KR101126314B1 - 항동결능을 가지는 신규 세포외다당체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653 및 상기 균주 유래 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653 및 상기 균주 유래 항동결능을 가지는 신규 엑소폴리사카라이드, 그 제조 방법 및 이를 함유하는 항동결용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규의 엑소폴리사카라이드 및 이를 함유하는 항동결 조성물은 조직의 손상을 최소화하면서 세포 및 조직을 포함하는 생물학적 시료를 냉장, 냉동 및 유리화 상태로 보호 또는 보존하는데 매우 유용하다.
세포외다당체, 엑소폴리사카라이드, 항동결

Description

항동결능을 가지는 신규 세포외다당체{Novel Cryoprotective Exopolysaccharide}
본 발명은 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653 및 상기 균주 유래 항동결능을 가지는 신규 엑소폴리사카라이드, 그 제조 방법 및 이를 함유하는 항동결용 조성물에 관한 것이다.
엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)는 미생물에서 생산되는 당분자 단위체로 구성된 고분자의 폴리머로서, 글루코즈(glucose), 갈락토오즈(galactose), 람노즈(rhamnose), 푸코오즈(fucose), 아세틸 갈락토오즈(acetylated galactose), 아세틸 갈락토사민(N-acetyl-galactosamine) 등의 단일 당분자로 구성되어 호모폴리사카라이드(Homopolysaccharides)를 이루거나, 여러 가지 종류의 당분자로 구성된 헤테로폴리사카라이드(heteropolysacchardes)로 분류된다.
일반적으로 엑소폴리사카라이드는 균체 외부로 분비되어 균체를 둘러싸 습도 및 온도에 의한 환경적인 생장억제요건 및 독성물질을 포함하는 길항기전으로부터 균체를 보호하는 역할을 하며, 생장에 필요한 양이온을 균체 주변에 격리시키거나, 콜로니 형성 또는 동종 균체로서 인지하는데 관여한다(Roberts,I.S., Annu. Rev . Microbio., 50:285, 1996; DeVuyst, L. et al ., Int . Dairy J., 11:687, 2001; Krinos, C.M. et al ., Nature, 414:555, 2001; Looijesteijn, P.J. et al ., Int . J. Food Sci ., 64:71, 2001). 또한, 점착성이 높아 바이오필름을 형성하며, Escherichia coli, Salmonella 및 Haemophilus influenza를 포함하는 병원성 그람 음성균에서는 병원성을 부여하는 역할을 한다(Cerning, J., FEMS Microbiol . Rev ., 87:113, 1990).
엑소폴리사카라이드의 생리학적, 유변학적(rheological) 및 화학적 성질은 분자량을 결정하는 폴리머 사슬의 길이에 따라 차이가 있는데, 폴리머가 길수록, 폴리머 분자 사이의 내부 결합이 더욱 활발하게 일어나며, 이는 폴리머의 4차 구조 및 물리학적 특성을 결정한다 (Sutherland, I.W., Biotechnol . Adv ., 12:393, 1994).
북극 및 남극과 같은 극한의 기후환경에서는 동결 및 해동의 순환이 지속적으로 이루어지기 때문에, 이 지역에서 서식하는 미생물 , 일부 규조류(diatom) 및 시아노박테리아(cyanobacteria)는 다량의 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharides)를 분비하여 세포 주변에 두꺼운 겔을 형성하여 세포를 보호함으로써 세포 생장에 치명적인 혹한의 환경에 적응한다 (Palmisano, A.C. and Sullivan, C.W., Growth , Metabolism and Dark Survival in Sea Ice Microalgae, p131-146, CRC Press, 1985; Cooksey, K.E. and Cooksey, B., Aqua . Micro. Ecolo ., 9:87, 1995; Costerton, J.W., et al ., Microbiol ., 49:711, 1995; Stoderegger, K. and Herndl, G., Limnol . Oceanol ., 43:877, 1998).
