JP2011229504A - 生産性および不凍活性を向上させた改変型不凍タンパク質とその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の1または複数が、QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の1または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の1または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
【選択図】なし
Description
[1] SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の1または複数が、QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の1または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の1または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
[2] SP型不凍タンパク質の配列番号6に示されるアミノ酸配列において、18番目および19番目から選択される1または2つのアミノ酸残基を、QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該18番目および19番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基でそれぞれ置換されてなる、[1]の改変型不凍タンパク質。
[3] (i)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列;
(ii)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列;または
(iii)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで、配列番号1のアミノ酸配列における18番目、配列番号2のアミノ酸配列における19番目、ならびに配列番号3のアミノ酸配列における18番目および19番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、[2]の改変型不凍タンパク質。
[4] QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の1または複数が、SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の1または複数に相対的に対応する位置にある、不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の1または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
[5] QAE型不凍タンパク質の配列番号8に示されるアミノ酸配列において、8番目のアミノ酸残基を、SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該8番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基で置換されてなる、[4]の改変型不凍タンパク質。
(ii)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列;または
(iii)配列番号4のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで配列番号4のアミノ酸配列において8番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、[5]の改変型不凍タンパク質。
[7] [1]〜[6]のいずれかの改変型不凍タンパク質をコードするDNA。
[8] [7]のDNAを含む組換えベクター。
[9] [8]の組換えベクターを含む細胞。
[10] DNA組換え法を用いて合成することを含む、[1]〜[6]のいずれかの改変型不凍タンパク質の製造方法。
[11] [9]の細胞を培養すること、および該細胞の培養物より改変型不凍タンパク質を回収することを含む、[1]〜[6]のいずれかの改変型不凍タンパク質の製造方法。
配列番号1〜4の改変III型不凍タンパク質、SP P18L、SP A19V、SP P18L/A19V、QAE N8TをコードするDNAの作製にはそれぞれ、図2に示すプライマーと鋳型を用いた。以下、SP P18Lの発現ベクター構築法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の発現ベクターも同様に構築した。
以下、SP P18Lの発現法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の発現も同様に行なった。
以下、SP P18Lの精製法について述べるが、他の改変III型不凍タンパク質の精製も同様に行なった。
1/3長に切断したガラスキャピラリー管(EMマイスターミニキャップス、内径0.92mm、外径1.39mm)の中央に0.1mMの不凍タンパク質を含む試料溶液0.7μlを入れ、蒸発を防止するために両端をミネラルオイルで塞いだ。これを銅製のホルダーにはめ込み、ライカ社製DMLB100型顕微鏡(Leica DMLB 100 photomicroscope)のステージ部に設置した冷却箱内にセットした。そして30μlのエチレングリコールでガラスキャピラリー管と銅製ホルダーの隙間を満たした。冷却箱および銅製ホルダーの上下には直径1mmの光取り入れ穴をあけ、顕微鏡光源からの光は下側の穴から箱内を通り上側の穴を抜けてレンズに入光させるようにした。この上下の穴により規定される光軸上に試料溶液をセットすることで、光軸上にある試料溶液中の物質を顕微鏡観察することができる。試料溶液がセットされた冷却箱の中の温度は、リンカム社製LK600温度制御装置(LK600 温度コントローラー)により制御される。室温下で試料溶液をセットした後、温度制御装置により冷却箱内の温度を毎秒30℃でマイナス30℃まで下降させた。およそマイナス14℃からマイナス25℃の間の温度のどこかで試料溶液の全体が凍結する。凍結の後に毎秒10℃で冷却箱内温度を上昇させ零℃で上昇を停止し、そのまま10秒程度の間、零℃を維持していると凍結が溶け、無数の亀裂の入った氷結晶状態を経たのちに、数えられる程度の氷結晶粒が水中に浮かんだものが観測された。更に冷却箱内温度を±0.05℃の範囲で繰り返し上昇・降下させることで氷結晶を溶解させその数を減らし、最終的に一つだけの氷結晶を試料溶液中に得た。この氷結晶が溶け初める温度を融点として予め記録しておき、融点より0.20℃低い温度で一つの氷結晶を含む試料溶液を保持し、10分間隔で氷結晶の形状と大きさを観察した。観察結果を図5に示す。SPを含む試料溶液中では、バイピラミダル氷結晶の体積が10分間のうちに91倍に成長した。これに対し、SP P18Lでは7.5倍、SP A19Vでは2.7倍、SP P18L/A19Vでは1.9倍であった。30分後においても、SP P18Lでは49倍、SP A19Vでは7.4倍、SP P18L/A19Vでは2.4倍であり、これらの改変III型不凍タンパク質で氷結晶成長抑制能の大幅な向上が確認された。また、QAE N8TがQAEと同等の氷結晶成長抑制能を有することが確認された。
Claims (11)
- SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の1または複数が、QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の1または複数に相対的に対応する位置にある、氷結晶結合に関与するアミノ酸残基の1または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
- SP型不凍タンパク質の配列番号6に示されるアミノ酸配列において、18番目および19番目から選択される1または2つのアミノ酸残基を、QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該18番目および19番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基でそれぞれ置換されてなる、請求項1記載の改変型不凍タンパク質。
- (i)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列;
(ii)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列;または
(iii)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで、配列番号1のアミノ酸配列における18番目、配列番号2のアミノ酸配列における19番目、ならびに配列番号3のアミノ酸配列における18番目および19番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、請求項2記載の改変型不凍タンパク質。 - QAE型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の1または複数が、SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該アミノ酸残基の1または複数に相対的に対応する位置にある、不凍タンパク質の分子表面に存在するアミノ酸残基の1または複数で置換されてなる、改変型不凍タンパク質。
- QAE型不凍タンパク質の配列番号8に示されるアミノ酸配列において、8番目のアミノ酸残基を、SP型不凍タンパク質のアミノ酸配列において該8番目のアミノ酸残基に相対的に対応する位置にあるアミノ酸残基で置換されてなる、請求項4記載の改変型不凍タンパク質。
- (i)配列番号4のアミノ酸配列;
(ii)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列;または
(iii)配列番号4のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ不凍活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ここで配列番号4のアミノ酸配列において8番目のアミノ酸残基は保存されている、
で示される、請求項5記載の改変型不凍タンパク質。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の改変型不凍タンパク質をコードするDNA。
- 請求項7に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項8に記載の組換えベクターを含む細胞。
- DNA組換え法を用いて合成することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の改変型不凍タンパク質の製造方法。
- 請求項9に記載の細胞を培養すること、および該細胞の培養物より改変型不凍タンパク質を回収することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の改変型不凍タンパク質の製造方法。
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