CZ309774B6 - Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace - Google Patents
Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309774B6 CZ309774B6 CZ2022-148A CZ2022148A CZ309774B6 CZ 309774 B6 CZ309774 B6 CZ 309774B6 CZ 2022148 A CZ2022148 A CZ 2022148A CZ 309774 B6 CZ309774 B6 CZ 309774B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cryopreservation
- dmso
- hyaluronic acid
- cryopreservation medium
- medium
- Prior art date
Links
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 26
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 106
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 11
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 abstract description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 11
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 3
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 3
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 238000013142 basic testing Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950001002 cianidanol Drugs 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000001342 constant potential amperometry Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006565 epigenetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229940006076 viscoelastic substance Drugs 0.000 description 1
- 239000003190 viscoelastic substance Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Kryoprezervační médium je roztok kyseliny hyaluronové a/nebo její sodné soli a DMSO pro kultivaci kmenových buněk, kde kyselina hyaluronová má molekulovou hmotnost v rozmezí 1 000 000 až 2 200 000 g/mol a koncentraci v rozmezí 0,08 až 0,2 % (w/v), a DMSO má koncentraci 3 až 5 % (v/v). Je určeno pro uchování buněčných linií a kmenových buněk v podmínkách velmi nízkých teplot a umožňuje snížení koncentrace potenciálně cytotoxického kryoprotektiva dimethylsulfoxidu DMSO. Dále se popisuje použití tohoto kryoprezervačního média a způsob kryoprezervace.
Description
Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace
Oblast techniky
Vynález se týká složení, použití a přípravy zamrazovacího média pro dlouhodobé uchovávání buněčných linií kmenových buněk kryoprezervací. Médium obsahuje kyselinou hyaluronovou a/nebo její sodnou sůl, o hmotnostně střední molekulové hmotnosti v rozmezí 1 000 000 až 2 200 000 g/mol, v koncentraci 0,08 až 0,2 % (v/w), a DMSO v koncentraci 3 až 5 % (v/v).
Dosavadní stav techniky
Kryoprezervace je běžná metoda pro dlouhodobé uchovávání biologického materiálu pro následný výzkum či klinické použití. Kryoprezervace využívá nízkých teplot (-80 °C až -196 °C), při kterých dochází k pozastavení metabolických procesů. Optimální proces kryoprezervace je takový, kdy buňky po rozmrazení vykazují vysoký stupeň přežití, viabilitu a mají zachovanou svou funkčnost. Především u buněčných kultur kmenových buněk používaných pro terapeutické účely je nezbytné zachování vysoké proliferační aktivity kryoprezervovaných buněk a také jejich pluripotence a genomické stability.
Proces kryoprezervace však může mít závažné následky na přežívání buněk. Z tohoto důvodu je nezbytné použít kryoprotektiva (CPA), látky, které snižují buněčné poškození během kryoprezervace, ovlivňují integritu membrán a udržují rovnováhu iontových sil mezi intra- a extracelulárním prostorem. Nejčastěji používané kryoprotetivum dimethylsulfoxid (DMSO) má velmi úzké rozhraní účinku mezi cytoprotekcí a cytotoxicitou a existují pochyby o jeho biologické inertnosti (např. o vlivu na genovou expresi či epigenetické procesy).
Negativní efekt DMSO in vitro na kmenové buňky je závislý na dávce, při laboratorní teplotě už v rozmezí koncentrací 0,1 až 1 % (v/v) byl pozorován efekt na viabilitu, morfologii, buněčnou adhezi a diferenciaci (Pal et al., 2012; Tuncer et al., 2018). Kryoprezervované fetální jaterní progenitorové buňky měly sníženou expresi genů kmenovosti NANOG, OCT a SOX2 a buňky kostní dřeně měly změněnou morfologii a funkci (Borisov et al., 2014; Czysz et al., 2015). Z těchto důvodů je snaha omezit působení DMSO na co nejnižší úroveň, snížit koncentraci DMSO či nahradit jej alternativním CPA (Awan et al., 2020).
Většina takových alternativních kryoprotektiv se však v savčích buňkách nevyskytuje a jejich použití tedy vyžaduje přesnou znalost biokompatibility pro použití při kryoprezervaci. Jinak je tomu u hyaluronanu (kyselina hyaluronové - HA), HA je hlavní a přirozenou komponentou nik kmenových buněk (mikroprostředí obklopující kmenové buňky) (Nevi et al., 2017).
