KR102268624B1 - Il-33의 결정화를 위한 신규 융합 단백질 및 이를 이용한 결정화 방법 - Google Patents

Il-33의 결정화를 위한 신규 융합 단백질 및 이를 이용한 결정화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-33의 결정구조 분석을 위한 신규한 융합 단백질, 이의 제조방법 및 결정화 방법 등에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 2-3 Å 정도의 X선 회절 데이터를 모을 수 있는 사이즈 200 μm 이상의 결정을 얻을 수 있으며, 고분해능의 구조를 얻을 수 있다. 상기 구조를 기반으로 하여, IL-33과 저해제 물질이 형성한 복합체의 구조 분석이 가능한바, 본 발명은 사이토카인 단백질의 구조 연구 및 다양한 저해 화합물, 펩타이드 등의 약물에 대한 스크리닝을 위한 플랫폼 단백질로서 활용될 것으로 기대된다.

Description

IL-33의 결정화를 위한 신규 융합 단백질 및 이를 이용한 결정화 방법{Novel fusion protein for crystallization of IL-33 and crystallization method using the same}
본 발명은 IL-33(Interleukin-33)의 결정구조 분석을 위한 신규한 융합 단백질, 이의 제조방법 및 결정화 방법 등에 관한 것이다.
아토피성 피부염, 천식 및 알레르기성 비염과 같은 알레르기성 면역 질환은 삶의 질을 감소시키는 만성 질환이다. 특히 이 질병은 유년기 및 청소년기에 높은 발병률을 보이며, 이 시기의 치료가 적절하지 않을 시에 성인이 된 이후에도 이들 질병의 치료를 위해 더욱 많은 사회적 비용이 발생하게 된다. 알레르기 질환은 재발률이 높기 때문에 그 질환을 조기에 차단하여 알레르기 질환의 진행을 억제하는 것이 중요하다[비특허문헌 1].
알레르기 질환의 발달은 면역체계와 관련이 있다. 특히, IL-33, IL-25 및 TSLP 등의 알레르기 유발 물질은 상피 세포에서 분비된다. 이들은 초기의 T helper 세포를 T helper 2 세포(Th2)로의 분화를 유도한다. Th2는 면역 글로불린 E(IgE) 및 관련 염증 반응을 유발하는 요인인 IL-4와 IL-5를 분비한다. 현재의 치료 연구는 주로 Th2에서 매개되는 사이토카인에 초점을 맞추고 있어, 초기 단계의 알레르겐(allergens; IL-33, IL-25 및 TSLP)에 대한 연구는 충분하지 않은 상태이다[비특허문헌 2, 3].
알러지 유발 사이토카인으로서 IL-33은 그 알레르기 질환을 유발하는 주요 인자일 뿐만 아니라, 장벽을 보호하는 주요 요인이기도 하다[비특허문헌 4]. IL-33은 270개의 잔기로 구성되며, N-말단 도메인(localization peptide), 중앙 도메인 및 사이토카인 도메인과 같은 IL-1을 구성한다. 인간 IL-33은 비증식 내피세포 및 각질세포에서 전장 형태(full-length form)의 전구체로서 생산된다. 사이토카인 도메인과 같은 IL-1을 포함하는 mature IL-33(95~270, 99~270 또는 109~270 a.a.)는 전신 IL-33(1~270 a.a.) 보다 수용체 단백질인 ST2와의 반응에서 10배의 활성의 차이를 보인다[비특허문헌 5]. 피부 장벽이 병원균에 의해 손상되면 IL-33은 세포 외부로 방출된다. N-말단 도메인은 수용체 ST2 및 IL-1 상동 수용체 부속 단백질(IL-1AcP)을 통해 세포 내부의 신호전달 반응을 발생시킨다[비특허문헌 6].
IL-33은 구조적으로 13개의 β strand로 구성된다. 이들은 도 2에 도시된 바와 같이, 각각 한 쌍씩의, β2-β13, β1-β4-β5 및 β9-β10 와 β3-β4, β7-β8 및 β11-β12에 의해 β-트레포일(β-trefoil) 구조를 형성한다[비특허문헌 7]. 현재 확인된 IL-33 구조가 있지만, 복합체 구조가 대부분이며, 아포 구조는 NMR로 분석된 단 하나의 구조만 존재한다[비특허문헌 8, 9]. IL-33 활성형의 엑스선 결정구조는 밝혀지지 않아, 여러 저해제와의 복합체 구조 등을 통한 정보의 획득에 어려움이 있다. 결정화가 어려운 여러 원인 중 대표적인 것이 사이토카인 단백질 내에 존재하는 시스테인으로 인한 산화 현상인데, 이는 결정의 균질성을 방해하여, 단백질 결정구조에 있어 중요한 패킹(packing)에 영향을 주기 때문인 것으로 여러 선행연구를 통해 알 수 있다[비특허문헌 6].
따라서, 보다 손쉽게 단백질 결정을 획득하여, IL-33의 구조를 아포 형태로 밝히고, 향후 약물 개발에 대한 다양한 정보를 제공하는, 저분자 저해제의 구조적 스크리닝을 가능하게 하는 플랫폼 단백질의 개발이 필요하다.
미국공개특허 US 2004/0191869A
Davidson WF, et al. Report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on "Atopic dermatitis and the atopic march: Mechanisms and interventions", The Journal of Allergy and Clinical Immunology, Volume 143, Issue 3, Pges 894-913 (2019) Gandhi NA, et al. "Targeting key proximal drivers of type 2 inflammation in disease"Nature Reviews Drug Discovery 15, 35-50 (2016) Liew, F.Y., et al. "IL-33: a Janus cytokine". Ann. Rheum. Dis. 71 (suppl. 2), i101-i104 (2012) Schmitz J, et al. "IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines." Immunity 23(5):479-490. (2005) Lefrancais E, et al. "IL-33 is processed into mature bioactive forms by neutrophil elastase and cathepsin G." Proc Natl Acad Sci USA 109(5):1673-1678 (2012) E. Suzanne Cohen, et al. "Oxidation of the alarmin IL-33 regulates ST2-dependent inflammation" Nature Communications 6, Article number: 8327 (2015) Andreas Linge,l et al. "The structure of interleukin-33 and its interaction with the ST2 and IL-1RAcP receptors - insight into the arrangement of heterotrimeric interleukin-1 signaling complexes" Structure, 17(10):1398-410 (2009) Xi Liu et al.,"Structural insights into the interaction of IL-33 with its receptors" Proc Natl Acad Sci USA 110(37):14918-14923 (2013) S. Gunther et al.,"IL-1 Family CytokinesUse Distinct MolecularMechanisms to Signal through Their Shared Co-receptor" Immunity , 47: 510-523 (2017)
