KR101816802B1

KR101816802B1 - Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주 유래 세포외다당을 함유하는 동결보호제

Info

Publication number: KR101816802B1
Application number: KR1020170058701A
Authority: KR
Inventors: 임정한; 김일찬; 한세종; 윤의중; 이홍금; 김성진; 강필성; 김정은; 김태경; 박하주; 송진행; 김민주; 홍주미; 조동규
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2018-01-11
Also published as: EP3401389A1; RU2019114407A3; US20180325101A1; CN108864315B; JP6768959B2; RU2019114407A; AU2017413156B2; US10993434B2; CA3043814C; JP2019530471A; CN108864315A; CA3043814A1; AU2017413156A1; WO2018207988A1

Abstract

본 발명은 극지방에서 서식하는 신규 균주인 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01균주(KCTC 12867BP) 균주 유래 세포외다당 및 이를 함유하는 세포의 동결보호용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 세포외다당은 동결보존 시, 우수한 세포 동결보호능을 가지고, 세포독성을 나타내지 않아, 기존의 고동도에서 세포독성을 나타내었던 동결보호제를 대체할 수 있다.

Description

Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주 유래 세포외다당을 함유하는 동결보호제{Cryoprotective Agent Containing Exopolysaccharide from Pseudoalteromonas sp. CY01}

본 발명은 극지방에서 서식하는 신규 균주인 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주 유래 세포외다당에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주 유래 세포외다당 및 이를 함유하는 세포의 동결보호용 조성물에 관한 것이다.

해양 환경에서 서식하는 세균들 중 많은 종류는 세포외다당(exopolysaccarides, EPS)이라는 점성의 세포외 탄화수소 폴리머를 분비한다. 해양 세균이 생산하는 대부분의 EPS는 6탄당, 5탄당, 아미노당 또는 uronic 산 등의 3 또는 4가지 종류의 단당이 10개 이상이 그룹으로된 반복단위로 이루어지는 이종다당(heteropolysaccarides)이다. EPS는 미생물을 추운 환경에서 보호하는 역할을 하며, 극지방의 추춘 환경의 세균들이 분비하는 EPS는 새로운 구조와 동결방지능을 가지는 경우가 많다.

북극해의 박테리아인 Pseudoalteromonas sp. SM20310와 남극 박테리아인 Pseudoalteromonas arctica KOPRI 21653에서 분비되는 EPS는 비극지방 박테리아인 대장균의 동결 융해주기(freeze-thaw cycle)에 대한 생존력을 향상시키는 것이 확인되어, 이들 세균의 EPS를 동결보호제(CPAs)로 사용가능성이 제시되고 있다(Liu, S. B. et al. Applied and environmental microbiology, 79:224, 2013; Kim, S. J. & Yim, J. H., J. Microbiology, 45:510, 2007).

얼음의 형성과 성장은 세포 수준에서 물리적인 손상을 초래할 뿐만아니라, 용액 내의 물 부피를 감소시켜, 세포외 용액의 농도 증가로 인한 삼투압 쇼크를 초래하며, 이는 빙점 이하의 기온에서 생물학적 물질을 보관할 때 문제가 된다.

재생의학과 장기이식이 급속도로 늘어나면서 공여 세포, 조직, 장기 및 적혈구(RBC)의 동결보존의 필요성이 증가되고 있다. 일반적으로 팩킹된 혈액은 동결보존 없이 ADSOL과 같은 복합등장용액에서 4℃조건으로 42일간 보관되며, 용혈현상이 높은 비율로 일어난다. 이는 글리세롤을 동결보호제로 사용하여 해결할 수 있으나 40% w/v 이상의 고농도의 글리세롤을 첨가하여 1℃/분의 냉각속도로 아주 천천히 냉각시켜 -80℃에서 보관하여야만 높은 적혈구 회복능을 간직할 수 있다.

그러나, 글리세롤은 해동 후 세척을 통하여, 1% 이하로 희석되어야만 세포에 독성이 없어지며, 이러한 글리세롤의 단점을 극복하기 위하여, 트레할로오스, 슈크로오스, 글루코오스, 라피노오스, 말토오스 등의 저분자 당을 포함하는 다른 동결보호제를 사용하는 시도가 계속되고 있으나, 이러한 방법은 삼투압이나 산화 등의 문제로 적혈구의 최종 동결효과에 영향을 미칠 수 있다. 해동 후의 복잡한 세척과정을 단순화시키기 위하여, 글리세롤을 대신하여, HES(hydroxyethyl starch), 폴리비닐프롤리돈 및 덱스트란과 같은 비침투성 첨가제를 사용하는 방법이 시도되고 있다(Scott, K. L. et al., Transfus. Med. Rev., 19:127, 2005; Stolzing, A. et al., Transfusion Apheresis Sci.,46:137, 2012; E.P. Horn et al., Anesth. Analg., 85:739,1997). 이러한 폴리머들은 세포막을 투과하지 못하고 세포막의 외부에만 존재하므로, 적혈구 동결 후 해동 시에 복잡한 세척 과정이 필요하지 않다. 그러나, 적혈구의 동결보존을 위하여는 20% w/v 이상의 고농도 HES 용액이 요구되고 이러한 고농도는 높은 점성을 초래하여 동결과정을 핸들링 하는데 어려움을 초래한다.

