝胶因子在低温自组装形成超分子凝胶，可低温长期保存胰岛细胞，维持胰岛细胞的活性，生物相容性好，且便于运输，方便实用，解冻后可以直接用于体内的胰岛细胞移植。

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

按照表1的低温保存小鼠胰岛细胞的凝胶制剂各实施例和对比例的组成，称取各组分，将各组分分散溶解至复方电解质注射液或氨基酸注射液或生理盐水注射液，搅拌均匀后，冷冻干燥除去水分，γ-射线辐照灭菌后，密闭保存，用前加入小鼠胰岛细胞混悬液即可。

注：对比例1-5中“/”代表该组分为0。对比例5：以肝脱细胞基质代替肺脱细胞基质，其组分含量为40 mg/ml。对比例6：以灵芝提取物代替芦荟提取物，其组分含量为20 mg/ml。对比例7：以瓜尔多胶代替明胶，其组分含量为40 mg/ml。对比例8：以胆绿素代替胆红素，其组分含量为4 mg/ml。

将以上各组细胞保存凝胶分别在低温保存7天和30天后复苏。复苏后培养1天，胰岛细胞计数计算细胞回收率，然后用Annexin V-PI染色，通过FACSCalibur flowcytometer观察细胞发生凋亡的情况。实验结果(表2)表明，实施例凝胶制剂中的细胞存活率大大高于各对比例的细胞存活率，表明本发明用于凝胶制剂适用于小鼠胰岛细胞的低温保存。

将以上各组凝胶制剂中低温保存的小鼠胰岛细胞低温保存7天后复苏。复苏后培养一天检测小鼠胰岛细胞的胰岛素释放能力。实验结果显示本发明的低温保存小鼠胰岛细胞的凝胶制剂可显著维持小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌功能（糖刺激指数＞1.8），而各对比例中的小鼠胰岛细胞的功能受损。该结果表明使用本发明的凝胶制剂能较好的保护小鼠胰岛细胞的功能。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种温敏凝胶制剂，其特征在于包括以下质量份数的组分：

肺脱细胞基质 20~50份；

芦荟提取物 5~50份；

明胶 30~50份；

胆红素 1~10份；

还包括溶解液，所述肺脱细胞基质在制剂中的含量为20~50 mg/ml。

2.根据权利要求1所述的温敏凝胶制剂，其特征在于：包括以下质量份数的组分：

肺脱细胞基质 40份；

芦荟提取物 20份；

明胶 35份；

胆红素 10份；

还包括溶解液，所述肺脱细胞基质在制剂中的含量为40 mg/ml。

3.根据权利要求1所述的温敏凝胶制剂，其特征在于：所述溶解液为复方电解质注射液或氨基酸注射液或生理盐水注射液。

4.通过权利要求1-3任一项所述的温敏凝胶制剂低温长期保存胰岛细胞的方法。

5.根据权利要求4所述的通过温敏凝胶制剂低温长期保存胰岛细胞的方法，其特征在于：所述胰岛细胞加入到所述温敏凝胶制剂，于2-6℃保存。

6.根据权利要求5所述的通过温敏凝胶制剂低温长期保存胰岛细胞的方法，其特征在于：每毫升温敏凝胶制剂中含有0.5×10⁵～2×10⁷个胰岛细胞。