WO2012023486A1 - 氷結晶化阻害タンパク質 - Google Patents

氷結晶化阻害タンパク質 Download PDF

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ice crystallization
ice
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protein according
protein
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秀昭 毛笠
荒井　直樹
真一 横田
友野　潤
秀久 河原
芳栄 小出
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株式会社カネカ
学校法人 関西大学
有限会社 一栄
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes

Definitions

  • the present invention relates to an ice crystallization-inhibiting protein, an antibody that specifically reacts with the ice crystallization-inhibiting protein, and a composition, food, biological sample protecting agent, and cosmetic containing the ice crystallization-inhibiting protein.
  • the ice crystallization inhibitor protein is also called antifreeze protein or antifreeze protein (AFP), and is known to have actions such as thermal hysteresis, suppression of freezing of aqueous solution, and ice crystal shape control.
  • AFP antifreeze protein
  • the ice crystallization inhibitor protein is used as a means for protecting the body from freezing of cells in living organisms, and is found, for example, from fish, insects, plants, fungi, microorganisms and the like.
  • Examples of fish crystallization-inhibiting proteins found so far from fish, insects, and microorganisms include those derived from sika deer fishes, those derived from insects such as larvae of the stag beetle, Flavobacterium genus, etc. Some are derived from microorganisms, and these have high ice crystallization inhibitory activity (Patent Documents 1 to 3). As plant-derived ice crystallization inhibitory proteins, for example, those derived from winter rye and carrots are known (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • fungal-derived ice crystallization-inhibiting proteins for example, those derived from basidiomycetes such as Ishikarigamanotake and Antarctic enokitake (Flamulina velutipes KUAF-1) are known (Patent Documents 4 to 5).
  • Patent Documents 6 to 7 attempts have been made to use the above properties industrially and use ice crystallization-inhibiting proteins to maintain the quality of frozen confectionery products such as ice cream and frozen foods.
  • JP 2004-83546 A Special table 2002-507889 gazette JP 2004-161761 A JP 2004-24237 A JP 2004-275008 A International Publication No. 92/22581 Pamphlet International Publication No. 94/03617 Pamphlet
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an ice crystallization inhibitory protein that has excellent ice crystallization inhibitory activity suitable for practical use and can be efficiently and stably provided in a safe process that can be used for food production. There is to do.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody that specifically reacts with the ice crystallization inhibitor protein, and a composition, food, biological sample protective agent, and cosmetic product containing the ice crystallization inhibitor protein.
  • a commercially available enokitake (Flamulina velutipes species) has a high ice crystallization inhibitory activity, can be stably supplied, and can be industrially applied to complete the present invention.
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention is characterized by having any one of the following amino acid sequences (1) to (6).
  • the ice crystallization-inhibiting protein of the present invention is more specifically derived from basidiomycetes, in particular from basidiomycetes belonging to the order Agaric.
  • basidiomycetes belonging to the order Agaricidae one or more basidiomycetes selected from the group consisting of the basidiomycetes belonging to the family Numerigidae, Kishimeji, Amanita, Agaricaceae, Cypridaceae, Moegitakeceae, Fucentae, Iguchi and Benitake Or a similar or improved variety of these.
  • the basidiomycetes belonging to the xylem family include xyme, murasakiji, oshiroi shimeji, kakumino shimeji, shaka shimeji, harushimeji, hatake shimeji, bunshimeji, hon shimeji, ohoriraitake, sugihiratake, hariganechitake, naruto mushroom,
  • examples of the ice crystallization inhibiting protein of the present invention include those having a molecular weight of 25000 ⁇ 250 Da and secreted proteins.
  • the antibody according to the present invention is characterized in that it specifically reacts with the ice crystallization inhibitor protein.
  • composition, food, biological sample protecting agent and cosmetic according to the present invention are characterized by containing the ice crystallization inhibitor protein according to the present invention.
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention can be obtained from basidiomycetes such as commercially available enokitake (Flamulina velutipes), which are easily available. Therefore, it can be manufactured stably and in large quantities. Moreover, the ice crystallization inhibitory protein according to the present invention has an excellent ice crystallization inhibitory activity suitable for practical use.
  • the ice crystallization inhibiting protein means a protein having a function of binding to the crystal plane of the ice crystal and inhibiting the growth of the ice crystal, measurement of thermal hysteresis, observation of the ice crystal structure, It means a protein having ice crystallization inhibitory activity defined by any known method such as measurement of ice crystallization inhibition.
  • Thermal hysteresis refers to the temperature range where ice cannot grow even in an aqueous solution containing ice crystallization inhibiting protein even at a temperature below the equilibrium melting point. If the temperature at which ice begins to grow in the aqueous solution is defined as the freezing point, Thermal hysteresis is detected as the difference between the equilibrium melting point and the freezing point.
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention includes any one of the above (1) to (5) in addition to the amino acid sequence of any one of (1) to (5) above at the N-terminus or other position.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is preferably 1 or more, 3 or less, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • Having an ice crystallization inhibitory activity means having an activity to inhibit ice crystal growth and coarsening by inhibiting ice crystallization or controlling the ice crystal shape in the protein aqueous solution. To do.
  • Examples of the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention include those derived from basidiomycetes.
  • basidiomycetes that secrete or contain ice crystallization-inhibiting proteins include those belonging to the order Agaric.
  • basidiomycetes belonging to the order Agaric include those belonging to the family Numerigidae, Kishimeji, Amanita, Agaric, Cypridaceae, Moegitake, Mushroom, Iguchi, and Amanita.
  • basidiomycetes belonging to the family Numerisa include goattake.
