KR102027295B1 - 키티나아제를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

키티나아제를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 염장 발효식품인 새우젓으로부터 분리된 키티나아제(chitinase)를 생산능을 갖는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 대표적인 염장발효식품 중 하나인 새우젓에서 분리된 살리니비브리오 속 균주(salinivibrio sp .)에 관한 것으로, 기존의 살리니비브리오 속의 균주들과는 다른 신규한 균주이며, 우수한 키티나아제(chitinase)의 생산능을 갖는다. 이와 같은 염장발효식품인 새우젓에서 분리된 키티나아제(chitinase)의 생산능을 갖는 살리니비브리오 속 균주가 생산하는 키티나아제를 제공함으로 산업적으로 해양 갑각류 폐기물의 처리 생물전환을 통한 2차 생산물의 생산 발효식품의 발효기간 단축 등에 활용될 수 있다.

Description

키티나아제를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도{Novel chitinase-producing salinivibrio sp. strain and use thereof}
본 발명은, 염장 발효식품인 새우젓으로부터 분리되어 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
키틴(chitin)은 지구의 자연 상태에서 가장 풍부하게 존재하는 물질 중의 하나로, 포도당의 유도체인 N-아세틸글루코사민을 기본 단위로 하여 베타 1-4 글리코시드 결합(β 1,4-glycosidic bond)을 통하여 연결되어 있는 고분자 다당류이다.
또한, 키틴은 셀룰로오스 다음으로 천연에서 두번째로 풍부하게 존재하는 고분자로, 진균류(fungi)의 세포벽, 갑각류 및 곤충과 같은 절지동물의 외골격 및 연체동물의 치설(radula)을 이루는 주요 성분으로 알려져 있다.
이러한 키틴을 탈아세틸화하여 수득되는 키토산은 천연 항균성 물질로, 상기 키토산을 처리한 제품들이 항균, 방취 및 보습효과 등 복합적인 기능을 나타낸다고 알려짐에 따라, 키토산을 제조할 수 있는 키틴 역시 천연 물질로서 다양한 용도로 활용될 수 있다는 점에서 주목 받고 있다.
최근의 연구 결과에 따르면, 키틴은 식물에서 질병의 방어 메커니즘에 중요한 역할을 하며, 식물의 산출을 증가시키기 위한 비료 성분으로 농업 분야에서 활용되기 시작했을 뿐만 아니라, 특히 물의 정화, 식품이나 의약품 등에서 안정화제로 사용되거나, 염료, 직물 등에서 바인더로서의 기능을 하며, 멤브레인이나 이온 교환 수지의 레진, 의학의 수술용 실의 원료로 사용되는 등 다양한 산업분야에서 여러가지 기능성 성분으로 활용되고 있다.
한편, 키틴의 기본 단위인 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine(NAG), 다른 이름으로 β-1,4-linked 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose, GlcNAc)은 20 여 년 전부터 키틴 및 키토산이 주목을 끌기 시작한 이래로 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. N-아세틸글루코사민은 N-아세틸뮤라믹산(N-acetylmuramic acid, MurNAc)과 함께 미생물의 세포벽을 이루는 생체고분자의 일부분으로서, MurNAc의 젖산 부위에서 올리고펩타이드(oligopeptide)와 cross-link되어 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 형성하고 있다.
특히, GlcNAc는 신경전달과정(neurotransmission)에서 주목을 받고 있는데, 현재까지 N-아세틸글루코사민의 주요한 기능으로는 인간의 면역력 증진을 포함한 다양한 생리활성 등이 밝혀지고 있으며, 생물학적으로는 키틴분해효소를 이용하는 방법으로 이용하여 저분자당의 키틴 올리고당 또는 GlaNAc의 효율적인 생산을 추구하고 있다.
하지만, 게와 새우 껍질을 알칼리 조건에서 제단백한 후 산성 조건에서 탈회분하여 키틴을 조제한 후, 열조에서 진한 NaOH로 처리하는 화학적 방법으로 가수분해하여 키토산을 수득하는 방법은 많은 에너지와 다량의 폐알칼리용액을 발생한다는 점에서 환경적 문제점이 있다.
