JP7445611B2 - 凍結保存液 - Google Patents
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Description
本発明は、凍結保存液に関する。また、本発明は、凍結保存液を用いた生体試料の凍結保存方法、生体試料を保存する方法および生体試料の凍結保存剤に関する。
近年の再生医療研究の飛躍的な発展に伴い、ヒトにのみならず獣医分野においても細胞治療などの再生医療が積極的に行われている。生体から採取した骨髄由来間葉系幹細胞や脂肪由来間葉系幹細胞は、採取の後に大量に増やし、上記のような再生医療や再生医療研究に用いられる。この際、余剰に増やした細胞を凍結保存し、適宜使用することが一般的である。また、このような細胞の安定供給に対する需要も高まっている。
細胞の凍結保存メカニズムにおいて、凍結および／または解凍の過程で細胞内に氷結晶が成長すると、細胞膜や細胞内構造が損傷を受けたり、細胞のタンパク質が変性したりして細胞が致命的なダメージを受けてしまうことが知られている。したがって、細胞を凍結保存する際には、細胞内凍結を防ぐことが重要であり、通常、細胞の凍結保存には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、プロピレングリコールなどの低分子化合物が細胞内浸透型の凍結保護試薬として、培養培地などの緩衝液に加えることにより用いられている（特許文献１）。このうち、ＤＭＳＯが最もよく用いられており、細胞や細胞小器官を保護する効果は良好である。しかしながら、細胞内浸透型の凍結保存液では、細胞内に凍結保護試薬である低分子化合物が浸透するため、凍結保護試薬の細胞への影響が懸念されている（非特許文献１）。
そこで、化学物質の代わりに、凍結保護試薬として天然の凍結保護剤を利用する試みも行われている。例えば、二糖、オリゴ糖、または高分子多糖が非浸透型の凍結保護試薬として、培養培地などの緩衝液に加えることが知られている。
また、ハイドロゲルを形成する架橋体内に生体成分を保持させる方法も検討されている。特許文献２には、重量平均分子量が５０００～４００万である原料のヒアルロン酸に、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する側鎖が導入された修飾ヒアルロン酸を原料とした生体成分用保存剤が記載されている。修飾ヒアルロン酸は、ポリビニルアルコールなどの複数の水酸基を有する化合物の水酸基と反応して修飾ヒアルロン酸を架橋した架橋物となり、この寒天状のハイドロゲル中に生体成分が包埋されることにより保存剤として使用されている。特許文献２に記載のハイドロゲルの実際の保存剤としての分子量は数百万以上であると推測される。特許文献２においては、生体成分の保存は約４℃の冷蔵で実施されており保存期間は数日程度である。
また、特許文献３では、ポリアミノ酸のアミノ基が、カルボン酸無水物でカルボキシル化（またはアセチル化）されることによりブロックされているカルボキシル化ポリアミノ酸と有機両性剤とを含む凍結保存組成物が記載されている。
REJUVENATION RESEARCH Volume 18 Number 5 (2015): 422-436, Mary Ann Liebert, Inc.
細胞内浸透型の凍結保護物質は、細胞の脱水を促進させることにより、細胞内に形成される氷晶の形成速度を遅らせ、氷晶形成を阻害する。特にＤＭＳＯは細胞内に浸透しやすく、したがって、哺乳動物細胞などの複雑な構造をもつ細胞の凍結保存に有効であるが、上述の非特許文献１にも記載されているように、ＤＭＳＯのような化学物質は細胞毒性を有している。凍結保護物質の細胞内への浸透が進み細胞内濃度が上昇すると毒性の影響も高まると考えられる。
さらに、ＤＭＳＯは、ＨＬ－６０細胞やＰ１９ＣＬ６細胞（マウス胎生期癌（embryonal carcinoma）細胞由来）などの分化を誘導すること（PNAS March 27, 2001 98 (7) 3826-3831.およびBiochem Biophys Res Commun. 2004 Sep 24;322(3):759-65.）、また、ＥＳ細胞の分化に影響を及ぼすことが報告されている（Cryobiology. 2006 Oct;53(2):194-205.）。したがって、凍結保護試薬としてのＤＭＳＯの使用は、幹細胞における未分化性や機能性の維持が必要である場合の細胞保存には適さないことが考えられる。また、ＤＭＳＯを用いて試料を長期保存する場合、取扱い管理が必要となる液体窒素中または雰囲気下での試料の保存が必要不可欠であり、再生医療や再生医療研究の普及への課題となると考えられる。
一方、糖などの天然凍結保護物質は、細胞に親和的であるが、分子サイズが大きく、細胞内に取り込まれにくい。したがって、細胞外から添加するだけでは細胞内凍結を十分に抑制できないと考えられる。
特許文献２に記載の生体成分用保存剤では、前述のように、試験された保存期間は数日にすぎず、数か月単位の保存をするためにはより優れた凍結保存技術が必要であると考えられる。また、特許文献２に記載のハイドロゲルを製造するためにはヒアルロン酸への修飾基の導入が必要であり、さらに保存後の生体成分のハイドロゲルからの回収のためにゲルを溶解するための添加物の使用も必要となる。しかしながら、このような添加物を凍結保存方法に導入すると研究試験用としては使用できるものの、不純物の混入リスク等から、実際の医療用には使用しづらい。
特許文献３には、ポリアミノ酸のアミノ基がカルボン酸で修飾されたカルボキシル化ポリアミノ酸と有機両性剤と必要に応じて多糖を含む、凍結保存組成物が開示されているが、細胞を凍結保存させた場合の生存率は十分なものではなかった。
非浸透型の凍結保護試薬を使用する方法も知られているが、このような保存試薬のみでは、細胞への影響は低いものの、十分な保存効果を得ることができない。そこで、細胞内浸透型のＤＭＳＯ、グリセリン、プロピレングリコールなどの細胞内浸透型の化合物と非浸透型の物質とを組み合わせて、化合物量の低減や置換が行われたものが市販されている。しかしながら、生体構成成分などの天然成分のみで良好な凍結保存効果を示し、かつ実用的であるような凍結保護物質は未だ報告されていない。
本発明は、前記問題点に鑑みてなされたもので、生体試料を適切に保存するための凍結保存用の高分子水溶液を提供する。特には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）等の化学物質を基本的に使用せず、また、血清や血清由来タンパク質を基本的に添加せずとも生体試料を－２７℃以下の温度で安定的に長期間保存可能とする凍結保存用の高分子水溶液、生体試料の凍結保存剤、および生体試料を安定的に凍結保存する方法を提供することを目的とする。
本発明は、溶媒中に、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩とを含む生体試料用の凍結保存液に関する。高分子または糖類の塩は、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。
本発明においては、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩は、主成分として、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩は、副成分として含まれていることが望ましい。本明細書において、主成分とは、溶媒中に溶解している成分の中で、重量比の最も高い成分をいう。主成分以外の構成成分は副成分である。
本発明において使用される親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子は、その親水性基が修飾されていないか、修飾されていてもその親水性基の全数の５０％以下であることが望ましい。高分子中の親水性基が、生体試料の保護および溶媒のガラス化、分子量３０００以下の糖と生体試料周辺の水との置換に関与していると推定され、親水性基が修飾されることで、疎水化されてしまうと、細胞の凍結保存効果が低下するからである。従って、主成分としてカルボキシポリアミノ酸のような疎水化した高分子は除かれることが望ましい。
本発明の生体試料の凍結保存液は、細胞内浸透型の凍結保護物質であるジメチルスルホキシドを含まないことが望ましい。また、本発明の生体試料の凍結保存液は、エチレングリコールなどの細胞毒性のある凍結保護剤は含まない方が望ましい。これらは、解凍後の細胞にとって有害だからである。
本発明においては、高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
親水性基を有するモノマーが、ヒドロキシル基ならびにカルボン酸基およびその塩からなる群より選択される少なくとも一つである親水性基を有するモノマーである生体試料用の凍結保存液が好ましい。
高分子がさらに、置換されていてもよいアミノ基または置換されていてもよいアミド基を有する窒素含有モノマーを繰り返し単位として含む生体試料用の凍結保存液が好ましい。
高分子が、前記親水性基を有するモノマーと前記窒素含有モノマーとの交互共重合体である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
親水性基を有するモノマーが、エクアトリアル位に置換したヒドロキシル基を有するモノマーである生体試料用の凍結保存液が好ましい。
１００００以上の粘度平均分子量を有する高分子またはその塩を含む生体試料用の凍結保存液が好ましい。
高分子が、複数の糖残基を含む高分子である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
糖類が、単糖類、二糖類、またはオリゴ糖である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
糖類が、グルコース、フルクトース、ガラクトースまたはそれらのアルコール基が酸化したウロン酸もしくはアルコール基がアミノ基で置換されたアミノ糖、スクロース、グリコサミノグリカンの切断生成物、グリコサミノグリカンの構成単糖、または、それらの重合体もしくは組み合わせである生体試料用の凍結保存液が好ましい。
糖類が、グルクロン酸またはＮ－アセチルグルコサミンである生体試料用の凍結保存液が好ましい。
凍結保存液中の高分子またはその塩の濃度が、５ｗ／ｖ％以上、２０ｗ／ｖ％以下である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
凍結保存液中の糖類またはその塩の濃度が、１ｗ／ｖ％以上、１０ｗ／ｖ％以下である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
細胞内非浸透型の凍結保存液である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
前記生体試料が、細胞、組織、または、膜もしくは凝集体である組織様物である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
前記生体試料が、間葉系幹細胞、血球細胞、内皮細胞、または移植用組織である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
前記生体試料が、精子、卵子、または受精卵である生体試料用の凍結保存液が好ましい。
本発明は、また、本発明の凍結保存液により、望ましくは冷却速度１０℃／ｍｉｎ以下、好ましくは、冷却速度１℃／ｍｉｎ以下の緩慢凍結法で冷却および凍結を行う、生体試料の凍結方法に関する。
本発明は、また、溶媒中に、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩とを含む凍結保存液中に生体試料を含ませる工程と、前記生体試料を含む前記凍結保存液を凍結に供する工程と、－２７℃以下の温度に前記生体試料を含む前記凍結保存液を保持することで保存を行う工程とを含む生体試料の凍結保存方法に関する。
高分子または糖類の塩は、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。また、凍結保存液中にはジメチルスルホキシドやエチレングリコールなどの細胞浸透性で細胞毒性を有する化合物を含まない方が望ましい。これらは解凍後に細胞に対して毒性を有しているからである。
本発明の生体試料の凍結保存方法で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
また、本発明の生体試料の凍結保存方法における凍結保存温度の範囲としては、－２７℃以下であれば限定されるものではないが、上限として、望ましくは、－７０℃以下、好ましくは－８０℃以下である。また下限として、望ましくは、－１９６℃以上、好ましくは－１５０℃以上である。
前記生体試料の保護が保存中におこる生体試料の凍結保存方法が好ましい。
前記凍結保存液の前記生体試料を含ませる工程が、前記生体試料を冷却する前に行われる生体試料の凍結保存方法が好ましい。
前記生体試料が、細胞、組織、または、膜もしくは凝集体である組織様物である生体試料の凍結保存方法が好ましい。
前記生体試料が、精子、卵子、または受精卵である生体試料の凍結保存方法が好ましい。
本発明は、また、生体試料を保存する方法であって、前記生体試料が３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩との存在下で、かつ、－２７℃以下で保存され、前記保存が、前記生体試料が前記高分子またはその塩と前記糖類またはその塩との存在下で少なくとも５か月の期間保存された場合に、保存直前の前記生体試料の生存率を基準として５％未満の生存率の低下を示す保存であることを特徴とする方法に関する。
高分子または糖類の塩は、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。また、凍結保存液中にはジメチルスルホキシドやエチレングリコールなどの細胞浸透性で細胞毒性を有する化合物を含まない方が望ましい。これらは解凍後に細胞に対して毒性を有しているからである。
本発明の生体試料を保存する方法で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
また、本発明の生体試料を保存する方法における凍結保存温度の範囲としては、－２７℃以下であれば限定されるものではないが、上限として、望ましくは、－７０℃以下、好ましくは－８０℃以下である。また下限として、望ましくは、－１９６℃以上、好ましくは－１５０℃以上である。
前記保存が、前記生体試料が前記高分子またはその塩と前記糖類またはその塩との存在下で少なくとも６か月の期間保存された場合に、保存直前の前記生体試料の生存率を基準として１０％未満の生存率の低下を示す保存であることを特徴とする生体試料を保存する方法が好ましい。
前記保存が、－２７℃以下での凍結保存後に解凍された生体試料を４℃で１日間保存した場合に、解凍直後の前記生体試料の生存率を基準として５％未満の生存率の低下を示すことを特徴とする生体試料を保存する方法が好ましい。
前記生体試料が、細胞である生体試料を保存する方法が好ましい。
前記生体試料が、哺乳動物細胞である生体試料を保存する方法が好ましい。
前記生体試料が、哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物血球細胞、または哺乳動物内皮細胞である生体試料を保存する方法が好ましい。
本発明は、また、－２７℃以下、望ましくは－１５０℃を超え、－７０℃以下、好ましくは－１５０℃を超え、－８０℃以下の温度で、生体試料を、望ましくはインビトロで、保存するための、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩との混合物の使用に関する。
高分子または糖類の塩は、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。また、凍結保存液中にはジメチルスルホキシドやエチレングリコールなどの細胞浸透性で細胞毒性を有する化合物を含まない方が望ましい。これらは解凍後に細胞に対して毒性を有しているからである。
本発明は、生体試料を凍結保存するための、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩との混合物の使用に関する。
高分子または糖類の塩は、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。
本発明で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
