CN112753694A

CN112753694A - 一种细胞冻存液和用于间充质干细胞的冷冻方法及其应用

Info

Publication number: CN112753694A
Application number: CN202011562542.XA
Authority: CN
Inventors: 王云娟; 闫占海
Original assignee: Eyecure Therapeutics Inc
Current assignee: Eyecure Therapeutics Inc
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-05-07

Abstract

本发明提供一种细胞冻存液，按体积百分数计，细胞冻存液包括以下组分：二甲基亚砜溶液1%～10%，羟乙基淀粉氯化钠溶液1%～10%，人血白蛋白溶液5%～20%，葡萄糖溶液2%～20%，右旋糖酐40氯化钠溶液5%～20%，非必须氨基酸溶液0.1～1%，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100%。本发明的细胞冻存液组成成分简单、配制方便，多采用药用级辅料，能满足细胞治疗药品申报的要求，细胞冻存液冻存效果良好，冻存的细胞，复苏活率能稳定保持在90%以上，复苏后细胞的回收率90%以上，冻存效果良好，为细胞治疗的成药提供了保证。

Description

一种细胞冻存液和用于间充质干细胞的冷冻方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其用于间充质干细胞的冻存方法。

背景技术

干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能，已经被广泛应用于科学研究和临床治疗，干细胞中的间充质干细胞已经被广泛用于动物疾病模型的治疗研究和人体临床实验，间充质干细胞可治疗的疾病包括糖尿病、肝硬化、皮肤损伤、心肌梗死、干眼病以及神损伤等疾病，除此之外，间充质干细胞还具有促进造血和进行免疫调节等功能，目前在世界范围内已经有干细胞药物产品上市。

细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法，在生物学领域已有深入广泛的应用，因为正常情况下，直接冷冻细胞会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡，因此在细胞冷冻保存时需要添加一定比例的冻存液，以保持冷冻复苏后细胞的完整性和最大限度减小对细胞的损伤，但不可避免的是，细胞在冷冻保存过程中会存在活性的降低和细胞损伤。

目前，关于细胞冻存液的专利技术很多，但各自有各自的技术特点，最常用的冻存液通常为胎牛血清(FBS)中添加10％二甲基亚砜(DMSO)溶液，DMSO可以减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，可以很好地在细胞冻存过程中保护细胞，但使用FBS具有动物源病毒及细胞因子等造成安全隐患，不利于细胞制品规模化及产业化，从而限制了该技术的进一步提升。也有采用人血小板裂解液(HPL)替代传统的FBS成为无动物源的细胞冻存液，但这类细胞冻存液的长期冻存效果不佳，同时，不同批次的人血小板裂解液(HPL)有差异从而导致冻存细胞的质量不稳定。有的专利技术是基于可以直接用于人体输注，这类冻存液专利所使用的成分相对比较单一，一般是将少量的DMSO和白蛋白加入缓冲盐溶液，这类冻存液配方简单，但冻存效果不理想，活率很难稳定的保持在90％以上，回收率和贴壁率则更差，而且冻存过程要求比较苛刻，需要为其开发特定的冻存程序；有的专利技术为了提高冻存效果会加入一些小分子物质，如胰岛素、肝素、VEGF、HGF等，这些小分子的加入虽然有可能提高细胞冻存效果，但这些小分子类物质的加入增加了细胞应用于人体的风险，特别是激素类物质。因此，对于临床治疗的细胞需要开发冻存效果极佳的冻存液以及特定的冻存方法，以利用细胞制品的进一步产业化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种细胞冻存液及其用于间充质干细胞的冻存方法，该冻存液组成成分简单，配制方便，冻存效果好，易于产业化制备，冻存液用于间充质干细胞的特定的冻存方法，冻存的细胞复苏活率能稳定保持在90％以上，复苏后细胞的回收率可达90％以上。

本发明采用的技术方案是：

一种细胞冻存液，其中，按体积百分数计，所述细胞冻存液包括以下组分：

二甲基亚砜溶液1％～10％，羟乙基淀粉氯化钠溶液1％～10％，人血白蛋白溶液5％～20％，葡萄糖溶液2％～20％，右旋糖酐40氯化钠溶液5％～20％，非必须氨基酸溶液0.1～1％，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100％。

二甲基亚砜溶液中二甲基亚砜的质量浓度为＞99％，羟乙基淀粉氯化钠溶液中羟乙基淀粉的质量浓度为6％；人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量浓度为20％；葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度为10％；右旋糖酐40氯化钠溶液中右旋糖酐40的质量浓度为6％，非必需氨基酸溶液浓度为100％。

优选的是，所述的细胞冻存液，其中，所述Hank's平衡盐溶液包括CaCl₂ 140mg/L，MgCl₂·6H₂O 100mg/L，MgSO₄·7H₂O 100mg/L，NaHCO₃ 350mg/L，D-葡萄糖1000mg/L。