남극의 토양에서 분리한 진균류인 Phomaherbarum은 7.4 x 106 kDa인 글루코즈 호모사카라이드(glucose homosaccharide)를 분비하며, 이 엑소폴리사카라이드는 남극의 혹한에서 항동결 물질(cryoprotectant)로서의 기능을 가지는 것으로 추정되고 있다 (Selbmann, L. et al ., Res . Microbiol., 153:585, 2002).
항동결 물질은 저온에 의한 얼음결정 형성에 의한 조직손상으로부터 체조직을 보호하는 기질로서, 극지방에 서식하는 곤충, 어류, 양서류 및 파충류에서는 체내에서 이러한 기질을 생산하여 동절기에 조직이 파괴되는 것을 방지하는데, 곤충은 당을 항동결 기질로, 극지방의 개구리는 글루코즈를 항동결 기질로 사용한다.
일부 항동결 물질은 용액 또는 물질의 유리전이온도(Glass transition temperature)를 낮추는 기능을 하여 동결이 이루어지지 않도록 하며, 생물분자와 수소결합을 형성하여 물분자와의 결합위치를 대신하는 기능을 한다. 이러한 원리로 단백질이나 DNA는 수소결합에 의한 분자 고유의 구조를 유지하면서 보존하게 된다.
항동결 물질은 자동차의 부동액, 세포보존 및 식품보존 등에 사용되고 있는데, 일부 항동결 물질은 뛰어난 항동결능에도 불구하고 독성이 있기 때문에 단일로 사용하기보다는, 다른 항동결 기질을 혼합하여 사용하기도 하며, 식품에 첨가하는 경우에는 주로 독성이 없는 당(sucrose)을 사용한다.
산업적으로 이용하는 종래의 항동결 물질(cryoprotectants)은 에틸렌 클리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 글리세롤(glycerol)을 포함하는 글리콜(glycol)이 가장 대표적으로 사용되고 있으며, 에틸렌 글리콜의 경우에는 자동차 부동액으로, 프로필렌글리콜은 아이스크림 제조 시 얼음생성을 억제하는 유화제로도 사용되며 세포 보존에 대해서는 글리세롤(glycerol) 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용한다. 상기 물질은 세포의 수분함량을 최소화시키고, 유리화가 진행되도록 하며, 세포 내 고분자의 보호기능을 향상시킨다 (Dumont, F. et al ., Cryobiol, 46:33, 2003; Ablett, S. et al., J. Chem . Soc . Faraday Trans ., 88:789, 1992; Adam, M.M. et al ., Cryobiol., 32:92, 1994; Anchordoguy, T.J. et al ., Cryobiol ., 24:324, 1987).
최근에는 특히, 줄기세포 연구, 이식 및 세포치료기술 등의 의료기술 향상으로 세포의 냉동보존에 대한 관심이 높아짐에 따라, 다양한 세포에 대한 동결해동의 환경에서의 100% 보존기술을 목표로 냉동보존에 대한 기술 개발이 활발하게 진행되고 있으며(Albrecht, R.M. et al ., Cryobiol ., 10:233, 1973; Dumont, F. et al ., Cryobiol ., 46:33, 2003; Hubalek, Z., Cryobiol ., 46:205, 2003), 따라서 환경친화적이며 세포에 대해 저독성을 가지는 신규의 항동결 물질의 개발이 끊임없이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 남극의 토양에서 분리한 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica)로부터 엑소폴리사카라이드를 분리하고, 이를 이용하여 E. coli를 동결해동시키는 환경에서 세포 생존율을 측정한 결과, 세포 보존력이 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 엑소폴리사카라이드 생성능을 가지는 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653 및 상기 균주를 이용한 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 유래 엑소폴리사카라이드 및 상기 엑소폴리사카라이드를 함유하는 항동결용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 엑소폴리사카라이드 생성능을 가지는 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653 KCTC 11233BP를 제공한다.