HA je nabitý hydrofilní nesulfatovaný lineární polysacharid, glykosaminoglykan (GAG) složený z opakujících se podjednotek disacharidů (β, 1-4)-glukuronové kyseliny (GlcUA) a (β, 1-3)-Nacetyl glukosaminu (GlcNAc). Délka polymeru, tedy molekulová hmotnost určuje fyziologické vlastnosti HA, vazbu na ECM a buněčné receptory (např. CD44), a tak ovlivňuje kaskádu buněčné regulace (Monslow et al., 2015).
Mechanismus kryoprotektivních účinků HA není znám. Vysoká hydratační kapacita HA způsobující zpomalení růstu krystalů ledu a její velmi nízká cytotoxicita by však mohla být výhodná pro její použití v kryoprezervaci (Gurruchaga et al., 2018; Ujihira et al., 2010). Použití HA při kryoprezervaci je dáno fyzikálně-chemickými vlastnostmi HA plynoucími především z poměru koncentrace a molekulové hmotnosti HA.
- 1 CZ 309774 B6
V současné době je mj. známo řešení podle přihlášky EP 1648227, která cílí na použití HA jako viskoelastické substance s cytoprotektivním charakterem pro transport a uchovávání rohovky pro transplantace. V rámci přihlášky je ale popsáno, že kryoprotektivní vlastnosti jsou dány přídavkem DMSO, nikoliv HA.
Také postup kryoprezervace již je popsán v patentu EP 2885969 B1, který v určitých případech zmiňuje obsah HA při kryoprezervaci kmenových buněk. Patent naznačuje možnost, že HA je vhodnou složkou zamrazovacího média, avšak nezmiňuje se, jaká molekulová hmotnost (a případně jakého původu) je nejvhodnější. Tento postup se také opírá o kryoprotektivní vlastnosti jiných CPA, mj. propylenglykolu, sacharózy, případně i ostatních cukrů (např. etylenglykolu).
V patentu CN 110074096 B je popsáno složení bezsérového média s obsahem DMSO, hydroxyetylovaného škrobu (HES), katechinu, tetraborátu sodného, hyaluronanu 0,8% až 2% (w / v) a vitaminu C. V tomto patentu nejsou kryoprotektivní vlastnosti HA přímo prokázány, např. použití DMSO a HES je dlouhodobě používáno a není z patentu jasné, jaká MW HA byla použita a za jaké zlepšení kryoprezervace je HA odpovědná při použití vysoké koncentrace DMSO.
V přihlášce CN 113661977 A bylo také použití polyglutamové kyseliny, HA a trehalózy zmíněno, nicméně byla namítána absence inovativnosti právě díky použití trehalózy, jejíž kryoprotektivní vlastnosti jsou dlouhodobě známy. Je zmíněno, že při rutinním zkoušení by bylo možné odvodit použití trehalózy v kryomédiu, jak je popsáno v CN 112806354 A. V této přihlášce jsou opět mezi kryoprotektivy použity HA, trehalóza, Dextran, glukóza a HES. Vliv HA na účinnost kryoprezervace nebyl ani v této přihlášce samostatně stanoven, nevyplývá z ní tedy, zdali není účinnost dána ostatními komponentami kryomédia.
Patent CN 110839614 B zmiňuje hyaluronovou kyselinu, avšak pro oddělení buněk od sebe a pro umožnění buněčné migrace, proliferace a zabránění diferenciace, nikoliv pro vlastní kryoprezervaci.
Patent KR 102274228 B1 zmiňuje použití sulfatované kyseliny hyaluronové, ale pro porovnání i použití nesulfatované HA v rozmezí 300 000 až 500 000 g/mol a koncentracích 0,1 až 2 mg/ml (w/v). Patent však nároky cílí na sulfatovanou HA a její soli.
Podstata vynálezu
Přestože se v odborné a patentové literatuře použití HA zmiňuje, nevyplývá z žádného uvedeného řešení postup kryoprezervace hMSC opírající se o kryoprotektivní vlastnosti HA zvyšující jejich aplikační potenciál a postup eliminace negativních účinků DMSO při kryoprezervaci hMSC pomocí HA.