이에, 본 발명자들은 비침투성으로 세포독성이 낮으면서, 우수한 동결보호 효과를 가지는 동결보호제를 찾고자 예의 노력한 결과, 남극 해양에 서식하는 신규 균주인 Pseudoalteromonas sp. Strain CY 01(KCTC 12867BP) 균주가 생산하는 세포외다당(EPS)을 적혈구 동결보존 시에 첨가하는 경우, 다른 동결보호제(CPAs: Cryoprotective Agents)에 비해 상대적으로 낮은 농도에서 우수한 동결보호효과를 나타내고, 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 세포에 대한 동결보호능을 가지는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP) 균주 유래 세포외다당(p-CY01) 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Strain CY01 유래 세포외다당을 부분적으로 분해하여 수득되는 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당(p-CY01_LM) 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포외다당(p-CY01_LM)을 함유하는 동결보존 시의 세포의 동결보호용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포외다당(p-CY01_LM)을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 극지방에서 서식하고, 세포외다당을 생성하는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP) 균주를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)에 의해 생산되고, 글루코오스와 갈락토오스로 구성되어 있는 세포외다당(p-CY01)을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포외다당(p-CY01)을 산분해하여 수득되는 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당(p-CY01_LM)을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포외다당(p-CY01_LM)을 함유하는 동결보존 시의 세포의 동결보호용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)를 배양하여 세포외다당(p-CY01)을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 세포외다당(p-CY01)을 수득하는 단계를 포함하는 글루코오스와 갈락토오스로 구성되어 있는 세포외다당(p-CY01)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)를 배양하여 세포외다당(p-CY01)을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 세포외다당을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 세포외다당을 부분적으로 가수분해하는 단계를 포함하는 상기 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당(p-CY01_LM)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포외다당(p-CY01_LM)을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포외다당 생성능을 가지는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)를 제공한다.

본 발명의 세포외다당(p-CY01_LM)은 동결보존 시, 우수한 세포 동결보호능을 가지고, 세포독성을 나타내지 않아, 적혈구의 동결보존에 대해 기존의 고동도에서 세포독성을 나타내고 복잡한 해동과정을 요구하는 동결보호제를 대체할 수 있어 혈액의 냉동 장기보존에 효과가 있다.

도 1은 분리된 10개 균주의 EPS 생산능과 동결보호효과를 나타낸 것으로, 흰색 막대는 생산된 EPS를 나타내고, 검은 막대는 EPS의 대장균에 대한 동결보호효과(%)를 나타낸 것이다. 표준편차(ㅁSD)는 3번의 반복실험을 통하여 나타내었다.
도 2는 CY01 균주의 16sRNA 서열을 이용한 계통분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 CY01 유래 EPS의 크로마토그래피 피크를 나타낸 것으로, A는 음이온크로마토그래피 결과를 나타낸 것이고, B는 겔 여과 칼럼크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 겔 여과 칼럼크로마토 그래피로 수득된 CY01 유래 EPS 분획의 순수성을 HPLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A는 EPS의 구성 당 성분을 GS/MS로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 5의 B는 EPS의 구성 당의 결합양식을 GC/MS로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 A, B는 p-CY01을 저분자화 하여 수득된 p-CY01_LM의 ¹H and ¹³C NMR 스펙트럼을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 A, B는 저분자화 하여 수득된 p-CY01_LM의 2D-HSQC 스펙트럼으로 proton-carbon correlation을 확인한 결과이고, 도 7의 C, D, E, F는 2D-TOCSY, 2D-COSY, 2D-HMBC, 2D-NMR(600MHz)의 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 상기 GC/MS와 NMR 분석결과를 바탕으로 하여 p-CY01의 주요구조를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A는 p-CY01과 산분해 처리하여 저분자화 된 p-CY01_LM과의 크기배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이고, 도 9의 B는 p-CY01_LM 용액의 유동학적 성질의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다. #는 p-CY01을 *는 p-CY01_LM을 나타낸다.
도 10의 A는 동결보존액 내의 p-CY01_LM의 농도가 증가함에 따른 적혈구 용혈율(%)을 나타낸 것이고, 도 10의 B는 2.5% p-CY01_LM 용액에서 동결보존 후 해동된 적혈구의 온전율을 현미경으로 확인한 것이고, 도 10의 C는 PBS 용액에서 동결보존 후 해동된 적혈구의 온전율을 확인한 것이며, 도 10의 D는 p-CY01_LM 용액에서 장기간 동결보존 후 해동한 적혈구의 용혈율을 나타낸 것이다. 검은색 막대는 2.5% p-CY01_LM 용액에서 동결보존 후 해동된 적혈구의 용혈율(%)을 나타낸 것이고, 흰색 막대는 PBS 용액에서 동결보존 후 해동된 적혈구의 용혈율(%)을 나타낸 것이다.
도 11은 p-CY01_LM 용액에서 동결보존된 적혈구를 용혈시켜, ATP와 2, 3-DPG 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 A는 동결보존액에 첨가되는 각각의 성분에 대한 적혈구 보존능을 확인한 것으로, ADSOL은 ADSOL 용액을 나타내고, "G + D" 는 1% (w/v) 글리세롤과 DMSO, "p-CY01_LM"은 2.5% (w/v) p-CY01_LM 용액을 나타내며, ''G + D + p-CY01_LM''는 1%(w/v) glycerol, 1%(w/v) DMSO 및 2.5%(w/v) p-CY01_LM를 함유한 용액을 나타낸다. *는 각 성분을 ADSOL에 용해시킨 것을 나타낸다. 12의 B는 동결보존액에 첨가되는 각 성분의 적혈구 냉동보존에 대한 주 효과 분석을 Plackett??Burman 통계분석법을 이용해 결과로 나타낸 것이다. *는 statistical different 값이 0.05 이하임을 나타낸다.
도 13은 p-CY01_LM 용액의 DSC 분석결과를 나타낸 것으로, 도 13의 A는 음성대조군으로, 글리세롤 1% 및 DMSO 1% 용액이고, 13의 B는 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 0.5% p-CY01_LM 용액이고, 13의 C는 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 2.5% p-CY01_LM 용액을 나타낸다.
도 14는 p-CY01_LM 용액의 항동결능을 얼음 결정 형태분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 14의 A는 글리세롤 1% 및 DMSO 1%용액이고 도 14의 B는 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 2.5% p-CY01_LM을 포함하는 ADSOL 용액(p-CY01_LM 용액). 그리고 도 14의 C는 1% 글리세롤, DMSO 및 2.5% HES를 포함하는 ADSOL 용액에서 얼음 결정 형태분석 결과이다. 각 실험구의 1에서 2는 얼음 결정 씨앗이 냉각 되면서 얼음 결정의 형태가 커지는 것을 의미한다. 자는 10μm를 나타낸다.
도 15는 p-CY01_LM의 항동결능을 냉동 해동과정을 현미경상에서 관찰 하면서 적혈구의 잔존형태와 얼음 결정 형태 변화의 분석을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 PBS에서의 적혈구, (b)는 p-CY01_LM 용액에서의 적혈구, (c)는 1% 글리세롤, DMSO 및 2.5% HES를 포함하는 ADSOL 용액에서의 적혈구의 형태를 나타낸 것이다. 적혈구의 용혈 이미지는 각 단계에서 5분 후에 수득한 것이고, 자는 20μm를 나타낸다.
도 16은 p-CY01_LM의 얼음 재결정화 억제활성(IRI: ice recrystallization inhibition)을 확인한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 PBS, (B)는 p-CY01_LM 용액, (C)는 1% 글리세롤, DMSO 및 2.5% HES를 포함하는 ADSOL 용액을 나타낸 것이다. 자는 100μm를 나타낸다.