따라서, 화학적 방법으로 키틴을 가수분해하는 것보다는 진균 또는 효모로 부터 분리된 효소를 사용하여 키틴을 가수분해하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다.
키티나아제(chitinase)는 키틴의 가수분해 효소로, N-아세틸글루코사민 중합체의 β-1,4 결합(glycosidic)을 가수분해하여, 키토산과 키틴 올리고당을 생산하는 가수 분해 효소이다. 또한 상기 키티나아제는 키틴, 콘드로이틴과 그 수용성 유도체인 글리콜 키틴을 가수분해하지만 Gram 양성 세균의 세포벽 펩티드 글리칸을 분해(용균)하지 않는 것으로 알려져 있다.
따라서, 키틴 및 키토산을 산업적으로 생산 또는 응용하기 위해서는 응용하기 위해서는 보다 선택적이고 높은 수율로 키티나아제를 생산할 수 있는 새로운 균주에 대한 연구개발이 필요한 실정이다.
공개특허 제2015-0046447호(2015.04.30. 공개) 공개특허 제2015-0046448호(2015.04.30. 공개)
본 발명은, 염장 발효식품인 새우젓으로부터 분리된 균주들 중 키틴의 분해활성이 우수한 키티나아제(chitinase)를 생산능을 갖는 신규한 살리니비브리오 속 균주를 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 염장발효식품인 새우젓에서 분리되어 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 균주이다.
바람직하게는 상기 살리니비브리오 속 균주는, BAO-01 균주(기탁번호 KACC 81049BP, 국립농업과학원 농업유전자원센터, 2017.07 03.)이며, 상기 BAO-01 균주는, 리보오스(D-Ribose), 자일로오스(D-Xylose), 갈락토오스(D-Galactose), 글루코스(D-Glucose), 만노오스(D-Mannose), 만니톨(D-Mannitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 셀로비오스(D-Cellobiose), 수쿠레이스(D-Saccharose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 및 글루콘산염(Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 성장에 필요한 탄소원으로 이용할 수 있다.
상세하게는 상기 BAO-01 균주는, 바실러스 세레우스균(B. cereus), 대장균(E.coli K99), 황색포도상구균(S. aureus), 살모넬라 콜레라수이스균(S.choleraesuis), 시겔라보이드균(S. boydii) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Y.enterocolitica)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하는 항균 효과를 가지고 있을 뿐만 아니라, 반코마이신(Vancomycin), 카나마이신(Kanamycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 항생물질에 내성이 있다.
바람직하게는 상기 BAO-01 균주는, 5 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 9.5의 조건에서 배양될 수 있다.
한편, 본 발명의 염장발효식품인 새우젓에서 분리되어 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 균주는, BAO-02 균주(기탁번호 KACC 81050BP, 국립농업과학원 농업유전자원센터, 2017.07.03.)일 수 있다.
바람직하게는 상기 BAO-02 균주는, 리보오스(D-Ribose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 및 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 성장에 필요한 탄소원으로 이용할 수 있다.
이러한 BAO-02 균주는, 바실러스 세레우스균(B. cereus), 대장균(E. coli K99), 살모넬라 갈리나륨균(S. gallinarum), 황색포도상구균(S. aureus) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Y.enterocolitica)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하는 효과가 있다.
반면, BAO-02 균주는, 반코마이신(Vancomycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 항생물질에 내성이 있다.
상기 BAO-02 균주는, 0 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 8.0 조건에서 배양될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 앞서 언급한 균주를 리보오스(D-Ribose), 자일로오스(D-Xylose), 갈락토오스(D-Galactose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), 만노오스(D-Mannose), 만니톨(D-Mannitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 셀로비오스(D-Cellobiose), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 수쿠레이스(D-Saccharose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene), 글루콘산염(Gluconate) 및 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 탄소원; 제1인산암모늄(NH4H2PO4), 제2인산암모늄((NH4)2HPO4) 및 황산암모니아((NH4)2SO4)으로 이루어진 군 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 무기 질소원; 및 유기 질소원인 카제인(Casein)인; 을 포함하는 배양용 배지에 접종하여 배양할 수 있다.