优选的是，所述的细胞冻存液，其中，所述Hank's平衡盐溶液PH值为7.2～7.4。

优选的是，所述的细胞冻存液，其中，按体积百分数计，所述细胞冻存液包括以下组分：二甲基亚砜溶液5％～8％，羟乙基淀粉氯化钠溶液5％～8％，人血白蛋白溶液10％～15％，葡萄糖溶液5％～10％，右旋糖酐40氯化钠溶液5％～10％，非必须氨基酸溶液0.5～1％，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100％。

优选的是，所述的细胞冻存液，其中，所述二甲基亚砜溶液中二甲基亚砜的质量浓度为＞99％，羟乙基淀粉氯化钠溶液中羟乙基淀粉的质量浓度为6％，人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量浓度为20％，葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度为10％，右旋糖酐40氯化钠溶液中右旋糖酐40的质量浓度为6％，非必需氨基酸溶液浓度为100×溶液。

一种细胞冻存液用于间充质干细胞的冷冻方法，其中，包括以下步骤：

S1、按照权利要求1的各组分配比配制细胞冻存液；

S2、取贴壁培养融合完全的间充质干细胞，消化、离心收集细胞；

S3、弃去离心上清，将步骤S1的细胞冻存液重悬细胞并调整细胞密度至(2～6)×10⁶/ml，将细胞分装于冻存管中冻存；

S4、采用程序降温仪间充质干细胞冻存程序将细胞降温至-90.0℃，后转移并长期存储于液氮中。

优选的是，所述的细胞冻存液用于间充质干细胞的冷冻方法，其中，所述步骤S4的程序降温仪间充质干细胞冻存程序具体为:

4.0℃维持5min；

以1.0℃/min降温至﹣4.0℃；

以25.0℃/min迅速降温至﹣40.0℃；

以10.0℃/min升温至﹣12.0℃；

以1.0℃/min降温至﹣40.0℃；

以10.0℃/min降温至﹣90.0℃；

结束。

一种细胞冻存液在制备细胞制剂中的应用。

一种细胞冻存液在制备细胞制剂中的应用，其中，所述细胞制剂包括细胞冻存液和间充质干细胞，所述间充质干细胞的密度为(2～6)×10⁶个/mL。

一种细胞冻存液在制备间充质干细胞药物中的应用，间充质干细胞相关疾病选自干眼症、免疫系统疾病。

本发明的优点在于：本发明的细胞冻存液是一种既可用于常规冻存又可用于程序降温仪的间充质干细胞冻存液，能满足用户自由选择使用方式；细胞冻存液组成成分简单、配制方便，多采用药用级辅料，能满足细胞治疗药品申报的要求；细胞冻存液是一种无血清冻存液，不含FBS和HPL等成分，各种组成成分稳定，批次之间的差异很小；细胞冻存液配方中不含可能影响细胞临床使用的小分子物质，特别是激素类；细胞冻存液冻存效果良好，冻存的细胞，复苏活率能稳定保持在90％以上，复苏后细胞的回收率90％以上，冻存效果良好，为细胞治疗的成药提供了保证。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.按表1溶液体积分数配制冻存液，其中

二甲基亚砜溶液中二甲基亚砜的质量百分数为＞99％，羟乙基淀粉氯化钠溶液中羟乙基淀粉的质量百分数为6％，人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量百分数为20％，葡萄糖溶液中葡萄糖的质量百分数为10％，右旋糖酐40氯化钠溶液中右旋糖酐40的质量百分数为6％，非必需氨基酸溶液为100×溶液。

Hank's平衡盐溶液(含钙镁)中，CaCl₂(无水)含量为140mg/L，MgCl₂·6H₂O含量为100mg/L，MgSO₄·7H₂O含量为100mg/L，NaHCO₃含量为350mg/L，D-葡萄糖含量为1000mg/L，PH值为7.2～7.4。

表1冻存液成分组成表

2.对照培养基：

表2对照冻存液配方表

对照	配方
		对照1	10％DMSO+90％FBS
对照2	10％DMSO+90％HPL

实施例2间充质干细胞的冻存方法

1.间充质干细胞的获取

复苏P2代MSC细胞，使用MSC完全培养基，T225培养瓶培养，接种密度为8000-12000/cm²，培养时间为3～4天，扩培至P4代，待细胞融合完全，弃去培养上清液，用HBSS溶液清洗后，用Tryple select 5ml消化3～5min后，用2倍体积的HBSS中和，以450g，离心5min，收集MSC细胞。