  • the basidiomycetes belonging to the xylem family include xyme, murasakiji, oshiroi shimeji, kakumino shimeji, shaka shimeji, harushimeji, hatake shimeji, bunshimeji, hon shimeji, ohoriraitake, sugihiratake, hariganechitake, naruto mushroom, , Shiitake, enokitake, etc .; basidiomycetes belonging to the family Amanita mushrooms, tamagotake, kabairoturutake, etc .; basidiomycetes belonging to the agaricaceae include agaric mushrooms, white mushrooms, etc .; ; Nameko et al. As basidiomycetes belonging to Moegitake family; Shogenji etc. as basidiomycetes belonging to Pleurotusaceae;
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention is not particularly limited, but can be suitably obtained from, for example, Enokitake (Flamulina velutipes).
  • the above-mentioned enokitake is also preferably white and sprout-shaped commercially available enokitake (Flamulina velutipes) artificially cultivated.
  • Commercial enokitake is readily available.
  • Commercially available enokitake is more preferred in that the extract obtained from the unit weight of basidiomycetes has excellent ice crystallization inhibitory activity.
  • related varieties means, for example, fungi belonging to the same genus even if the related varieties in the family are close in scholarly classification. This refers to varieties that are close in classification. “Improved variety” refers to fungi that have been improved by artificial selection, crossing, mutation, genetic recombination, and the like.
  • the ice crystallization-inhibiting protein according to the present invention is not particularly limited, and can be obtained, for example, by culturing basidiomycetes and recovering from the culture solution as follows.
  • the medium for cultivating basidiomycetes is not particularly limited as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, and other necessary nutrients necessary for the strain to be assimilated. Either of these can be used.
  • the culture method is not particularly limited, and may be performed by known shaking culture, aeration-agitation culture or stationary culture.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is preferably performed at a low temperature. By culturing basidiomycetes at a relatively low temperature, that is, by acclimating to a low temperature, an ice crystallization inhibitor protein can be induced. For example, 25 degrees C or less is preferable and 20 degrees C or less is more preferable. On the other hand, since the liquid medium may be frozen below the freezing point, the temperature is preferably 0 ° C. or higher.
  • the culture period is not particularly limited, but it is preferably performed for 3 days or longer. Also, the upper limit of the culture period is not particularly limited, but it may be until the basidiomycetes become confluent, or until the concentration of the ice crystallization-inhibiting protein in the medium does not increase any more, and is within 3 months. It is preferable.
  • the culture solution containing the ice crystallization-inhibiting protein obtained as described above can be used as it is, but may be further purified as necessary.
  • contaminant components may be removed by suitably combining decantation, filtration, centrifugation, membrane separation, and the like.
  • salt precipitation, precipitation with an organic solvent, affinity chromatography, ion exchange column chromatography, gel filtration, purification by binding to ice using a low-speed cooling device, etc., and concentration by dialysis or ultrafiltration are suitable. You may carry out in combination.
  • the above-described extract is powdered according to a conventional method such as spray drying or freeze-drying, or the extract is adsorbed and supported on an excipient to form powder or granules.
  • the method include solidification.
  • Examples of the ice crystallization-inhibiting protein according to the present invention include those having a molecular weight of about 25 kDa. However, since there is an experimental error in the molecular weight measurement, in the present invention, a protein having a molecular weight of 25000 ⁇ 2500 Da is also regarded as the same as the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention.
  • the molecular weight is preferably 25000 ⁇ 2000 Da, more preferably 25000 ⁇ 1000 Da, further preferably 25000 ⁇ 500 Da, and particularly preferably 25000 ⁇ 250 Da.
  • the molecular weight in the present invention can be a value calculated from a mobility comparison with a marker protein when analyzed by SDS-PAGE in the presence of a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol, for example. .
  • the ice crystallization inhibitor protein according to the present invention is preferably a secreted protein.
  • a secreted protein can be easily separated and purified from a basidiomycete culture solution.
  • the secreted protein is a generic term for proteins secreted outside the cell. That is, all proteins secreted outside the cell are called secreted proteins, regardless of the protein secretion mode or protein type.
  • the ice crystallization-inhibiting protein according to the present invention can be used for the purpose of suppressing this failure in various fields in which failure occurs due to ice crystallization of water.
  • it can be used in the food field, machine field, civil engineering field, cosmetics field, medical field using biomaterials, and the like.
  • the taste of the food can be prevented from deteriorating. For example, it prevents starch aging, or suppresses deterioration of taste and quality caused by changing the structure of water in foods by crystallizing ice and physically pressing proteins and oil components. be able to.
  • the cosmetics field it can be used as an additive to prevent deterioration of cosmetic quality.
  • a cosmetic containing an oil / fat component is frozen, water contained in the cosmetic may crystallize in ice, and the oil / fat component may be physically pressed to break the structure, thereby deteriorating the quality and feeling of use.
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention is used, the structure of the oil and fat component is retained by preventing the ice crystallization of water, so that deterioration of quality and the like can be suppressed.
  • the medical field it can be used as a protective agent when cryopreserving a biological sample.
  • a biological sample such as cells, blood, or organs
  • the water in the preservation solution freezes to produce ice crystals, which can damage the biological sample.
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention is added, the generation and growth of ice crystals can be suppressed, so that the biological sample can be protected from damage due to ice crystals.