Výše uvedené problémy jsou do značné míry vyřešeny v tomto vynálezu popisujícím kryoprezervační médium opírající se o kryoprotektivní vlastnosti kyseliny hyaluronové.
Předmětem tohoto vynálezu je použití nativní kyseliny hyaluronové rozpuštěné v solích pro kultivace jako kryoprezervačního roztoku pro kryoprezervaci kmenových buněk, buněčných linií a tkání z živých buněk.
Složkou kryoprezervačního roztoku je nativní kyselina hyaluronová a její sodná sůl s hmotnostně střední molekulovou hmotností 1 000 000 až 2 200 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 1 000 000 do 1 750 000 g/mol, výhodněji 1 500 000 g/mol.
Nativní kyselina hyaluronová a její sodná sůl je použita v tomto vynálezu v koncentraci 0,08 až 0,2 % (w/v), s výhodou 0,1 až 0,2 % (w/v), ještě výhodněji 0,1 % (w/v).
- 2 CZ 309774 B6
Složkou pro rozpuštění nativní kyseliny hyaluronové jsou soli pro kultivace, čímž se rozumí standardní média, jako jsou například Dulbekovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), modifikované Eaglovo médium v alfa modifikaci (α-MEM), Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI-1640) a Hankův roztok vyvážených solí (HBSS), výhodněji RPMI-1640 a HBSS v modifikaci bez přídavku NaHCO3. Zbývající komponentou směsi je voda.
Buněčnými kulturami se rozumí aseptické kultury eukaryotických buněk živočichů, jako jsou epiteliální, nervové, epidermální buňky, keratinocyty, hematopoetické buňky, melanocyty, chondrocyty, imunitní buňky typu B a T, červené krvinky, makrofágy, monocyty, fibroblasty, svalové buňky a kmenové buňky, konkrétněji embryonální, mezenchymální a indukované pluripotentní kmenové buňky.
Tento vynález, kryoprezervační médium, je výhodný v tom, že nemusí obsahovat chemicky nedefinovanou složku fetální bovinní sérum (FBS).
Kryoprezervační médium se používá sterilní a složení dle tohoto vynálezu umožňuje terminální sterilizaci vlhkým teplem.
Kryoprezervační médium popsané v tomto vynálezu obsahuje sníženou koncentraci DMSO oproti běžně používané koncentraci, konkrétně 3 až 5 % oproti 10 % DMSO (v/v), výhodněji 3 % DMSO (v/v).
Dále se vynález týká použití kryoprezervačního média popsaného výše pro kryoprezervaci kmenových buněk, buněčných linií a tkání z živých buněk a způsobu kryoprezervace kmenových buněk, buněčných linií a tkání z živých buněk, za použití tohoto média, kde se nejprve k buněčným kulturám kmenových buněk, buněčným liniím nebo tkáním z živých buněk přidá kryoprezervační médium podle vynálezu a následně se tato směs pomalu zamrazí, například rychlostí 1 °C/min, pro následné uchovávání při -80 °C až -196 °C.
Použití kryoprezervačního média dle stávajícího vynálezu umožňuje snížení potřebné koncentrace DMSO a tím snížení negativních účinku DMSO na kryoprezervované kultury.
Použití kryoprezervačního média dle stávajícího vynálezu zvyšuje proliferační schopnost kryoprezervovaných kmenových buněk a tím vede k vyššímu počtu kmenových buněk získaných následnou kultivací.
Použití kryoprezervačního média dle stávajícího vynálezu udržuje povrchový fenotyp kmenových buněk a zvyšuje expresi povrchového markeru spojeného s proliferací a pluripotentnosti.
Použití kryoprezervačního média dle stávajícího vynálezu nemění schopnost kmenových buněk diferenciovat do různých vývojových buněčných linií.
Objasnění výkresů
Obr. 1 znázorňuje celkový počet buněk hMSC měřený pomocí CaSy cell counter (OMNI Life Science GmbH) po dvou týdnech kultivace. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka.