바람직하게는 상기 언급된 균주를 배양용 배지에 접종한 후, 5 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 8.5 조건에서 약 48 ~ 72 시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는, 앞서 언급된 배양방법으로 배양된 살리니비브리오 속 균주에 의해 생산된 키티나아제(chitinase)이다.
본 발명은, 대표적인 염장발효식품 중 하나인 새우젓에서 분리된 살리니비브리오 속 균주(salinivibrio sp .)에 관한 것으로, 기존의 살리니비브리오 속의 균주들과는 다른 신규한 균주이며, 우수한 키티나아제(chitinase)의 생산능을 갖는다.
이와 같은 염장발효식품인 새우젓에서 분리된 키티나아제(chitinase)의 생산능을 갖는 살리니비브리오 속 균주가 생산하는 키티나아제를 제공함으로 산업적으로 해양 갑각류 폐기물의 처리 생물전환을 통한 2차 생산물의 생산 발효식품의 발효기간 단축 등에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 균주(BAO-01 및 BAO-02)의 rRNA의 염기서열 정보를 나타낸 데이터이다.
도 2는 본 발명의 균주(BAO-01 및 BAO-02)의 생화학적 분석 결과를 나타낸 데이터이다.
도 3은 본 발명의 균주(BAO-01 및 BAO-02)의 배양시간의 경과에 따른 균주의 생장과 키티나아제의 활성을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 균주(BAO-01 및 BAO-02)의 각기 다른 탄소원 또는 질소원에 따른 키티나아제의 활성을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 균주(BAO-01 및 BAO-02)의 항생제의 감수성, 항균활성, 안정성을 측정한 실험의 결과를 나타낸 데이터이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예들에 의해 한정되지 않는다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
본 명세서 전체에서, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 특별한 언급이 없는 한, 고체/고체는 w/w%, 고체/액체는 w/v%, 액체/액체 v/v%를 의미한다.
먼저, 본 발명의 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주는 염장 발효식품인 새우젓으로부터 분리 동정된 균주들 중 우수한 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
상세하게는 상기 본 발명의 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주는, 전통 발효 식품 중 하나인 염장발효식품인 새우젓에서 분리 및 동정된 신규한 균주로, 도 1과 같이 본 발명에서 분리동정한 균주의 16S rRNA 분석에 의한 유전적 유전관계도로, 균주의 16S rRNA 분석을 통해 본 발명의 균주가 살리니비브리오 속에 속하는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명에서는 본 발명의 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 신규한 살리니비브리오 속 균주를 각각 BA0-01 또는 BAO-02로 명명하였으며, 각각 (KACC 81049BP, KACC 81050BP)의 수탁번호를 부여받았으며, 상기 BA0-01 균주 또는 BAO-02 균주의 염기서열정보는 GenBank에 등록하여 각각 KX990293, KX990294의 번호를 부여받았다.
또한, 본 발명의 균주를 이용하여 키티나아제(chitinase)를 제조하기 위해서는 상기 균주 자체만을 이용할 수 있으며, 상기 균주를 특정의 배지에서 특정 조건하에서 배양하여 얻어진 배양물, 배양 상등액을 이용할 수도 있다.
구체적으로, 새우젓에서 분리된 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 균주인 BAO-01 균주(KACC 81049BP)는, 5 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 9.5 조건에서 배양될 수 있으며, 성장시 리보오스(D-Ribose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 및 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 탄소원으로 이용할 수 있다.
또한, 상기 BAO-01 균주(KACC 81049BP)는 바실러스 세레우스균(B. cereus), 대장균(E.coli K99), 살모넬라 갈리나륨균(S. gallinarum), 황색포도상구균(S. aureus) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Y. enterocolitica)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하는 항균성을 가지고 있다.
반면에, 반코마이신(Vancomycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 항생 물질에 내성이 있다.
