KR101501212B1 - 항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 테트라오도니스 유래의 세포외다당체 - Google Patents

항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 테트라오도니스 유래의 세포외다당체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 슈도알테로모나스 테트라오도니스 (Pseudoalteromonas tetraodonis) 유래의 항동결능을 가지는 세포외다당체 및 이를 함유하는 항동결용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포외다당류 및 이를 함유한 항동결 조성물은 저온에서 우수한 세포 보존력을 나타내므로, 조직의 손상을 최소화하면서 세포 및 조직을 포함하는 생물학적 시료를 냉장 및 냉동 상태로 보호 또는 보존하는데 유용하다.

Description

항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 테트라오도니스 유래의 세포외다당체 {Cryoprotective Exopolysaccharide from Pseudoalteromonas tetraodonis}
본 발명은 슈도알테로모나스 테트라오도니스 (Pseudoalteromonas tetraodonis) 유래의 항동결능을 가지는 세포외다당체 및 이를 함유하는 항동결용 조성물에 관한 것이다.
북극과 남극 같은 극한의 기후환경에서는 동결 및 해동의 순환이 지속적으로 이루어지므로, 이 지역에 서식하는 미생물은 세포를 손상시키는 이와 같은 프로세스에 적응하여 진화한 것으로 예상된다(Mazur et al ., Science. 168:939-949, 1970).
세포외다당체(EPS)는 미생물에서 생산되는 당분자 단위체로 구성된 고분자 폴리머로서, 균체 외부로 분비되어 균체를 둘러싸 극한의 저온 환경에서도 균체를 보호하는 역할을 하며(Decho et al ., Oceano Mar Biolo . 28:73153, 1990), 미생물들은 생물막을 형성하고 있다(Nichols et al ., J App Microbiol . 96:10571066, 2004). 세포외다당체의 물리, 화학 및 유변학적 특성은 분자량 결정하는 폴리머 사슬의 길이에 따라 차이가 있으며, 폴리머 길이가 길수록 폴리머 분자 사이의 내부결합이 더욱 커지고, 이는 폴리머의 4차 구조 및 물리적 특성을 결정한다(Sutherland et al ., Biotechnol Adv . 12:393448, 1994). 남극의 토양에서 분리한 진균류인 Phomaherbarum은 분자량이 7.4x106Da인 글루코스 호모사카라이드(glucose homosaccharide)를 분비하며, 이 세포외다당체는 남극 혹한에서 항동결 물질로서의 기능을 가지는 것으로 추정되고 있다(Selbmann et al ., Res Microbiol . 153:585 592, 2002).
세포의 냉동보존을 위한 항동결 물질로는 글리세롤 및 DMSO가 사용되고 있으며(Hubalek et al ., Cryobiol . 46:205229. 2003), 이외 다른 동결보호제(CPA, cryoprotective agents)들은 높은 독성으로 인해 세포 보존에 적합하지 않다(Fahy et al ., Cryobiol . 23(1):113, 1986). 또한, 트레할로스와 수크로스 같은 탄수화물 CPA들은 세포막 침투와 세포 안정화 역할을 하지 못하는 것으로 알려져 있다(Crowe et al ., Biochim Biophys Acta. 769:141150, 1984). 따라서, 독성이 없고 항동결능이 우수한 새로운 동결방지제의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 북극 해양에서 분리한 슈도알테로모나스 테트라오도니스 균주로부터 세포외다당체를 분리하고, 이를 이용하여 E. coli를 대상으로 동결-해동 시키는 실험 환경에서 세포 생존율을 측정한 결과, 상기 세포외다당체가 세포 생존력 및 보존력이 현재 일반적으로 사용하는 보존법과 비교해 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 세포외다당체를 생산하는 Pseudoalteromonas tetraodonis, 상기 균주 유래 세포외다당체 및 상기 세포외다당체를 함유하는 항동결용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루코스, 갈락토스 및 만노스가 1.5 : 1.0 : 0.3의 몰비로 구성되는 것을 특징으로 하는 항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 속 균주 유래의 세포외다당체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 항동결용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 세포외다당류 및 이를 함유한 항동결 조성물은 저온에서 우수한 세포 보존력을 나타내므로, 조직의 손상을 최소화하면서 세포 및 조직을 포함하는 생물학적 시료를 냉장 및 냉동 상태로 보호 또는 보존하는데 유용하다.