また、凍結保存温度の範囲としては、－２７℃以下であれば限定されるものではないが、上限として、望ましくは、－７０℃以下、好ましくは－８０℃以下である。また下限として、望ましくは、－１９６℃以上、好ましくは－１５０℃以上である。
また、本発明は、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩との混合物からなる、生体試料の凍結保存剤に関する。
高分子または糖類の塩は、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。
本発明で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
また、凍結保存温度の範囲としては、－２７℃以下であれば限定されるものではないが、上限として、望ましくは、－７０℃以下、好ましくは－８０℃以下である。また下限として、望ましくは、－１９６℃以上、好ましくは－１５０℃以上である。
高分子が、ペントース、ヘキソースもしくはウロン酸またはそれらの組合せを繰り返し単位として含むことが好ましい。
高分子が、繰り返し単位としてアミノ糖をさらに含むことが好ましい。
高分子またはその塩の親水性基は、修飾されていないことが好ましい。
高分子が、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、またはコンドロイチン硫酸であることが好ましい。
高分子として、カルボキシル化ポリアミノ酸は除かれることが好ましい。
高分子として、カルボキシル化ポリアミノ酸は除かれることが好ましい。
糖類が、単糖類、二糖類、またはオリゴ糖であることが好ましい。
糖類が、グルコース、フルクトース、ガラクトースまたはそれらのアルコール基が酸化したウロン酸もしくはアルコール基がアミノ基で置換されたアミノ糖、スクロース、グリコサミノグリカンの切断生成物、グリコサミノグリカンの構成単糖、または、それらの重合体もしくは組み合わせであることが好ましい。
本発明は、また、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩とを含む生体試料用の凍結保存液の製造方法であって、５０００００を超える分子量を有する多糖類またはその塩を水に溶解させた後、水の亜臨界条件下で抽出処理を行うことを含む、生体試料用の凍結保存液の製造方法に関する。
本発明で使用される高分子および／または糖類の塩としては、金属塩、ハロゲン塩もしくは硫酸塩が望ましい。金属塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。
本発明で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
前記水の亜臨界条件が、温度１５０～３５０℃、圧力０．５～２５ＭＰａである生体試料用の凍結保存液の製造方法が好ましい。
本発明によれば、細胞内浸透型の凍結保護物質であるＤＭＳＯやエチレングリコールなどの細胞浸透性で毒性を有する化合物を用いなくても、細胞や組織などの生体試料を適切に保存することができる。さらに、本発明の凍結保存液は細胞内非浸透型であるため、高い凍結保存効果を示すにも関わらず、細胞に対して低毒性である。
また、血清、血清由来タンパク質を含まないため、細菌やウィルスに汚染されることもない。なお、細菌やウィルスに汚染されていないようなタンパク質を添加することは可能である。また、細胞毒性を有する化学物質を細胞の機能を損なわない低濃度で加えることは可能である。
なお、本発明において使用される高分子または糖類の「粘度平均分子量」とは、以下のような方法と計算式とによって求められる。
極限粘度測定：
（１）所定量のＮａＣｌを３０℃のイオン交換水に溶解させ、０．２ＭのＮａＣｌ溶液（標準液）を調製する。
（２）高分子または糖類の試料を３０℃の標準液に溶解させ、原液を調製する。標準液および原液それぞれの粘度を測定し、標準液に対する原液の相対粘度が２．０～２．４となるように調整する。
（３）３０℃の原液を、３０℃の標準液を用いて５／４、５／３、５／２倍となるようにそれぞれ希釈する。
（４）３０℃の標準液、原液および希釈液の粘度をそれぞれ測定する。粘度測定には、Ｅ型粘度計を用いる。
（５）原液および希釈液それぞれの粘度を標準液の粘度で割ったものを相対粘度（ηr）とし、下式に基づき還元粘度を導出する。
ここで、ηsp：高分子または糖類の還元粘度［ｍＬ／ｇ］、ηr：高分子または糖類の相対粘度［－］、Ｃ：高分子または糖類の濃度［ｇ／ｍＬ］である。
（６）高分子または糖類の濃度と、高分子または糖類の還元粘度との関係をそれぞれプロットし、近似直線を引く。近似直線の切片（高分子または糖類濃度＝０）の値を極限粘度とする。
（１）所定量のＮａＣｌを３０℃のイオン交換水に溶解させ、０．２ＭのＮａＣｌ溶液（標準液）を調製する。
（２）高分子または糖類の試料を３０℃の標準液に溶解させ、原液を調製する。標準液および原液それぞれの粘度を測定し、標準液に対する原液の相対粘度が２．０～２．４となるように調整する。
（３）３０℃の原液を、３０℃の標準液を用いて５／４、５／３、５／２倍となるようにそれぞれ希釈する。
（４）３０℃の標準液、原液および希釈液の粘度をそれぞれ測定する。粘度測定には、Ｅ型粘度計を用いる。
（５）原液および希釈液それぞれの粘度を標準液の粘度で割ったものを相対粘度（ηr）とし、下式に基づき還元粘度を導出する。
（６）高分子または糖類の濃度と、高分子または糖類の還元粘度との関係をそれぞれプロットし、近似直線を引く。近似直線の切片（高分子または糖類濃度＝０）の値を極限粘度とする。
粘度平均分子量：
粘度平均分子量は、極限粘度から算出する。
上記のマークホーイング桜田の式に、測定で導出した極限粘度と、文献等で公開されているＫとαの値から粘度平均分子量Ｍを求める。
粘度平均分子量は、極限粘度から算出する。
Ｋおよびαは高分子の種類によって変動する数値であり、例えば「高分子材料便覧」（社団法人高分子学会編）など多数の公開文献にＫとαの値が開示されており、公表されている値を用いて粘度平均分子量の計算を行うことができる。
例えば、ヒアルロン酸の場合、Ｋ＝３．６×１０-4およびα＝０．７８、プルランおよびゼラチンの場合、文献値よりＫ＝９×１０-4、α＝０．５である。例えばデキストランの場合、Ｋ＝６．３×１０-8、α＝１．４、コンドロイチン硫酸の場合、Ｋ＝５．８×１０-4、α＝０．７４を用いることができる。
単糖や二糖、単分子と考えられる化合物の場合は、構造式から分子量が明確に特定されるため、本発明においては、構造式から特定される分子量を粘度平均分子量として擬制して扱う。
また、本発明の凍結保存液を調製するために使用される溶媒としては、水のような水性溶媒を用いることが望ましい。特に体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であることが好ましい。具体的には、例えば、水、生理食塩水、緩衝効果のある生理食塩水であるリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline；ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水（Tris Buffered Saline；ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等、ハンクス平衡塩溶液などの平衡塩溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、または、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０、Ｍ－１９９などの動物細胞培養用基礎培地、他の市販の培地などを挙げることができる。
本発明の生体試料の凍結保存用の高分子水溶液は、粘度平均分子量３０００を超え、５０００００以下の高分子成分により、溶媒部分に氷晶が生成することを防止してガラス化することにより、氷晶形成による細胞などの生体試料の破裂を抑制し、細胞膜などの生体試料の、溶媒との境界組織近傍の水分子を粘度平均分子量３０００以下の低分子量の糖類により置換することで、細胞膜付近の氷晶形成および成長を阻害させ、細胞膜障害を抑制することができる。また、本発明の生体試料の凍結保存液は、細胞内非浸透型の凍結保存液であるにも関わらず従来技術では得ることのできなかった高い凍結保存効果を示すものであるため、生体試料へのダメージおよび生体試料の性質変化を顕著に軽減することができる。
また、本発明の生体試料の凍結保存用の高分子水溶液は、ＤＭＳＯやエチレングリコールなどの細胞内浸透型の化学物質を含まないため、細胞毒性や、ＤＭＳＯに関して報告されているような細胞の性状への影響を軽減することができる。したがって、凍結保存中および凍結保存後の生体試料における生体試料の性状を維持することができる。なお、ＤＭＳＯやエチレングリコールなどの細胞毒性を有する化学物質を細胞の機能を損なわない低濃度で加えることは可能である。
本発明においては、高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
また、血清および／または血清由来タンパク質を含まないため、細菌やウィルスに汚染されることもない。なお、細菌やウィルスに汚染されていないようなタンパク質を添加することは可能である。
また、本発明の生体試料の凍結保存用の高分子水溶液は、－２３℃±４℃付近でガラス転移点を有するため、本発明の生体試料の凍結保存方法および生体試料を保存する方法によれば、凍結した生体試料を、ＤＭＳＯやエチレングリコールなどの細胞毒性を有する化学物質や血清などのタンパク質を用いることなしに、－２７℃以下の温度で、すなわちディープフリーザー中などで長期間安定に保存することができる。なお、細菌やウィルスに汚染されていないようなタンパク質を添加することは可能である。また、ＤＭＳＯやエチレングリコールなどの細胞毒性を有する化学物質を細胞の機能を損なわない低濃度で加えることは可能である。
凍結保存温度の範囲としては、－２７℃以下であれば限定されるものではないが、上限として、望ましくは、－７０℃以下、好ましくは－８０℃以下である。また下限として、望ましくは、－１９６℃以上、好ましくは－１５０℃以上である。
本発明の生体試料の凍結保存用の高分子またはその塩の水溶液（以下、本発明の高分子水溶液ともいう）は、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子またはその塩と、３０００以下である粘度平均分子量を有する糖類またはその塩とを含む凍結保存液である。そして、本発明の高分子は親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子である。すなわち、本発明の生体試料の凍結保存液は、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含み、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子またはその塩と、３０００以下である粘度平均分子量を有する糖類またはその塩との混合物を含む凍結保存剤を溶媒に溶解させたものである。
本発明で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
なお、本発明において使用される高分子または糖類の「粘度平均分子量」とは、以下のような方法と計算式とから算出される値を意味する。
以下に極限粘度の測定方法および極限粘度を用いた粘度平均分子量の計算方法を記載する。
極限粘度測定：
（１）所定量のＮａＣｌを３０℃のイオン交換水に溶解させ、０．２ＭのＮａＣｌ溶液（標準液）を調製する。
（２）高分子または糖類の試料を３０℃の標準液に溶解させ、原液を調製する。高分子または糖類の試料が溶液で入手される場合は、溶液から溶媒を除去した固形分を高分子または糖類の試料とする。高分子および糖類の混合試料、複数の高分子を含む混合試料または複数の糖類を含む混合試料の場合は、各物質を分離、分画した後、各物質から溶媒を除去したものを高分子または糖類の試料とする。また、高分子および／または糖類が未知の場合は、高分子および／または糖類についてＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳやＬＣ－ＩＲ等で物質を同定する。未知の高分子および／または糖類を複数含む場合は、各成分を分離、分画し、それぞれの高分子および／または糖類についてＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳやＬＣ－ＩＲ等で物質を同定し、後述するように粘度平均分子量を計算する。なお、高分子や糖類に不純物が混じった混合物であっても、粘度に影響がなければ（例えば、金属塩のような不純物）、混合物を高分子または糖類の試料とする。また、粘度平均分子量の計算に影響がある不純物を含む場合は、不純物を除去するか、高分子や糖類を分画した後測定する。標準液および原液それぞれの粘度を測定し、標準液に対する原液の相対粘度が２．０～２．４となるように調整する。
（３）３０℃の原液を、３０℃の標準液を用いて５／４、５／３、５／２倍となるようにそれぞれ希釈する。
（４）３０℃の標準液、原液および希釈液の粘度をそれぞれ測定する。粘度測定には、Ｅ型粘度計を用いる。
（５）原液および希釈液それぞれの粘度を標準液の粘度で割ったものを相対粘度（ηr）とし、下式に基づき還元粘度を導出する。
ここで、ηsp：高分子または糖類の還元粘度［ｍＬ／ｇ］、ηr：高分子または糖類の相対粘度［－］、Ｃ：高分子または糖類の濃度［ｇ／ｍＬ］である。
（６）高分子または糖類の濃度と、高分子または糖類の還元粘度との関係をそれぞれプロットし、近似直線を引く。近似直線の切片（高分子または糖類濃度＝０）の値を極限粘度とする。
粘度平均分子量：
粘度平均分子量は、極限粘度から算出する。
上記のマークホーイング桜田の式に、測定で導出した極限粘度と、文献等で公開されているＫとαの値から粘度平均分子量Ｍを求める。ヒアルロン酸の場合は、Ｋ＝３．６×１０-4およびα＝０．７８を代入して、粘度平均分子量Ｍを求める。実施例で用いられているプルランおよびゼラチンには、文献値よりＫ＝９×１０-4、α＝０．５を、また、デキストランには、Ｋ＝６．３×１０-8、α＝１．４を、コンドロイチン硫酸には、Ｋ＝５．８×１０-4、α＝０．７４、カルボキシポリリジンについては、Ｋ＝２．７８×１０-5、α＝０．８７を用いる。
極限粘度測定：
（１）所定量のＮａＣｌを３０℃のイオン交換水に溶解させ、０．２ＭのＮａＣｌ溶液（標準液）を調製する。
（２）高分子または糖類の試料を３０℃の標準液に溶解させ、原液を調製する。高分子または糖類の試料が溶液で入手される場合は、溶液から溶媒を除去した固形分を高分子または糖類の試料とする。高分子および糖類の混合試料、複数の高分子を含む混合試料または複数の糖類を含む混合試料の場合は、各物質を分離、分画した後、各物質から溶媒を除去したものを高分子または糖類の試料とする。また、高分子および／または糖類が未知の場合は、高分子および／または糖類についてＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳやＬＣ－ＩＲ等で物質を同定する。未知の高分子および／または糖類を複数含む場合は、各成分を分離、分画し、それぞれの高分子および／または糖類についてＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳやＬＣ－ＩＲ等で物質を同定し、後述するように粘度平均分子量を計算する。なお、高分子や糖類に不純物が混じった混合物であっても、粘度に影響がなければ（例えば、金属塩のような不純物）、混合物を高分子または糖類の試料とする。また、粘度平均分子量の計算に影響がある不純物を含む場合は、不純物を除去するか、高分子や糖類を分画した後測定する。標準液および原液それぞれの粘度を測定し、標準液に対する原液の相対粘度が２．０～２．４となるように調整する。
（３）３０℃の原液を、３０℃の標準液を用いて５／４、５／３、５／２倍となるようにそれぞれ希釈する。
（４）３０℃の標準液、原液および希釈液の粘度をそれぞれ測定する。粘度測定には、Ｅ型粘度計を用いる。
（５）原液および希釈液それぞれの粘度を標準液の粘度で割ったものを相対粘度（ηr）とし、下式に基づき還元粘度を導出する。
（６）高分子または糖類の濃度と、高分子または糖類の還元粘度との関係をそれぞれプロットし、近似直線を引く。近似直線の切片（高分子または糖類濃度＝０）の値を極限粘度とする。
粘度平均分子量：
粘度平均分子量は、極限粘度から算出する。
Ｋおよびαは高分子の種類によって変動する数値であり、例えば「高分子材料便覧」（社団法人高分子学会編）など多数の公開文献にＫとαの値が開示されており、公表されている値を用いて粘度平均分子量の計算を行う。