  • the form of the ice crystallization-inhibiting protein of the present invention varies depending on its use, and may be a solution, a concentrated solution, a suspension, a lyophilized product, a powder, a granule, a tablet, or the like as it is. Moreover, it can also be set as the composition mixed with the excipient
  • the antibody according to the present invention specifically reacts with the ice crystallization inhibitory protein, and tests for the presence or absence of the ice crystallization inhibitory protein in the basidiomycete or the culture solution thereof, or tests the ice crystal from the protein mixture. It can be used to identify a protein having oxidization inhibitory activity.
  • the antibody according to the present invention may be prepared according to a conventional method. For example, mice and rats are immunized with the ice crystallization inhibitor protein, and hybridomas are obtained by fusing antibody-producing cells, spleen cells and myeloma cells. The hybridoma is cloned, and a clone producing an antibody that specifically reacts with the ice crystallization inhibiting protein is screened. This clone may be cultured and the secreted monoclonal antibody may be purified.
  • the method for measuring the ice crystallization inhibitory activity of the ice crystallization inhibitory protein of the present invention uses an appropriate method according to the type of basidiomycete. For example, it can be performed by a known method such as measurement of thermal hysteresis, observation of ice crystal structure, measurement of ice crystallization inhibition, etc., and if any method shows improvement in ice crystallization inhibition activity, It is included in the scope of the invention.
  • the ice crystallization inhibitory activity is measured, for example, by cooling an ice crystallization inhibitory protein aqueous solution containing 30 w / v sucrose to ⁇ 40 ° C., raising the temperature to ⁇ 6 ° C., and measuring the average area of ice crystals observed with a microscope.
  • the ice crystallization inhibitory activity of the ice crystallization inhibitory protein can be quantitatively evaluated using this value as an index. For example, if the same measurement is performed for a control that is a similar aqueous sucrose solution that does not contain ice crystallization inhibitor protein, and ice crystal formation is inhibited even when ice crystallization inhibitor protein is added, ice crystallization may occur. Judged to have inhibitory activity.
  • the method for measuring the ice crystallization-inhibiting protein of the present invention is not particularly limited, and can be performed by a known method such as the Lowry method, the bicinchoninic acid (BCA) method, or the Bradford method (Coomassie method). .
  • BCA bicinchoninic acid
  • Bradford method oomassie method
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 1 Preparation of Aqueous Solution of Ice Crystallization Inhibitory Protein (1) Cold Acclimation A 500 mL Erlenmeyer flask was charged with 100 mL of YG medium (containing 0.25% yeast extract and 1% glucose, pH 6.0) and artificially The cultivated white sprouts of commercially available enokitake mycelium were inoculated. Rotational culture was performed at 120 rpm and 18 ° C. for 1 week, and further low-temperature conditioned culture was performed at 4 ° C. for 1 week.
  • YG medium containing 0.25% yeast extract and 1% glucose, pH 6.0
  • EXAMPLE 2 Ice aqueous ice crystallization inhibitor protein obtained by concentrating the first embodiment of the crystallization inhibitor protein (71 mL), was subjected to concentration procedure described below. That is, the aqueous solution was cooled at a low speed (from ⁇ 0.5 ° C. to ⁇ 1.5 ° C. in 16 hours) by a circulating cooling device (Thermo Fisher Scientific, ThermoNESLAB RTE-7). Next, ice adsorbed with the ice crystallization-inhibiting protein was collected. A 38 mL solution obtained by dissolving the collected ice was used as an ice crystallization inhibitor protein concentrate. This concentrated solution was lyophilized and redissolved in 10 mM potassium phosphate buffer (60 ⁇ L, pH 7.0).
  • Example 3 Analysis of Ice Crystallization Inhibitory Protein (1) Identification of Ice Crystallization Inhibitory Protein The mass of the protein contained in the ice crystallization inhibitory protein concentrate obtained in Example 2 above was determined by the bicinchoninic acid (BCA) method. It was measured. As a result, the protein concentration was 0.2 mg / mL, and the total protein amount was 12 ⁇ g. In addition, bovine serum albumin (BSA) was used as the standard protein.
  • BCA bovine serum albumin
  • the ice crystallization inhibition protein concentrate obtained in Example 2 above was weighed in an amount containing 40 ng of protein (0.2 ⁇ L), and mixed with SDS-PAGE electrophoresis buffer (9.8 ⁇ L). did.
  • the electrophoresis buffer includes 25 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, 192 mM glycine, 0.1% sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as “SDS”).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the obtained mixed solution (10 ⁇ L) was mixed with a sample buffer (manufactured by ATTO, EzApply, 10 ⁇ L) at a volume ratio of 1: 1, and heat-treated at 99 ° C. for 3 minutes.
  • the enokitake mushroom-derived ice crystallization inhibitor is a protein, and since the ice crystallization inhibitor is present in the culture medium, the enokitake mushroom-derived ice crystallization inhibitor is a secreted protein. Is clear.
  • the gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane (Millipore, Immobilon PSQ) by a semi-dry method, and CBB staining was performed.
  • the stained spot was cut out, and the N-terminal amino acid sequence was determined by Edman method using a protein sequencer (manufactured by Shimadzu Corporation, PPSQ-33A). The obtained sequences were those shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 (SEQ ID NOS: 1 to 4).
  • the protease buffer contains V8 protease, 10% glycerol, 0.1% SDS, 125 mM Tris-HCl buffer (pH 6.7), 1 mM EDTA, 0.01% bromophenol blue.
  • SDA-PAGE was performed at 10 mA for 15 minutes, that is, at 20 mA for another 5 minutes until the sample was removed from the well. Subsequently, the power was turned off and the enzyme reaction was performed for 1 hour. After turning on the power again and performing SDS-PAGE at 20 mA for 80 minutes, the gel was transferred to a PVDF membrane (Millipore, Immobilon PSQ) by the semi-dry method, and CBB staining was performed.
