CN108096186A - 一种肝干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肝干细胞注射液及制备方法。所述注射液由肝干细胞、脐带血干细胞、苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸、黄体酮按照一定的分量比组成。本发明所述的肝干细胞注射液中,肝干细胞和脐带血干细胞相配合,对糖尿病治疗效果更佳;本发明所述的注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性,且无任何毒副成分,安全有效,成本低廉,可直接应用与糖尿病临床注射。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种肝干细胞注射液及其制备方法。
背景技术
在20世纪早期,有学者通过一些实验现象推测成熟的肝脏具有很强的再生能力,因为其中存在着一群可分化为肝细胞和胆管细胞的“祖先”细胞。目前人们对肝干细胞的存在已形成广泛共识,它是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞,可以通过自身对称性和不对称性分裂产生表现型和基因型与自身完全相同的干细胞,也能产生肝脏组织中不同发育阶段和不同分化方向的细胞,如肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞等。随着对其特性的深入了解,它将代替肝细胞移植和肝脏移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源,在肝细胞移植、体外人工肝、基因治疗方面均有着巨大的潜力,目前现有技术中已有利用流产胎儿的肝脏组织培养肝脏干细胞用于治疗糖尿病的先例,病取得了良好的疗效。
由肝干细胞制备的干细胞注射液在临床上可以用于治疗肝硬化或糖尿病等。然而与普通生物制品和药品不同,干细胞注射液的活性物质是细胞,细胞在离体环境中,活性会迅速下降,传统方法用含人血白蛋白的氯化钠注射液对肝干细胞进行保存,在8-24h以内,细胞活性即大幅下降,无法长期保证细胞活性,例如中国专利CN102948413B中公开的肝干细胞保存液,主要由人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和肝素钙组成,将肝干细胞重悬于所述保存液中即形成注射液,细胞保存能力较差。大量研究发现,用含有胎牛血清或细胞培养基的保存液可以解决细胞活性下降的问题,但是细胞接触胎牛血清时会内吞胎牛血清,进而引起细胞某些蛋白表达特性的变化,细胞回输人体后可能引起过敏反应,且血清中含有大量未知成分,不能临床使用。
发明内容
本发明的特征在于在前人研究的基础上,提供了一种肝干细胞注射液,能够长时间维持肝干细胞的活性,以及肝干细胞体外培养方法及专用培养基,达到抑制分化,同时给予适当的营养位置及生长因子以促进增殖的目的。
为实现上述目的,本发明具体技术方案如下:
本发明一方面提供了肝干细胞在治疗糖尿病的注射液中的应用。
本发明另一方面提供了一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,该注射液包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:1-5%的苯甲醇、3-4%的天冬酰胺、3-5%的谷氨酰胺、3-5%的异亮氨酸、3-6%的脯氨酸、0.5-0.9%的透明质酸、3-5%的转铁蛋白、3-5%的黄精多糖、0.3-0.5%的牛磺酸和0.5-1.0%的黄体酮;余量为生理盐水。
本发明所述的肝干细胞注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性,且无任何毒副成分,安全有效,成本低廉。
本发明另一方面还提供了注射液的制备方法,该方法包括如下步骤:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述注射液。
进一步本发明还提供了所述的肝干细胞注射液在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
本发明的有益效果是:本发明所述的肝干细胞注射液,其中肝干细胞和少量脐带血干细胞相配合,对糖尿病的治疗效果更佳;所述注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性,4℃下条件下,可有效期长达3天,且无任何毒副成分,安全有效,成本低廉。
具体实施方式
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含1×107个肝干细胞和1×103个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:2.1%的苯甲醇、3.3%的天冬酰胺、3.4%的谷氨酰胺、4%的异亮氨酸、4.4%的脯氨酸、0.9%的透明质酸、3.7%的转铁蛋白、4%的黄精多糖、0.4%的牛磺酸和0.7%的黄体酮;余量为生理盐水。
实施例2
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含3×105个肝干细胞和1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:1.3%的苯甲醇、3.5%的天冬酰胺、4.6%的谷氨酰胺、4.1%的异亮氨酸、3.4%的脯氨酸、0.7%的透明质酸、4.5%的转铁蛋白、4.1%的黄精多糖、0.5%的牛磺酸和0.8%的黄体酮;余量为生理盐水。