본 발명에서는 남극의 해수 샘플에서 세포외다당(Exopolysaccharide)을 생산하는 신규 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01을 분리하였다. CY01 균주가 생산하는 세포외다당이 초기 선별과정에서 대장균에 대하여 높은 동결보호효과를 가지는 것을 확인하였으며, 이러한 결과로 CY01 균주가 생산하는 세포외다당이 세포의 동결보존 시에 동결보호제로서 사용가능 한지를 확인하였다. 동결보존 시에 적합한 물성을 가지게 하기 위하여, CY01 유래 세포외다당을 부분적으로 산분해하여 저분자화한 후, 상기 저분자 세포외다당을 적혈구의 동결보존 시에 첨가한 결과, 높은 항동결능을 나타내고, 세포독성을 가지지 않는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)에 의해 생산되고, 글루코오스와 갈락토오스로 구성되어 있는 세포외다당에 관한 것이다.

본 발명에서는 남극 해수 샘플에서 분리된 2,980개 균주 중 점액성 세포외다당을 생산하는 73개 균주를 분리하고, 세포외다당 생산능이 우수한 10 균주를 선별하였다. 각 균주로부터 얻은 0.2%(w/w) 조 세포외다당 용액에서 대장균을 동결-해동 사이클을 수행한 후 대장균의 생존율을 확인하여 측정하고, 이들 10 균주 중 CY01 균주가 생산하는 조 세포외다당이 가장 높은 동결보호능을 나타내었다.

본 발명의 일양태에서, 0.2%의 CY01 균주 유래 조 세포외다당을 함유하는 용액에서 대장균의 생존율은 88.16±2.92% 이었으며, 다른 균주 유래의 조 세포외다당 함유 용액(0.2%)에서의 대장균의 생존율은 42.01±1.93%~67. 28±4.32% 이었다.

본 발명에 있어서, CY01 유래 세포외다당의 상기 글루코오스, 상기 갈락토오스의 몰랄 비는 약 3.4 : 1인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, CY01 유래 세포외다당의 glycosyl linkage 분석과 NMR 분석결과, 4-링크 글루코피라노스와 6-링크 갈락토피라노오스가 주된 구성으로 반복구조를 가지며 이 성분은 주쇄를 이루는 구성성분인 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 세포외다당을 산분해하여 수득되는 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당에 관한 것이다.

본 발명에서는 세포외다당을 동결보호제로 사용할 때에, 취급 시와 세척 시에 어려움을 초래하는 세포외다당의 높은 점도를 낮추고, 가용성을 높이기 위하여, 산분해를 수행하였다.

본 발명의 일양태에서는 CY01 유래 세포외다당(p-CY01)를 0.1M TFA 처리하고, 121℃에서 1시간 가열하여 산분해된 p-CY01(p-CY01_LM)을 수득하였으며, 그 결과, p-CY01의 평균분자량이 약 1.1 x 10⁷Da인 반면, 산에 의하여 부분 분해된 p-CY01_LM의 분자량은 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da 범위였으며, 저분자량화 된 p-CY01_LM 용액의 유동학적 성질의 변화에 따라 점도가 감소하고 가용성이 증가한 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 세포외다당을 함유하는 동결보존 시의 세포의 동결보호용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일양태에서는 p-CY01_LM과 동결보호제를 함유하는 적혈구 시료의 동결 시에, 냉각 속도를 조절하지 않았고(-80℃로 곧바로 냉각), -80℃에 보관하였다. 적혈구 시료는 40℃의 수조에서 급격 해동하였으며, 해동 후 p-CY01_LM의 동결보호제로서의 성능은 적혈구의 용혈 측정 및 광학현미경 분석을 통하여 확인하였으며, p-CY01_LM의 농도가 증가함에 따라 용혈율(%)이 감소하였고, 2.5%∼4.0%의 p-CY01_LM에서 9.08±0.37%∼5.64±0.96%의 용혈율을 나타내었으며, 3.5%의 p-CY01_LM을 사용하였을 때 가장 낮은 용혈율(5.40%)을 나타내었다. 즉, 2.5%∼4.0%의 p-CY01_LM에서 해동 후 90%의 RBC가 온전한 상태를 나타내는 것을 확인하였다(도 7 A).