  • Example 4 Measurement of Ice Crystallization Inhibitory Activity
  • an aqueous solution of ice crystallization inhibitory protein was obtained from commercially available enokitake, commercially available eringi, commercially available hakutake and commercially available bunshimeji.
  • the protein mass in each aqueous solution was measured by the same method as in Example 3.
  • the ice crystallization inhibitory activity was measured as follows. That is, under a microscope having a stage with a cooling control function, the 30 w / v% sucrose solution of the measurement sample was cooled to ⁇ 40 ° C., and then the temperature was raised to ⁇ 6 ° C. to dissolve the ice crystals. Each area of the ice crystal group observed when observed for 30 minutes in the maintained state was measured, and the average area was calculated. The results are shown in Table 1. The value in Table 1 shows the relative area when the average area of the solution derived from commercially available enokitake is 1.0. The smaller the average area of the ice crystals, the stronger the ice crystallization inhibitory activity.
  • an ice crystallization-inhibiting protein can be obtained from a basidiomycete culture solution, but it is clear that an ice crystallization-inhibiting protein obtained from a commercially available enokitake mushroom culture solution has particularly strong ice crystallization inhibition activity. It was made.
  • Example 2 In a similar manner to that measured in Example 1 of Example 5 ice crystallization inhibiting activity, to obtain an aqueous solution of ice crystallization inhibitor protein from commercial Flammulina and Antarctic Flammulina velutipes. Measuring the protein mass in the aqueous solution by the same method as in Example 3, it was also measured ice crystallization inhibiting activity in the same manner as in Example 4. The results are shown in Table 2.
  • an ice crystallization inhibitory protein can also be obtained from an Antarctic enokitake mushroom culture solution, but the ice crystallization inhibitory protein obtained from a commercially available enokitake mushroom culture solution has been demonstrated to have extremely strong ice crystallization inhibitory activity. It was.
  • the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention By adding the ice crystallization inhibiting protein according to the present invention to food, it can be used for maintaining the quality of food. Furthermore, it can be effectively used for a protective agent for cryopreservation of biological samples such as organs, cells, blood (platelets), and cosmetics having characteristics such as protecting the skin from low temperatures and excellent stability at low temperatures.

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Abstract

　本発明の解決課題は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有し、食品製造に利用できる安全な工程で効率良く安定的に提供することが可能な氷結晶化阻害タンパク質を提供することにある。また、本発明は、当該氷結晶化阻害タンパク質へ特異的に反応する抗体、並びに当該氷結晶化阻害タンパク質を含む組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、特定のアミノ酸配列を有することを特徴とする。

Description

氷結晶化阻害タンパク質
　本発明は、氷結晶化阻害タンパク質、当該氷結晶化阻害タンパク質へ特異的に反応する抗体、並びに当該氷結晶化阻害タンパク質を含む組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品に関するものである。
　氷結晶化阻害タンパク質は、不凍タンパク質やａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）とも呼ばれるものであり、熱ヒステリシス、水溶液の凍結の抑制、氷結晶形状制御といった作用を有することが知られている。氷結晶化阻害タンパク質は、生物において細胞の凍結から身を守る手段として利用されており、例えば、魚類、昆虫、植物、菌類、微生物などから見出されている。