本発明では、この方法で算定された分子量を粘度平均分子量とする。なお、スクロースやグルクロン酸のような単糖や二糖、単分子と考えられる化合物の場合は、構造式から分子量が明確に特定されるため、構造式から特定される分子量を粘度平均分子量として擬制して扱う。
本発明の凍結保存液は、生体試料が凍結保存される際に生体試料を適切に保存するための保存液である。所定の分子量を有し、かつ親水性基を多数もつ高分子を含むことにより、本発明の高分子水溶液は、冷却過程で高分子鎖により形成されるマトリックス内に溶媒分子をトラップすることができる。高分子鎖には親水性基が含まれているため、この高分子鎖の作用により、冷却時に溶媒の水の分子運動を制限して、水を結晶化せずにガラス化状態で固化および／または凍結することができる。通常、ガラス化法と呼ばれる凍結方法は、溶液が凍結する際に溶質（凍害を防止するための凍結保護剤）が結晶から排除されることにより残存溶液中の塩濃度が上昇し、細胞内外で浸透圧差が生じることにより細胞内を脱水し細胞内部をガラス化するという方法であり、解凍後の生存率が特に低い細胞に適用される。このような方法では、水をよりガラス化しやすくするために、溶質（凍結保護剤）の濃度を高めることや、冷却速度を大きくすることが行われる。しかしながら、浸透圧差を大きくすると細胞へのダメージも大きくなってしまう問題や、溶解時に再結晶化が起こり細胞がダメージを受けてしまうという問題が知られてきた。また、手技的にも困難が伴う。
本発明の高分子を含む凍結保存液によれば、高分子鎖の作用により細胞内が脱水されてガラス化されるので、細胞内での氷晶の形成が抑制され、さらに、従来のガラス化法での問題である凍結時の細胞における浸透圧ショックを弱めることができる。したがって、細胞毒性を有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やエチレングリコールなどの化学物質を含有させる必要がなく、本発明の高分子を含む凍結保存液は、ＤＭＳＯおよび／またはエチレングリコールを含まない。本発明の高分子の粘度平均分子量が、３０００を超え、５０００００以下であることにより、本発明の凍結保存液が冷却された場合、凍結状態での非晶質であるガラス状態が安定化される。このため、冷却および凍結によっても細胞がダメージを受けにくく、細胞が安定に効率よく凍結保存され得る。したがって、凍結保存後の生体試料を解凍した後の、生体試料における細胞の生存率が高い。高分子の粘度平均分子量が３０００以下であると、ガラス化が良好に起こりにくい場合がある。また、高分子の粘度平均分子量が５０００００より大きいと、粘度が著しく上昇し、また、溶解度が低下したり、調製した溶液が泡立ってハンドリング性が悪化するという問題が生じ得る。粘度平均分子量は例えば、１００００以上が好ましい。また、４０００００以下、さらには２０００００以下の粘度平均分子量である高分子が好ましく、１５００００以下が特に好ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
本発明において使用される高分子は、親水基を有するモノマーを繰り返し単位として含む重合体である。親水性基は、例えば、ヒドロキシル基ならびにカルボン酸基およびその塩である。また、本発明の高分子は、置換されていてもよいアミノ基または置換されていてもよいアミド基を有する窒素含有モノマーを繰り返し単位として含んでいてもよい。さらに、本発明の高分子は、その構造内にエクアトリアル位のヒドロキシル基を有していることが好ましい。これにより、溶媒の水を凍結時により良好に高分子鎖で形成されるマトリックス内にトラップすることができると考えられる。
親水基を有するモノマーは例えば、糖残基である。この場合、本発明の高分子は、糖残基が繰り返し単位としてグリコシド結合により結合したものおよびこれらの誘導体を含む高分子であり得る。糖残基としては、単糖、または、単糖のヒドロキシル基および／またはヒドロキシメチル基が置換された単糖、例えば、ヒドロキシル基および／またはヒドロキシメチル基が、カルボキシル基、アミノ基、Ｎ－アセチルアミノ基、スルホオキシ基、メトキシカルボニル基およびカルボキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基で置換された単糖などが例示されるがこれらに限定はされない。
単糖としては、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソースおよびヘプトース等が挙げられる。例えば、ペントースとしては、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、キシルロース、リブロース、デオキシリボースなどが挙げられる。ヘキソースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース、ラムノースなどが挙げられる。
例えば、カルボキシル基で置換された単糖としては、ウロン酸などが挙げられる。ウロン酸としては、例えば、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸およびガラクツロン酸などが挙げられる。アミノ基で置換された単糖としては、アミノ糖などが挙げられる。アミノ糖としては、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンおよびムラミン酸などが挙げられる。Ｎ－アセチルアミノ基で置換された単糖としては、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルマンノサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンおよびＮ－アセチルムラミン酸などが挙げられる。スルホオキシ基で置換された単糖としては、ガラクトース－３－硫酸などが挙げられる。また複数の置換基をもつ単糖としては、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン－４－硫酸、イズロン酸－２－硫酸、グルクロン酸－２－硫酸、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－硫酸、ノイラミン酸およびＮ－アセチルノイラミン酸などが挙げられる。
例えば、本発明において使用される高分子は、上述したような単糖類を繰り返し単位として含む高分子である。例えば、本発明の高分子は、置換されていてもよいペントース、ヘキソースもしくはウロン酸またはそれらの組合せを繰り返し単位として含む高分子であり得る。また、本発明の高分子は、親水性基を有するモノマーと窒素含有モノマーとの交互共重合体であってもよい。窒素含有モノマーは例えばアミノ糖であってもよい。この場合、例えば、本発明の高分子は、グリコサミノグリカンであり得る。また、１つ以上のヒドロキシル基がスルホオキシ基で置換された、硫酸化多糖類であってもよい。これらに限定されるわけではないが、本発明の高分子としては、例えば、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、またはコンドロイチン硫酸などが挙げられる。
本発明において使用される高分子は、天然由来のものであってもよく、また、化学的に合成したものを用いてもよい。市販の高分子をそのまま使用してもよい。分子量がより大きな天然由来の高分子化合物や市販の高分子化合物を用いて、加水分解や酵素処理、亜臨界処理等の処理に付してその切断生成物を得、分子量の調整をして本発明の高分子としてもよい。また、各モノマーも、天然由来のものであってもよく、天然由来のモノマーを修飾・置換して用いてもよく、また、化学合成されたものでもよい。例えば、好ましくは、本発明の高分子に含まれるモノマーは生体構成成分である。高分子を含む凍結保存液の細胞毒性が低いと考えられる。
本発明において使用される高分子の親水性基は、修飾されていないか、修飾されていても親水性基の全数の５０％以下、すなわち、高分子鎖に置換基が導入されていないか、導入されていても親水性基の全数の５０％以下であることが望ましい。高分子の親水性基、特にＯＨ基、ＮＨ2基、ＣＯＯＨ基が生体試料の保護および溶媒のガラス化、糖と細胞周辺の水との置換に寄与していると推定されるため、これらの官能基が修飾されていない方が生体試料の生存率向上に有利だからである。さらに、高分子の親水性基を修飾する際に使用される試薬などにより、高分子の凍結保護効果に悪影響を与えたり、再生医療目的の生体試料の凍結保存に使用できなくなったりする恐れがある。
また、高分子の親水性基は、低分子量の糖類を水素結合により保持できると考えられ、低分子量の糖類が保持された高分子が細胞などの生体試料の周りに存在することで、細胞膜近傍の水分子と糖類の置換が促進できると推定される。このため、親水性基が修飾されていると、親水性基の低分子量の糖類の保持効果が低下してしまい、低分子量の糖類が共存していても、生体試料の生存率向上には十分寄与しない。例えば、ＯＨ基やＮＨ2基をカルボン酸などで修飾することは好ましくない。
本発明において使用される高分子または糖類の塩は、多糖類の金属塩、ハロゲン塩または硫酸塩であってもよい。金属塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属またはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。塩類は、溶媒の凝固点を降下させ、これにより溶媒のガラス化に寄与するものと考えられる。
本発明の凍結保存液および凍結保存剤は、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩を含む。凍結保存液および凍結保存剤に、高分子と共にこのような小さな分子量を有する糖類が含まれていると、細胞膜付近の水分子が糖類によって置換されて、細胞膜付近の氷晶形成および成長が抑制され、その結果、細胞膜障害が顕著に抑制され得る。すなわち、本発明において使用される糖類またはその塩は、細胞保護のための成分として機能し得る。本発明の糖類は例えば、分子量が３０００以下、好ましくは２０００以下、さらに好ましくは１０００以下である、単糖類、二糖類、またはオリゴ糖などであり得る。
糖類は、例えば、高分子を構成するモノマーとして上述された単糖類であってもよい。例えば、糖類は、グルコース、フルクトース、ガラクトースまたはそれらのアルコール基が酸化したウロン酸もしくはアルコール基がアミノ基で置換されたアミノ糖、スクロース、トレハロース、または、それらの重合体または組み合わせである。また、糖類は、例えば、本発明において使用される高分子、例えばヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、またはコンドロイチン硫酸などの断片であってもよい。本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、糖類は、例えば、グリコサミノグリカンの切断生成物（断片）すなわちグリコサミノグリカンを構成している単糖、その二糖、またはそのオリゴ糖であり得る。
好ましくは、糖類は、ヒアルロン酸の切断生成物である。したがって、好ましくは、本発明において使用される糖類は、グルクロン酸もしくはＮ－アセチルグルコサミン、または、それらからなる二糖もしくはオリゴ糖である。好ましくは、糖類は、グルクロン酸もしくはその修飾化合物、またはその二糖もしくはオリゴ糖であり得る。
本発明において用いられる「切断生成物」とは、高分子に対して加水分解や酵素処理、亜臨界処理等の処理を行った際に得られると考えられる、元の高分子より小さな分子量をもつ化合物を意味する。本発明において使用される高分子は、上述のように、より大きな高分子化合物の処理により得られる、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であってもよく、本発明において使用される糖類は、高分子の処理により得られる、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であってもよい。本発明で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。切断生成物は、元の高分子の構成成分であるモノマーおよび／またはモノマーの種々の重合度の重合体および／またはそれらの混合物であり得る。
「亜臨界処理」とは、所定の温度および所定の圧力の条件下で亜臨界状態にした抽出溶媒としての亜臨界流体と、抽出対象の原料とを接触させることを意味する。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ以上および温度３７４．１５℃以上まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い近傍の温度および圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水の加水分解作用を用いて、抽出対象の原料から所望の成分を得ることができる。本発明において亜臨界処理する場合の条件としては、例えば、１５０℃以上、３５０℃以下の温度であり、亜臨界処理圧力は、各温度の飽和蒸気圧以上とすることができるが例えば、０．５ＭＰａ以上、２５ＭＰａ以下とすることができる。亜臨界処理後、所定の分子量以下である成分が分離回収され、本発明における切断生成物として使用され得る。また、加水分解や酵素処理としても、特に限定されず、通常用いられるような試薬および処理方法が問題なく用いられ得る。
本発明における所定の分子量を有する高分子および糖類は、一度の亜臨界処理によって同時に得られるものであってもよい。すなわち、本発明における高分子および糖類は、粘度平均分子量として３０００より大きく、５０００００以下である分子量範囲に第１の分子量分布を有し、粘度平均分子量として３０００以下の分子量の範囲に第２の分子量分布を有するような、高分子化合物の亜臨界処理物であってもよい。したがって、例えば、本発明の生体試料用の凍結保存液の製造方法は、粘度平均分子量として５０００００を超える分子量を有する多糖類である高分子を水に溶解させた後、水の亜臨界条件下で抽出処理を行うことによって、本発明における高分子および糖類を得る工程を含んでいてもよい。しかしながら、もちろん、本発明における高分子および糖類は、別々の処理工程で処理および／または分子量に基づいて分離されたものを組み合わせて用いてもよい。本発明の凍結保存液に含まれる高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
本発明における高分子と糖類とを含む凍結保存液によれば、細胞毒性が低く、さらに、水の分子運動を制限するために溶質の濃度を高める必要がないので、細胞へのダメージが低いと考えられる。また、本発明の凍結保存液は、従来のガラス化法と異なり、浸透圧ショックを軽減するための大きな冷却速度も冷却時に必要としない。したがって、本発明の凍結保存液によれば、生体試料を毒性が軽減された簡便な方法で効率よく凍結保存することができる。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）による本発明の凍結保存液の熱分析の結果によれば、本発明の凍結保存液は、－２３℃±４℃近辺にガラス転移温度をもつ。さらに、本発明の凍結保存液では、冷却過程において氷晶形成が抑制されるだけでなく、その後の昇温過程での、すなわち融解時の水の再結晶化も抑制することができる。すなわち、本発明における高分子と糖類とを用いることによる凍結保存では、生体試料の凍結状態でのガラス状態が安定化されていると考えられる。このようにガラス状態がより安定化されるため、本発明の凍結保存液は、ヒト、ウシ由来の血清や血清由来成分（例えばアルブミンなど）のタンパク質成分の添加を必要とせずに、高い細胞保護効果を示す。したがって、感染症などの心配がなく、また、生物製剤によるロット間格差などの影響も受けないと考えられる。細胞毒性も低いため、本発明の凍結保存液を用いた凍結保存後、解凍された細胞は高い生存率を示す。なお、感染症の心配の無いようなタンパク質を添加することは可能である。