본 발명에서 동결보존되는 물질은 세균, 진균, 동물세포, 식물세포, 적혈구, 혈소판, 정모세포, 난모세포, 조직, 장기 등일 수 있다.

본 발의 조성물은 조직 및 장기를 구성하는 세포들의 경우도 동결로부터 보호할 수 있다.

본 발명의 동결보호용 조성물은 글리세롤 또는 DMSO를 추가로 함유하거나, 글리세롤 및 DMSO를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는, p-CY01_LM이 장기(long-term) 동결 보존에서 수혈 가능한 동결보호제로서 글리세롤을 대체할 수 있는 지를 확인하였으며, 2.5%(w/v) p-CY01_LM, 1%(v/v) 글리세롤 및 1%(v/v) DMSO를 함유한 ADSOL(이하, p-CY01_LM 용액이라 함)에서 적혈구를 -80℃로 급송냉각 후 1시간 보존 후의 적혈구 용혈율은 6.09±0.64% 였고, 5달 보관 후의 용혈율은 7.24±2.15% 로 5달의 보간기간 용혈율에는 변화가 거의 없었다(도 7 D).

또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, (a) Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주(KCTC 12867BP)를 배양하여 세포외다당을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 세포외다당을 수득하는 단계를 포함하는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)에 의해 생산되고, 글루코오스와 갈락토오스로 구성되어 있는 세포외다당의 제조방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, (a) Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)를 배양하여 세포외다당을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 세포외다당을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 세포외다당을 부분적으로 가수분해하는 단계를 포함하는 상기 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당의 제조방법에 관한 것이 다.

본 발명에 있어서, 상기 가수분해는 약산에 의한 산분해인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (c) 단계는 열처리를 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 세포외다당을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 동결은 10℃/분~ 196℃/분의 넓은 동결속도의 범위를 가지는 급속 동결인 것을 특징으로 하는 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 남극에 서식하고, 점액성 세포외다당을 생성하는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 (KCTC 12867BP)에 관한 것이다.

본 발명의 CY01 균주는 16S rRNA 서열을 통한 계통학적 분석을 통하여, 남극에 많이 존재하는 Pseudoalteromonas 속 균주로 분류되었다(도 2). CY01 균주는 Pseudoalteromonas paragorgicola KMM 3548T (99.52%), P. nigrifaciens NCIIMB 8614T (99.51%) 및 P. agarivorans KMM 255T (99.38%)와 높은 상동성을 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 동결보호능을 가지는 세포외다당을 생산하는 균주의 스크리닝 및 동정

남극 해수 샘플에서 분리된 2,980개 균주를 직접 제작한 S-ZoBell(pH 7.0) 아가 플레이트를 사용하여, 15℃에서 3일간 배양하였으며, 점액성 세포외다당을 생산하는 73개 균주를 분리하였다. 분리된 균주에 의해 생성되는 세포외다당의 생산량은 S-ZoBell(pH 7.0) 액체 배지를 사용하여, 15℃에서 3일간 배양하고 세포외다당을 추출하여 동결건조 후 건조무게를 측정하여 확인하였다. 동결보호능은 각 균주로부터 얻은 0.2%(w/w) 조 세포외다당 용액에서 대장균을 동결-해동 사이클을 수행한 후 대장균의 생존율을 확인하여 측정하였다.

분리된 균주 중 10개의 균주가 1g/L이상의 조 세포외다당(crude EPS)을 생성하였으며, 이들 균주가 생산하는 조 세포외다당의 범위는 1.04±0.18g/L ~ 2.04±0.13g/L 이었으며, 이들 10 균주 중 RosPo13 균주가 2.04g/L로 가장 높은 세포외다당 생산능을 보였고, CY01 균주가 생산하는 조 세포외다당이 가장 높은 동결보호능을 나타내었다(도 1).

0.2%의 CY01 균주 유래 조 세포외다당을 함유하는 용액에서 대장균의 생존율은 88.16±2.92% 이었으며, 다른 균주 유래의 조 세포외다당 함유 용액(2%)에서의 대장균의 생존율은 42.01±1.93%~67. 28±4.32% 이었다.

CY01 균주는 16S rRNA 서열을 통한 계통학적 분석을 통하여, 남극에 많이 존재하는 Pseudoalteromonas 속 균주으로 분류되었다(도 2). CY01 균주는 Pseudoalteromonas paragorgicola KMM 3548T (99.52%), P. nigrifaciens NCIIMB 8614T (99.51%) 및 P. agarivorans KMM 255T (99.38%)와 높은 상동성을 나타내었다.

실시예 2: CY01 균주 유래 세포외다당의 정제 및 정제된 세포외다당 특성확인

세포외다당 CY01 균주 배양물로 부터 에탄올 침전을 통하여 분리하였으며, 프로테아제를 처리하여 단백질을 제거하였으며, 수득된 조 세포외다당은 DEAE-Sepharose 칼럼을 이용한 음이온 크로마토그래피를 통하여 세포외다당 함유 분획을 수득하였으며(도 3 A), 수득된 세포외다당 분획은 Sepharose 4B-gel filtration 크로마토그래피 칼럼으로 정제하여(도 3 B), 단일 분획을 수득하였다. 분획에 포함된 세포외다당 농도는 Anthrone-sulfuric acid 분석방법으로 OD ₆₃₀에서 측정하였다.