본 발명은 또한, 글루코즈:갈라토오즈가 약 1.5:1(molar ratio)인, 항동결능을 가지는 엑소폴리사카라이드를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653를 배양하는 단계; (b) 상기 미생물의 배양액에 알코올을 첨가하여 침전물을 수득하는 단계; (c) 상기 침전물에서 단백질을 제거한 다음, 알코올를 첨가하여 재침전시키는 단계; 및 (d) 상기 재침전물을 투석한 다음, 투석막 내 물질을 수거하는 단계를 포함하는 항동결능을 가지는 신규의 엑소폴리사카라이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 엑소폴리사카라이드를 함유하는 항동결용 조성물을 제 공한다.
본 발명에 따른 엑소폴리사카라이드 및 이를 함유하는 항동결용 조성물은 저온에서 우수한 세포보존 효과를 나타내기 때문에, 조직의 손상을 최소화하면서 세포 및 조직을 포함하는 생물학적 시료를 냉장, 냉동 및 유리화상태로 보호 또는 보존하는데 매우 유용하다.
본 발명은 일 관점에서, 엑소폴리사카라이드 생성능을 가지는 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653 KCTC 11233BP 및 글루코스:갈락토오스가 약 1.5:1(molar ratio)인 항동결능(cryoprotective)을 가지는 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)에 관한 것이다.
본 명세서의 용어, '항동결능'은 저온에서 조직 또는 분자 내에 얼음 결정 형성에 의한 손상으로부터 보호하는 능력을 말하며, 항동결능을 가진 기질에 노출됨으로써 이러한 효과를 얻을 수 있다.
본 명세서의 용어, '유리화(vitrification)'은 액체상태에서 결정이 생성되지 않고 과냉각된 고체화된 상태이다.
본 발명의 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653는 남극지방의 토양에서 분리된 미생물이다. 남극지방의 토양샘플에서 분리한 다수의 미생물에 대해 엑소폴리사카라이드를 분비하는 미생물을 선별하고, 이 중에서 엑소폴리사카라이드 생산량과 E.coli에 대한 항동결능이 우수한 균주를 분리하여, 16S rRNA의 서열분석을 수행하였다. 그 결과, 분리된 균주는 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) A37-1-2T의 16S rRNA와 100% 일치하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 엑소폴리사카라이드는 남극토양에서 분리된 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoaltermonas arctica) KOPRI 21653에서 생산되어 균체외부로 분비되며, 글루코즈(glucose) 및 갈락토오즈(galactose)가 약 1.5:1의 비율로 혼합 구성된 헤테로폴리사카라이드(heteropolysaccharide)이다. 상기 엑소폴리사카라이드는 항동결능이 종래의 상용화된 항동결제에 비해 우수한 항동결능을 가진다.
E. coli가 현탁된 용액과 본 발명의 엑소폴리사카라이드가 0.001(w/v)% 내지 1(w/v)%의 희석액을 혼합하여 균체를 3회 내지 7회의 동결해동을 반복한 결과, 본 발명의 엑소폴리사카라이드의 함량이 증가할 경우, 동결해동을 거친 E. coli의 생존율이 18.41±0.42%내지 100.57±6.7%까지 동반적으로 상승하는 것으로 나타났으며, 또한 최대 7회의 동결해동을 반복하는 조건에서 동일한 함량의 엑소폴리사카라이드에 대한 항동결능은 5회 동결해동을 했을 때와 비교하여 30%내지 40%정도 감소하는 것으로 나타났으나, 특이적으로 엑소폴리사카라이드의 함량이 0.5% 내지 1%일 경우에는 별 영향이 없었다.