도 1은 북극해에서 분리된 세포외다당류를 생산하는 미생물 중 항동결능이 가장 우수한 미생물을 선별하기 위하여 각 미생물의 정제 전 단계의 크루드 세포외다당체 0.5%(w/v) 용액에서 E. coli의 동결-해동을 3번 수행한 후, E. coli의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 ArcPo20의 16S rDNA을 기준으로 작성한 슈도알테로모나스 속의 계통도이다.
도 3은 P-ArcPo20의 TMS methyl glycoside 유도체의 가스 크로마토그래피-FID 분석 결과이다. 각 피크는 세포외다당류를 구성하는 단당체를 나타낸다(Man: 만노스, Gal: 갈락토스, Glu: 글루코스)
도 4는 실험실에서 배양한 ArcPo20 미생물이 생산한 P-ArcPo20의 퓨리에 변환 적외선 스펙트럼 결과이다.
도 5는 E. coli의 생존율을 정제된 0.5%(w/v) P-ArcPo20과 일반적으로 알려진 보존법인 20%(w/v) 글리세롤에서 비교한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 남극 해양에서 분리한 다수의 미생물에서 세포외다당체를 분비하는 미생물을 선별하고, 이 중에서 세포외다당체 생산량과 E. coli에 대한 항동결능이 우수한 균주를 분리하여, 16S rDNA 서열분석을 실시하였다. 그 결과, 분리된 균주는 Pseudoalteromonas tetraodonis IAM14160(T)의 16S rDNA 서열과 100% 일치하는 것으로 확인되었다.
상기 슈도알테로모나스 균주로부터 분리한 세포외 다당체는 HPLC를 이용하여 젤침투크로마토그래피, 가스크로마토그래피 및 푸리에 변환 적외선 분광법으로 고유 특성을 분석하였다. 또한 0.5%(w/v)의 낮은 농도에서 E. coli를 혼합하여 여러 번의 동결-해동 과정을 가하였으나 E. coli에 대한 항동결능을 분석한 결과, 90% 이상의 세포 생존력을 보이는 매우 우수한 항동결능을 가지는 것으로 나타났다.
본 발명은 일 관점에서, 글루코스, 갈락토스 및 만노스가 1.5 : 1.0 : 0.3의 몰비로 구성되는 것을 특징으로 하는 항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 속 균주 유래의 세포외다당체에 관한 것이다.
본 원의 용어 항동결능은 저온에서 조직 또는 세포내에 얼음결정 형성에 의한 손상으로부터 보호하는 능력을 말하며, 항동결능을 가진 기질에 노출됨으로써 이러한 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 슈도알테로모나스 속 균주는 Pseudoalteromonas tetraodonis ArcPo20이며, 1.0x107Da의 분자량을 갖는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 항동결용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항동결용 조성물은 상기 세포외다당체가 0.5(w/v)% 함유되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 항동결용 조성물은 세포, 배아, 인간 또는 동물 유래의 조직, 미생물, 식물체 등을 포함하는 생물학적 시료의 냉장 또는 냉동 상태가 유지되는 동안 시료의 활성이 유지되도록 보호(cryoprotective) 및 보존(cryopreservation)의 용도로 사용할 수 있다.
상기 항동결용 조성물은 본 발명의 세포외다당체 외에 생물학적 시료의 최적의 냉장보존 상태를 유지하기 위하여, 종래의 시판되는 BSM(balanced salt media), 비전해질, 시트르산, 마그네슘 킬레이트 또는 고분자량의 음이온 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 항동결용 조성물은 세포외다당체 외에 생물학적 시료의 냉장보존 시 발생할 수 있는 아시도시스(acidosis), 세포내 자유라디칼 생성 및 경축(contracture) 방지를 위하여, 완충액, 만니톨 또는 글루타치온 및 글루탐산 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 항동결용 조성물은 본 발명의 세포외다당체 외에 생물학적 시료의 최적의 냉동 상태를 유지하기 위하여, DMSO, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로파네디올(propanediol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 아세트아미드(acetamide) 등의 항동결제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 항동결용 조성물은 추가적으로 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리딘, 식물유래 항동결 단백질, 카르복시메틸셀룰로스, 혈청 알부민, 하리드록시에틸 스타치, 피콜, 덱스트란, 젤라틴, 유제품, 지질 운반체, 레시틴 등의 침투제를 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 항동결용 조성물을 사용하여 생물학적 시료를 냉장 또는 냉동시켜 보존하는 방법은 당업계에서 통상의 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
[실시예]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: 미생물 분리
북극 척키해(733.3-82.3°N, 173°E-153°W)에서 CTD로 채집한 633가지 다양한 샘플(바닷물, 침전물, 무척추동물 및 저생동물)을 유리섬유필터(pore size 0.7μm, Whatman)에 통과시킨 후, ZoBell 배지(5g peptone, 1g yeast extract, 0.01g FePO4, 15g agar, 750ml 해수, 250 ml DW)에서 25℃로 3일간 배양하였다. 배양후, 점액성 세포외다당체를 생산하는 콜로니만을 선별하여 SZolBell 배지(ZolBell+2% 포도당)에 접종하고 15℃에서 120rpm으로 3일간 진탕 배양하였다. 세포를 원심분리하여 얻은 상층액에 에탄올을 첨가하고 4℃에서 24시간 반응시킨 후, 침전된 세포외다당체를 원심분리로 회수하였다. 회수한 세포외다당체는 동결건조기로 건조 후 건조중량을 측정하였다.