Obr. 2 znázorňuje fenotypový profil povrchových receptorů hMSC vyhodnocený před kryoprezervací a dva týdny po rozmrazení. Graf reprezentuje procenta pozitivních buněk určený jako procento s fluorescenční intenzitou větší, než je 99,5 % negativní izotypové kontroly. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka.
- 3 CZ 309774 B6
Obr. 3 znázorňuje immunocytochemické a histologické barvení pro stanovení diferenciačního potenciálu hMSC.
Obr. 4 vlevo znázorňuje celkový počet buněk hMSC měřený pomocí CaSy cell counter (OMNI Life Science GmbH) po dvou týdnech kultivace. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka. Obr. 4 vpravo znázorňuje fenotypový profil povrchového receptoru hMSC vyhodnocený dva týdny po rozmrazení. Graf reprezentuje procenta pozitivních buněk určený jako procento s fluorescenční intenzitou větší, než je 99,5 % negativní izotypové kontroly. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka.
Obr. 5 vlevo znázorňuje celkový počet buněk hMSC měřený pomocí CaSy cell counter (OMNI Life Science GmbH) po dvou týdnech kultivace. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka. Obr. 5 vpravo znázorňuje fenotypový profil povrchového receptoru hMSC vyhodnocený dva týdny po rozmrazení. Graf reprezentuje procenta pozitivních buněk určený jako procento s fluorescenční intenzitou větší, než je 99,5 % negativní izotypové kontroly. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka.
Obr. 6 vlevo znázorňuje celkový počet buněk hMSC měřený pomocí CaSy cell counter (OMNI Life Science GmbH) po dvou týdnech kultivace. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka. Obr. 6 vpravo znázorňuje fenotypový profil povrchového receptoru hMSC vyhodnocený dva týdny po rozmrazení. Graf reprezentuje procenta pozitivních buněk určený jako procento s fluorescenční intenzitou větší, než je 99,5 % negativní izotypové kontroly. Data jsou zobrazena jako průměry a směrodatná odchylka znázorněna jako chybová úsečka.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Buněčné kultury mezenchymálních kmenových buněk byly kryoprezervovány. Metoda kryoprezervace se skládá z přídavku kryoprezervačního média ke vzorku a následné nekontrolované kryoprezervace pomalým zamrazením rychlostí 1 °C/min, pro uchování vzorku v nízkých teplotách (-80 °C až -196 °C). Kryoprezervovaná kultura kmenových buněk je po době uchování oživena rozmrazením ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 2 minut a následně je od buněčné suspense kryoprezervační médium odmyto centrifugací. Poté jsou buňky nasazeny na kultivační láhev a kultivovány po dobu dvou týdnů.
Pro kryoprezervaci bylo použito 4 různých kombinací kryoprotektivního média obsahujícího kyselinu hyaluronovou o MW 1 500 000 g/mol ve dvou koncentracích 0,1 a 0,2 % (w/v) s přídavkem 5 nebo 3 % DMSO (v/v) rozpuštěných ve standardním médiu α-MEM. Kompozice obsahující 5, 3 nebo 10 % (v/v) DMSO v médiu sloužila jako kontrola kryoprezervace. Snížená koncentrace DMSO na 5 až 3 % (v/v) se projevila na nižší efektivitě přežití a proliferace MSCs.
Překvapivě, obohacení kryoprezervačního média o 0,1 či 0,2 % (w/v) HA o MW 1 500 000 g/mol vedlo k nárůstu v efektivitě přežití a proliferace kmenových buněk. Oproti očekávání vyšší účinnosti vyšší koncentrace HA (0,2 % (w/v)) a vyšší koncentrace DMSO (5 % (v/v)) byl počet kryoprezervovaných kmenových buněk nejvyšší v kombinaci 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol a po dvou týdnech kultivace přesáhl úroveň nejen své kontroly (3 % DMSO (v/v)), ale i 10 % DMSO (v/v) (obr. 1).
Zatímco vysoká exprese markerů CD73 a CD90 nebyla nijak ovlivněna složením kryoprezervačního média, pozorovali jsme nárůst CD49f markeru u buněk kryoprezervovaných
- 4 CZ 309774 B6 pomocí 3 % DMSO a 0,1 % HA o MW 1 500 000 g/mol, spojený pravděpodobně s vyšší proliferační aktivitou (obr. 2).