　これまで見出されている魚類、昆虫類、微生物由来の氷結晶化阻害タンパク質としては、カジカ科の魚類に由来するもの、ゴミムシダマシの幼虫などの昆虫類に由来するもの、フラボバクテリウム属などの微生物に由来するもの等があり、これらは高い氷結晶化阻害活性を有する（特許文献１～３）。また、植物由来の氷結晶化阻害タンパク質としては、例えば、冬ライ麦やニンジン由来のものが知られている（非特許文献１～２）。
　その他に、菌類由来の氷結晶化阻害タンパク質として、例えばイシカリガマノホタケや南極エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ　ＫＵＡＦ－１）などの担子菌類に由来するものが知られている（特許文献４～５）。
　近年は、上記の性質を工業的に利用し、氷結晶化阻害タンパク質をアイスクリームなどの冷凍菓子製品や冷凍食品の品質維持のために用いる試みがなされている（特許文献６～７）。
特開２００４－８３５４６号公報 特表２００２－５０７８８９号公報 特開２００４－１６１７６１号公報 特開２００４－２４２３７号公報 特開２００４－２７５００８号公報 国際公開第９２／２２５８１号パンフレット 国際公開第９４／０３６１７号パンフレット
Plant Physiology（プラント・フィジオロジー），第１１９巻，第１３６１～１３６９頁（１９９９年） Biochem．J．（バイオケミカル・ジャーナル），第３４０巻，第３８５～３９１頁（１９９９年）
　しかしながら、魚類由来の氷結晶化阻害タンパク質は臭気を完全に取り除くことが難しい。また、昆虫や微生物は食品原料とし難いことから、昆虫や微生物由来の氷結晶化阻害タンパク質は食品への使用には適していない。
　一方、植物は食品原料として利用されていることから、植物由来の氷結晶化阻害タンパク質は食品での使用が期待されている。しかし、その氷への結合能力が他の氷結晶化阻害タンパク質と比較して弱いといった理由から、工業化は実現していない。
　同様に、従来における菌類由来の氷結晶化阻害タンパク質は、氷結晶化阻害活性が十分ではなかった。
　そこで、本発明の解決課題は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有し、食品製造に利用できる安全な工程で効率良く安定的に提供することが可能な氷結晶化阻害タンパク質を提供することにある。また、本発明は、当該氷結晶化阻害タンパク質へ特異的に反応する抗体、並びに当該氷結晶化阻害タンパク質を含む組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行なった。その結果、市販のエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）から高い氷結晶化阻害活性を有し、かつ安定供給可能で工業的に応用可能なタンパク質を見出し、本願発明を完成させるに至った。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、下記（１）～（６）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。
　（１）　配列番号１のアミノ酸配列
　（２）　配列番号２のアミノ酸配列
　（３）　配列番号３のアミノ酸配列
　（４）　配列番号４のアミノ酸配列
　（５）　配列番号５のアミノ酸配列
　（６）　上記（１）～（５）の何れかのアミノ酸配列の１以上、５以下のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する物質が氷結晶化阻害活性を有するアミノ酸配列
　本発明の氷結晶化阻害タンパク質は、より具体的には担子菌に由来するものであり、特にハラタケ目に属する担子菌に由来するものである。ハラタケ目に属する担子菌としては、ヌメリガサ科、キシメジ科、テングタケ科、ハラタケ科、ヒトヨタケ科、モエギタケ科、フウセンタケ科、イグチ科およびベニタケ科に属する担子菌からなる群から選ばれる１以上の担子菌、または、これらの類縁品種もしくは改良品種を挙げることができる。キシメジ科に属する担子菌としては、キシメジ、ムラサキシメジ、オシロイシメジ、カクミノシメジ、シャカシメジ、ハルシメジ、ハタケシメジ、ブナシメジ、ホンシメジ、オオホウライタケ、スギヒラタケ、ハリガネオチバタケ、キツネタケ、ナラタケ、ムキタケ、マツタケ、シロマツタケモドキ、シイタケおよびエノキタケからなる群から選ばれる１以上の担子菌、または、これらの類縁品種もしくは改良品種を挙げることができ、特に、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｔｉｐｅｓ種）、または、これらの類縁品種もしくは改良品種を挙げることができる。
　本発明の氷結晶化阻害タンパク質として、より具体的には、分子量が２５０００±２５０Ｄａであるもの、また、分泌タンパク質であるものを挙げることができる。
　本発明に係る抗体は、上記氷結晶化阻害タンパク質と特異的に反応することを特徴とする。
　本発明に係る組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品は、上記本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質を含むことを特徴とする。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、例えば、入手が容易な市販エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ種）などの担子菌から得ることが可能である。従って、安定かつ大量に製造でき、提供することができる。また、本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する。
　以下、本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質について詳細に説明する。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質とは、氷結晶の結晶面に結合して氷結晶の成長を阻害する機能を有するタンパク質を意味するものであり、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷結晶化阻害の測定など、公知の何れかの方法により定義される氷結晶化阻害活性を有するタンパク質を意味する。
　熱ヒステリシスとは、氷結晶化阻害タンパク質を含む水溶液中で平衡融点以下の温度であっても氷が成長できない温度域をいい、氷が水溶液中で成長を開始する温度を凝固点と定義すれば、熱ヒステリシスは平衡融点と凝固点の差として検出される。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、上記（１）～（５）の何れかのアミノ酸配列をＮ末端またはそれ以外の位置に有するものの他、上記（１）～（５）の何れかのアミノ酸配列の１以上、５以下のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する物質が氷結晶化阻害活性を有するアミノ酸配列（６）をＮ末端またはそれ以外の位置に有するものである。
　上記アミノ酸配列（６）において、欠失、置換または付加されるアミノ酸の数としては、１以上、３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。
　氷結晶化阻害活性を有するとは、そのタンパク質水溶液において、氷の結晶化を阻害したり氷結晶形状を制御することによって、氷結晶の成長や粗大化を抑制する活性を有することをいうものとする。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質としては、例えば、担子菌に由来するものを挙げることができる。
　氷結晶化阻害タンパク質を分泌する、或いは含む担子菌としては、ハラタケ目に属するものを挙げることができる。ハラタケ目に属する担子菌としては、例えば、ヌメリガサ科、キシメジ科、テングタケ科、ハラタケ科、ヒトヨタケ科、モエギタケ科、フウセンタケ科、イグチ科、ベニタケ科に属するものが挙げられる。
