JP5397848B2 - 南極産子嚢菌類の産生する不凍タンパク質 - Google Patents
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Description
(1)アンタクトマイセス属に属する菌類の産生する不凍タンパク質。
(2)糖鎖を有する、(1)に記載の不凍タンパク質。
(3)アンタクトマイセス属に属する菌類がアンタクトマイセス・サイクロトロフィクスである(1)又は(2)に記載の不凍タンパク質。
(4)配列番号1で表されるN末端アミノ酸配列又はこれらと実質的に相同なN末端アミノ酸配列を含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の不凍タンパク質。
(6)pH2.0〜13.0の範囲で不凍活性を示す、(1)〜(5)のいずれかに記載の不凍タンパク質。
(7)不凍タンパク質を産生する能力を有するアンタクトマイセス・サイクロトロフィクスを低温下培養し、該培養液から不凍タンパク質を回収することを特徴とする不凍タンパク質の製造方法。
(9)(1)〜(5)のいずれかに記載の不凍タンパク質を含む凍結防止剤。
(10)アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株(NITE P−725)。
(実施例1)アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス由来不凍タンパク質の製造
Difco社製ポテト・デキストロース液体培地1lを3l容三角フラスコに移し、121℃にて15分間オートクレーブ滅菌を行った。種菌としてAntarctomycespsychrotrophicus Syw−1株(アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株)(受託番号:NITE P−725)を接種し、−1℃で1ヶ月間培養し、培養液を得た。該培養液をろ過・遠心分離し、得られた上清液を透析した後、Q−、ハイドロキシアパタイト及びゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分画し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動法により単一バンドになるまで精製を行い、凍結乾燥により精製タンパク質標品を得た。得られたタンパク質は下記の性質を有していた。
Ala−Gly−Leu−Asp−Leu−Gly−Ala−Ala−Ser−Xaa−Phe−Gly−Ala−Leu−Ala−Phe−Glu−Gly−Val−Ala(配列番号1)であり、データベースとの照合の結果、新規のタンパク質であることが確認された。ここでXaaは、未知のアミノ酸を示す。
1.熱ヒステリシス及び氷結晶形状修飾の測定
実施例1の方法で製造した南極産子嚢菌アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株由来不凍タンパク質(以下、本発明の不凍タンパク質と称する場合がある)を超純水で、濃度0.1〜20mg/mlの範囲に調整した試料を用いて測定を行った。不凍タンパク質溶液を直径1mmのキャピラリーガラス管に1μl入れ、試料水分の蒸発を防止するためにキャピラリー管の両端にミネラルオイルを入れた。試料が入っているキャピラリー管を測定用顕微鏡の冷却ステージに乗せ、コントローラーにより冷却ステージ温度を制御した。サンプル温度を−30℃まで冷却し、全体を凍らせた後、同じ速度でサンプルを加熱した。融点付近の温度になると、速度を0.5℃/分とし、凍結と融解の繰り返しで徐々に1つのみの氷結晶を残し、これを氷核とした。冷却速度0.1℃/分にて氷核を溶かし、氷核が溶け出す温度を溶液の融点とした。同じ速度で冷却し、氷核の形状修飾を観察した。不凍タンパク質が氷核の成長を抑制できる限界温度を超えると氷核は急成長し、溶液全体が凍った。この温度を溶液の凝固点とした。不凍タンパク質溶液の凝固点と融点の差を熱ヒステリシスとした。アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株由来精製不凍タンパク質が示す凝固点降下度は、イシカリガマホタケより調製した担子菌類由来不凍タンパク質より低く(図2)、魚類由来の不凍タンパク質と同様に、氷結晶をバイピラミッド状に修飾した。しかし、本不凍タンパク質が低濃度で結合した氷結晶表面は滑らかではなく、詳細を比較すれば魚類由来不凍タンパク質とも異なっていた(図3)。
実施例1の方法で製造したアンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株由来の不凍タンパク質を含む試料(0.05及び0.1mg/ml)を二枚のスライド・カバーガラスの間に挟み、熱ヒステリシス測定時と同様な装置を用いて測定した。冷却速度55℃/分にて試料を急速凍結させ、その後、−6℃に加温し、この状態で3時間保持した。不凍タンパク質を含まない試料(ネガティブコントロール)では、同条件にて保持することにより、氷結晶数の減少及び一氷結晶当たりの面積の増加により氷の再結晶が確認された(図4B)。一方、本発明の不凍タンパク質を含む試料では、氷結晶数の減少及び一氷結晶あたりの面積の増大は殆ど認められなかった(図4C及びD)。
実施例1の方法で製造したアンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株由来不凍タンパク質又はイシカリガマホタケ由来不凍タンパク質を含む試料を100mM 広域緩衝液にそれぞれ溶解させ、2mg/mlに調整し、実施例2に示す方法にて熱ヒステリシスの測定を行った。本発明の不凍タンパク質は、イシカリガマホタケ由来不凍タンパク質とは異なり、pH2.0〜13.0までの広いpH域にて活性を示し、至適pHは9.0付近であった(図5)。
実施例1の方法で製造したアンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株及びイシカリガマホタケ由来の不凍タンパク質を含む試料(0.1mg/ml)をそれぞれ超純水に溶解させた後、100μlを−80℃にて12時間かけて凍結させた後、2日間凍結乾燥処理を行った。処理後、再び超純水に溶解させ、実施例2に示す方法にて熱ヒステリシス及び再結晶抑制効果の測定を行った。表1に示すとおり、イシカリガマホタケ由来不凍タンパク質は凍結乾燥処理によって活性を失ったが、本発明の不凍タンパク質は処理後も活性に変化が無かった。
Claims (8)
- アンタクトマイセス属に属する菌類の産生する不凍タンパク質であって、配列番号1で表されるN末端アミノ酸配列を含む分子量20〜30kDaの不凍タンパク質。
- 糖鎖を有する、請求項1に記載の不凍タンパク質。
- アンタクトマイセス属に属する菌類がアンタクトマイセス・サイクロトロフィクスである請求項1又は2に記載の不凍タンパク質。
- pH2.0〜13.0の範囲で不凍活性を示す、請求項1〜3のいずれか1項に記載の不凍タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の不凍タンパク質の製造方法であって、該不凍タンパク質を産生する能力を有するアンタクトマイセス・サイクロトロフィクスを低温下培養し、該培養液から該不凍タンパク質を回収することを特徴とする、前記不凍タンパク質の製造方法。
- アンタクトマイセス・サイクロトロフィクスが、アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株(NITE P−725)である、請求項5に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の不凍タンパク質を含む凍結防止剤。
- アンタクトマイセス・サイクロトロフィクス Syw−1株(NITE P−725)。
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