점액성 물질을 생산하는 약 22가지 박테리아를 ZolBell 배지에서 선택하고, 그 중 7개 균주가 항동결능을 가지는 세포외다당체를 생산하는 것을 확인하였다. 가장 높은 항동결 활성을 나타내는 ArcPo20 균주로부터 생산되는 세포외다당체 P-ArcPo20을 분리하였다(도 1). 정제 전 단계의 0.5%(w/v) 크루드 P-ArcPo20에서 3번의 동결-해동 과정을 반복한 E. coli의 생존율은 92.28±1.13% 였지만, 다른 세포외다당체에서의 생존율은 83.85±0.74%~62.36±1.27%인 것을 확인하였다.
실시예 2: 미생물 동정
실시예 1에서 분리된 미생물에서 DNA를 추출한 후, 보편적인 박테리아 프라이머 27F[5'-GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'](서열번호 1)와 1492R[5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3'](서열번호 2)를 사용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 여기서 얻어진 PCR 산물은 LaboPass PCR 정제 키트(Cosmogentech)로 정제하여, PCR-프라이머(27F, 1492R) 및 inter-프라이머 518F[5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3'] (서열번호 3), 800R[5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'](서열번호 4)을 사용하여 염기서열 분석을 하였다.
ArcPo20(1400bp) 균주의 16S rDNA 서열은 Advanced BLAST 검색을 사용하여 분석하였고, Pseudoalteromonas tetraodonis IAM14160(T)의 16S rDNA 서열과 100% 상동성을 가진 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3: P- ArcPo20 세포외다당체의 순수분리 정제 및 특성 분석
3-1: P- ArcPo20 의 순수분리 정제
P-ArcPo20의 순수분리 정제는 Yim et al .,(2004) 방법을 수정한 방법(Yim et al ., Mar Biotechnol . 6:1725, 2007)에 따라 수행하였다.
3-2: 젤침투크로마토그래피
P-ArcPo20의 분자량은 Waters Alliance 2695 HPLC를 이용하여 젤침투크로마토그래피(GPC)로 측정하였다. Shodex GPS 컬럼에 주입하여 0.1M NaCl로 0.4ml/min 속도로 용출시켰다.
GPC 수행결과 세포외다당체의 단일 피크를 얻었고, 세포외다당체의 분자량은 1.0x107Da인 것을 확인하였다.
3-3: 가스크로마토그래피
P-ArcPo20의 당조성은 TMS(trimethylsilyl) 유도체의 가스크로마토그래피로 분석하였다. P-ArcPo20에 메탄올 염산(1.25N; Sigma)을 첨가하여 80℃에서 16시간 동안 가수분해된 단당류는 Tri-Sil(Pierce,USA)로 80℃에서 30분간 TMS화 하였다. 시료는 질소가스로 건조시킨 후, 분석하기 위해 핵산에 용해시켰다.
TMS 메틸 글리코시드의 GC/MS 분석은 Clarus 500(Perkin elmer,USA)를 사용하였으며, 샘플 분석 온도 조건은 120℃로 1분간, 다음 180℃에 도달할 때까지 분당 2℃씩 증가시키고, 230℃까지 분당 20℃씩 증가시키는 조건으로 분석하였다. 각 당 조성의 TMS 유도체의 피크 유지시간 및 분자이온조각 패턴은 표준시료에서 측정하였다.