　ヌメリガサ科に属する担子菌としては、ヤギタケ等が挙げられる。キシメジ科に属する担子菌としては、キシメジ、ムラサキシメジ、オシロイシメジ、カクミノシメジ、シャカシメジ、ハルシメジ、ハタケシメジ、ブナシメジ、ホンシメジ、オオホウライタケ、スギヒラタケ、ハリガネオチバタケ、キツネタケ、ナラタケ、ムキタケ、マツタケ、シロマツタケモドキ、シイタケ、エノキタケ等が；テングタケ科に属する担子菌としては、タマゴタケ、カバイロツルタケ等が；ハラタケ科に属する担子菌としては、ハラタケ、シロオオハラタケ等が；ヒトヨタケ科に属する担子菌としてはヒトヨタケ等が；モエギタケ科に属する担子菌としてはナメコ等が；フウセンタケ科に属する担子菌としてはショウゲンジ等が；イグチ科に属する担子菌としてはヤマドリタケ等が；ベニタケ科に属する担子菌としてはアイタケ等が挙げられる。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、特に限定されるものではないが、例えばエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）から好適に得ることができる。
　上記エノキタケでも、人工的に栽培した白色かつもやし状の市販エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）が好ましい。市販エノキタケは、容易に入手できる。また、市販エノキタケは、担子菌類の単位重量あたりから得られる抽出物が有する氷結晶化阻害活性が優れている点で、より好ましい。
　なお、上記担子菌の類縁品種および改良品種も、適宜使用することができる。
　本発明において、「類縁品種」とは、例えば、科の類縁品種は同じ属に属する菌類でも学術上の分類において近い品種をいい、具体的な菌株の類縁品種は同じ科に属する菌株でも学術上の分類において近い品種をいう。また、「改良品種」とは、人為的な選択、交雑、突然変異、遺伝子組み換えなどにより改良した菌類をいうものとする。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、特に限定されるものではないが、例えば担子菌を培養し、以下のようにしてその培養液から回収することにより得ることができる。
　担子菌を培養する培地としては、特に限定されるものではなく、菌株が資化し得るのに必要な炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を含んでいればよく、合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
　培養方法は特に限定されるものではないが、公知の振とう培養、通気撹拌培養または置地培養などで行えばよい。
　培養温度は特に制限されないが、低温下で行うことが好ましい。比較的低温で担子菌を培養する、即ち低温馴化することにより、氷結晶化阻害タンパク質を誘導することができる。例えば、２５℃以下が好ましく、２０℃以下がより好ましい。一方、氷点下以下では液体培地が凍結するおそれがあるため、０℃以上とすることが好ましい。
　培養期間は特に制限されないが、３日以上行うことが好ましい。また、培養期間の上限も特に制限されないが、担子菌がコンフルエントな状態となるまでや、培地中の氷結晶化阻害タンパク質の濃度がそれ以上向上しなくなるまでとすればよく、３ヶ月以内とすることが好ましい。
　上記のようにして得られた氷結晶化阻害タンパク質を含む培養液は、そのまま用いることもできるが、必要に応じて、さらに精製を行ってもよい。例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離、膜分離などを好適に組み合わせて夾雑成分を除去してもよい。また例えば、塩析や有機溶媒による沈殿や、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、低速冷却装置を用いた氷への結合等による精製、透析や限外濾過などによる濃縮を好適に組み合わせて行ってもよい。
　さらに必要に応じて、粉末状または顆粒状など任意の形態に固形化してもよい。固形化の方法は特に限定されないが、例えば、上記の抽出物を噴霧乾燥や凍結乾燥などの常法に従って粉末化する方法や、抽出物を賦形剤に吸着、担持させて粉末または顆粒状に固形化する方法などを挙げることができる。これらの操作は当業者に公知のものであり、用途に応じて適宜選択して用いることができる。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質としては、その分子量が約２５ｋＤａであるものを挙げることができる。但し、分子量測定では実験誤差もあるので、本発明においては、分子量が２５０００±２５００Ｄａのタンパク質も、本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質と同様のものとみなす。当該分子量としては、２５０００±２０００Ｄａが好ましく、２５０００±１０００Ｄａがより好ましく、２５０００±５００Ｄａがさらに好ましく、２５０００±２５０Ｄａが特に好ましい。
　なお、本発明における分子量とは、例えば２－メルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤の存在下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した際にマーカータンパク質との移動度比較から算出した値とすることができる。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、分泌タンパク質であることが好ましい。分泌タンパク質であれば、担子菌の培養液から容易に分離精製することが可能になる。ここで分泌タンパク質とは、細胞外に分泌されるタンパク質を総称するものである。即ち、タンパク質の分泌様式やタンパク質の種類によらず、細胞外に分泌されるタンパク質は全て分泌タンパク質と呼ぶ。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質は、水が氷結晶化することで障害が生じる様々な分野において、この障害を抑制する目的で利用可能である。例えば、食品分野、機械分野、土木分野、化粧品分野、生体材料を用いる医療分野などで利用可能である。
　食品分野では、食品に含まれる水の氷結晶化を抑制することで、当該食品の味の劣化などを防ぐことができる。例えば、澱粉老化を防止したり、食品中の水が氷結晶化して、タンパク質や油脂成分などを物理的に圧迫し、その構造を変化させることによる味や品質などの劣化を、抑制したりすることができる。
　機械分野、土木分野では、機械の可動部、道路、地盤などの凍結防止剤として利用できる。
　化粧品分野では、化粧品の品質の劣化などを防ぐための添加剤として利用できる。例えば、油脂成分を含む化粧品を凍結させると、当該化粧品に含まれる水が氷結晶化して、当該油脂成分を物理的に圧迫してその構造を壊すことがあり、品質と使用感が劣化する。本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質を用いれば、水の氷結晶化を防ぐことで油脂成分の構造が保持されるため、品質の劣化などを抑制することができる。
　医療分野では、生体試料を凍結保存する際の保護剤として用いることができる。例えば、細胞、血液、臓器などの生体試料を従来公知の保存液に入れて凍結保存すると、保存液中の水分が凍結して氷結晶を生じ、かかる氷結晶により生体試料が損傷することがある。しかし、本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質を添加すれば、氷結晶の発生や成長を抑制することができるので、生体試料を氷結晶による損傷から保護することができる。