상기 수득된 분획으로 HPLC(Agilent, USA)를 수행하였다. HPLC는 세포외다당 분획을 증류수에 녹인 용액(0.1% w/w) 5μl를 주입하여 0.4ml/분의 유속으로 수행하였으며, RI(Refractive index, Agilent, USA) 검출기를 사용하여 검출하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 단일의 피크가 검출되었으며, RI를 이용해 크기배제크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 정제된 세포외다당의 분자량을 측정한 결과, 평균 분자량 약 1.1 x 10⁷Da 이였으며, CY01 균주 유래 정제된 EPS는 p-CY01으로 명명하였다.

GC/MS를 이용하여, 세포외다당의 당 구성 분석을 수행하였다. 분석은 Clarus 500(Perkin-Elmer,USA)을 이용하여, 질량 선택 검출기와 electron impact ionization mode로 수행하였다.

그 결과, 도 5 A에 나타난 바와 같이, p-CY01은 글루코오스와 갈락토오스로 구성되어 있었으며, 글루코오스가 많은 당 성분이었으며, 글루코오스:갈락토오스의 몰랄 비는 약 3.4 : 1이었다.

도 5 B와 표 1에 나타난 바와 같이, p-CY01의 glycosyl linkage 분석결과, 4-링크 글루코피라노스와 6-링크 갈락토피라노오스가 주된 구성으로 확인되었으며, 마이너 피크로 말단에 링크된 갈락토피라노오스와 말단에 링크된 글루코피라노오스, 3,4-링크 글루코피라노오스 및 4, 6-링크 갈락토피라노오스가 확인되었다.

p-CYO1에 대하여 1D 및 2D NMR 구조 결정 실험은 Bruker AVANCE (600 MHz) spectrometer를 이용하였고, 시료는 25ㅀC 조건에서 ¹H NMR은 600 MHz에서 ¹³C NMR은 150 MHz에서 측정하였다.

NMR 분석을 통하여, p-CY01의 ¹H and ¹³C NMR 스펙트럼(도 6A, B)으로부터 전형적인 폴리글루코피라노스와 폴리갈락토피라노오스의 peak 양식을 확인할 수 있었다. 특히, p-CY01은 →4)-β-D-Glcp-(1→와 →6)-α-D-Galp-(1→의 반복 단위가 주성분이었으며 다른 가지결합(side chain)의 peak는 상대적으로 너무 작거나, 주 반복 유닛의 peak에 중첩되는 것으로 확인하였다. 또한 2D-HSQC 스펙트럼(도 7A, B)으로부터 proton-carbon correlation을 하였으나 2D-TOCSY, 2D-COSY, 2D-HMBC, 2D-NMR(600 MHz)으로 부터는 주성분인 글루코피라노스와 갈락토피라노오스의 correlation 이외에는 특이할만한 정보를 확인하기는 어려웠다(도 7 C∼F). 상기의 glycosyl linkage 분석결과와 NMR 스펙트럼의 분석결과를 종합하여 p-CY01의 주요 구조를 확인하였다(도 8). p-CY01은 분석결과, 4-링크 글루코피라노스와 6-링크 갈락토피라노오스가 주된 구성으로 반복구조를 가지며 III의 [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]n의 연결 구조와 II의 [→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→]n의 연결 구조가 반복적으로 이어져 주쇄를 이루는 구조인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한 주쇄의 곁가지 구조로 I: T-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1,4→ 연결 구조를 소량 가지는 것으로 확인하였다.

실시예 3: 세포외다당의 가수분해에 따른 분자량 변화 및 유동학적(rheological) 특징 분석

세포외다당이 가지는 높은 점성과 낮은 용해성은 생물산업에 적용하는 장애가 되므로, 폴리머의 분해를 통해 평균 분자량의 감소가 점성을 낮추고 가용성을 증가시킬 수 있다. 최근, PVA를 고농도로 사용하여 난자와 적혈구를 동결 보전하는 경우, 용액의 높은 점성 때문에 취급하기가 쉽지 않고 세척을 수행하여야 하는 단점이 있었다(Deller, RC et al., Nat. Commun., 5:3244, doi:10.1038/ncomms4244, 2014).

본 실시예에서는 폴리머가 가지는 이러한 단점을 극복하기 위하여, 본 발명의 p-CY01의 분자량을 약산 분해를 통하여 조절하였다. p-CY01을 0.1M의 TFA(Trifluoroacetic acid)와 함께 121℃에서 1시간 가열하여 산분해 p-CY01을 수득하고, 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)를 수행하였다. 그 결과, TFA 처리를 하지 않은 p-CY01은 19~25분 사이에 GPC칼럼에서 용출되었으며, TFA와 열 처리된 p-CY01의 경우는 주된 피크는 33분과 37분에 용출되었으며, 51분에도 용출되었다(도 9 A). 33분과 37분의 고분자량 피크는 p-CY01이 부분적으로 분해된 분획이고, 51분에 나타낸 피크는 단당(monossaccharide)으로 분해된 것이다. p-CY01의 평균분자량이 약 1.1 x 10⁷Da인 반면, 산에 의하여 부분 분해된 p-CY01의 분자량은 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da이었다.