本発明の凍結保存液を用いた凍結保存方法では、上述のように、冷却時に細胞保護のための大きな冷却速度を必要としないため、生体試料に本発明の凍結保存液を添加した後、本発明の凍結保存液のガラス転移点温度である－２７℃以下に冷却する、例えば生体試料を含む本発明の凍結保存液を凍結処理容器等に入れて－８０℃のディープフリーザー中に放置するだけで、保存に付される細胞や組織などを安定的に凍結、そして保存することができる。通常の細胞などの凍結保存時に必要とされる－１５０℃といった低温度は必ずしも必要でないため、液体窒素凍結保存のための特別な容器や液体窒素の準備などを不要とすることができる。このため、生体試料の凍結保存に関わる操作が顕著に簡便化され得る。また、本発明の凍結保存液では、融解時の水の再結晶化も抑制することができるので、本発明の凍結保存液を用いれば、生体試料の凍結、保存、および解凍の一連の工程が、特別な手技を必要とすることなく、容易に効率よく行うことができる。勿論、本発明の凍結保存液を用い、液体窒素を用いて生体試料を凍結保存することも可能である。
さらに、本発明の凍結保存液は、非浸透型の凍結保護試薬であるため、細胞毒性は低いと考えられる。また、本発明の凍結保存液では、さらに糖類が細胞保護のために機能し得るため、凍結保存中に細胞の性状を変化させないと考えられる。したがって、細胞の特性を維持しつつ生体試料を凍結保存できると考えられる。
本発明の凍結保存液は、高分子またはその塩を１ｗ／ｖ％以上、５０ｗ／ｖ％以下程度の濃度で含む。５ｗ／ｖ％よりも低い濃度であると、溶媒部分を良好にガラス化することができない場合がある。また、２０ｗ／ｖ％より高い濃度では、粘度が高くなりすぎて、ハンドリング性が悪化するおそれがある。例えば、高分子またはその塩の濃度は、５ｗ／ｖ％以上が好ましく、１０ｗ／ｖ％以上が特に好ましい。また、高分子またはその塩の濃度は、５０ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、２０ｗ／ｖ％以下が特に好ましい。好ましくは、高分子またはその塩の濃度は、５ｗ／ｖ％以上、２０ｗ／ｖ％以下である。
本発明における糖類またはその塩の凍結保存液中の濃度は、１ｗ／ｖ％以上、１０ｗ／ｖ量％以下程度である。すなわち、本発明における高分子と糖類との割合が約１０：１程度であることが好ましい。糖類またはその塩の濃度が１ｗ／ｖ％未満であると本発明の効果が十分得られない場合がある。また、糖類を１０ｗ／ｖ％以上の濃度となるように添加しても、細胞保護成分としてのさらなる効果は得られにくい。
本発明の凍結保存液は、非浸透型の凍結保護試薬であるため、本発明の凍結保存液を用いて凍結保存に付される生体試料は特に限定されない。種々の種類の細胞の凍結保存に使用することができる。また、細胞の由来種も特に問わない。本発明の凍結保存液は、凍結および融解時の氷晶形成および再結晶を効果的に抑制することができるため、複雑な構造をもつ哺乳動物細胞等にも良好に使用され得る。したがって様々な種類の動物種、マウス、イヌ、ヒトなどの種の細胞の凍結保存に適用できる。さらに、本発明の凍結保存液は、一般の培養用細胞と比較して凍結時の障害が大きいことが知られており、いわゆる従来の緩慢凍結法では生存率の顕著な低下が避けられないような幹細胞、初期胚や卵子、精子、受精卵等の生殖細胞の凍結保存に特に好適に使用できる。また、本発明の凍結保存液は、分化因子として働き得るＤＭＳＯやエチレングリコールのような化学物質を含まないため、未分化維持が必要な細胞の保存に使用することができ、例えば、再生医療用途の幹細胞も、分化のリスクを伴うことなしに凍結保存できる。なお、ＤＭＳＯやエチレングリコールのような化学物質を上記リスクが問題とならない低濃度で加えることは可能である。
また、血清や血清由来タンパク質を添加しないため、細菌やウィルスによる汚染もない。なお、感染症の心配の無いようなタンパク質を添加することは可能である。
また、本発明の凍結保存液は、凍結状態でのガラス状態を安定化する効果に優れているため、保存が困難であることが知られている細胞のサイズが大きな卵子等の細胞や受精卵、および、組織化された細胞構造体、組織や組織様物、例えば再生医療で得られた組織などの凍結保存にも使用することができる。
すなわち、本発明の凍結保存液は、細胞、組織、または、膜もしくは凝集体である組織様物などから選択される生体試料に使用されて、高い生存率を実現することができる。特には、本発明の凍結保存液は、初代細胞あるいは樹立細胞に関係なく、間葉系幹細胞；造血系幹細胞；神経系幹細胞；骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞；血球細胞；内皮細胞；等の凍結保存、とりわけ、マウスよりも凍結耐性が低いとされている霊長類の幹細胞の凍結保存、移植用組織の凍結保存、および、生殖医療における生殖細胞の凍結保存において有利に使用され得る。
また、本発明においては、高分子として、例えば、生体構成成分である高分子を使用すれば、凍結保存された生体試料を融解して、そのまま細胞投与用溶液として用いることも可能である。さらに、組織または組織様物の場合には、組織化の段階で本発明のこのような高分子溶液を添加しておき、そのまま凍結保存することも可能である。これにより、移植後の問題が軽減すると考えられる。このような場合、本発明の凍結保存液のための好ましい高分子は、ヒアルロン酸である。特に、粘度平均分子量が３０００より大きく、より望ましくは５０００より大きく、そして、６００００以下、より望ましくは２００００以下であるヒアルロン酸である。
本発明の凍結保存液は、緩慢凍結法用の凍結保存液である。すなわち、本発明の凍結保存液を用いた凍結方法では、冷却速度が１０℃／ｍｉｎ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、冷却速度は、１℃／ｍｉｎ以下程度である。この程度の冷却速度であれば、細胞内が適度に脱水されていって細胞内液のガラス化が良好に起こり、そして高い細胞凍結保護効果が得られると考えられる。
本発明の凍結保存方法は、溶媒中に、３０００より大きく、５０００００以下で粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩とを含む凍結保存液中に生体試料を含ませることと、生体試料を含む凍結保存液を凍結に供することと、－２７℃以下の温度に生体試料を含む凍結保存液を保持することで保存を行うこととを含んでいる。
本発明の凍結保存方法で使用される高分子またはその塩の粘度平均分子量は、４０００００以下、特に２０００００以下であることが望ましい。粘度を低く調整でき、凍結保存液として取扱いやすいからである。
高分子および糖類の塩は、多糖類の金属塩、ハロゲン塩または硫酸塩であってもよい。金属塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩が望ましい。アルカリ金属またはアルカリ土類金属としてはナトリウム、カリウム、カルシウムなどが選択される。ハロゲンとしては、塩素、臭素などを使用できる。－８０℃のディープフリーザー中で、生体試料を含む凍結保存液を冷却速度１０℃／ｍｉｎ以下、好ましくは、冷却速度１℃／ｍｉｎ以下程度で凍結しそのまま保存することにより凍結保存が行えるため、従来のガラス化法で求められる急速冷却のための迅速な操作が求められることはない。したがって、操作性が向上すると同時に、安定した保存効果を得ることができると考えられる。
凍結保存温度の範囲としては、－２７℃以下であれば限定されるものではないが、上限として、望ましくは、－７０℃以下、好ましくは－８０℃以下である。また下限として、望ましくは、－１９６℃以上、好ましくは－１５０℃以上である。
本発明の凍結保存液のための溶媒としては、水のような水性溶媒を用いることが望ましい。特に体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であることが好ましい。具体的には、例えば、水、生理食塩水、緩衝効果のある生理食塩水であるリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline；ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水（Tris Buffered Saline；ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等、ハンクス平衡塩溶液などの平衡塩溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液などが例示されるがこれらに限定される訳ではない。また、本発明の効果を損なわない限り溶媒は、例えば等張剤やキレート剤、溶解補助剤などの他の任意成分を含んでいてもよい。本明細書において、「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味している。例えば溶媒は、５％グルコース水溶液などであってもよい。また、本発明の凍結保存液のための溶媒として、細胞培養用の培地が用いられてもよい。培養培地としては特に限定される訳ではなく、例えば市販の培地やＤ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０、Ｍ－１９９などの動物細胞培養用基礎培地、各種の細胞または組織用の一般的な培養液が例示され得る。したがって、本発明の凍結保存液は、細胞培養後の培養液または細胞懸濁液に、凍結保存剤が所望の濃度となるように添加されてもよい。
また、本発明の凍結保存液は、必要に応じて、ｐＨ調整され得る。例えば、親水性基を有するモノマーの親水性基がカルボン酸基などである場合、このようなモノマーが重合された高分子を含む凍結保存液は酸性を呈することがある。また、糖類がカルボン酸基などを有している場合、このような糖類により凍結保存液は酸性を呈し得る。このような場合、ｐＨ調整を行うことによって凍結保存液を中性溶液とすることで、凍結保存される細胞の生存により適した溶液となり得、細胞の生存率が向上すると考えられる。ｐＨ調整のために用いられる塩としては限定されず、水溶液のｐＨ調整に通常使用されるものを使用することができる。
本発明の凍結保存液を用いた生体試料の凍結保存方法では、ガラス化状態が安定化されており、毒性も低いため、生体試料を長期間安定的に保存することができる。本明細書において、長期間安定的な保存とは、例えば、本発明の凍結保存液を用いた場合の解凍後の生体試料例えば細胞の生存率が、保存直前の細胞の生存率を基準として、５か月後に、１０％未満程度、好ましくは５％未満程度の低下、または、６か月後に、２０％未満程度、好ましくは１０％未満程度の低下、または、１２か月後に、１５％未満程度、好ましくは３０％未満程度の低下しかみられないことを意味する。また、本明細書において、長期間安定的な保存とは、例えば、細胞を凍結して－８０℃で長期間保存した後、解凍し、続いて４℃で細胞を保存した場合に、解凍後の２４時間後でも、解凍直後の細胞生存率を基準として５％未満の生存率の低下しかみられないことを意味する。本発明の凍結保存液では、ＤＭＳＯ溶液と比べ、細胞をストレスの少ない条件で凍結保存することができると考えられる。したがって、本発明の凍結保存液では、１０％のＤＭＳＯ溶液などの従来の凍結保存液を用いた凍結保存と比較して、解凍後の非常に高い細胞生存率を得ることができる。さらに、解凍直後のみならず、解凍後に冷蔵保存された細胞も高い細胞生存率を示し得る。本発明の凍結保存液によれば、細胞の性状を変化させることなしに、安定的に長期間、細胞を凍結保存できる。
本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下において、ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製のヒアルロン酸は、ヒアルロン酸ナトリウムであるが、簡単化のため、「ヒアルロン酸」と記載している。
凍結保存剤および凍結保存液
＜試験用試料および試料溶液の調製＞
・実施例１
容積２Ｌの耐圧容器に平均分子量１００万である高分子ヒアルロン酸（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅａｓｉｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）と水とを２０：１００で混合し、処理温度１７５℃、処理圧力０．８９ＭＰａ、および処理時間３分で亜臨界処理を行った。その後、亜臨界処理物を凍結乾燥またはスプレードライ法で乾燥した。これにより、粘度平均分子量が約１万の高分子ヒアルロン酸と粘度平均分子量１０００のヒアルロン酸との混合物、すなわち本発明の凍結保存剤を得た。
＜試験用試料および試料溶液の調製＞
・実施例１
容積２Ｌの耐圧容器に平均分子量１００万である高分子ヒアルロン酸（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅａｓｉｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）と水とを２０：１００で混合し、処理温度１７５℃、処理圧力０．８９ＭＰａ、および処理時間３分で亜臨界処理を行った。その後、亜臨界処理物を凍結乾燥またはスプレードライ法で乾燥した。これにより、粘度平均分子量が約１万の高分子ヒアルロン酸と粘度平均分子量１０００のヒアルロン酸との混合物、すなわち本発明の凍結保存剤を得た。
粘度平均分子量については、本実施例１によって得られた亜臨界処理によるヒアルロン酸分解物をＨＰＬＣで確認したところ（図１８）、高分子量ヒアルロン酸と低分子量のヒアルロン酸の混合物であると考えられたため、エタノール中で高分子量ヒアルロン酸を沈殿させ、低分子量ヒアルロン酸を上澄み側に分画し、この分画した上澄みをＨＰＬＣで再分析したところ、後述する製造例１のヒアルロン酸のＨＰＬＣピーク（図１７Ａ）と概ね一致したため、本実施例１によって得られた低分子量ヒアルロン酸成分の粘度平均分子量は１０００と見積もられた。
高分子量ヒアルロン酸の極限粘度は、０．４９ｄＬ／ｇであり、粘度平均分子量は１００００であった。
この試験用凍結保存剤１ｇを、溶媒として１０ｍＬのαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）に溶解させることにより、実施例１の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中のヒアルロン酸試料の濃度が１０ｗ／ｖ％）。なおこの実施例１を含めて、本発明の実施例、製造例および比較例では、αＭＥＭ培地を溶媒としているが、αＭＥＭ培地に代えて、超純水を溶媒として用いてもよい。また、後述するＤＳＣの測定では、溶媒をαＭＥＭに代えて超純水としている。なお、以下の例により得られる各試験用試料は、凍結保存液の凍結保存剤として、後述の各評価のための試験において、それぞれ適切な溶媒を用いて所定の濃度となるように調製されて使用された。
・製造例１
処理時間７分で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同様な操作を行い、粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度０．０８ｄＬ／ｇであった。
処理時間７分で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同様な操作を行い、粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度０．０８ｄＬ／ｇであった。
・製造例２
処理時間５分で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同様な操作を行い、粘度平均分子量が２０００のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度は、０．１４ｄＬ／ｇであった。
処理時間５分で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同様な操作を行い、粘度平均分子量が２０００のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度は、０．１４ｄＬ／ｇであった。
・製造例３
処理時間４分で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同様な操作を行い、粘度平均分子量が３０００のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度は、０．１９ｄＬ／ｇであった。
処理時間４分で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同様な操作を行い、粘度平均分子量が３０００のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度は、０．１９ｄＬ／ｇであった。
・比較例１