한편, 본 발명의 다른 하나의 균주인 새우젓에서 분리된 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 BAO-02 균주(KACC 81050BP)는, 0 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 8.0 조건에서 배양될 수 있으며, 이 때 성장에 필요한 탄소원으로 리보오스(D-Ribose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 및 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 상기 BAO-02 균주는, 바실러스 세레우스균(B. cereus), 대장균(E. coli K99), 살모넬라 갈리나륨균(S. gallinarum), 황색포도상구균(S. aureus) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Y.enterocolitica)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하는 항균성을 가지고 있고, 반코마이신(Vancomycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 항생물질에 내성이 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시 형태는, 상기 언급된 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주를 배양하는 방법에 관한 것으로, 리보오스(D-Ribose), 자일로오스(D-Xylose), 갈락토오스(D-Galactose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), 만노오스(D-Mannose), 만니톨(D-Mannitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 셀로비오스(D-Cellobiose), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 수쿠레이스(D-Saccharose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene), 글루콘산염(Gluconate) 및 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 탄소원; 제1인산암모늄(NH4H2PO4), 제2인산암모늄((NH4)2HPO4) 및 황산암모니아((NH4)2SO4)으로 이루어진 군 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 무기 질소원; 및 카제인(Casein)인 유기 질소원; 을 포함하는 배양용 배지에 접종하여 배양할 수 있다.
일 예로, 상기 균주(BAO-01 균주 또는 BAO-02 균주)를 배양용 배지에 접종한 후, 5 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 8.5 조건에서 약 48 ~ 72 시간 동안 배양하는 것이 균주가 최대 성장을 이루면서, 키티나아제의 생산능이 최대치를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시 형태는 상기 언급한 균주의 배양방법으로 배양된 살리니비브리오 속 균주에 의해 생산된 키티나아제(chitinase)이다.
1. 균주의 분리
신선한 새우에 20 w/w% 소금을 첨가하여 15℃에서 12주간 발효한 새우젓 샘플을 여수 지역 시장으로부터 공급받아, 시료를 연속 희석하여 0.5 w/v% 콜로이드 키틴(colloidal chitin)이 함유된 해양 배지(Difco, USA)에 확산 방법으로 분주하였다.
분주된 배양 배지를 30℃ 와 37℃에서 5일 동안 배양한 후, 키틴이 분해되어, 명확히 구분된 부분을 가지는 균주를 분리 선별하였다. 균락(colony)는 형태학상 차이와 도말된 해양 배지의 정제의 차이에 따라 무작위로 선별하였다.
무작위로 선별된 균주는 API 50 CHL 및 APIWYM 테스트 방법(bioM'erieux, USA)을 사용하여, 그람 염색법(gram staining), 카탈라아제 형성(catalase formation), 탄수화물 발효 패턴(carbohydrate fermentation pattern), 효소 활성(enzyme activity)에 대해 검사하였다.
선별된 균주들 중 형태학적으로 서로 다른 50개의 박테리아 콜로니 중 해양 배지에서 투명환(clear zone)을 형성하는 균주를 스크리닝을 통해 두 가지 균주(colony)가 선택하여, BAO-01(KACC 81049BP)와 BAO-02(KACC 81050BP)로 명명하였다.
2. 균주의 16s rRNA를 이용한 계통도 분석
새우젓으로부터 분리된 두 가지 균주의 유전학적 특성을 확인하기 위하여 Genomic DNA prep Kit(Solgent, Korea)를 이용하여 추출하였다.
16S rDNA 증폭은 정방향 프라이머는 27 Forward primer(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 역방향 프라이머인 1492Reverse primer(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하고, Takara Thermo Cycler Dice(TR-800, Takara, Japan)사용하여 증폭시켰다.
PCR 혼합물은 25μL에, 주형 DNA 및 각 프라이머 0.5μM, Taq polymerase (SolGent, Korea) 1U, dNTPs 1 μM 및 2.5μM MgCl2가 포함된 것을 사용하였다.
PCR 반응은, PCR 튜브를 95 ℃에서 7 분간 예열한 다음, 95 ℃에서 30 초간, 50 ℃에서 45 초간, 72 ℃에서 30 초간 30회 반복하여 증폭하였다. 5 μL의 PCR 생성물은 1 % 아가로스 겔에 접종한 후, 이를 자외선을 조사하하여 시각화 하였다.
상기 BAO-01과 BAO-02의 시각화한 형태적 특징은 하기 표 1과 같다.