저분자량 p-CY01(p-CY01_LM) 용액의 유동학적 성질의 변화를 확인하였다.

유동학적 성질은 스핀들 S18을 이용하여 Brookfield 점도계로 측정하였으며, 서로 다른 전단 속도에 대한 p-CY01, PBS 및 p-CY01_LM 용액(0,2%, 2,5% 및 5.0%, w/v)의 전단 스트레스(shear stress)를 확인하였다.

그 결과, 도 9 B에 나타난 바와 같이, 0.2% p-CY01 용액의 경우는 전단속도가 증가함에 따라 전단스트레스도 증가하였으나, p-CY01_LM의 경우는 높은 전단속도에서 전단 스트레스가 증가하지 않았다. 이는 p-CY01_LM의 점도가 현저히 감소한 것을 나타내며, 이러한 점도의 감소는 p-CY01의 분자량 변화에 의한 것이다. 세포외다당이 분해되고, 비다량체화(depolymerization)되면, 점도가 감소하고, 가용성이 증가하게 된다.

실시예 4: p-CY01_LM에 의한 인간 적혈구(RBC)의 동결보존

적혈구는 ADSOL과 함께 4℃에서 32일 동안 보존할 수 있으며, 적혈구는 Haemonetics ACP215에서 탈글리세롤 작업을 수행하고, ADSOL에서 보관하면 4℃에서 3일간 1% 미만 용혈도를 가지면서 보관할 수 있다. 글리세롤은 세포내 동결보호제이고, 적혈구의 용혈을 방지하기 위하여, 해동 후 세척을 통하여 글리세롤의 최종 농도는 1%로 감소시켜야 한다.

DMSO는 인간 혈소판과 적혈구의 동결보존제로 FDA에서 승인하여 사용되고 있다. 따라서, 이하의 p-CY01_LM의 동결보존 실험에서는 글리세롤과 DMSO을 함께 사용하였으며, PBS를 대신하여 ADSOL을 동결보존 버퍼용액으로 사용하였다.

임상에서, 적혈구는 40%의 높은 글리세롤 농도를 사용하여 저속도 냉각(1℃/분)하여 -80℃에서 보관하거나 액체질소에서 보관하는 것이 높은 적혈구 회수율을 나타낼 수 있다. 아울러, 세포외 다당 동결보호제(PVP, HES)는 액체질소에서의 물리적인 동결 및 보관과정이 요구된다.

본 실시예에서는 적혈구 시료를 동결할 때에, 냉각 속도를 조절하지 않았고(-80℃로 곧바로 냉각), -80℃에 보관하였다. 적혈구 시료는 40℃의 수조에서 급격 해동하였으며, 해동 후 용혈을 Drabkin's 어세이를 통하여 정량하였다.

p-CY01_LM의 동결보호제로서의 성능은 적혈구의 용혈 어세이 및 광학현미경 분석을 통하여 확인하였다.

도10 A에 나타낸 바와 같이, p-CY01_LM의 농도가 증가함에 따라 용혈율(%)이 감소하는 것을 알 수 있다. 2.5%~4.0%의 p-CY01_LM에서 9.08±0.37%∼5.64±0.96%의 용혈율을 나타내었으며, 3.5%의 p-CY01_LM을 사용하였을 때 가장 낮은 용혈율(5.40%)을 나타내었다. 즉, 2.5%∼4.0%의 p-CY01_LM에서 해동 후 90%의 RBC가 온전한 상태를 나타내는 것으로 확인되었으며, 미국혈액은행연합(American Association of Blood Bank)의 표준은 80%의 즉시 생존율(20% 미만의 용혈율)과 수혈 세포의 70%가 24시간 생존하는 것을 조건을 요구하고 있다.

2.5%(w/v) p-CY01_LM와 1%(v/v) 글리세롤 및 1%(v/v) DMSO를 함유한 ADSOL에서 9.08±0.37%의 용혈(90.92%의 해동 후 적혈구 온전율)을 나타내었고(도 10 A, B), PBS에서의 용혈율은 92.48±6.49%(7.52%의 해동 후 적혈구 온전율)을 나타내었다(도 10 A, C).

그러므로, 2.5% p-CY01_LM를 적혈구 동결보존에 최적 농도로 선택하였다.

p-CY01_LM이 장기(long-term) 동결 보존에서 수혈가능한 동결보호제로서 글리세롤을 대체할 수 있는 지를 확인하였다. 도 10 D에 나타난 바와 같이, 2.5%(w/v) p-CY01_LM, 1%(v/v) 글리세롤 및 1%(v/v) DMSO를 함유한 ADSOL(이하, p-CY01_LM 용액이라 함)에서 적혈구를 -80℃로 급속냉각 후 1시간 보존 후의 적혈구 용혈 율은 6.09±0.64% 였고, 5달 보관 후의 용혈율은 7.24±2.15% 로 5달의 보간기간 용혈율에는 변화가 거의 없었다.

아울러, p-CY01_LM 용액에서 실온으로 1시간 보관된 적혈구의 용혈율은 2% 미만(98% 이상의 적혈구 온전율)으로 유지되었으며, 동결보관 작업수행 과정에서 이는 세포독성이나 용혈이 일어나지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5: p-CY01_LM으로 동결된 적혈구의 생화학적 성질 측정

적혈구의 ATP 수준은 적혈구막의 오목한 모양을 유지하는 지와 적혈구 막의 역학적 변동증가를 확인할 수 있다. ATP 수준과 헤모글로빈의 산소친화도를 조절하는 2, 3-DPG(2, 3-diphosphoglycerate)의 수준을 측정하여 세포 기능과 적혁구의 치료적 유용성 수준을 확인하였다.