　本発明の氷結晶化阻害タンパク質の形態は、その用途に応じて様々であり、そのまま、溶液、濃縮液、懸濁液、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などであってもよい。また、賦形剤などと混合した組成物とすることもできる。
　また、本発明に係る抗体は、上記氷結晶化阻害タンパク質と特異的に反応するものであり、担子菌またはその培養液における当該氷結晶化阻害タンパク質の有無を試験したり、タンパク質混合物から氷結晶化阻害活性を有するタンパク質を特定したりするために用いることができる。
　本発明に係る抗体の調製は常法に従えばよい。例えば、上記氷結晶化阻害タンパク質を用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、上記氷結晶化阻害タンパク質へ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
　次に、本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質の活性測定法とタンパク質量の測定法について説明する。
　本発明の氷結晶化阻害タンパク質の氷結晶化阻害活性の測定方法は、担子菌の種類などに応じて適宜適したものを用いる。例えば、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷結晶化阻害の測定などの公知の方法にて行うことができ、何れかの方法で氷結晶化阻害活性の向上が認められる場合は、本発明範囲に含まれるものとする。氷結晶化阻害活性の測定は、例えば、ショ糖を３０ｗ／ｖ％含む氷結晶化阻害タンパク質水溶液を－４０℃に冷却した後に－６℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積を測定することにより行うことができる。氷結晶化阻害活性が強いほどこの氷結晶の平均面積は小さくなることから、この数値を指標として、氷結晶化阻害タンパク質の氷結晶化阻害活性を定量的に評価することができる。例えば、氷結晶化阻害タンパク質を含まない同様のショ糖水溶液である対照につき同様の測定を行い、氷結晶化阻害タンパク質を添加したときに氷結晶の形成が少しでも阻害されれば、氷結晶化阻害活性を有すると判断する。
　本発明の氷結晶化阻害タンパク質の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えばＬｏｗｒｙ法やビシンコニン酸（ＢＣＡ）法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ法）などの公知の方法にて行うことができる。標準タンパク質としては、特に限定されないが、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を好適に用いることができる。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　実施例１　氷結晶化阻害タンパク質の水溶液の調製
　（１）　低温馴化
　５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬのＹＧ培地（０．２５％酵母エキスと１％グルコースを含む，ｐＨ６．０）を入れ、人工的に栽培した白色かつもやし状の市販エノキタケ菌糸を植菌した。１２０ｒｐｍ、１８℃で１週間回転培養を行い、さらに４℃で１週間低温馴化培養を行った。
　（２）　氷結晶化阻害タンパク質の水溶液の取得
　上記で得られた培養液を、１０，０００×ｇで３０分遠心分離し、さらに分画分子量１０，０００の限外濾過膜にて濃縮した後、培地を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と置換した。
　実施例２　氷結晶化阻害タンパク質の濃縮
　上記実施例１で得られた氷結晶化阻害タンパク質の水溶液（７１ｍＬ）を、以下に示す濃縮操作に供した。即ち、上記水溶液を、循環冷却装置（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ＴｈｅｒｍｏＮＥＳＬＡＢ　ＲＴＥ－７）により低速（１６時間で－０．５℃から－１．５℃）で冷却した。次いで、氷結晶化阻害タンパク質が吸着した氷を回収した。回収した氷を溶解させることにより得られた３８ｍＬの溶液を、氷結晶化阻害タンパク質濃縮液とした。この濃縮液を凍結乾燥し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（６０μＬ，ｐＨ７．０）に再溶解した。
　実施例３　氷結晶化阻害タンパク質の分析
　（１）　氷結晶化阻害タンパク質の特定
　上記実施例２で得られた氷結晶化阻害タンパク質濃縮液に含まれるタンパク質の質量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により測定した。その結果、タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍＬであり、総タンパク質量は１２μｇであった。なお、標準タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。
　上記測定結果に基づき、上記実施例２で得られた氷結晶化阻害タンパク質濃縮液を、タンパク質を４０ｎｇ含む分（０．２μＬ）だけ量り取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ泳動用バッファー（９．８μＬ）と混合した。泳動用バッファーは、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、１９２ｍＭグリシン、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」という）を含む。得られた混合液（１０μＬ）を、サンプルバッファー（ＡＴＴＯ社製，ＥｚＡｐｐｌｙ，１０μＬ）と容量比１：１で混合し、９９℃で３分間加熱処理した。次に、１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製，ｅ－Ｐａｇｅｌ）にアプライし、２０ｍＡで８５分間ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。電気泳動終了後、銀染色キット（コスモバイオ社製）を用い、銀染色した。その結果、単一のバンドが得られた。その分子量は約２５ｋＤａであった。
　以上の結果のとおり、エノキタケ由来の氷結晶化阻害物質はタンパク質であり、また、培養液中に氷結晶化阻害物質が存在することから、エノキタケ由来の氷結晶化阻害物質が分泌タンパク質であることは明らかである。
　（２）　Ｎ末端アミノ酸配列の特定１
　上記実施例２で得られた氷結晶化阻害タンパク質濃縮液から、タンパク質を０．５μｇ含む分（２．５μＬ）だけ量り取り、ＳＤＡ－ＰＡＧＥ用バッファー（２．５μＬ）と混合した。得られた混合液（５μＬ）を、サンプルバッファー（ＡＴＴＯ社製，ＥｚＡｐｐｌｙ，５μＬ）と容量比１：１で混合し、９９℃で３分間加熱処理した。次に、１５％ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製，ｅ－Ｐａｇｅｌ）にアプライし、２０ｍＡで８５分間ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。電気泳動終了後のゲルを、セミドライ法にてＰＶＤＦ膜（ミリポア社製，イモビロンＰＳＱ）に転写し、ＣＢＢ染色を行った。染色されたスポットを切り出し、プロテインシーケンサ（島津製作所製，ＰＰＳＱ－３３Ａ）を用い、Ｎ末端アミノ酸配列をエドマン法により決定した。得られた配列は、配列番号１～４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＳ：１～４）に示すものであった。
　（３）　Ｎ末端アミノ酸配列の特定２