Salinivibrio sp . BAO-01 Salinivibrio sp . BAO-02
콜로니 형태 원형(Round) 원형(Round)
콜로니 색 크림화이트(Cream white) 크림화이트(Cream white)
세포의 형태 간균형(Curved rods) 간균형(Curved rods)
세포 크기(㎛) 0.4-0.6×1.0-4.3 0.4-0.6×1.0-2.3
그람 염색 그람 음성 박테리아 그람 음성 박테리아
포자 - -
증폭된 PCR 생성물은 Accuprep®의 PCR purification Kit(Bioneer, Korea)를 사용하여 정제한 후, 정제된 PCR 생성물은 27F와 1492R 프라이머를 시퀀스로 사용하였으며, MEGA v7.0(Kumar et al. 2016)를 사용하여 neighbor-joining 분석방법으로 분자 진화 유전자 분석을 통해 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였으며, 1,000 부트스트랩 값(bootstrap value)으로 계통 간의 유전적 거리 차이를 표시하였다.
그 결과 본 발명의 균주인 BAO-01 및 BAO-02은, 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp)계통으로, 도 1과 같은 계통도를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
3. 균주의 배양 조건(API 50CHL system을 사용한 생화학적 분석)
염장발효식품인 새우젓에서 분리된 키티나아제(chitinase)의 생산능을 갖는 살리니비브리오 속 신규 균주인 BAO-01과 BAO-02의 최적의 배양 조건과 상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주가 최적의 키티나아제의 생산능을 갖는 배양시간을 조사하였다.
API 50 CHL system을 사용하여 분리된 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 생화학적으로 분석하였다.
0.1 % w/v% 콜로이드 키틴이 함유된 해양 배지(Difco, USA)인 MB-C 배지를 사용하여 각각 온도가 10 ℃, 20 ℃, 30 ℃, 37 ℃, 50 ℃이고, 0.1M의 HCl 및/또는 NaOH를 통해 pH를 각각 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 로 조절한 조건에서, 6일 동안 각각의 균주를 배양하였다. 또한, 상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주가 배양, 생장할 수 있는 NaCl의 농도 범위를 확인하기 위하여 MB-C 배지에 5 ~ 20 w/v% NaCl를 추가하였다.
상기 콜로이드 키틴은, 새우 껍질 키틴(Sigma, US)로부터 제조되었으며, 일 예로 불말화된 키틴 10 g을 10 N 농도의 HCl 100 ml에 혼합한 후, 4 ℃ 온도를 유지시키면서 충분히 방치하였다. 그 후 1.9 L의 100 % 에탄올을 첨가하여 -20 ℃ 온도에서 다시 충분히 방치하였다. 그 다음, 20 분간 4 ℃에서 8,000 x로 원심분리한 후 펠렛을 채취하였다. 콜로이드 키틴은 멸균 증류수로 중화될 때까지 세척한 후, 동결 건조하여 제조하였다.
키티나아제 활성 분석은, 콜로이드 키틴을 기질로 사용하여 (monreal & reese 1969) 방법에 따라 수행되었다. 1 ml의 샘플과 0.5 ml 콜로이드 키틴, 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)을 넣고, 1시간 동안 40 ℃에서 반응시킨 혼합물을 끓는 물의 욕조에서 10 분간 가열하였다. 가열된 혼합액을 1분간 10,000 x로 원심분리한 후, 녹지 않은 불용성 키틴을 제거하였다. 감소된 설탕의 양을 측정하기 위하여 N-아세틸-β-D-글루코사민을 기준으로 사용하여 디니트로살리실산 방법(Miller 1959)을 통해 측정하였다. 키티나아제 활성의 기본 단위는 분당 1 μmol GlcNAc 분해되어 방출되는 양으로 정의하였다.
도 2를 살펴보면, 상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주는 모두 10 ~ 50 ℃ 온도 범위에서 성장 가능하였으며, 바람직하게는 37 ℃에서 최적의 성장을 확인할 수 있었다.