2.间充质干细胞的分装冻存

按表1中冻存液NO.1～NO.9进行冻存，以表2中冻存液做对照，细胞冻存密度梯度分别是2×10⁶细胞/ml/支、4×10⁶细胞/ml/支、6×10⁶细胞/ml/支，每种冻存液每密度梯度至少冻存3支，使用程序降温仪进行冻存。

3.采用的程序降温仪降温程序为：

4.0℃维持5分钟；

以1.0℃/分钟降温至﹣4.0℃；

以25.0℃/分钟迅速降温至﹣40.0℃；

以10.0℃/分钟升温至﹣12.0℃；

以1.0℃/分钟降温至﹣40.0℃；

以10.0℃/分钟降温至﹣90.0℃；

结束。

4.细胞复苏检测

细胞冻存数天后，每冻存液每梯度各取2支冻存的细胞复苏后进行活率，回收率以及细胞贴壁率的检测，细胞复苏后按照活细胞50万/孔接种至六孔板，培养16～20h后消化细胞统计贴壁率，比较不同冻存液冻存效果。

5.实验结果

表3冻存液间对MSC冻存效果的影响

由表3的实验结果可知，本发明的冻存液冻存效果良好，冻存的细胞复苏活率能稳定保持在90％以上，复苏后细胞的回收率在90％以上，冻存效果良好，为细胞治疗的成药提供了保证。

本发明的细胞冻存液是一种既可用于常规冻存又可用于程序降温仪的间充质干细胞冻存液，能满足用户自由选择使用方式；细胞冻存液组成成分简单、配制方便，多采用药用级辅料，能满足细胞治疗药品申报的要求；细胞冻存液是一种无血清冻存液，不含FBS和HPL等成分，各种组成成分稳定，批次之间的差异很小；细胞冻存液配方中不含可能影响细胞临床使用的小分子物质，特别是激素类；细胞冻存液冻存效果良好，冻存的细胞，复苏活率能稳定保持在90％以上，复苏后细胞的回收率90％以上，冻存效果良好，为细胞治疗的成药提供了保证。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种细胞冻存液，其特征在于，按体积百分数计，所述细胞冻存液包括以下组分：

二甲基亚砜溶液 1%～10%，羟乙基淀粉氯化钠溶液 1%～10%，人血白蛋白溶液5%～20%，葡萄糖溶液 2%～20%，右旋糖酐40氯化钠溶液5%～20%，非必须氨基酸溶液 0.1～1%，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100%。

2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述Hank's平衡盐溶液包括CaCl₂140mg/L，MgCl₂•6H₂O 100mg/L，MgSO₄•7H₂O 100mg/L，NaHCO₃ 350mg/L，D-葡萄糖1000mg/L。

3.如权利要求2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述Hank's平衡盐溶液PH值为7.2~7.4。

4.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，按体积百分数计，所述细胞冻存液包括以下组分：二甲基亚砜溶液 5%～8%，羟乙基淀粉氯化钠溶液 5%～8%，人血白蛋白溶液10%～15%，葡萄糖溶液5%～10%，右旋糖酐40氯化钠溶液5%～10%，非必须氨基酸溶液 0.5～1%，剩余为Hank's平衡盐溶液，以上总和为100%。

5.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜溶液中二甲基亚砜的质量浓度＞99%，羟乙基淀粉氯化钠溶液中羟乙基淀粉的质量浓度为6%，人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量浓度为20%，葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度为10%，右旋糖酐40氯化钠溶液中右旋糖酐40的质量浓度为6%，非必需氨基酸溶液浓度为100×溶液。

6.一种细胞冻存液用于间充质干细胞的冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、按照权利要求1的各组分配比配制细胞冻存液；

S3、弃去离心上清，将步骤S1的细胞冻存液重悬细胞并调整细胞密度至（2~6）×10⁶/ml，将细胞分装于冻存管中冻存；

7.如权利要求6所述的细胞冻存液用于间充质干细胞的冷冻方法，其特征在于，所述步骤S4的程序降温仪间充质干细胞冻存程序具体为:

4.0℃维持5min；

以1.0℃/min降温至﹣4.0℃；

以25.0℃/min迅速降温至﹣40.0℃；

以10.0℃/min升温至﹣12.0℃；

以1.0℃/min降温至﹣40.0℃；

以10.0℃/min降温至﹣90.0℃；

结束。

8.一种如权利要求1-4任一项所述的细胞冻存液在制备细胞制剂中的应用。

9.一种如权利要求1-4任一项所述的细胞冻存液在制备细胞制剂中的应用，其特征在于，所述细胞制剂包括权利要求1-4任一项所述细胞冻存液和间充质干细胞，所述间充质干细胞的密度（2~6）×10⁶个/mL。

10.一种如权利要求1-4任一项所述的细胞冻存液在制备间充质干细胞药物中的应用。