양성대조군으로는 신선 적혈구의 용혈액의 ATP와 2, 3-DPG 활성을 측정하였으며, 시험군으로 p-CY01_LM 용액에서 -80℃, 1시간 동결보관한 적혈구의 용혈액의 ATP와 2, 3-DPG 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, p-CY01_LM 용액에서 동결보관된 적혈구의 경우 ATP 활성에 있어서 양성대조군과 차이가 거의 없었다. p-CY01_LM 용액에서 동결보관된 적혈구의 ATP 활성은 2.50±0.06 μmol/gHb ~ 2.26±0.19 μmol/gHb이었고, 음성대조군인 PBS에서 동결보관된 적혈구의 ATP 활성은 0.18±0.02 μmol/gHb로 크게 감소하였다. 2,3-DPG의 농도는 신선 적혈구의 경우, 4.26±0.24 μmol/gHb이었고, p-CY01_LM 용액에서 동결보관된 적혈구는 3.98±0.47 μmol/gHb 이었으며, PBS에서 동결보관 한 경우는 0.78±0.92 μmol/gHb이었다.

신선 적혈구와 p-CY01_LM 용액에서 동결 보관된 적혈구사이에는 ATP 및 2, 3-DPG 농도에서 큰 차이가 없었다.

실시예 6: 주요 동결첨가제의 확인 및 적혈구 동결보존에서의 주된 효과분석

적혈구 동결보존에서, 각각의 동결보호제의 효과를 분석하기 위하여, ADSOL 단독, 1% (w/v) 글리세롤과 1% (w/v) DMSO 용액(G + D), 2.5% (w/v) p-CY01_LM 용액, 및 "1%(w/v) 글리세롤, 1%(w/v) DMSO 및 2.5%(w/v) p-CY01_LM을 함유한 용액(G + D + p-CY01_LM)의 적혈구 보존능을 용혈율로 확인하였다.

그 결과, 도 12 A에 나타낸 바와 같이, 1% (v/v) 글리세롤 및 DMSO를 함께 함유한 용액에서는 용혈수준이 76.29±2.95%로 음성대조군인 PBS나 ADSOL을 사용하였을 때와 비교하여 큰 차이가 없었으며, 2.5%(w/v) p-CY01_LM을 단독으로 함유하는 용액의 경우는 적혈구 용혈율이 18.73±1.86%로 현저히 낮은 용혈율을 나타내었으며, 1%(w/v) 글리세롤, 1%(w/v) DMSO 및 2.5%(w/v) p-CY01_LM을 함유한 용액은 9.43±2.16%의 낮은 용혈율을 나타내어 가장 우수한 동결보호효과를 나타내었다.

Packett-Burman 방법을 이용하여 적혈구 동결보호에 대한 각 보호제 성분의 적혈구 냉동보호에 대한 주효과 수치(main effect value)를 구하였다.

도 12 B와 표 2에 나타난 바와 같이, 1(%) 글리세롤, 1(%) DMSO, ADSOL 및 2.5%(w/v) p-CY01_LM은 적혈구 동결보존에서 양(+)의 주된 효과를 나타내었으나, 각각의 주효과수치는 글리세롤은 2.32이고, DMSO는 2.62이며, ADSOL은 5.82이고, p-CY01_LM은 51.69로 적혈구 동결보존에서 사용되는 p-CY01_LM의 적용농도는 글리세롤이나 DMSO 보다 단지 2.5배 이지만 적혈구 동결보존에 관여하는 주효과는 19배 이상이었다. 이때, ADSOL과 p-CY01_LM은 P값(P-value)이 0.05이하로 글리세롤이나 DMSO에 비해 유의도가 높은 인자로 확인되었다.

실시예 7: p-CY01_LM의 DSC(differential scanning calorimetry) 분석

p-CY01_LM 용액의 냉각 및 해동에서의 DSC 분석을 수행하였다(도 13). 각 시료는 +5℃에서 -78℃까지 40℃/분의 속도로 냉각하였으며, 2℃/분의 속도로 해동하였다.

1% 글리세롤과 1% DMSO 용액(도 13 A)과 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 (0.5~2.5%) p-CY01_LM 용액(도 13 B, C)에 대하여 DSC 분석을 실시하였다. 음성대조군인 1% 미만의 저농도의 글리세롤과 DMSO만을 사용한 경우, 엔탈피 변화량은 212.0±3.8(J/g)로 종래의 고농도 글리세롤과 DMSO(10~40%)사용하였을 때 가지는 동결보호 메카니즘 처럼 엔탈피 변화량 ??H(J/g)이 현저히 감소하여 동결 시의 얼음 형성량을 감소시키는 작용을 하지 못하는 것을 확인하였다 (표 3). 글리세롤 1% 및 DMSO 1% 용액의 초냉각점(super cooling point)는 -14.2℃이고, 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 0.5% p-CY01_LM 용액의 초냉각점은 -13.9℃이고, 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 2.5% p-CY01_LM 용액의 초냉각점은 ??32.1℃이다. 표 3에는 상기 각 실험구의 냉각과 해동 온도와 동결에 따른 엔탈피 변화를 나타내었다. 그중 1% 글리세롤, 1% DMSO 및 2.5% p-CY01_LM 용액에서 냉각 및 해동 온도가 현저한 하강하였으며, 엔탈피 변화량 ??H(J/g)이 52.81±8.7(J/g)로 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (표 3). 이러한 현상은 동결-해동 사이클 동안 물에서 얼음으로 형성 될 수 있는 총량이 감소함을 의미하며, p-CY01_LM이 가지는 항동결 기작이다.