이와 더불어, E. coli에 대해 상기와 동일한 동결해동조건에서 상용화된 항동결제와 본 발명의 엑소폴리사카라이드의 항동결능을 비교한 결과, 0.1(w/v)% 이 상의 엑소폴리사카라이드는 우수한 항동결능을 가진 것으로 분석되었다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653를 배양하는 단계; (b) 상기 미생물의 배양액에 알코올을 첨가하여 침전물을 수득하는 단계; (c) 상기 침전물에서 단백질을 제거한 다음, 알코올를 첨가하여 재침전시키는 단계; 및 (d) 상기 재침전물을 투석한 다음, 투석막 내 물질을 수거하는 단계를 포함하는 항동결능을 가지는 엑소폴리사카라이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 (c)단계의 재침전 시 10% CPC(cetylpyridinium chloride)을 추가로 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 엑소폴리사카라이드를 제조하기 위해 상기 균주를 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 배양 조건에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물을 배양한 후 목적하는 엑소폴리사카라이드를 분리 및 정제하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의하여 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 분리 및 정제 방법에는 침전법, 원심분리, 여과, 교환크로마토그래피 및 동결건조 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 미생물 배양물에 알코올 및/또는 금속이온을 가하여 다당류를 침전시킨 후 얻어진 침전물에 대해 단백질을 제거하는 공정을 추가할 수 있으며, 크로마토그래피를 통하 여 분리할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 엑소폴리사카라이드를 함유하는 항동결용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항동결용 조성물은 상기 엑소폴리사카라이드가 0.0001중량% ~ 50중량%가 함유되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 항동결용 조성물은 세포, 배아(embryo), 인간 또는 동물 유래의 조직, 미생물, 식물체 등을 포함하는 생물학적 시료의 냉장, 냉동 또는 유리화 상태가 유지되는동안 시료의 활성이 유지되도록 보호(cryoprotection) 및 보존(preservation)의 용도로 사용할 수 있다.
상기 항동결용 조성물은 본 발명의 엑소폴리사카라이드 외에 생물학적 시료의 최적의 냉장상태를 보존상태를 유지하기 위하여, 종래의 EBS(Earle's Buffered salts), CZB, T6, Earle's MTF, KSOM, SOF 배지, TALP(tyrode's albumin lactate phosphate) 등의 시판되는 BSM(balanced salt media), 비전해질, 시트르산, 마그네슘 켈레이트 또는 고분자량의 음이온 등을 포함할 수 있다.
상기 항동결용 조성물은 본 발명의 엑소폴리사카라이드 외에 생물학적 시료의 냉장 보존 시 발생할 수 있는 아시도시스(acidosis), 세포 내 자유라디칼 생성 및 경축(contracture) 방지를 위하여. 버퍼용액(Buffer), 만니톨(manitol) 또는 글루타치온(glutathione) 및 글루탐산(glutamate) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 항동결용 조성물은 본 발명의 엑소폴리사카라이드 외에 생물학적 시료의 최적의 냉동 또는 유리화 상태를 유지하기 위하여, DMSO, 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로파네디올(propanediol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 아세트아미드(acetamide) 등의 항동결제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 항동결용 조성물은 추가적으로 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 프로리딘(polyvinyl pyrrolidine), 어류 또는 식물유래 항동결 단백질, 카르복시메틸셀룰로오즈(carboxymethylcellulose), 혈청 알부민, 하이드록시에틸 스타치(hydroxylethyl starch), 피콜(Ficoll), 덱스트란(dextran), 젤라틴(gelatin), 유제품(milk protein), 지질 운반체(lipid vesicles), lecithin 등의 침투제(permeating agent)를 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 항동결용 조성물을 사용하여 생물학적 시료를 냉장, 냉동 또는 유리화시켜 보존하는 방법은 당업계에서 통상의 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 미생물 분리 및 동정
킹조지 섬(King George Island)의 바튼(Barton) 반도에서 채집한 해안토양 및 침전물을 식염수(0.85 NaCl)에 희석한 다음, ZoBell 배지(Zobell, C.E., Marine Microbiology XV , p240, Chronica Botanica, 1946)에 도발하여 25℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 점액상의 폴리머를 생산하는 콜로니만을 선별하여 20%(v/v) 글리세롤에 현탁하고 -80℃에 보관하였다. 엑소폴리사카라이드를 생산하는 균주를 분리하기 위하여, 상기 냉동보관하였던 콜로니를 20 mL의 Zobell 배지에서 접종하여 25℃에서 120 rpm으로 3일간 진탕배양한 후, 10,000g에서 20분간 원심분리하여 세포를 제거한 상층액만을 수거하였으며, 상기 상층액에 대해 2배 부피의 양만큼의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 방치하여 폴리머 복합체가 침전되도록 하였다.