또한, BAO-01 균주는 NaCl 5 ~ 20 w/v% 범위에서 성장 가능하나, 바람직하게는 5 w/v%에서 최적의 성장을 확인할 수 있으며, pH 4.0 ~ 9.5 범위에서 성장할 수 있으나 최적의 성장조건은 pH 7.5가 바람직한 것으로 확인되었다. 한편, BAO-02 균주는 NaCl 0 ~ 20 w/v% 범위에서 성장 가능하나, 바람직하게는 5 w/v%에서 최적의 성장을 확인할 수 있으며, pH 4.0 ~ 8.0 범위에서 성장할 수 있으나 최적의 성장조건은 pH 7.5가 바람직함을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 앞서 언급한 최적의 성장조건 하에서 상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주는 성장을 위해 다양한 탄소원을 이용하는 것을 확인할 수 있는데, 구체적으로 살펴보면 BAO-01 균주는 리보오스(D-Ribose), 자일로오스(D-Xylose), 갈락토오스(D-Galactose), 글루코스(D-Glucose), 만노오스(D-Mannose), 만니톨(D-Mannitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 셀로비오스(D-Cellobiose), 수쿠레이스(D-Saccharose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 또는 글루콘산염(Gluconate)를 탄소원으로 사용할 수 있었으며, 상기 BAO-02 균주는 리보오스(D-Ribose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 또는 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)을 탄소원으로 사용함을 확인할 수 있었다.
반면, 상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 MB-C 배지에서의 성장률은 흡광도 600 nm에서 분광광도계를 통해 측정하였으며, 한편 균주의 배양시간에 따른 최적의 키티나아제의 생성능은 MB-C 배지에서 37 ℃에서 4일 동안 배양하여 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3의 결과를 살펴보면, BAO-01 균주의 경우, 12시간 경과 후 성장율 측정시 BAO-02 균주보다 높은 성장을 보였으며 이는 측정이 완료된 96 시간 경과 후까지 이어짐을 확인할 수 있었다. 또한, BAO-01 균주는 48 시간 경과 후 최대 성장(OD600 = 1.36)에 이르렀으며, 그 이후 72 시간까지 안정적인 성장을 확인할 수 있었으며, 키티나아제 활성은 48 시간 후 최대 생산(19.02 U/ml)에 도달함을 확인할 수 있었다.
또한, BAO-02 균주의 경우 36 시간 후 세포 성장(OD600 = 0.91)이 최대를 이루었으며, 높은 수준의 키티나아제의 활성(15.56 U/ml)을 확인할 수 있었으나, 배양 72 시간 경과 후에는 세포 성장 및 키티나아제의 활성 모두 저하됨을 확인할 수 있었다.
상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 경우 배양 72 시간을 기점으로 점차 키티나아제의 활성은 감소 되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 정상적인 균주의 밀도가 떨어지기 시작하는 성장의 정지 단계에서 키티나아제의 활성 프로테아제의 분비가 최대에 이르며, 그 후 균주의 밀도가 저함되에 따라 키티나아제의 활성 프로테아제의 분비가 감소하면서, 키티나아제의 활성 또한 저하되었음을 예상할 수 있었다.
4. 균주 배양시, 탄소원 또는 질소원에 따른 키티나아제의 활성분포
갈락토스(Galactose), 만니톨(Mannitol), 스타치(Starch), 프룩토오스(Fructose), 수크로오스(Sucrose), 글루코스(Glucose) 및 덱스트로오스(Dextrose)의 탄소원;과 요소(Urea), 효모추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 맥아추출물(Malt extract), 젤라틴(Gelatin), 황산암모니아(Ammonium sulphate) 및 카제인(Casein)의 질소원;에 따라 균주의 키티나아제의 활성 분포를 측정하였다.
상기 언급한 각각의 탄소원 또는 질소원 1 w/v% 을 포함한 100 ml MB-C 배지에 10 w/v% 균주(109 CFU/ml)를 접종한 후, 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 키티나아제의 활성은 앞서 언급한 균주의 배양 조건의 키티나아제의 활성 측정과 동일한 방법으로 진행하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.
