CN115956557A - 间充质干细胞液氮冻存保护液及其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞生物制品冻存工艺保护剂，具体涉及间充质干细胞液氮冻存保护液及其制备方法和使用方法。一种间充质干细胞液氮冻存保护液，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料包括人血白蛋白10%~50%、二甲基亚砜2%~5%、右旋糖酐注射液20%~90%；所述冻存保护液冻存后的间充质干细胞经21‑42℃复苏后的细胞活率不低于85%。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物制品冻存工艺保护剂，具体涉及间充质干细胞液氮冻存保护液及其制备方法和使用方法。
背景技术
人间充质干细胞具有很好的免疫调节特性与损伤组织修复能力，是一类最具临床应用潜能的多能干细胞，人间充质干细胞已被作为主要细胞原料，用于重点研发干细胞1类生物制品药物。由于间充质干细胞的生物学特性，如何使间充质干细胞由医疗治疗技术转变为真正的生物药，使间充质干细胞具备长期货架储存和使用便捷的药品属性，是间充质干细胞生物制品工艺开发的重点和难点。
目前，间充质干细胞药物工艺中虽具备冻存技术与冻存保护液产品，但临床使用时，需对细胞产品复苏后，在洁净条件下进行再次清洗、离心、重悬制剂，后才能临床进行静脉输注使用。由于目前间充质干细胞药物工艺要求在临床使用端前设洁净控制操作，不仅增大了间充质干细胞药物被污染的可能性，还增大了批次制剂质量偏差风险控制成本与难度，且在临床使用前的有效期限短，保存条件苛刻。
因此，本申请亟需研发一种间充质干细胞液氮冻存保护液，复苏后无需清洗去除冻存液成分。
发明内容
为了无需清洗去除冻存液成分，本申请提供一种间充质干细胞液氮冻存保护液及其制备方法和使用方法。
第一方面，本申请提供一种间充质干细胞液氮冻存保护液，采用如下技术方案实现：一种间充质干细胞液氮冻存保护液，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料包括人血白蛋白10％～50％、二甲基亚砜2％～5％、右旋糖酐注射液20％～90％；所述冻存保护液冻存后的间充质干细胞经21-42℃复苏后的细胞活率不低于85％。
通过采用上述技术方案，本申请提供的间充质干细胞液氮冻存保护液的成分简单，各组分都为药物成分或药规级产品，能用于冻存骨髓、脂肪、脐带等多种组织来源人脐带间充质干细胞，且在-135℃超低温液氮条件下长期保存，经复苏后细胞活率不低于85％，关键功能分子mRNA及蛋白水平都符合质量标准。同时，本申请提供的间充质干细胞液氮冻存保护液作为制剂溶媒，间充质干细胞液氮冻存保护液与0.9wt％生理盐水注射液稀释配伍后，满足注射液渗透压控制标准，可满足临床静脉注射使用要求，无需进行离心洗涤，对细胞的损伤小，且无再次清洗操作时引入的污染风险，提高了间充质干细胞生物制品批次间的质量稳定性和间充质干细胞生物制品的活性。
本申请中，所述人血白蛋白是指人血白蛋白的含量为20g/100mL的人血白蛋白静脉输注溶液，人血白蛋白静脉输注溶液的成份包括：人血白蛋白20g/100mL、N-乙酰色氨酸钠16mmol/L、锌酸钠16mmol/L、氯化钠140mmol/L以及注射用水。
本申请中，所述右旋糖酐注射液为右旋糖酐40氯化钠注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、右旋糖酐70氯化钠注射液、右旋糖酐70葡萄糖注射液中的一种或多种；优选的，所述右旋糖酐注射液为右旋糖酐40氯化钠注射液。
本申请中，所述右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐40的含量为6g/100mL或10g/100mL；优选的，所述右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐40的含量为10g/100mL。
本申请中，所述二甲基亚砜的体积百分比控制在2-5％，浓度较低，远低于临床安全警戒线。
优选的，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料由人血白蛋白10％～50％、二甲基亚砜2.5％～5％、右旋糖酐注射液45％～87.5％组成。
优选的，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括醋酸钠林格注射液5％～48％。
本申请中，所述醋酸钠林格注射液的成份包括：氯化钠3g/500mL、醋酸钠(三水合物)1.9g/500mL、氯化钾0.15g/500mL、氯化钙(二水合物)0.1g/500mL，辅料为稀盐酸、注射用水。
醋酸钠林格注射液的加入可以调节冻存保护液的pH，使冻存保护液的pH值在中性值阈值，有利于提高间充质干细胞生物制品批次间的质量稳定性和间充质干细胞生物制品的活性。
醋酸钠林格注射液的加入可以减少二甲基亚砜的加入量，使二甲基亚砜的体积百分比不高于2.5％，减少了细胞损伤程度，降低了对细胞潜在的毒性作用。且间充质干细胞液氮冻存保护液与0.9wt％生理盐水注射液稀释配伍后，渗透压接近或在280-330mOsmol/kg标准范围内，可直接进行静脉输注使用，操作方便，无需清洗去除成分。