AccuPrep genomic DNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 침전 폴리머로 선별된 균체로부터 DNA를 추출한 후, 27F 및 1492R 프라이머 세트(Lane, D. J., Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, p. 115, Wiley, 1991)를 사용하여 균체 DNA로부터 16S rRNA를 증폭하였으며, 여기서 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다.
27F: 5'-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3'
1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
분석된 염기서열을 다중 서열 염기 분석툴인 CLUSTALW(Thompson et al, 1994)를 사용하여 1차 서열분석을 수행하였으며, PHYDIT(Chun, 1995)를 사용하여 16S rRNA의 2차구조 정보를 바탕으로 분석된 염기서열의 구조를 추정하였다. PHYLIP(Felsenstein, 1993)을 사용하여 계통분석을 수행하였으며, Kimura의 이모수모델(two-parameter model)과 이웃결합법을 사용한 계통수를 작성하였다 (Saitou and Nei, 1987). 상기 과정으로 도출된 계통수 형상은 이웃결합의 부트스트랩 분석으로 평가하였다.
엑소폴리사카라이드 생산균주는 침전된 폴리머 복합체의 두께를 기준으로 점액성 물질을 분비하는 것으로 나타난 약 25개 균주에서 7개의 균주에서 점액성 폴리사카라이드를 생산하는 것을 확인하였으며, 최종적으로 엑소폴리사카라이드를 생산하는 균주 KOPRI 21653을 분리하였다 (표 1).
균주명 유래시료 채집위치
KOPRI 21650 Sediment King George Island, 62° 13'S, 58° 47'W
KOPRI 21653 Sediment King George Island, 62° 14'S, 58° 44'W
KOPRI 21654 Seaside soil King George Island, 62° 13'S, 58° 44'W
KOPRI 21663 Sediment King George Island, 62° 13'S, 58° 46'W
EP 144 Seaside soil King George Island, 62° 13'S, 58° 47'W
EP 205 Seaside soil King George Island, 62° 13'S, 58° 47'W
EZ 291 Seaside soil King George Island, 62° 14'S, 58° 43'W
KOPRI 21653은 길이 3 ~ 5 ㎛, 폭 0.3 ~ 0.5 ㎛의 간균으로 관찰되었으며, KOPRI 21653에서 1400 bp의 16S rRNA 서열을 Advanced BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov) 검색툴을 사용하여 분석한 결과, 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) A 37-1-2T의 16S rRNA와 100% 상동성을 가진 것으로 나타났다.
그 밖의 다른 슈도알터로모나스 균주(Pseudoalteromonas elyakovii KMM162T, 99.64%; Pseudoalteromonas distincta KMM638T, 99.64%; Pseudoalteromonas nigrifaciens NCIMB-8614T, 99.57%; Pseudoalteromonas paragorgicola KMM3548T, 99.50%)들과는 다소 적은 상동성을 나타내었으며, 도 1의 계통도에 나타난 바와 같이, 본 실험에서 사용한 균주는 슈도알터로모나스 균주들과 밀접한 유연관계를 보였다.
이상의 결과로 항동결능을 가지는 엑소폴리사카라이드를 생산하는 균주를 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653라 명명하고, 2007년 11월 13일자 KCTC에 기탁하였다(KCTC 11233BP).
실시예 2: 엑소폴리사카라이드 순수분리
미생물 배양액을 4℃, 12,000g에서 30분간 원시분리하여 균체를 제거하고, 여기서 얻어진 배양 상층액에 상기 액 부피의 2배의 에탄올을 첨가하고 4℃에서 24시간동안 침전치켜 엑소폴리사카라이드를 추출하였다. 침전된 엑소폴리사카라이드를 4℃, 10,000g에서 20분간 원심분리로 수거하고, dH2O에 용해한 다음, 동결건조시켰다. 동결건조로 수득한 조엑소폴리사카라이드(crude exopolysaccharide)에서 단백질을 제거하기 위해 37℃에서 30분간 단백질 분해효소처리를 하였으며, Viva-Flow(Sartorius, Germany)를 사용하여 dH2O에서 투석하고, 10% 세틸피리디니움 클로라이드(CPC, Cetylpyridinium Chloride)를 혼합하여 재침전시켰다. 침전된 CPC-조엑소폴리사카라이드 복합체를 4℃, 10,000g에서 20분간 원심분리로 수거하고, 10% NaCl에 다시 용해시켰다. 침전된 폴리사카라이드는 다시 부피의 3배에 해당하는 양의 에탄올을 첨가하여 재추출한 후, dH2O에 용해하여 dH2O에서 2회 투석하고 다시 동결건조시켜 최종적으로 수득하였다.