V základním testu diferenciace hMSC do chondrogenní a osteogenní buněčné linie nebyly pozorovány imunocytochemickým barvením rozdíly mezi kryomédii. Buňky kryoprezervované pomocí 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol byly schopny diferenciace do chondrogenní a osteogenní buněčné linie (obr. 3).
Kompozice kryoprezervačního média 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol je tedy účinná pro kryoprezervaci kmenových buněk a je bezpečná pro zachování klíčových a unikátních vlastností MSCs - vysoké proliferační aktivity a pluripotentnosti a umožňuje tak snížení koncentrace DMSO.
Příklad 2
Buněčné kultury mezenchymálních kmenových buněk hMSC byly kryoprezervovány. Metoda kryoprezervace se skládá z přídavku kryoprezervačního média ke vzorku a následné nekontrolované kryoprezervace pro uchování vzorku v nízkých teplotách (-80 °C až -196 °C). Kryoprezervovaná kultura kmenových buněk je po době uchování oživena rozmrazením ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 2 minut a následně je od buněčné suspense kryoprezervační médium odmyto centrifugací. Poté jsou buňky nasazeny na kultivační láhev a kultivovány.
Pro kryoprezervaci kmenových buněk bylo použito různých molekulových hmotností kyseliny hyaluronové od 800 do 2 120 000 g/mol v koncentraci 0,1 % (w/v) s přídavkem 3 % DMSO (v/v) rozpuštěných ve standardním médiu pro kultivaci buněk DMEM. Pro porovnání účinnosti bylo každé složení kryoprezervačního média srovnáno s médiem obsahujícím 10 % a 3 % DMSO (v/v) a 3 % DMSO (v/v) spolu s 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol.
Oproti pozorovanému nárůstu celkového počtu hMSC v kryoprezervačním médiu s kombinací 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) nebyl takový nárůst oproti kontrole s 3 % DMSO (v/v) pozorován u kombinací s HA o MW od 800 do 130 000 g/ml po dvou týdnech kultivace od rozmrazení. Částečný nárůst v počtu buněk u kombinace HA o MW 130 000 g/ml a 3 % DMSO (v/v) nebyl překvapivě reflektován u exprese povrchového markeru CD49f oproti kombinaci 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol (obr. 4).
U kombinací kryoprezervačního média s HA o MW od 260 000 do 800 000 g/ml po dvou týdnech kultivace od rozmrazení byl nárůst počtu buněk již pozorován, překvapivě však nedosahoval takového rozsahu jako u kombinace kryoprezervačního média 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol, přestože již byl nárůst exprese povrchového markeru CD49 patrný (obr. 5).
U kombinací kryoprezervačního média s HA o MW 2 070 000 až 2 120 000 g/mol po dvou týdnech kultivace od rozmrazení nebyl nárůst počtu buněk oproti kombinaci kryoprezervačního média 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol rozdílný. Taktéž nárůst exprese povrchového markeru CD49 je u těchto kombinací kryoprezervačního média s HA stejný jako u kombinace kryoprezervačního média 3 % DMSO (v/v) a 0,1 % HA (w/v) o MW 1 500 000 g/mol (obr. 6).
Kompozice kryomédia 3 % DMSO/0,1 % HA je tedy účinná pro kryoprezervaci kmenových buněk a je bezpečná pro zachování klíčových a unikátních vlastností MSCs - vysoké proliferační aktivity a pluripotentnosti, a umožňuje tak snížení koncentrace DMSO.
- 5 CZ 309774 B6
Příklad 3
Buněčné kultury mezenchymálních kmenových buněk byly kryoprezervovány. Metoda kryoprezervace se skládá z přídavku kryoprezervačního média ke vzorku a následné nekontrolované kryoprezervace pro uchování vzorku v nízkých teplotách (-80 C až -196 °C). Kryoprezervovaná kultura kmenových buněk je po době uchování oživena rozmrazením ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 2 minut a následně je od buněčné suspense kryoprezervační médium odmyto centrifugací. Poté jsou buňky nasazeny na kultivační láhev a kultivovány po dobu dvou týdnů.