ＤＭＳＯ（ナカライテスク（株）製、細胞培養グレード）を試験用試料とした。この試験用試料１ｍＬを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例１の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のＤＭＳＯ濃度が１０ｗ／ｖ％）。
ＤＭＳＯ（ナカライテスク（株）製、細胞培養グレード）を試験用試料とした。この試験用試料１ｍＬを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例１の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のＤＭＳＯ濃度が１０ｗ／ｖ％）。
・比較例２
溶媒として使用したαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）を試験用試料とした。
溶媒として使用したαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）を試験用試料とした。
・比較例３
ゼラチン（粘度平均分子量３１５０００ 新田ゼラチン（株）製）１ｇを溶媒としてのαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例３の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のゼラチン濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は０．５０ｄＬ／ｇであった。
ゼラチン（粘度平均分子量３１５０００ 新田ゼラチン（株）製）１ｇを溶媒としてのαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例３の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のゼラチン濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は０．５０ｄＬ／ｇであった。
・比較例４
粘度平均分子量１００００００である高分子量ヒアルロン酸（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅａｓｉｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）１ｇを溶媒としてのαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１００ｍＬに溶解させることにより、比較例４の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１ｗ／ｖ％）。極限粘度は、１７．２ｄＬ／ｇであった。
粘度平均分子量１００００００である高分子量ヒアルロン酸（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅａｓｉｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）１ｇを溶媒としてのαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１００ｍＬに溶解させることにより、比較例４の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１ｗ／ｖ％）。極限粘度は、１７．２ｄＬ／ｇであった。
・比較例５
粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸（ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製；粉末）を凍結保存剤としての試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例５の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が、１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、０．６５ｄＬ／ｇであった。
粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸（ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製；粉末）を凍結保存剤としての試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例５の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が、１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、０．６５ｄＬ／ｇであった。
・比較例６
粘度平均分子量５００００であるヒアルロン酸（ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製；粉末）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例６の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、１．６７ｄＬ／ｇであった。
粘度平均分子量５００００であるヒアルロン酸（ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製；粉末）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例６の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、１．６７ｄＬ／ｇであった。
・比較例７
粘度平均分子量１２５０００であるヒアルロン酸（ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製；粉末）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例７の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、３．４ｄＬ／ｇであった。
粘度平均分子量１２５０００であるヒアルロン酸（ｌｉｆｅｃｏｒｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製；粉末）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例７の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、３．４ｄＬ／ｇであった。
・比較例８
粘度平均分子量３７３０００であるプルラン（東京化成工業（株）製）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより比較例８の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、０．５５ｄＬ／ｇであった。
粘度平均分子量３７３０００であるプルラン（東京化成工業（株）製）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより比較例８の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、０．５５ｄＬ／ｇであった。
・比較例９
粘度平均分子量２３０００であるコンドロイチン硫酸ナトリウム塩Ａ（ｓｉｇｍａ社製）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例９の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のコンドロイチン硫酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、０．９７ｄＬ／ｇであった。
粘度平均分子量２３０００であるコンドロイチン硫酸ナトリウム塩Ａ（ｓｉｇｍａ社製）を試験用試料とした。この試験用試料１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させることにより、比較例９の試験用凍結保存液を得た（すなわち、試験用凍結保存液中の試験用試料のコンドロイチン硫酸濃度が１０ｗ／ｖ％）。極限粘度は、０．９７ｄＬ／ｇであった。
・実施例２
比較例５の試験用試料（粘度平均分子量１５０００のヒアルロン酸）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたヒアルロン酸濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例２の試験用凍結保存液を得た。
比較例５の試験用試料（粘度平均分子量１５０００のヒアルロン酸）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたヒアルロン酸濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例２の試験用凍結保存液を得た。
・実施例３
実施例２の試験用凍結保存液（粘度平均分子量１５０００のヒアルロン酸および製造例１の試験用試料を含む）のｐＨを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて中性に調整することにより、実施例３の試験用凍結保存液とした。
実施例２の試験用凍結保存液（粘度平均分子量１５０００のヒアルロン酸および製造例１の試験用試料を含む）のｐＨを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて中性に調整することにより、実施例３の試験用凍結保存液とした。
・実施例４
比較例８の試験用試料（粘度平均分子量３７３０００のプルラン）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたプルラン濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例４の試験用凍結保存液を得た。
比較例８の試験用試料（粘度平均分子量３７３０００のプルラン）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたプルラン濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例４の試験用凍結保存液を得た。
・実施例５
実施例４の試験用凍結保存液（粘度平均分子量３７３０００のプルランおよび製造例１の試験用試料を含む）のｐＨを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて中性に調整することにより、実施例５の試験用凍結保存液とした。
実施例４の試験用凍結保存液（粘度平均分子量３７３０００のプルランおよび製造例１の試験用試料を含む）のｐＨを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて中性に調整することにより、実施例５の試験用凍結保存液とした。
・実施例６
比較例８の試験用試料（粘度平均分子量３７３０００のプルラン）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたプルラン濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度５ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例６の試験用凍結保存液を得た。
比較例８の試験用試料（粘度平均分子量３７３０００のプルラン）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたプルラン濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度５ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例６の試験用凍結保存液を得た。
・実施例７
実施例６の試験用凍結保存液（粘度平均分子量３７３０００のプルランおよび製造例１の試験用試料を含む）のｐＨを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて中性に調整することにより、実施例７の試験用凍結保存液とした。
実施例６の試験用凍結保存液（粘度平均分子量３７３０００のプルランおよび製造例１の試験用試料を含む）のｐＨを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いて中性に調整することにより、実施例７の試験用凍結保存液とした。
・実施例８
比較例９の試験用試料（粘度平均分子量２３０００のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたコンドロイチン硫酸ナトリウム濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例８の試験用凍結保存液を得た。
比較例９の試験用試料（粘度平均分子量２３０００のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたコンドロイチン硫酸ナトリウム濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例８の試験用凍結保存液を得た。
・実施例９
比較例５の試験用試料（粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたヒアルロン酸濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、スクロース（ナカライテスク（株）製、分子量（粘度平均分子量と同値）は３４２）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例９の試験用凍結保存液を得た。
比較例５の試験用試料（粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたヒアルロン酸濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、スクロース（ナカライテスク（株）製、分子量（粘度平均分子量と同値）は３４２）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例９の試験用凍結保存液を得た。
・実施例１０
比較例５の試験用試料（粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたヒアルロン酸濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、グルクロン酸（富士フイルム和光純薬（株）製、分子量（粘度平均分子量と擬制）１９４）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例１０の試験用凍結保存液を得た。
比較例５の試験用試料（粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸）１ｇを溶媒であるαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製、品番Ｃ１２５７－１５００ＢＴ、溶媒は水である）１０ｍＬに溶解させたヒアルロン酸濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液に、グルクロン酸（富士フイルム和光純薬（株）製、分子量（粘度平均分子量と擬制）１９４）を終濃度１ｗ／ｖ％の量で添加して、実施例１０の試験用凍結保存液を得た。
・比較例１０
アミノ基が６０％カルボキシル化されたカルボキシポリリジン（粘度平均分子量１３４００：（株）バイオベルデ製、ＣｒｙｏＳｃａｒｌｅｓｓ ＤＭＳＯ ｆｒｅｅ）を細胞保存液として使用した。
アミノ基が６０％カルボキシル化されたカルボキシポリリジン（粘度平均分子量１３４００：（株）バイオベルデ製、ＣｒｙｏＳｃａｒｌｅｓｓ ＤＭＳＯ ｆｒｅｅ）を細胞保存液として使用した。
・比較例１１
アミノ基が６０％カルボキシル化されたカルボキシポリリジン（粘度平均分子量１３４００：（株）バイオベルデ製、ＣｒｙｏＳｃａｒｌｅｓｓ ＤＭＳＯ ｆｒｅｅ）に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を１ｗ／ｖ％の量で添加して試験用凍結保存液とした。