실시예 3: 엑소폴리사카라이드 항동결능
E. coli에 수득한 엑소폴리사카라이드를 첨가하고 동결해동시켜 박테리아 생장에 미치는 영향을 박테리아 생장 확인 키트인 LIVE/DEAD BacLight™ Bacterial Viablity kit(Molecular Probes, USA)를 사용하여 확인함으로서 엑소폴리사카라이드의 항동결능을 확인하였다.
E. coli를 20 ml의 배지에 접종하여 대수기(log phase) 후기까지 배양하고 10,000g에서 5분 동안 원심분리하여 균체를 수거하였다. 수거된 균체를 20 ml의 식염수(0.85% NaCl)로 3회 세척하고, 세균수를 2 x 108개/ml(OD670 = 0.06)로 맞추어 희석한 후, 100 ㎕의 E. coli 희석액과 동량의 엑소폴리사카라이드를 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합액을 반복적으로 3-4회 동결해동을 반복하고, 여기서 100 ㎕를 취해 96웰 마이크로타이터 플레이트(flat-bottom microtiter plate, Nunc, USA)에 분주하고 LIVE/DEAD BacLight™ Bacterial Viablity kit에 포함된 염색액 100 ㎕를 혼합하여 실온 암소에서 15분간 반응시켰다. 반응이 종료되는 형광 리더기(Perkin elmer, USA)를 사용하여, 485 nm/530 nm (Emission 1, G) 및 485 nm/630 nm (Emission 2, R)에서 형광을 측정하였으며, 세포 생존율은 하기의 식을 사용하여 계산하였다.
세포 생존율(%) = (A/B) x 100
A = 동결해동처리 후 Emission 1/Emission 2의 형광비
B = 초기 Emission 1/Emission 2의 형광비
그 결과, 최종 수득한 엑소폴리사카라이드 중에서 P-21653의 항동결능이 가장 높은 것으로 조사되었다 (도 2 및 3).
실시예 4: P-21653의 특성 분석
엑소폴리사카라이드의 당조성을 분석하기 위해 GC-MS(Gas Chromatography/Mass selective detector, Perkin Elmer) 방법을 사용하였다.
P-21653 (10 ㎍)을 10 ml의 파이렉스 튜브에 넣고, 100 ml의 무수 메탄올과 4.56 ml의 아세틸 클로라이드(acetyl chloride, Sigma, USA)을 혼합한 Methanolysis 용액 0.5 ml을 혼합하여 80℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료되면, 시료를 질산을 가하여 건조시키고, 200 ㎕의 무수 아세토니트릴(anhydrous acetonitrile)에 용해시킨 후, 25 ㎕의 무수 헵타프루오부틸산(HFBAA, anhydrous heptaflurobutyric acid)를 첨가하여 150℃에서 30분간 가열하고, 실온까지 냉각한 후에, 다시 질산 가스를 약하게 가하여 건조시키고, 최종적으로 100 ㎕의 무수 아세토니트릴에 용해시켜 GC-MS 분석에 사용하였다.