도 4의 결과를 살펴보면, BAO-01 균주 및 BAO-02 균주 모두에서 탄소원으로는 수크로오스(Sucrose), 글루코스(Glucose), 덱스트로오스(Dextrose) 질소원으로는 황산암모니아(Ammonium sulphate) 및 카제인(Casein)를 사용할 경우 우수한 키티나아제의 활성을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 스타치(Starch)를 제외한 모든 탄소원에서 BAO-01 균주가 BAO-02 균주에 비해 높은 키티나아제의 활성을 보여주었으며, 질소원에서는 BAO-01 균주의 경우에는 효모추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone)에서는 유의적인 키티나아제 활성을 보여주었으나, 반면에 BAO-02 균주는 낮은 키티나아제의 활성을 확인할 수 있었다. 또한, 질소원으로 맥아추출물(Malt extract)을 사용할 경우에는 키티나아제의 활성이 미미함을 확인할 수 있었으며, 젤라틴(Gelatin) 역시 맥아추출물만큼은 아니였으나, 다른 탄소원 또는 질소원에 비해 키티나아제의 활성이 미미함을 확인할 수 있었다.
5. 균주의 항생제의 최소 저해 농도 및 항균 활성 측정
본 발명의 염장발효식품인 새우젓에서 분리된 키티나아제(chitinase)의 생산능을 갖는 신규한 살리니비브리오 속 균주인 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 항생제에 대한 감수성을 확인하기 위하여 특정 항생제에 대한 최소 저해 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)를 측정하였다.
MIC가 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)의 cut-off 값보다 크면 실험 균주가 항생제에 내성을 갖는 것으로 평가되고 MIC가 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)의 cut-off 값보다 작으면 실험 균주가 항생제에 감수성을 갖는 것으로 평가된다.
BAO-01 균주 및 BAO-02 균주에 대한 항생제의 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)는 96-웰 플레이트에서 미생물 미세 희석법(wiegand et al. 2008)에 의해 측정하였으며, 균주가 107 CFU/ml 최종 농도에 도달하도록 해양배지에서 37 ℃ 온도 조건에서 충분히 배양하였다. 배양된 현탁액 50 ㎕를 각 웰에 담고, 2배 단계 희석을 실시한 항생제 희석액을 담아, 총 200 ㎕ 을 37 ℃ 온도 조건에서 24시간동안 배양한 후, 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration)를 확인하였다.
이 때 시험에 사용된 항생제로 페니실린(Penicillin), 암피실린(Ampicillin), 반코마이신(Vancomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 카나마이신(Kanamycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)를 사용하였으며, 상기 항생제 각각을 0.5 mg/L에서 256 mg/L 까지 단계적으로 희석하여 준비하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과를 살펴보면, BAO-01 균주와 BAO-02 균주 모두는 반코마이신(Vancomycin), 테트라사이클린(Tetracycline)에 대한 내성이 있음을 확인할 수 있었으며, 암피실린(Ampicillin)에 대한 감수성이 높음을 확인할 수 있었다.
구체적으로, BAO-01 균주는 반코마이신(Vancomycin), 카나마이신(Kanamycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 항생물질에 내성있는 것으로 확인할 수 있었으며, BAO-02 균주는, 반코마이신(Vancomycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)에 내성이 있음을 확인할 수 있었다.
또한, BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 항균활동을 확인하기 위하여 디스크확산법(disk diffusion method)을 사용하여 실험을 수행하였다.
항균 활성 측정 실험에 사용된 병원성 미생물은, 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KTCT), 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC), 사단법인 한국종균협회 부설 한국 미생물보존센터(KCCM)에서 추출된 병원성 미생물을 영양 한천 배지에 접종하였다.
상기 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 상등액을 8 mm 종이 디스크에 적재하고 건조시킨 다음, 상기 병원성 미생물이 포함된 영양 한천 배지에 넣었다. 그 다음 37℃에서 24시간 배양하면서 병원성 미생물의 생육 여부를 관찰하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과를 살펴보면, BAO-01 균주는, 바실러스 세레우스균(B. cereus), 대장균(E.coli K99), 황색포도상구균(S. aureus), 살모넬라 콜레라수이스균(S.choleraesuis), 시겔라보이드균(S. boydii) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Y.enterocolitica)을 억제하는 항균력이 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, BAO-02 균주는, 바실러스 세레우스균(B. cereus), 대장균(E. coli K99), 살모넬라 갈리나륨균(S. gallinarum), 황색포도상구균(S. aureus) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Y.enterocolitica)에 대한 항균성이 있음을 확인할 수 있었다.