그 결과, ArcPo20에 의해 생산되는 세포외다당체 P-ArcPo20는 3가지 단당체로 구성되어 있는 것을 확인하였으며, 글루코스, 갈락토스가 가장 풍부하고 만노스는 미량 존재하였다. 각각의 피크는 글루코스, 갈락토스 및 만노스의 유지시간 및 조각패턴을 나타내며, P-ArcPo20의 상대적 몰비는 글루코스, 갈락토스 및 만노스가 1.5:1.0:0.3으로 확인되었다(도 3).
3-4: 푸리에 변환 적외선 분광법
FT-IR 적외선 분광법은 기능그룹을 검출하기 위해 KBr 디스크를 사용하며, 2mg 세포외다당체와 200mg KBr의 혼합물을 분쇄하여 분석하였다. 분석 해상도는 4cm-1간격으로 16번 스캔하였고, 400~4000cm-1의 범위를 Thermo NICOLET 6700(Thermo, USA)으로 기록하였다.
그 결과, ArcPo20에 의해 생산되는 세포외다당체의 FT-IR 적외선 분광분석 결과 여러 개의 피크가 관찰 되었다(도 4). 3289cm-1에서 보여지는 피크는 -OH의 스트레칭 및 굽힘에 의한 것이다. 반면, 1026cm-1은 카르복실 그룹의 스트레칭 진동에 의한 것이며, 1629와 1026cm-1 사이에서 다당체의 특이적인 피크들이 나타났다(Nichols et al ., J App Microbiol . 96:10571066, 2004).
실시예 4: P-ArcPo20 세포외다당체의 항동결 활성
본 실시예에서는 P-ArcPo20의 항동결능이 E. coli의 생존에 미치는 영향을 분석하였다.
P-ArcPo20의 항동결 활성 측정은 동일량의 정제 0.5%(w/v) P-ArcPo20와 E. coli 2x108cell/ml(OD600=0.06) 혼합물을 -80℃에서 30분간 동결시키고, 25℃에서 20분간 해동 후 다시 -80℃로 동결시키는 과정을 1~5번 반복 수행하여 분석하였다. E. coli의 생존율은 형광 접합되어있는 bacterial viability kit(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits; Molecular Probes, USA)를 이용하여 분석하였다. 측정은 형광리더기(Perkin Elmer, USA)로 485nm/530nm(Emission1, green) 및 485nm/630nm(Emission2, red)에서 수행하였으며, 세포 생존률은 하기의 식을 사용하여 계산하였다.
세포 생존율(%)=(A/B)x100
A: 동결-해동 수행후 Emission1/Emission2의 형광비
B: 초기 Emission1/Emission2의 형광비
그 결과, 동결-해동 과정을 1~5번 수행하는 동안 E. coli의 생존율의 변화는 95.11±6.61%에서 93.13±10.29%로, 0.5%(w/v) P-ArcPo20에서의 E. coli 생존율은 매우 높게 나타났다. 반면, 20%(v/v) 글리세롤에서의 생존율은 65.33±1.17%에서 54.11±4.97%로 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 5). 이는 기존 시판되는 항동결제에 비해 P-ArcPo20은 0.5%(w/v) 저농도에서 90% 이상의 세포 생존력을 보이는 매우 우수한 항동결능을 가지는 것을 나타낸다.
한국생명공학연구원 KCTC12506BP 20131023
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Cryoprotective Exopolysaccharide from Pseudoalteromonas tetraodonis <130> P13-B270 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 518F <400> 3 ccagcagccg cggtaatacg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 800R <400> 4 taccagggta tctaatcc 18

Claims (6)

  1. 글루코스, 갈락토스 및 만노스가 1.5 : 1.0 : 0.3의 몰비로 구성되는 것을 특징으로 하는 항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 속 균주 유래의 세포외다당체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 슈도알테로모나스 속 균주는 Pseudoalteromonas tetraodonis ArcPo 20 (KCTC 12506BP)인 것을 특징으로 하는 세포외다당체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외다당체는 1.0x107Da의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 세포외다당체.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 항동결용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포외다당체의 함량은 0.5(w/v)% 인 것을 특징으로 하는 항동결용 조성물.
KR1020130128525A 2013-10-28 2013-10-28 항동결능을 가지는 슈도알테로모나스 테트라오도니스 유래의 세포외다당체 KR101501212B1 (ko)

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