^α G, ^β D 는 글리세롤과 DMSO를 나타내고, 모든 실험은 ADSOL에 용해시켜 수행하였다. ± SD 는 3반복 실험하여 수행하였다.

실시예 8: p-CY01_LM 용액의 얼음 형성 저해

동결 과정의 얼음결정 성장 저해(Ice crystal growth inhibition) 분석을 통하여 p-CY01_LM의 항동결능을 확인하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, p-CY01_LM 용액(1% 글리세롤, DMSO, 2.5% p-CY01_LM을 함유하는 ADSOL) 내의 얼음결정 씨앗(도 14 B1)은 온도가 냉각됨에 따라 얼음결정의 성장이 저해 되어 6각 별(도 14 B2) 형태로 얼음결정이 성장하였다. 이러한 현상은 항동결 단백질(Antifreezing protein)에서 흔히 나타나는 현상으로 p-CY01_LM이 가지는 항동결 기작이다. 반면 대조군(1% 글리세롤 및 DMSO를 포함하는 ADSOL)과 HES 용액(1% 글리세롤, DMSO, 2.5% HES를 함유하는 ADSOL)에서는 얼음결정의 성장이 저해 받지 않아, 동그랗거나, 평평한 얼음결정으로 성장하여(도 14 A1- A2 및 C1-C2) 얼음결정 성장 저해에 따른 항동결효과가 관찰되지 않았다. 또한, 음성대조군인 물의 초냉각점이 -15.9℃인 반면, p-CY01_LM 용액의 초냉각점은 표 3에 나타난 바와 같이, -30.5℃이다. 이러한 결과는 p-CY01_LM의 항동결 효과라 할 수 있다.

실시예 9: 냉동과 해동 시의 적혈구에 대한 실시간 동결현미경 관찰

IRI(ice recrystallization inhibition) 어세이를 통해 해동시의 얼음결정의 크기를 분석하였다. 얼음 재결정화 저해제가 존재하는 경우 해동시 재결정화 되는 얼음 결정의 크기가 크게 자라지 못할 것이다. 따라서 본 실시예는 동결 현미경을 사용하여 적혈구를 동결하고 해동하는 과정 중 적혈구세포와 얼음결정을 이미징하였다. 적혈구를 2.5%의 p-CY01_LM을 포함하는 ADSOL 용액과 2.5%(v/v)의 HES를 포함하는 ADSOL 용액에서 25℃/분의 속도로 -40℃로 냉각하였다. 상기 샘플을 25℃/분의 속도로 -6℃로 온도를 상승한 후 5분간 두면서 사진을 촬영하였다.

도 15는 2.5%의 p-CY01_LM의 유무에 따른 적혈구와 얼음결정의 재결정화 형태의 이미지를 나타낸 것이다. PBS(도 15 A)나 2.5% HES가 첨가된 용액(도 15 C)보다 2.5%의 p-CY01_LM가 존재할 때(도 15 B) 재결정화된 얼음의 크기가 현저히 작았으며 특히, 완전히 해동 되었을 때, 적혈구의 형태가 온전히 유지되어 있는 것을 확인하였다(도 15 A4, B4, C4).

이러한 결과는 p-CY01_LM의 IRI 활성을 측정하여 재확인 하였다. 직경 10μm 미만의 다핵성 얼음 웨이퍼를 -6℃에서 30분간 성장시킨 후, 얼음 결정 크기를 대조군(PBS)과 비교하여 확인하였다.

도 16에 나타난 바와 같이, PBS(도 16 A), 2.5%(w/v) p-CY01_LM (도 16 B)및 2.5%(v/v) HES(도 16 C)에 대하여 측정한 결과, p-CY01_LM 함유 용액이 동일농도에서 뚜렷한 IRI 활성을 나타내어 얼음 재결정화를 억제하였으며, HES는 상대적으로 별다른 억제효과를 나타내지 못했다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC12867BP

수탁일자 : 20150715

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주(KCTC 12867BP)에 의해 생산되고, 글루코오스 및 갈락토오스가 3.4 : 1의 몰랄 비로 구성되어 있고, 동결보존시 세포 보호능을 가지는 세포외다당.
삭제
제1항의 세포외다당을 산분해하여 수득되는 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당.
제1항 또는 제3항의 세포외다당을 함유하는 동결보존 시의 세포의 동결보호용 조성물.
제4항에 있어서, 글리세롤 또는 DMSO를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음 단계를 포함하는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주(KCTC 12867BP)에 의해 생산되고, 글루코오스 및 갈락토오스가 3.4 : 1의 몰랄 비로 구성되어 있고, 동결보존시 세포 보호능을 가지는 세포외다당의 제조방법:
(a) Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주(KCTC 12867BP)를 배양하여 세포외다당을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 세포외다당을 수득하는 단계.
다음 단계를 포함하는 제3항의 분자량 1.0x10⁵∼4.3x10⁵Da의 저분자 세포외다당의 제조방법:
(a) Pseudoalteromonas sp. Strain CY01 균주(KCTC 12867BP)를 배양하여 세포외다당을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 세포외다당을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 생성된 세포외다당을 가수분해하는 단계.
제7항에 있어서, 가수분해는 약산에 의한 산분해인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, (c) 단계는 열처리를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항의 세포외다당을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존방법.
제1항의 세포외다당 생성능을 가지는 Pseudoalteromonas sp. Strain CY01균주 (KCTC 12867BP).