Pro kryoprezervaci bylo použito kryoprotektivního média obsahujícího kyselinu hyaluronovou o MW 1 500 000 g/mol v koncentraci 0,08 a 0,1 % (w/v) s přídavkem 5 nebo 3 % DMSO (v/v) rozpuštěných ve standardním médiu RPMI-1640. Kompozice obsahující 3 nebo 10 % (v/v) DMSO v médiu sloužila jako kontrola kryoprezervace. Počet kryoprezervovaných kmenových buněk získaných po dvou týdnech kultivace, stejně jako viabilita buněk a exprese markerů CD49f, CD70 a CD90 byly srovnatelné s kryoprezervačním médiem podle příkladu 1.
Reference:
Awan, M., Buriak, I., Fleck, R., Fuller, B., Goltsev, A., Kerby, J., Lowdell, M., Mericka, P., Petrenko, A., Petrenko, Y., et al. (2020). Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity? Regen. Med. 15, 1463-1491.
Borisov, P.A., Dimitrov, A.Y., Ostankov, M.V., and Goltsev, A.N. (2014). Effect of Different DMSO Concentrations on Expression Level of Stemness Genes in Mice Fetal Liver Stem Cells Prior to and after Cryopreservation. Probl. Cryobiol. Cryomedicine 24, 185.
Czysz, K., Minger, S., and Thomas, N. (2015). DMSO efficiently down regulates pluripotency genes in human embryonic stem cells during definitive endoderm derivation and increases the proficiency of hepatic differentiation. PloS One 10, e0117689.
Gurruchaga, H., Saenz del Burgo, L., Orive, G., Hernandez, R.M., Ciriza, J., and Pedraz, J.L. (2018). Low molecular-weight hyaluronan as a cryoprotectant for the storage of microencapsulated cells. Int. J. Pharm. 548, 206-216.
Monslow, J., Govindaraju, P., and Puré, E. (2015). Hyaluronan - A Functional and Structural Sweet Spot in the Tissue Microenvironment. Front. Immunol. 6, 231.
Nevi, L., Cardinale, V., Carpino, G., Costantini, D., Di Matteo, S., Cantafora, A., Melandro, F., Brunelli, R., Bastianelli, C., Aliberti, C., et al. (2017). Cryopreservation protocol for human biliary tree stem/progenitors, hepatic and pancreatic precursors. Sci. Rep. 7, 6080.
Pal, R., Mamidi, M.K., Das, A.K., and Bhonde, R. (2012). Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Arch. Toxicol. 86, 651661.
Tuncer, S., Gurbanov, R., Sheraj, I., Solel, E., Esenturk, O., and Banerjee, S. (2018). Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Sci. Rep. 8, 14828.
Ujihira, M., Iwama, A., Aoki, M., Aoki, K., Omaki, S., Goto, E., and Mabuchi, K. (2010). Cryoprotective effect of low-molecular-weight hyaluronan on human dermal fibroblast monolayers. Cryo Letters 31, 101-111.
Claims (9)
1. Kryoprezervační médium pro kryoprezervaci kmenových buněk, buněčných linií a tkání z živých buněk, obsahující kyselinu hyaluronovou a/nebo její sodnou sůl a DMSO, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová a její sodná sůl má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozmezí 1 000 000 až 2 200 000 g/mol a přičemž kyselina hyaluronová a její sodná sůl je v médiu přítomna v koncentraci 0,08 až 0,2 % (v/w), a že DMSO je v médiu přítomen v koncentraci 3 až 5 % (v/v).
2. Kryoprezervační médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová a její sodná sůl mají molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 000 000 do 1 750 000 g/mol.
3. Kryoprezervační médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová a její sodná sůl mají molekulovou hmotnost 1 500 000 g/mol.
4. Kryoprezervační médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová a její sodná sůl jsou přítomny v koncentraci 0,1 % (v/w).
5. Kryoprezervační médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že DMSO je přítomen v koncentraci 3 % (v/v).
6. Kryoprezervační médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová a její sodná sůl jsou rozpuštěny ve standardním médiu vybraném ze skupiny obsahující DMEM, MEM v alfa modifikaci, RPMI-1640 a HBSS.
7. Kryoprezervační médium podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronová a její sodná sůl jsou rozpuštěny v RPMI-1640 nebo HBSS v modifikaci bez přídavku NaHCO3.