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中含有7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述治疗糖尿病的注射液。
实施例3
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含1×106个肝干细胞和7×103个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:1%的苯甲醇、3.5%的天冬酰胺、4.9%的谷氨酰胺、4.8%的异亮氨酸、3.6%的脯氨酸、0.8%的透明质酸、3.5%的转铁蛋白、3.9%的黄精多糖、0.4%的牛磺酸和1%的黄体酮;余量为生理盐水;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中含有7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述治疗糖尿病的注射液。
实施例4
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含1×106个肝干细胞和7×103个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:4.2%的苯甲醇、3.8%的天冬酰胺、4.6%的谷氨酰胺、4.3%的异亮氨酸、3.6%的脯氨酸、0.6%的透明质酸、4.1%的转铁蛋白、4.8%的黄精多糖、0.5%的牛磺酸和0.7%的黄体酮;余量为生理盐水;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中含有7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述治疗糖尿病的注射液。
实施例5
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含1×106个肝干细胞和7×103个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:2.4%的苯甲醇、3.3%的天冬酰胺、4.4%的谷氨酰胺、3.2%的异亮氨酸、3.4%的脯氨酸、0.9%的透明质酸、3.6%的转铁蛋白、3.2%的黄精多糖、0.5%的牛磺酸和0.7%的黄体酮;余量为生理盐水;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中含有7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述治疗糖尿病的注射液。
实施例6
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含1×106个肝干细胞和7×103个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:3.9%的苯甲醇、3.2%的天冬酰胺、4.1%的谷氨酰胺、4.6%的异亮氨酸、5.2%的脯氨酸、0.9%的透明质酸、4.3%的转铁蛋白、3.3%的黄精多糖、0.3%的牛磺酸和0.9%的黄体酮;余量为生理盐水;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
制备方法:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中含有7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述治疗糖尿病的注射液。
对照实施例
一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,每ml注射混合液含1×107个肝干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:3.7%的苯甲醇、3.1%的天冬酰胺、3.9%的谷氨酰胺、4.9%的异亮氨酸、4%的脯氨酸、0.8%的透明质酸、3%的转铁蛋白、3.2%的黄精多糖、0.4%的牛磺酸和0.6%的黄体酮;余量为生理盐水。
试验1:含有本发明方法获得的肝干细胞注射液在糖尿病动物模型中的应用
1)分组
A组(A1-A6):取实施例1-6所述的肝干细胞注射液;
B组:取对照实施例所述的肝干细胞注射液;
C组:空白组,0.9%的氯化钠溶液。
2)试验方法
将购自北京大学医学部的I型糖尿病鼠模型,随机分组,每组10只。A、B两组在第0天给鼠尾静脉注射1ml注射液(内含1×107个肝干细胞),第7天和第14天以相同剂量再次注射;C组于相同时间点在尾静脉注射同体积生理盐水并计算鼠模型血糖大小。分别于最后一次注射后的第7天、第14天、第21天和第28天监测鼠模型空腹血糖水平,结果如下表1所示。
表1I型糖尿病鼠治疗前后的血糖水平比较
从表1可已看出,与C组相比可看出,A组和B组均对I型糖尿病鼠模型具有良好的治疗效果,说明肝干细胞在治疗糖尿病方便有着较好的疗效。与B组相比,A组疗效更佳,说明本发明所述的用于治疗糖尿病的肝干细胞注射液中肝干细胞与脐带血干细胞相配合,对糖尿病的治疗效果更佳;经试验,本发明所述的肝干细胞注射液静脉注射小鼠未引起急性毒理及排斥反应。