6. 균주의 인비트로 (in vitro) 안전성 평가
(1) 생체 유래 아민 생성 평가
L-phenlyalanine, L-lysine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-argnine, L-ornithine, L-histidine과 같은 아미노산을 각각 추가한 decarboxylase 배지에서 실험 균주인 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주를 각각 배양한 후, Bover-Cid와 Holzapfel의 방법(Bover-Cid S, Hozapfel WH. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 1999)에 따라 생체 유래 아민 생성 여부를 확인하였다. 이때, 대조군으로 아미노산이 없는 탈카복실화 배지(decarboxylas medium)를 사용하였다. 이 결과는 도 5에 나타내었다.
(2) 뮤신 분해 평가
BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 뮤신 분해 여부는 0.3% 뮤신(mucin)이 공급된 아가로스 배지를 사용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
(3) 용혈 활성 평가
실험 균주인 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주의 용혈 활성은 5% 탈섬유소 양 혈액(defibrinated sheep blood, Thermo scientific, USA)를 포함하는 MRS 한천 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 배양하여 평가하였다. 혈액 한천 배지 내의 콜로니 주변에 클리어런스 영역(clearance zone)이 나타나면 용혈 활성이 양성인 경우를 의미하고 클리어런스 영역(clearance zone)이 나타나지 않으면 용혈 활성이 음성인 경우를 의미한다. 상기 균주들에 관한 용혈 활성 평가의 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과를 보면, 실험 균주인 BAO-01 균주 및 BAO-02 균주 모두 생체 유래 아민 생성, 뮤신 분해, 용혈 활성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 염장발효식품인 새우젓에서 분리 동정되되,
    바실러스 세레우스균(Bacillus cereus), 대장균(E. coli K99), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라 콜레라수이스균(Salmonella choleraesuis), 시겔라 보이드균(Shigella boydii) 및 에르시니아 엔테로콜리티카균(Yersinia enterocolitica)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하고,
    반코마이신(Vancomycin), 카나마이신(Kanamycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 항생물질에 내성이 있는,
    키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 BAO-01 균주(기탁번호 KACC 81049BP, 국립농업과학원 농업유전자원센터, 2017.07.03.).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 BAO-01 균주는, 리보오스(D-Ribose), 자일로오스(D-Xylose), 갈락토오스(D-Galactose), 글루코스(D-Glucose), 만노오스(D-Mannose), 만니톨(D-Mannitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 셀로비오스(D-Cellobiose), 수쿠레이스(D-Saccharose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene) 및 글루콘산염(Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 성장에 필요한 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 BAO-01 균주는, 5 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 9.5의 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 균주를
    리보오스(D-Ribose), 자일로오스(D-Xylose), 갈락토오스(D-Galactose), 글루코스(D-Glucose), 프룩토오스(D-Frutose), 만노오스(D-Mannose), 만니톨(D-Mannitol), N-아세틸-글루코사민(N-Acetyl-glucosamine), 셀로비오스(D-Cellobiose), 말토오스(D-Maltose), 락토오스(D-Lactose), 수쿠레이스(D-Saccharose), 스타치(Starch), 글리코겐(Glycogene), 글루콘산염(Gluconate) 및 2-케토-글루콘산염(2-keto-Gluconate)으로 이루어진 군 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 탄소원;
    제1인산암모늄(NH4H2PO4), 제2인산암모늄((NH4)2HPO4) 및 황산암모니아((NH4)2SO4)으로 이루어진 군 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 무기 질소원; 및
    유기 질소원인 카제인(Casein)인; 을 포함하는 배양용 배지에 접종하여 배양하는, 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 균주의 배양방법.
  13. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 균주를 배양용 배지에 접종한 후,
    5 ~ 20 NaCl v/w%, 10 ~ 50 ℃ 및 pH 4.0 ~ 8.5 조건에서 48 ~ 72 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 키티나아제(chitinase)를 생산할 수 있는 살리니비브리오 속 균주의 배양방법.
  14. 삭제
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