8. Použití kryoprezervačního média definovaného v kterémkoliv z nároků 1 až 7 pro kryoprezervaci kmenových buněk, buněčných linií a tkání z živých buněk.
9. Způsob kryoprezervace kmenových buněk, buněčných linií a tkání z živých buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
a) k buněčným kulturám kmenových buněk, buněčným liniím nebo tkáním z živých buněk se přidá kryoprezervační médium definované v kterémkoliv z nároků 1 až 7,
b) buněčné kultury, buněčné linie nebo tkáně v kryoprezervačním médiu z kroku a) se pomalu zamrazí pro následné uchovávání při -80 °C až -196 °C.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-148A CZ309774B6 (cs) | 2022-04-08 | 2022-04-08 | Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace |
| PCT/CZ2023/050017 WO2023193839A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-04-06 | Cryopreservation medium comprising hyaluronic acid, use thereof and method of cryopreservation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2022-148A CZ309774B6 (cs) | 2022-04-08 | 2022-04-08 | Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2022148A3 CZ2022148A3 (cs) | 2023-09-27 |
| CZ309774B6 true CZ309774B6 (cs) | 2023-09-27 |
Family
ID=86331032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2022-148A CZ309774B6 (cs) | 2022-04-08 | 2022-04-08 | Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309774B6 (cs) |
| WO (1) | WO2023193839A1 (cs) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056763A2 (en) * | 2003-12-04 | 2005-06-23 | University Of Utah Research Foundation | Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue |
| AU2013234396A1 (en) * | 2007-12-04 | 2013-10-17 | Proteobioactives Pty Ltd | Protection of progenitor cells and regulation of their differentiation |
| WO2020166711A1 (ja) * | 2019-02-15 | 2020-08-20 | イビデン株式会社 | 凍結保存液 |
-
2022
- 2022-04-08 CZ CZ2022-148A patent/CZ309774B6/cs unknown
-
2023
- 2023-04-06 WO PCT/CZ2023/050017 patent/WO2023193839A1/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056763A2 (en) * | 2003-12-04 | 2005-06-23 | University Of Utah Research Foundation | Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue |
| AU2013234396A1 (en) * | 2007-12-04 | 2013-10-17 | Proteobioactives Pty Ltd | Protection of progenitor cells and regulation of their differentiation |
| WO2020166711A1 (ja) * | 2019-02-15 | 2020-08-20 | イビデン株式会社 | 凍結保存液 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PILBAUEROVA, NELA, ET AL.: "Innovative Approach in the Cryogenic Freezing Medium for Mesenchymal Stem Cells", BIOMOLECULES, vol. 12, no. 5, 2022-04-20, pages 610, XP093056347, ISSN: 2218-273X, DOI: 10.3390/biom12050610 * |
| SCHMIDT, JAN, ET AL.: "Low molecular weight hyaluronic acid effect on dental pulp stem cells in vitro", BIOMOLECULES, vol. 11, no. 1, 2020-12-28, pages 22, XP093056609, ISSN: 2218-273X, DOI: 10.3390/biom11010022 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2022148A3 (cs) | 2023-09-27 |
| WO2023193839A1 (en) | 2023-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5998265B2 (ja) | トレハロース及びデキストラン含有哺乳動物細胞移植用溶液 | |
| WO2012063870A1 (ja) | 幹細胞懸濁液 | |
| US11889829B2 (en) | Mammalian cell cryopreservation liquid | |
| JP7401865B2 (ja) | 機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物 | |
| CZ309774B6 (cs) | Kryoprezervační médium obsahující kyselinu hyaluronovou, jeho použití a způsob kryoprezervace | |
| AU2020263769B2 (en) | Trehalose-containing liquid for mammalian cell preservation | |
| CZ306800B6 (cs) | Prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk | |
| Naaldijk et al. | Cryopreservation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in complex sugar based cryoprotective solutions | |
| WO2021193606A1 (ja) | アカルボース及びデキストランを含む哺乳動物細胞保存用液 | |
| Bahadori et al. | Cryopreservation of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells by two conventional and open-pulled straw vitrification methods | |
| Chen | Improving transport and storage of mesenchymal stem cells through investigations into their energy metabolism |