アミノ基が６０％カルボキシル化されたカルボキシポリリジン（粘度平均分子量１３４００：（株）バイオベルデ製、ＣｒｙｏＳｃａｒｌｅｓｓ ＤＭＳＯ ｆｒｅｅ）に、製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を１ｗ／ｖ％の量で添加して試験用凍結保存液とした。
＜試験例１：初代ヒト間葉系幹細胞の試験用凍結保存液を用いた凍結保存およびその保存効果の評価＞
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１ならびに比較例１、２、４および５の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１ならびに比較例１、２、４および５の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。
その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。７日間、凍結した各試験用試料を含む細胞懸濁液を－８０℃で保存した後、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液は、解凍直後に細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１に示す。
図１は、凍結保存液未添加の培地中、すなわち比較例２の試験用凍結保存液中、または、実施例１ならびに比較例１、４および５の試験用凍結保存液中で凍結保存した細胞の、解凍後の細胞生存率を示している。図１に示されるように、実施例１において、すなわち、ヒアルロン酸の亜臨界処理により得られた、粘度平均分子量が約１万であって、さらに、粘度平均分子量１０００であるすなわち１万より小さな分子量を有するヒアルロン酸の切断生成物を含んでいるヒアルロン酸試料が凍結保存液中の凍結保存剤である実施例１の試験用凍結保存液を含んでいる場合に、９０％を超える顕著に高い保存効果が得られた。ここの保存効果は一般的によく用いられている凍結保存剤であるＤＭＳＯを凍結保存剤として含む比較例１よりも、さらに高い効果であった。本発明の凍結保存液が細胞毒性の低い優れた凍結保存液であることがわかる。分子量が１００００００と大きい高分子量ヒアルロン酸を試験用試料として含む比較例４では、細胞保護効果はほとんど認められなかった。なお、凍結保存剤を含まない比較例２では、細胞生存率はほぼ０％であった。また、粘度平均分子量１５０００のヒアルロン酸である試験用試料が凍結保存剤である比較例５では、実施例１ほどの細胞保護効果は見られなかった。したがって、高分子とそれより小さな分子量を有する糖類とからなる凍結保存剤が凍結保存液に含まれていることが、凍結保存液の細胞保護効果を向上させるために効果的であることが確認された。また、本発明の凍結保存剤は、溶媒としてαＭＥＭ培地などの培養液を使用して凍結保存液として調製しても、高い細胞保存効果を示すことから、本発明の凍結保存剤をそのまま細胞の培養液に加えて細胞を懸濁後、凍結させて保存することができる。保存する細胞を遠心分離する必要もなく、より高い細胞生存率および細胞の性状の維持が可能であると考えられる。
＜試験例２：示差走査熱量分析による凍結保存液の分析の評価＞
実施例１ならびに比較例２および５の試験用試料をαＭＥＭ培地に代えて超純水を用いて終濃度１０％に調製し、示差走査熱量分析用のサンプルとした。各サンプルを、次に示すように示差走査熱量分析装置（ＤＳＣ）で走査した。
（１）２０℃で１分間保持後、速度フリーで－８０℃まで降温。
（２）－８０℃で１分間保持後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃まで昇温。
実施例１ならびに比較例２および５の試験用試料をαＭＥＭ培地に代えて超純水を用いて終濃度１０％に調製し、示差走査熱量分析用のサンプルとした。各サンプルを、次に示すように示差走査熱量分析装置（ＤＳＣ）で走査した。
（１）２０℃で１分間保持後、速度フリーで－８０℃まで降温。
（２）－８０℃で１分間保持後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃まで昇温。
結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。試験用試料が超純水である比較例２（すなわち超純水であるサンプル）では、図２Ａに示されるように自由水の氷晶融解ピークのみが観察された。試験用試料が粘度平均分子量１５０００のヒアルロン酸である比較例５では、比較例２と比較して氷晶融解ピークのシフトおよび凝固点降下が見られ、また、－２０℃付近にガラス転移が確認された（図２Ｂ）。一方、粘度平均分子量が約１万のヒアルロン酸に加えてヒアルロン酸の切断生成物（粘度平均分子量１０００である低分子ヒアルロン酸）を含む実施例１の試験用試料では、－２３℃±４℃付近にガラス転移のみが確認され（図２Ｂ）、氷晶融解のピークは極めて小さく、ほぼ認められなかった。したがって、凍結保存液が、高分子とそれより小さい分子量を有する糖類とからなる凍結保存剤を含んでいると、融解時の水の再結晶化が抑制されるという顕著に有利な効果をもつことがわかる。
次いで、実施例１ならびに比較例１および２の試験用試料をαＭＥＭ培地に代えて超純水を用いて終濃度１０％に調製し、示差走査熱量分析用のサンプルとした。各サンプルを、次に示すように示差走査熱量分析装置（ＤＳＣ）で走査した。
（１）２０℃で１分間保持後、５℃／ｍｉｎの降温速度で－８０℃まで降温。
（２）－８０℃で１分間保持後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃まで昇温。
（１）２０℃で１分間保持後、５℃／ｍｉｎの降温速度で－８０℃まで降温。
（２）－８０℃で１分間保持後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃まで昇温。
結果を図３Ａ（比較例２）、図３Ｂ（比較例１）、図３Ｃ（実施例１）にそれぞれ示す。
試験用試料が超純水である比較例２では、図３Ａに示されるように、降温過程において、氷晶形成に伴う非常に大きな発熱ピークが見られた。また、昇温過程においても、氷晶融解に伴う大きな融解熱量が観察された。試験用試料がＤＭＳＯである比較例１では、図３Ｂに示されるように、小さな氷晶形成に伴うピークしか見られず、氷晶融解に伴うピークはほとんど見られなかった。これは、比較例１の試験用試料（ＤＭＳＯ）を含む凍結保存液は凍結状態においてガラス化状態に近いことを示している。実施例１の試験用試料（ヒアルロン酸の切断生成物を含む粘度平均分子量１００００のヒアルロン酸）を凍結保存剤として含む凍結保存液では、図３Ｃに示されるように、融解ピークはほとんど見られず、また、氷晶形成に伴うピークも比較例１で観察されたピークよりもはるかに小さいものであった。したがって、実施例１の試験用試料を含む凍結保存液では、氷晶はほぼ形成されず、極めて良好なガラス化状態にあると考えられる。
＜試験例３：初代ヒト間葉系幹細胞の試験用凍結保存液を用いた凍結保存における長期保存効果の評価＞
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。凍結した各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を－８０℃で最長１２か月まで保存した後、所定の保管期間で、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率を解凍直後にトリパンブルー染色により評価した。結果を図４Ａに示す。また、３か月間－８０℃で凍結保存した細胞懸濁液を解凍し、続いて４℃で、一日あるいは１週間保存した。４℃で保存後の細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。なお、４℃での保存後の細胞生存率は、解凍直後（すなわち保存直前）の細胞生存率を１００%として算出した。結果を図４Ｂに示す。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。凍結した各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を－８０℃で最長１２か月まで保存した後、所定の保管期間で、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率を解凍直後にトリパンブルー染色により評価した。結果を図４Ａに示す。また、３か月間－８０℃で凍結保存した細胞懸濁液を解凍し、続いて４℃で、一日あるいは１週間保存した。４℃で保存後の細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。なお、４℃での保存後の細胞生存率は、解凍直後（すなわち保存直前）の細胞生存率を１００%として算出した。結果を図４Ｂに示す。
図４Ａに示されている結果から、本発明の凍結保存液は、５か月の保存後でもほぼ変わらない、９５％以上の高い細胞生存率を示していることがわかる。一方、比較例１の試験用試料（ＤＭＳＯ）を含む凍結保存液では、凍結保存２か月後に既に細胞生存率の低下が見られた。そして、３か月後には、比較例１での凍結保存における細胞生存率は５０％をきっていることが分かる。この結果は、３か月後でも依然として高い細胞生存率が維持されている本発明の凍結保存液とは対照的であった。凍結保存６か月後においては、本発明の凍結保存液では１０％未満の生存率の低下しかみられない一方、比較例１の凍結保存液では、細胞生存率は２５％ほどに低下していた。さらに、本発明の凍結保存液での凍結保存では、凍結保存１２か月後においても、依然として高い細胞生存率が維持されており、細胞生存率の低下は１５％未満にすぎなかった。
したがって、本発明の凍結保存液によれば、細胞を長期間安定に、高い細胞生存率で凍結保存することができることがわかる。
また、－８０℃で長期間保存した細胞を解凍後にそのまま４℃で保存した場合において、本発明の凍結保存液では、４℃で１日保存した後の細胞生存率が保存直前の細胞生存率のほぼ１００％に近かった一方、比較例１では６０％程度に低下していた。一週間の４℃での保存後でさえも、本発明の凍結保存液では未だ４０％以上の細胞生存率が見られた。これは、本発明の凍結保存液において、解凍後に生存していた細胞が、実質正常に増殖に向かう細胞であったこと、および、保存中に凍結保存液が細胞にダメージを与えていないことを示しており、これにより、本発明の凍結保存液が非常に優れた細胞保存効果を有していることが確認された。
＜試験例４：初代ヒト間葉系幹細胞の試験用試料を用いた凍結保存後の性状の評価＞
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。凍結した各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を－８０℃で６か月間、凍結保存した。６か月後に、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を３７℃の温浴中で急速解凍し、αＭＥＭで洗浄したのち、６ウェルプレートに２．５×１０4個ずつ播種し、４日後、培養培地中のＨＧＦおよびＩＬ－１０濃度を定量した。ＨＧＦおよびＩＬ－１０の定量には、それぞれ、専用のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標） ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ、カタログ番号ＤＨＧ００、Ｒ＆Ｄ社製）、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標） ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１０、カタログ番号Ｄ１００Ｂ、Ｒ＆Ｄ社製）を用い、キット添付の手順書の順序に準じて行った。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。凍結した各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を－８０℃で６か月間、凍結保存した。６か月後に、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を３７℃の温浴中で急速解凍し、αＭＥＭで洗浄したのち、６ウェルプレートに２．５×１０4個ずつ播種し、４日後、培養培地中のＨＧＦおよびＩＬ－１０濃度を定量した。ＨＧＦおよびＩＬ－１０の定量には、それぞれ、専用のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標） ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ、カタログ番号ＤＨＧ００、Ｒ＆Ｄ社製）、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標） ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１０、カタログ番号Ｄ１００Ｂ、Ｒ＆Ｄ社製）を用い、キット添付の手順書の順序に準じて行った。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。
図５Ａに示されるように、凍結保存剤としてのＤＭＳＯを含む比較例１の凍結保存液の存在下の凍結保存では、解凍後の細胞におけるＨＧＦ産生が高かった。一方、ヒアルロン酸の切断生成物を含む粘度平均分子量１００００のヒアルロン酸を凍結保存剤として含む本発明の凍結保存液を用いた凍結保存では、解凍後の細胞におけるＨＧＦ産生量は低く、比較例１の１／３以下であった。ＤＭＳＯ存在下での結果は、ＤＭＳＯ存在下での保存では細胞がストレス状態にあったことを示している。本発明の凍結保存剤存在下での細胞保存ではこのような高いＨＧＦ産生は観察されないことから、本発明の凍結保存液では細胞は安定に保護されていることがわかる。
図５Ｂに示されるように、ＩＬ－１０産生量は、実施例１の凍結保存液を用いて凍結保存された細胞で高く、比較例１の凍結保存液を用いて凍結保存された細胞では非常に低かった。この結果から、本発明の凍結保存液は、細胞の機能を維持しつつ良好に細胞を凍結保存できることがわかる。
本発明の凍結保存液はＤＭＳＯおよびエチレングリコールなどの細胞毒性を有する化合物を含まないので、本発明の凍結保存液は、従来の凍結保存液とは異なり、生体試料をストレス状態にさらすことなく、その性状を維持したままで凍結保存することが可能であるという顕著な効果を有する。
また、血清や血清由来タンパク質を添加しないため、細菌やウィルスによる汚染もない。なお、細胞の機能を損なわない低濃度で細胞毒性を有する化合物を加えることは可能である。また、感染症の心配の無いようなタンパク質を添加することも可能である。
＜試験例５：初代ヒト間葉系幹細胞の試験用試料を用いた凍結保存後の性状（未分化性）の評価＞
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。凍結した各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を－８０℃で６か月間、凍結保存した。６か月後に、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液において、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ１０５の発現強度をフローサイトメトリーにより解析した。結果を図６に示す。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。凍結した各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を－８０℃で６か月間、凍結保存した。６か月後に、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液において、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ１０５の発現強度をフローサイトメトリーにより解析した。結果を図６に示す。
ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ１０５は、未分化状態の間葉系幹細胞に発現する代表的な表面タンパク質であり、間葉系幹細胞の未分化性マーカーとして用いられるものである。図６に示されるように、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ１０５の、全ての未分化性バイオマーカーの発現は、実施例１の凍結保存液で凍結保存した細胞において比較例１の凍結保存液で凍結保存した細胞よりも高かった。したがって、実施例１の凍結保存液で凍結保存した細胞が未分化マーカーの発現を維持していることがわかる。すなわち、実施例１の凍結保存液で凍結保存した細胞は未分化状態を保持することができる。本発明の凍結保存によれば、比較例１の凍結保存液で保存した場合に見られるような分化状態への影響を低減することができることがわかる。
この結果より、本発明の凍結保存液を用いた凍結保存方法が、未分化状態で凍結保存することが重要である幹細胞の凍結保存にも好適に適用可能であることがわかる。
＜試験例６：各種多糖類を含む凍結保存液の評価＞
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１～８および比較例５、８および９の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した（ただし、実施例１の試験用凍結保存液中のヒアルロン酸試料の濃度は２０ｗ／ｖ％とした）。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。１日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図７に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１～８および比較例５、８および９の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した（ただし、実施例１の試験用凍結保存液中のヒアルロン酸試料の濃度は２０ｗ／ｖ％とした）。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。１日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図７に示す。
図７に示されるように、ヒアルロン酸に限定されず他の高分子であってもその種類に関わらず所定の分子量を有し、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子を、高分子よりも分子量の小さい糖類またはその塩と組み合わせて凍結保存剤として使用することにより、凍結保存液は良好な細胞保護効果を示した。糖類またはその塩を添加することによって、調製された凍結保存液が酸性を呈している場合には、ｐＨ調整により凍結保存液を中性にすることで、より高い細胞保護効果が得られた。ｐＨ調整により細胞の生存に、より適切な条件となったと考えられる。また、添加される糖類またはその塩が細胞保護成分として作用して凍結乾燥後の細胞の細胞生存率がさらに向上されるためには、凍結保存液中に糖類またはその塩が、高分子である試験用試料に対して１～５ｗ／ｖ％の量で添加されていることが必要であった。一方、添加する糖類またはその塩の量を試験用試料に対して１０質量％より多くして、凍結保存液中の含有量をより増大させても、細胞生存率の向上効果にさらなる影響は見られなかった。
また、図７に示されている結果より、本発明の凍結保存液が、ヒトだけでなく、イヌ間葉系幹細胞に対しても、良好な凍結保護効果を示すことがわかった。
＜試験例７：３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類の細胞保護成分としての評価＞
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例９、１０および２の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。１日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率を解凍直後にトリパンブルー染色により評価した。結果を図８に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例９、１０および２の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。１日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率を解凍直後にトリパンブルー染色により評価した。結果を図８に示す。
図８に示されるように、粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸のみを凍結保存剤として含む比較例５（図１）と比較して、粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸よりも分子量の小さい糖類またはその塩が粘度平均分子量１５０００であるヒアルロン酸と組み合わされて凍結保存剤として用いられた場合、細胞保護効果が向上した。保水性の観点から従来の凍結保存液に添加されることもあるスクロースが高分子凍結保存剤に添加された場合（実施例９）も細胞保護効果の向上は見られたが、グルクロン酸（実施例１０）、および／または、亜臨界処理によって得られた断片を含む粘度平均分子量が１０００である製造例１のヒアルロン酸断片（実施例２）である試験用試料が、細胞保護成分として、すなわち本発明の３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩として、高分子に添加された場合に顕著により高い細胞保護効果が得られ得ることがわかる。この結果から、細胞保護成分としては、グリコサミノグリカンの切断生成物および／またはグリコサミノグリカンの構成単糖である糖類、特には、ヒアルロン酸の切断生成物である糖類やヒアルロン酸の構成単糖であるグルクロン酸が特に好ましいことが判明した。
＜試験例８：凍結された凍結保存液中の細胞の評価（細胞内ガラス化状態の評価）＞
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαＭＥＭ培地からなる比較例２の試験用試料溶液に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、硬質硝子製試料置板（１６φ×０．１２ｍｍ）に５μＬ添加し、硬質硝子製カバーガラス（１２φ×０．１２ｍｍ）でカバーし、ｌｉｎＫａｍ社製顕微鏡用冷却ステージ（ＴＨＭＳ６００）で、５℃／ｍｉｎで－８０℃まで降温し、透過光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）で－８０℃にて画像を撮影した。結果を図９Ａ～Ｃに示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαＭＥＭ培地からなる比較例２の試験用試料溶液に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、硬質硝子製試料置板（１６φ×０．１２ｍｍ）に５μＬ添加し、硬質硝子製カバーガラス（１２φ×０．１２ｍｍ）でカバーし、ｌｉｎＫａｍ社製顕微鏡用冷却ステージ（ＴＨＭＳ６００）で、５℃／ｍｉｎで－８０℃まで降温し、透過光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）で－８０℃にて画像を撮影した。結果を図９Ａ～Ｃに示す。
図９Ａは、対照懸濁液の結果を示しており、培地のみでは、細胞内に氷晶が発生して光が乱反射するために細胞が暗転していることがわかる。図９Ｂは、ＤＭＳＯが試験用試料である比較例１の結果を示している。図９Ｂにおいても、細胞は暗転しており、微小氷晶が形成されていることがわかる。図９Ｃは、実施例１の試験用試料を含む凍結保存液の結果である。細胞が明転しており、細胞内が非晶状態にガラス化していることがわかる。
この結果から、本発明の凍結保存液が細胞内をガラス化状態にして凍結させていることがわかる。そして、ヒアルロン酸の切断生成物である糖類を含むことにより、ガラス状態がより安定的に形成されることがわかった。３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類によって細胞周辺の氷晶形成が抑制されることにより、ガラス化が安定的に効率よく起こったと考えられる。
＜試験例９：明度差を用いた細胞内ガラス化状態の評価＞
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαＭＥＭ培地からなる比較例２の試験用試料溶液に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、硬質硝子製試料置板（１６φ×０．１２ｍｍ）に５μＬ添加し、硬質硝子製カバーガラス（１２φ×０．１２ｍｍ）でカバーし、ｌｉｎＫａｍ社製顕微鏡用冷却ステージ（ＴＨＭＳ６００）で、５℃／ｍｉｎで－８０℃まで降温し、透過光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）で－８０℃にて画像を撮影した。結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαＭＥＭ培地からなる比較例２の試験用試料溶液に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、硬質硝子製試料置板（１６φ×０．１２ｍｍ）に５μＬ添加し、硬質硝子製カバーガラス（１２φ×０．１２ｍｍ）でカバーし、ｌｉｎＫａｍ社製顕微鏡用冷却ステージ（ＴＨＭＳ６００）で、５℃／ｍｉｎで－８０℃まで降温し、透過光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）で－８０℃にて画像を撮影した。結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
図１０Ａに示されている観察像の細胞内と細胞外の明暗の差（絶対値）を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（https://imagej.nih.gov/ij/）を用いて解析した。それぞれの画像において、溶媒領域の明度および細胞内部の明度と、マンセル明度とを同条件で読み込み、溶媒領域の明度および細胞内部の明度のそれぞれの読み込みデータと各マンセル明度の読み込みデータとを比較して、最も近い読み込みデータのマンセル明度を、溶媒領域の明度および細胞内部の明度として採用して、溶媒の明度および細胞内部の明度を数値化（マンセル値化）した。なお、画像解析ソフトで読み込んだ細胞内領域または溶媒領域の明度の読み込み値が、マンセル明度の最も暗い値０の読み込み値よりもさらに暗い値である場合は、便宜上細胞内領域または溶媒領域のマンセル値を０とし、画像解析ソフトで読み込んだ細胞内領域または溶媒領域の明度の読み込み値が、マンセル明度の最も明るい値１０の読み込み値よりもさらに明るい値である場合は、便宜上細胞内領域または溶媒領域のマンセル明度の値を１０とする。
測定の結果、対照懸濁液（比較例２）では、溶媒領域のマンセル明度は５、細胞内領域のマンセル明度は０であり、溶媒領域と細胞内部領域のマンセル明度の差は５であった。比較例１では溶媒領域の明度は４、細胞内領域のマンセル明度は０、マンセル明度差は４であった。これに対し、実施例１では、溶媒領域のマンセル明度が４、細胞内領域のマンセル値が２で、マンセル明度差は２であった（図１０Ｂ）。
すなわち、実施例１では、細胞内領域の明度と溶媒領域の明度とが近い。この結果は、実施例１の試験用試料を含む凍結保存液では、凍結した細胞が明転しており、すなわち細胞内がガラス化されていることを示している。細胞内領域と溶媒領域の明度差は３以下であることが望ましい。また、細胞内領域の明度の値に比べて、溶媒領域の明度の値の方が大きいか同じであることが望ましい。
＜試験例１０：凍結された凍結保存液中の細胞面積の評価＞
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαＭＥＭ培地からなる比較例２の試験用試料溶液を添加した培地（すなわち培地のみ）に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、ｌｉｎＫａｍ社製顕微鏡用冷却ステージ（ＴＨＭＳ６００）で、５℃／ｍｉｎで－８０℃まで降温した後、－５０℃／ｍｉｎで急速融解させた。冷却前および融解後に、視野中に存在する細胞１０個の面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪで算出した。結果を図１１に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαＭＥＭ培地からなる比較例２の試験用試料溶液を添加した培地（すなわち培地のみ）に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、ｌｉｎＫａｍ社製顕微鏡用冷却ステージ（ＴＨＭＳ６００）で、５℃／ｍｉｎで－８０℃まで降温した後、－５０℃／ｍｉｎで急速融解させた。冷却前および融解後に、視野中に存在する細胞１０個の面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪで算出した。結果を図１１に示す。
図１１に示されるように、培地のみである比較例２およびＤＭＳＯが試験用試料である比較例１では、凍結後に細胞の面積が増大していた一方、本発明の凍結保存液を用いて凍結した後では、細胞は約１／３に縮小していた。凍結時に細胞内が良好に脱水されていることが確認された。細胞は、培地中の正射影面積の１／１未満、１／３．５以上に縮小していることが望ましい。
＜試験例１１：種々の細胞に対する凍結保護の評価＞
培養したマウス由来マクロファージ様細胞株（RAW264）、ヒト結腸癌由来細胞（Caco-2）および初代ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC）のそれぞれを、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。７日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１２に示す。
培養したマウス由来マクロファージ様細胞株（RAW264）、ヒト結腸癌由来細胞（Caco-2）および初代ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC）のそれぞれを、１×１０6個／ｍＬの濃度で、実施例１および比較例１の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。７日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１２に示す。
図１２に示されるように、本発明の凍結保存液を用いて凍結保存した場合、全ての細胞において、ＤＭＳＯが試験用試料である比較例１とほぼ同等、またはそれ以上の高い細胞生存率が得られた。この結果から、本発明の凍結保存液が、初代細胞あるいは樹立細胞に関係なく、また、細胞の由来種も問わず、様々な種類の細胞を高い細胞生存率で凍結保存することができることが確認された。
＜試験例１２：本発明の糖類の細胞生存率に及ぼす効果の評価＞
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、以下の各試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。７日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１３～１６に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、以下の各試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。７日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１３～１６に示す。
図１３は、分子量の異なる高分子に、亜臨界処理によって得られた断片を含む粘度平均分子量が１０００である製造例１のヒアルロン酸断片である試験用試料を添加した場合の効果を示したものである。用いられた各試験用凍結保存液は、それぞれ、実施例１の試験用凍結保存液、比較例６の試験用凍結保存液、比較例６の試験用凍結保存液に製造例１の試験用試料（粘度平均分子量が１０００のヒアルロン酸断片試料）を１ｗ／ｖ％の量で添加した試験用凍結保存液であった。