슈도알터로모나스 알티카가 생산하는 엑소폴리사카라이드의 당 조성을 확인하기 위해 P-21653의 가수분해 산물을 GC-MS 분석하였다 (Zanetta, J.P. et al., Glycobiol . 9:255, 1999). GC-MS 분석결과에 따르면 GC chromatogram에 4개의 피크가 나타났는데, 11.6분과 11.7분에 나타나는 두 개의 피크는 글루코즈와 동일한 체류시간과 분열패턴을 보이므로 글루코즈로 동정하였다. 또한 11.2분과 12.2분에 나타나는 두개의 피크는 갈락토오즈와 동일한 체류시간과 분열패턴을 보이므로 갈락토오즈로 동정하였다 (도 4). 글루코즈(11.6분과 11.7분)와 갈락토오즈(11.2분과 12.2분) 피크의 면적을 적분하여 면적비를 계산한 결과, 글루코즈 : 갈락토오즈 = 1.5 : 1로 확인하였다.
또한, 상기와 동일한 과정으로 P-21653의 항동결능을 확인하기 위해, 0.01 내지 1%(w/v) 함량의 범위 내에서 3회 동결해동을 반복조건에서 분석한 결과, 0.01(w/v)%, 0.03(w/v)%, 0.05(w/v)%, 0.1(w/v)%, 0.5(w/v)% 및 1(w/v)%의 P-21653를 사용했을 때, E. coli의 생존율은 각각 18.41±0.42%, 24.99±1.10%, 58.29±4.46%, 82.62±5.60%, 96.61±4.94% 및 100.57±6.7%인 것으로 나타났다 (도 5 및 6)
이러한 수치는 동결해동 순환의 횟수를 증가할수록 감소되는 경향을 보였으며, 동결해동을 5회내지 7회 수행하였을 경우에는 0.05%(w/v)의 P-21653에 대해 58.29±4.46% 내지 34.87±0.44%의 생존율을 기록하였으며, 0.1(w/v)% 의 P-21653에 대해 71.51±9.38% 내지 48.12±0.35%의 생존율을 나타내었다. 반면에, 동일한 횟수로 동결해동을 반복했더라도, 0.5(w/v)%내지 1(w/v)%의 P-21653에 대한 E. coli의 생존율은 횟수에 영향을 받지 않는 것으로 관찰되었다.
또한, P-21653의 항동결 효능은 시판되는 90%(v/v) VEG과 1%(v/v) X-1000의 혼합 항동결액 90%(v/v) VM3 항동결액, 20% 글리세롤의 효능과 비교하여 분석한 결과, E. coli의 생존율은 3회 동결-해동하였을 때, 92내지 95% 내외의 시판되는 항동결제에 반해 1%(w/v) P-21653는 98.48±4.37%, 0.5%는 91.69±5.99% 및 0.1%는 83.12±8.93%으로 나타나 매우 우수한 항동결능을 가진 것으로 나타났다 (도 7).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업게의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653가 포함되어 있는 슈도알터로모나스속(Pseudoalteromonas sp.)의 계통도이다.
도 2는 E. coli의 전자주사현미경(scanning electron micrograph) 사진을 나타낸 것이다(a: P-21653를 처리하지 않은 E. coli; b: 0.1(w/v)%의 P-21653를 처리한 E. coli)
도 3는 토양에서 분리된 미생물 유래 0.2%(w/v)의 조엑소폴리사카라이드를 각각 처리한 후 E. coli의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 신규 엑소폴리사카라이드의 당 조성을 확인하기 위한 GC/MS(Gas chromatography/Mass Selective Detector) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 LIVE/DEAD BacLight™ Bacterial Viablity kit을 사용하여 측정한 E.coli의 생존 정도를 보여주는 공촛점 형광 현미경 사진이다.
도 6은 다양한 농도의 P-21653를 처리한 상태에서 다수의 동결해동을 반복한 후 E. coli의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 종래의 항동결 기질과 P-21653의 항동결능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
<110> Korea Ocean Research & Development Institute <120> Novel Cryoprotective Exopolysaccharide <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1429R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

  1. 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide) 생성능을 가지는 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653 KCTC 11233BP.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항의 슈도알터로모나스 알티카(Pseudoalteromonas arctica) KOPRI 21653 KCTC 11233BP에 의해 제조되고, 글루코즈:갈락토오즈가 1.5:1(molar ratio)인 엑소폴리사카라이드를 유효성분으로 함유하는 항동결용 조성물.
  6. 삭제
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