优选的，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括氨基酸注射液1％～2％。
氨基酸注射液的加入不仅给间充质干细胞提供营养，且氨基酸注射液与醋酸钠林格注射液共同作用，更好的调节间充质干细胞代谢的酸碱失衡，保持细胞活力，提高了细胞的保存时间；同时，氨基酸注射液和人血白蛋白共同作用，提高了冻存保护液中右旋糖酐的稳定性，有利于降低间充质干细胞在液氮冻存时的损伤，从而提高了间充质干细胞复苏后的存活率。
优选的，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括0.1wt％羧甲基壳聚糖水溶液0.2％～0.5％。
羧甲基壳聚糖水溶液的加入，不仅可以提高冻存保护液的抑菌作用，羧甲基壳聚糖水溶液和氨基酸注射液共同作用，还能提高冻存保护液中右旋糖酐的稳定性，有利于降低间充质干细胞在液氮冻存时的损伤，从而提高了间充质干细胞复苏后的存活率。但本申请人在研究过程中发现，羧甲基壳聚糖水溶液的体积百分比不能太高，否则会影响冻存保护液的渗透压，且羧甲基壳聚糖水溶液的质量分数也不宜过高。
优选的，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括0.5wt％谷氨酰胺水溶液0.5％～1％。
谷氨酰胺水溶液的加入，不仅给间充质干细胞提供营养，谷氨酰胺水溶液、氨基酸注射液和羧甲基壳聚糖水溶液共同作用，还能提高冻存保护液中右旋糖酐的稳定性，有利于降低间充质干细胞在液氮冻存时的损伤，从而提高了间充质干细胞复苏后的存活率。
优选的，所述间充质干细胞的细胞浓度为1×104cells/mL～3×107cells/mL；所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人宫血间充质干细胞中的一种或多种。
本申请间充质干细胞液氮冻存保护液适用性广，人脐带间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人宫血间充质干细胞在-135℃下冻存后再经21-42℃温度自然解冻或水浴复苏时长超过5小时，细胞活率仍可保持在85％以上。
优选的，所述复苏采用空气或者水浴，所述复苏的时间不低于5h。
第二方面，本申请提供一种间充质干细胞液氮冻存保护液的制备方法，采用如下技术方案实现：
一种间充质干细胞液氮冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
向二甲基亚砜中加入预冷的右旋糖酐注射液，混匀后加入预冷的人血白蛋白，混匀，2℃～8℃保存，得冻存保护液；所述预冷的温度为2℃～8℃。
第三方面，本申请提供一种间充质干细胞液氮冻存保护液用于静脉输注的使用方法，采用如下技术方案实现：
一种间充质干细胞液氮冻存保护液用于静脉输注的使用方法，包括如下步骤：
将间充质干细胞液氮冻存保护液与0.9wt％生理盐水按体积比1:9进行配伍稀释，得稀释液；所述稀释液的渗透压符合临床静脉注射液渗透压的控制标准。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请提供的间充质干细胞液氮冻存保护液的成分简单，各组分都为药物成分或药规级产品，能用于冻存骨髓、脂肪、脐带等多种组织来源人脐带间充质干细胞，且在-135℃超低温液氮条件下长期保存，经复苏后细胞活率不低于85％。
2、本申请提供的间充质干细胞液氮冻存保护液，可以作为制剂溶媒，间充质干细胞液氮冻存保护液与0.9wt％生理盐水注射液稀释配伍后，满足注射液渗透压控制标准，可满足临床静脉注射使用要求。
3、本申请提供的间充质干细胞液氮冻存保护液，提高了间充质干细胞生物制品批次间的质量稳定性和间充质干细胞生物制品的活性。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请中，冻存保护液各制备原料的来源，没有特别的限制，市售均适用于本申请。
如，人血白蛋白，人血白蛋白的含量为20g/100mL的人血白蛋白静脉输注溶液，来源于山东泰邦生物制品有限公司或杰特贝林生物制品有限公司；
二甲基亚砜为临床级二甲基亚砜，来源于德国WAK CHEMIE公司或OriGenBioMedical公司；
右旋糖酐40氯化钠注射液，右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐40的含量为6g/100mL，来源于四川科伦药业股份有限公司或山东齐都药业有限公司；
右旋糖酐40氯化钠注射液，右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐40的含量为10g/100mL，来源于四川科伦药业股份有限公司或吉林省都邦药业股份有限公司；
醋酸钠林格注射液，来源于湖南康源制药有限公司或者湖南科伦制药有限公司；
氨基酸注射液18AA-II，来源于辰欣药业股份有限公司；
羧甲基壳聚糖，药用级，来源于山西锦洋药用辅料有限公司；
谷氨酰胺，医药级L-谷氨酰胺，来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
制备例
制备例1提供了一种0.1wt％羧甲基壳聚糖水溶液，其制备步骤为：称取0.1g羧甲基壳聚糖，加入99.9g注射用水，搅拌均匀，得0.1wt％羧甲基壳聚糖水溶液。