ヒアルロン酸の粘度平均分子量が５００００である比較例６を使用した実験では、試験用凍結保存液の粘性が高く、細胞懸濁液の調製時に泡立ちが生じるなどのハンドリング性にやや困難があったが、細胞懸濁液中の凍結保存液の濃度を１０ｗ／ｖ％に調製することは可能であった。図１３に示されるように、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、親水性基を有するモノマーを繰り返し単位として含む高分子またはその塩が粘度平均分子量１００００のヒアルロン酸であり、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩がヒアルロン酸の切断生成物である糖類である、実施例１の凍結保存液が最も生存率が高かった。高分子の粘度平均分子量が５００００である比較例６でも、ヒアルロン酸の切断生成物を含む粘度平均分子量が１０００の糖類である製造例１を添加することによって、細胞生存率が向上した。
図１４は、細胞懸濁液中の凍結保存液の含有量を低下させて凍結保存剤としての高分子の含有量が低い条件で細胞懸濁液を凍結し、解凍後の細胞生存率を調べた結果を示したものである。凍結保存剤としての高分子の含有量が低い細胞懸濁液は、それぞれ、比較例６の試験用凍結保存液を１ｗ／ｖ％含有する試験用凍結保存液、比較例６の試験用凍結保存液を１ｗ／ｖ％含有する試験用凍結保存液に製造例１を１ｗ/ｖ％の量で添加した試験用凍結保存液、比較例７の試験用凍結保存液を１ｗ／ｖ％含有する試験用凍結保存液、比較例７の試験用凍結保存液を１ｗ／ｖ％含有する試験用凍結保存液に製造例１を１ｗ/v％の量で添加した試験用凍結保存液、に細胞を懸濁させたものであった。
図１４の結果から、高分子の濃度が１ｗ／ｖ％程度では、糖類（ヒアルロン酸の切断生成物を含む粘度平均分子量が１０００である製造例１）を加えても、本発明の効果は得られないことがわかる。
図１５は、凍結保存液中の３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類またはその塩としての成分の分子量の、細胞生存率に及ぼす影響を調べた結果を示したものである。試験は、粘度平均分子量１５０００である試験用試料を含む比較例５の試験用試料溶液、比較例５の試験用試料にそれぞれ１質量％の量で製造例１～３（すなわち、粘度平均分子量がそれぞれ１０００、２０００、および３０００のヒアルロン酸断片である試験用試料）を添加したものを試験用試料として１ｗ／ｖ％で含む試験用凍結保存液とを用いた。
図１５の結果より、高分子より分子量の小さい糖類またはその塩を凍結保存剤に加えて凍結保存液に添加することにより、より向上した細胞生存効果を得ることができるが、糖類の分子量が大きくなるにつれて、その効果は徐々に低下することがわかる。
図１６は、高分子より分子量の小さい糖類またはその塩のみを試験用試料として、超純水に溶解させた濃度１０ｗ／ｖ％の試験用試料溶液を用いて凍結保存した場合の解凍後の細胞生存率を示したものである。試験用試料としては、製造例１～３の粘度平均分子量がそれぞれ１０００、２０００、および３０００である試験用試料を使用した。
図１６に示されるように、高分子より分子量の小さい糖類またはその塩だけでは、細胞生存効果を得ることはできない。製造例３では、約１０％の細胞生存率が観察されたが、これは、製造例３の試験用試料中に含まれ得る３０００より分子量の大きなヒアルロン酸によるものであると推測される。
＜試験例１３：亜臨界処理ヒアルロン酸試料のＨＰＬＣ分析＞
製造例１～３の試験用試料の１ｗｔ％水溶液を作製し、０．４５μｍのメンブレンフィルター（ミリポア社製）でフィルターろ過した後、各試験用試料の成分をＨＰＬＣにより分析した。移動相として、Ａ液：１６ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4水溶液、Ｂ液：８００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4水溶液を用い、ＺＯＲＢＡＸ ＮＨ2（アジレント・テクノロジー（株）製、カラムサイズφ４．６×２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）順相ＨＰＬＣカラムを用いて、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２１０ｎｍで、成分を分離した。グラジエント条件は、移動相Ｂ濃度０％（０分）→移動相Ｂ濃度１００％（６０分）とした。結果を図１７Ａ～Ｃに示す。また、標品として、０．２ｗｔ％の濃度で、二糖であるＨＡ０２、四糖であるＨＡ０４、六糖であるＨＡ０６、八糖であるＨＡ０８および十糖であるＨＡ１０（全てイズロン社製）のヒアルロン酸のオリゴ糖をそれぞれ含む水溶液を調製し同様にＨＰＬＣ分析を行った。この結果が図１７Ｄに示されている。
製造例１～３の試験用試料の１ｗｔ％水溶液を作製し、０．４５μｍのメンブレンフィルター（ミリポア社製）でフィルターろ過した後、各試験用試料の成分をＨＰＬＣにより分析した。移動相として、Ａ液：１６ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4水溶液、Ｂ液：８００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4水溶液を用い、ＺＯＲＢＡＸ ＮＨ2（アジレント・テクノロジー（株）製、カラムサイズφ４．６×２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）順相ＨＰＬＣカラムを用いて、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２１０ｎｍで、成分を分離した。グラジエント条件は、移動相Ｂ濃度０％（０分）→移動相Ｂ濃度１００％（６０分）とした。結果を図１７Ａ～Ｃに示す。また、標品として、０．２ｗｔ％の濃度で、二糖であるＨＡ０２、四糖であるＨＡ０４、六糖であるＨＡ０６、八糖であるＨＡ０８および十糖であるＨＡ１０（全てイズロン社製）のヒアルロン酸のオリゴ糖をそれぞれ含む水溶液を調製し同様にＨＰＬＣ分析を行った。この結果が図１７Ｄに示されている。
本ＨＰＬＣ分析条件では、単糖は保持時間３．５分、また、図１７Ｄに示されているように、二糖は保持時間９分付近に確認される。図１７Ａは、製造例１のヒアルロン酸の切断生成物を含む粘度平均分子量が１０００である試験用試料の分析結果を示すものであるが、保持時間３．５分付近に単糖に対応するピーク、保持時間９分付近の二糖に対応するピークが観察される。すなわち、製造例１の試験用試料には、このような単糖や二糖の成分が含まれており、細胞生存率の向上効果に寄与していると考えられる。
＜試験例１４：実施例１の試験用試料のＨＰＬＣ分析＞
実施例１の試験用試料（亜臨界処理により得られた粘度平均分子量が約１万のヒアルロン酸試料）について、上述の製造例１～３の試験用試料のＨＰＬＣ分析と同じ条件を用いて、ＨＰＬＣ分析した。結果を図１８に示す。
実施例１の試験用試料（亜臨界処理により得られた粘度平均分子量が約１万のヒアルロン酸試料）について、上述の製造例１～３の試験用試料のＨＰＬＣ分析と同じ条件を用いて、ＨＰＬＣ分析した。結果を図１８に示す。
同様に図１７Ｄと比較すると、実施例１の試験用試料にも、保持時間３．５分付近および９分付近にそれぞれ単糖や二糖に対応するピークが観察されることがわかる。すなわち、実施例１の試験用試料にも、このような単糖や二糖の成分が含まれており、これにより、高い細胞生存率効果が得られていると考えられる。
＜試験例１５：多糖類構造をもたない試験用試料による細胞生存率の評価＞
比較例３のゼラチンを含む試験用凍結保存液を用いて凍結保存後の細胞生存率を評価した。培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、比較例１および３の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。１日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１９に示す。
比較例３のゼラチンを含む試験用凍結保存液を用いて凍結保存後の細胞生存率を評価した。培養した初代イヌ間葉系幹細胞（cyagen C160）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、比較例１および３の試験用凍結保存液（血清非含有）に懸濁した。その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。１日間の凍結保存後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を取り出し、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図１９に示す。
図１９に示されるように、凍結保存剤としてゼラチンを用いた場合は、ＤＭＳＯが凍結保存剤である比較例１と比較して、低い細胞生存率しか得られなかった。したがって、本発明の凍結保存液のもつ高い細胞生存率効果は、凍結保存液中に、高分子に加え、高分子よりも分子量の小さい糖類またはその塩を含むことにより得られることがわかる。
＜試験例１６：カルボキシル化ポリリジンによる細胞生存率の評価＞
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、比較例１０および比較例１１の試験用凍結保存液中に懸濁した。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞（Lonza PT2501）を、１×１０6個／ｍＬの濃度で、比較例１０および比較例１１の試験用凍結保存液中に懸濁した。
その後、各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ミスターフロスティー）中で、－８０℃冷凍庫内で凍結した。７日間、凍結した各試験用試料を含む細胞懸濁液を－８０℃で保存した後、３７℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用凍結保存液を含む細胞懸濁液は、解凍直後に細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図２０に示す。
比較例１０では、細胞の生存率は６５％であった。カルボキシポリリジンと製造例１との混合物である比較例１１では、生存率は６０％であった。カルボキシポリリジンの場合、低分子量のヒアルロン酸を添加しても効果が見られなかった。
カルボキシポリリジンでは、ポリリジンのアミノ基が、カルボン酸で修飾されて疎水化しているため、細胞周辺の水が低分子量のヒアルロン酸で置換されにくくなるものと推定される。
上記の結果より、本発明における高分子と糖類とを含む生体試料用の凍結保存液は、細胞内を安定にガラス化することにより、ＤＭＳＯやエチレングリコールなどの細胞浸透性で細胞毒性のある化合物、および／または、血清や血清由来のタンパク質等の添加を基本的に必要とすることなく、高い細胞生存率で生体試料を凍結保存することができるという顕著な効果を有していることがわかる。細胞は良好に保護され、その性状も維持される。
Claims (26)
- 溶媒中に、
３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と、
３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩と
を含み、
ジメチルスルホキシドを含まない生体試料用の凍結保存液。 - 前記高分子が繰り返し単位として親水性基を有するモノマーを含み、前記モノマーが、エクアトリアル位に置換したヒドロキシル基を有する請求項１記載の凍結保存液。
- 前記高分子が、１００００以上の粘度平均分子量を有する請求項１または２記載の凍結保存液。
- 凍結保存液中の前記高分子の濃度が、５ｗ／ｖ％以上、２０ｗ／ｖ％以下である請求項１～３のいずれか１項に記載の凍結保存液。
- 凍結保存液中の前記糖類の濃度が、１ｗ／ｖ％以上、１０ｗ／ｖ％以下である請求項１～４のいずれか１項に記載の凍結保存液。
- 細胞内非浸透型の凍結保存液である請求項１～５のいずれか１項に記載の凍結保存液。
- 前記生体試料が、細胞、組織、または、膜もしくは凝集体である組織様物である請求項１～６のいずれか１項に記載の凍結保存液。
- 前記生体試料が、間葉系幹細胞、血球細胞、内皮細胞、または移植用組織である請求項７記載の凍結保存液。
- 前記生体試料が、精子、卵子、または受精卵である請求項８記載の凍結保存液。
- 請求項１～９のいずれか１項に記載の凍結保存液により、冷却速度１０℃／ｍｉｎ以下の緩慢凍結法で冷却および凍結を行う、生体試料の凍結方法。
- 溶媒中に、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩とを含み、ジメチルスルホキシドを含まない凍結保存液中に生体試料を含ませる工程と、
前記生体試料を含む前記凍結保存液を凍結に供する工程と、
－２７℃以下の温度に前記生体試料を含む前記凍結保存液を保持することで保存を行う工程と
を含む生体試料の凍結保存方法。 - 前記生体試料の保護が保存中におこる請求項１１記載の生体試料の凍結保存方法。
- 前記凍結保存液中に前記生体試料を含ませる工程が、前記生体試料を冷却する前に行われる、請求項１１または１２記載の生体試料の凍結保存方法。
- 前記生体試料が、細胞、組織、または、膜もしくは凝集体である組織様物である請求項１１～１３のいずれか１項に記載の生体試料の凍結保存方法。
- 前記生体試料が、精子、卵子、または受精卵である請求項１４記載の生体試料の凍結保存方法。
- 生体試料を保存する方法であって、
溶媒中に、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩とを含み、ジメチルスルホキシドを含まない生体試料用の凍結保存液の存在下で、かつ、－２７℃以下で保存され、
前記保存が、前記生体試料が前記生体試料用の凍結保存液の存在下で少なくとも５か月の期間保存された場合に、保存直前の前記生体試料の生存率を基準として５％未満の生存率の低下を示す保存であることを特徴とする生体試料を保存する方法。 - 前記保存が、前記生体試料が前記高分子またはその塩と前記糖類またはその塩との存在下で少なくとも６か月の期間保存された場合に、保存直前の前記生体試料の生存率を基準として１０％未満の生存率の低下を示す保存であることを特徴とする請求項１６記載の生体試料を保存する方法。
- 前記保存が、－２７℃以下での凍結保存後に解凍された生体試料を４℃で１日間保存した場合に、解凍直後の前記生体試料の生存率を基準として５％未満の生存率の低下を示すことを特徴とする請求項１６記載の生体試料を保存する方法。
- 前記生体試料が、細胞である請求項１６～１８のいずれか１項に記載の生体試料を保存する方法。
- 前記生体試料が、哺乳動物細胞である請求項１９記載の生体試料を保存する方法。
- 前記生体試料が、哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物血球細胞、または哺乳動物内皮細胞である請求項２０記載の生体試料を保存する方法。
- －２７℃以下の温度で、生体試料を保存するための、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩との混合物の、ジメチルスルホキシドを含まない条件下での使用。
- 生体試料を凍結保存するための、３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩との混合物の、ジメチルスルホキシドを含まない条件下での使用。
- ３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩との混合物からなり、ジメチルスルホキシドを含まない生体試料の凍結保存剤。
- 溶媒中に、
３０００より大きく、５０００００以下である粘度平均分子量を有する高分子であって、ヒアルロン酸またはプルランから選ばれる高分子またはその塩と、３０００以下の粘度平均分子量を有する糖類であって、ヒアルロン酸またはグルクロン酸から選ばれる糖類またはその塩とを含む生体試料用の凍結保存液の製造方法であって、
５０００００を超える分子量を有するヒアルロン酸またはプルランから選ばれる多糖類またはその塩を水に溶解させた後、水の亜臨界条件下で抽出処理を行うことを含み、ジメチルスルホキシドの添加を含まない、生体試料用の凍結保存液の製造方法。 - 前記水の亜臨界条件は、温度１５０～３５０℃、圧力０．５～２５ＭＰａである請求項２５記載の生体試料用の凍結保存液の製造方法。
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