试验2:注射液中肝干细胞活率检测
1)分组
试验组:取实施例1、2和6所述的肝干细胞注射液;
对照组:中国专利CN102948413B制成的肝干细胞重悬液。
2)试验方法
取试验组和对照组的肝干细胞注射液,检测在4℃下保存24h,48h,72h的细胞活率;并将本发明所述的注射液冻存1年后,在37℃水浴复苏,测试细胞活率;检测方法为台盼蓝经典染色法,检测结果见表2。
表2肝干细胞注射液中肝干细胞的活率检测结果
由表2可以看出,本发明所述的肝干细胞注射液和对照组在0h时,细胞活率相差不大,但对照组在4℃下保存24h后降低到接近国家最低标准,48h后细胞活率已经不能达到国家的86%标准;而本发明所述的肝干细胞注射液在4℃下条件下,可有效期长达3天,大大方便临床使用;另外本发明所述肝干细胞注射液无常用细胞冻存液DMSO,毒性小,但在冻存条件下也可以较好的保持肝干细胞的生命力,长时间保持细胞高存活率,各组间无差异。
结论
由上述试验可知,本发明所述的肝干细胞注射液可有效保持肝干细胞活性,4℃下条件下,可有效期长达3天,且在冻存条件下也可以较好的保持肝干细胞的生命力,长时间保持细胞高存活率,大大方便临床使用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.肝干细胞在制备治疗糖尿病的注射液中的应用。
2.一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:1-5%的苯甲醇、3-4%的天冬酰胺、3-5%的谷氨酰胺、3-5%的异亮氨酸、3-6%的脯氨酸、0.5-0.9%的透明质酸、3-5%的转铁蛋白、3-5%的黄精多糖、0.3-0.5%的牛磺酸和0.5-1.0%的黄体酮;余量为生理盐水。
3.根据权利要求2所述的治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:2.1%的苯甲醇、3.3%的天冬酰胺、3.4%的谷氨酰胺、4%的异亮氨酸、4.4%的脯氨酸、0.9%的透明质酸、3.7%的转铁蛋白、4%的黄精多糖、0.4%的牛磺酸和0.7%的黄体酮。
4.根据权利要求2所述的治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:1.3%的苯甲醇、3.5%的天冬酰胺、4.6%的谷氨酰胺、4.1%的异亮氨酸、3.4%的脯氨酸、0.7%的透明质酸、4.5%的转铁蛋白、4.1%的黄精多糖、0.5%的牛磺酸和0.8%的黄体酮。
5.根据权利要求2所述的治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:1%的苯甲醇、3.5%的天冬酰胺、4.9%的谷氨酰胺、4.8%的异亮氨酸、3.6%的脯氨酸、0.8%的透明质酸、3.5%的转铁蛋白、3.9%的黄精多糖、0.4%的牛磺酸和1%的黄体酮。
6.根据权利要求2所述的治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:4.2%的苯甲醇、3.8%的天冬酰胺、4.6%的谷氨酰胺、4.3%的异亮氨酸、3.6%的脯氨酸、0.6%的透明质酸、4.1%的转铁蛋白、4.8%的黄精多糖、0.5%的牛磺酸和0.7%的黄体酮。
7.根据权利要求2所述的治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:2.4%的苯甲醇、3.3%的天冬酰胺、4.4%的谷氨酰胺、3.2%的异亮氨酸、3.4%的脯氨酸、0.9%的透明质酸、3.6%的转铁蛋白、3.2%的黄精多糖、0.5%的牛磺酸和0.7%的黄体酮。
8.根据权利要求2所述的治疗糖尿病的肝干细胞注射液,其特征在于,包括肝干细胞、脐带血干细胞和注射混合液;每ml注射混合液含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞;所述注射混合液由以下质量百分比成分组成:3.9%的苯甲醇、3.2%的天冬酰胺、4.1%的谷氨酰胺、4.6%的异亮氨酸、5.2%的脯氨酸、0.9%的透明质酸、4.3%的转铁蛋白、3.3%的黄精多糖、0.3%的牛磺酸和0.9%的黄体酮。
9.一种权利要求2-8任一所述肝干细胞注射液的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
1)肝干细胞的培养;
2)脐带血干细胞的培养;
3)将苯甲醇、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、透明质酸、转铁蛋白、黄精多糖、牛磺酸和黄体酮溶于生理盐水中配制成复方溶液,4℃预冷备用;
4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带血干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中,制成单细胞悬液,使每毫升注射液中含7×105-5×106个肝干细胞和2×103-1×104个脐带血干细胞,得到所述注射液。
10.一种权利要求2所述的肝干细胞注射液在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
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