制备例2提供了一种0.5wt％谷氨酰胺水溶液，其制备步骤为：称取0.5g谷氨酰胺，加入99.5g注射用水，搅拌均匀，得0.5wt％谷氨酰胺水溶液。
实施例
实施例1-17提供了一种间充质干细胞液氮冻存保护液，以下以实施例1为例进行说明。
实施例1提供的间充质干细胞液氮冻存保护液，其制备步骤为：
S1、将右旋糖酐40的含量为10g/100mL的右旋糖酐40氯化钠注射液和人血白蛋白的含量为20g/100mL的人血白蛋白静脉输注溶液，置于2～8℃预冷30min，备用；
S2、吸取5mL二甲基亚砜，加至配液容器中，向其中缓慢加入45mL预冷的右旋糖酐40氯化钠注射液，混匀，然后再缓慢加入50mL预冷的人血白蛋白，混匀，2-8℃的医用冷藏箱中保存，得冻存保护液。
实施例2-17，与实施例1不同之处仅在于：冻存保护液各制备原料的体积不同，具体见表1。
表1实施例1-17冻存保护液各制备原料的体积/mL
1.渗透压：将人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞加入冻存保护液中(各细胞浓度见表2)，得细胞制剂原液，测试细胞制剂原液的渗透压，原液的渗透压的测试结果见表3；同时将细胞制剂原液与0.9％生理盐水按体积比1:9进行配伍稀释，得细胞制剂稀释液，稀释液的渗透压见表3。
表2细胞浓度
由表2可知，本申请提供的冻存保护液对应细胞浓度高，细胞浓度为0.4×107cells/mL～2.3×107cells/mL，可满足骨髓、脂肪，脐带等多种组织来源人脐带间充质干细胞制剂冻存使用。
表3原液以及稀释液的渗透压
由表3可知，本申请提供的冻存保护液对应的细胞制剂原液，以及细胞制剂原液经与0.9％生理盐水注射液稀释配伍后的细胞制剂稀释液，可满足注射液渗透压的控制标准，可以直接使用，无需进行离心洗涤，减少了对细胞的损伤，也减少了再次清洗操作所引入的污染风险，提高了间充质干细胞生物制品批次间的质量稳定性和间充质干细胞生物制品的活性。
2.将人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞加入冻存保护液中，检测冻存前细胞存活率，使用程控降温仪冻存降温至-80℃，后转移至气象液氮冻存管中保存12个月，液氮冻存后使用37℃水浴复苏8h，检测复苏后的细胞存活率以及复苏后细胞制剂的pH，其中，细胞存活率的检测结果见表4，pH的检测结果见表5。
表4冻存前后的细胞存活率
表5冻存后的细胞制剂的pH
由表5可知，本申请提供的冻存保护液将人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞在-135℃超低温液氮保存12个月后，经复苏后的细胞制剂的pH在7左右。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料包括人血白蛋白10%~50%、二甲基亚砜2%~5%、右旋糖酐注射液20%~90%；所述冻存保护液冻存后的间充质干细胞经21-42℃复苏后的细胞活率不低于85%。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料由人血白蛋白10%~50%、二甲基亚砜2.5%~5%、右旋糖酐注射液45%~87.5%组成。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括醋酸钠林格注射液5%~48%。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括氨基酸注射液1%~2%。
5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括0.1wt%羧甲基壳聚糖水溶液0.2%~0.5%。
6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存保护液的制备原料还包括0.5wt%谷氨酰胺水溶液0.5%~1%。
7.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，所述间充质干细胞的细胞浓度为1×104cells/mL~3×107cells/mL；所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人宫血间充质干细胞中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞液氮冻存保护液，其特征在于，所述复苏采用空气或者水浴，所述复苏的时间不低于5h。
9.一种权利要求1所述的间充质干细胞液氮冻存保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
向二甲基亚砜中加入预冷的右旋糖酐注射液，混匀后加入预冷的人血白蛋白，混匀，2℃~8℃保存，得冻存保护液；所述预冷的温度为2℃~8℃。
10.一种权利要求1所述的间充质干细胞液氮冻存保护液用于静脉输注的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的间充质干细胞液氮冻存保护液与0.9wt%生理盐水按体积比1:9进行配伍稀释，得稀释液；所述稀释液的渗透压符合临床静脉注射液渗透压的控制标准。
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