　上記実施例２で得られた氷結晶化阻害タンパク質濃縮液から、タンパク質を１μｇ含む分（５μＬ）だけ量り取り、サンプルバッファー（５μＬ）と容量比１：１で混合し、９９℃で３分間加熱処理した。ここで用いたサンプルバッファーは、１０％グリセロール、５％　２－メルカプトエタノール、２．３％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）、０．０１％ブロモフェノールブルーを含む。さらに、Ｖ８プロテアーゼ（ＷＡＫＯ社製，０．５μｇ）を含むプロテアーゼバッファー（５μＬ）を、同ウェルにアプライした。当該プロテアーゼバッファーは、Ｖ８プロテアーゼの他、１０％グリセロール、０．１％　ＳＤＳ、１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．７）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０１％ブロモフェノールブルーを含む。ＳＤＡ－ＰＡＧＥは、１０ｍＡで１５分間、即ち、ウェルからサンプルが抜けるまで、さらに、２０ｍＡで５分間行った。次いで、電源を切り、１時間酵素反応を行った。再び電源を入れ、２０ｍＡで８０分間ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、セミドライ法にてゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製，イモビロンＰＳＱ）に転写し、ＣＢＢ染色を行ったところ、２本のバンドが染色により確認された。染色されたスポットを切り出し、プロテインシーケンサ（島津製作所製，ＰＰＳＱ－３３Ａ）を用い、Ｎ末端アミノ酸配列をエドマン法により決定した。得られた配列は、上記（２）の配列番号１～４と、配列番号５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）に示すものであった。
　実施例４　氷結晶化阻害活性の測定
　上記実施例１と同様の方法により、市販エノキタケ、市販エリンギ、市販ハクレイタケおよび市販ブナシメジから氷結晶化阻害タンパク質の水溶液を得た。上記実施例３と同様の方法により、各水溶液におけるタンパク質質量を測定した。
　また、氷結晶化阻害活性を、次のとおり測定した。即ち、冷却調節機能が付いたステージを有する顕微鏡下で、測定試料の３０ｗ／ｖ％ショ糖溶液を－４０℃に冷却した後に－６℃まで温度を上げて氷結晶を溶かし、－６℃を保った状態で３０分間観察したときに認められる氷結晶群の各面積を測定し、平均面積を算出した。結果を表１に示す。表１中の値は、市販エノキタケ由来の溶液による上記の平均面積を１．０としたときの相対面積を示している。この氷結晶の平均面積が小さいほど、氷結晶化阻害活性が強いことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、担子菌の培養液からは氷結晶化阻害タンパク質が得られるが、特に市販エノキタケ培養液から得られる氷結晶化阻害タンパク質は、氷結晶化阻害活性が極めて強いことが明らかにされた。
　実施例５　氷結晶化阻害活性の測定
　上記実施例１と同様の方法により、市販エノキタケと南極エノキタケから氷結晶化阻害タンパク質の水溶液を得た。上記実施例３と同様の方法により各水溶液におけるタンパク質質量を測定し、また、上記実施例４と同様の方法により氷結晶化阻害活性を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、南極エノキタケの培養液からも氷結晶化阻害タンパク質が得られるが、市販エノキタケ培養液から得られる氷結晶化阻害タンパク質は、氷結晶化阻害活性が極めて強いことが実証された。
　本発明に係る氷結晶化阻害タンパク質を食品に添加することにより、食品の品質維持などに役立てることができる。さらに、臓器、細胞、血液（血小板）などの生体試料の凍結保存における保護剤や、皮膚を低温から保護したり、低温安定性に優れるといった特性を有する化粧品にも有効に用いることができる。

Claims (13)

  1. 　下記（１）～（６）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする氷結晶化阻害タンパク質。
    　（１）　配列番号１のアミノ酸配列
    　（２）　配列番号２のアミノ酸配列
    　（３）　配列番号３のアミノ酸配列
    　（４）　配列番号４のアミノ酸配列
    　（５）　配列番号５のアミノ酸配列
    　（６）　上記（１）～（５）の何れかのアミノ酸配列の１以上、５以下のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する物質が氷結晶化阻害活性を有するアミノ酸配列
  2. 　担子菌に由来するものである請求項１に記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  3. 　上記担子菌がハラタケ目に属するものである請求項２に記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  4. 　ハラタケ目に属する担子菌が、ヌメリガサ科、キシメジ科、テングタケ科、ハラタケ科、ヒトヨタケ科、モエギタケ科、フウセンタケ科、イグチ科およびベニタケ科に属する担子菌からなる群から選ばれる１以上の担子菌、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項３に記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  5. 　上記キシメジ科に属する担子菌が、キシメジ、ムラサキシメジ、オシロイシメジ、カクミノシメジ、シャカシメジ、ハルシメジ、ハタケシメジ、ブナシメジ、ホンシメジ、オオホウライタケ、スギヒラタケ、ハリガネオチバタケ、キツネタケ、ナラタケ、ムキタケ、マツタケ、シロマツタケモドキ、シイタケおよびエノキタケからなる群から選ばれる１以上の担子菌、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項４に記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  6. 　上記キシメジ科に属する担子菌が、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｔｉｐｅｓ種）、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項４に記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  7. 　分子量が２５０００±２５０Ｄａである請求項１～６の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  8. 　分泌タンパク質である請求項１～７の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質。
  9. 　請求項１～８の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質と特異的に反応することを特徴とする抗体。
  10. 　請求項１～８の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質を含むことを特徴とする組成物。
  11. 　請求項１～８の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質を含むことを特徴とする食品。
  12. 　請求項１～８の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質を含むことを特徴とする生体試料保護剤。
  13. 　請求項１～８の何れかに記載の氷結晶化阻害タンパク質を含むことを特徴とする化粧品。
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