이에, 본 발명자들은 IL-33 단백질의 3차 구조 규명 및 이를 활용한 신약 발굴 연구에 활용하기 위하여, IL-33과 T4L(T4-Lysozyme)과의 융합 구조 설계, 융합 단백질의 발현 및 정제 방법을 개발하고, 이를 통하여 IL-33, 및 IL-33과 저해제가 형성한 복합체의 결정형을 제조하고, 그 결정구조를 분석함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 IL-33의 결정구조 분석을 위한 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환 된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질의 결정형을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질의 결정형을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질과 상기 융합 단백질의 IL-33에 결합한 IL-33 저해제가 형성한 복합체의 결정형을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-33(Interleukin-33) 또는 이의 단편인 융합 성분 1, 및 T4L(T4-Lysozyme) 또는 이의 변이체인 융합 성분 2를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 융합 성분 2가 융합 성분 1의 β12-β13 루프(loop) 영역에 삽입되고, 융합 성분 2가 삽입된 융합 성분 1의 아미노산 서열이 결실된 것인, 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 IL-33은 인간 IL-33일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 IL-33의 단편은 인간 IL-33의 117 내지 270번째 아미노산 서열(서열번호 1)을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 T4L이 삽입되는 β12-β13 루프 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 T4L은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 T4L의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 14 내지 60번째 아미노산 서열이 결실되고, 상기 결실 부분에 펩타이드 링커가 삽입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 GGSGG(서열번호 4)의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 IL-33의 결정화(crystallization)를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질은 IL-33과 IL-33에 결합하는 저해제가 형성한 복합체의 결정화를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양 상등액으로부터 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 본 발명의 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 배양된 형질전환체를 용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁한 후 파쇄 및 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 상층액으로부터 친화성 크로마토그래피 및 겔 투과 크로마토그래피를 실시하여 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 융합 단백질을 결정화하는 단계를 포함하는 융합 단백질 결정형의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 결정화는 (i) 말론산 나트륨(sodium malonate) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액, 또는 (ii) Bis-tris, 리튬 설페이트(lithium sulfate) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액에서 결정화 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 말론산 나트륨 및 리튬 설페이트는 각각 농도가 150-250 mM이고, Bis-tris는 농도가 5-30 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 결정화는 pH 6.0 내지 7.0에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질의 결정형을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질의 결정형은 결정의 분해능 한계가 2.79 Å 또는 2.43 Å인 X-선 결정 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질의 결정형은 결정공간군 C2 인 X-선 결정 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 융합 단백질의 결정형은 격자 단위가 a=216.442 Å, b=40.544 Å, c=88.512 Å, α=90°, β=101.314°, γ=90°이거나, 또는 a=123.605 Å, b=69.071 Å, c=108.79 Å, α=90°, β=105.297°, γ=90°인 X-선 결정 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명은 융합 단백질과, 상기 융합 단백질의 IL-33에 결합한 IL-33 저해제가 형성한 복합체의 결정형을 제공한다.
본 발명은 IL-33의 결정구조 분석을 위한 신규한 융합 단백질, 이의 제조방법 및 결정화 방법 등에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 2-3 Å 정도의 X선 회절 데이터를 모을 수 있는 사이즈 200 μm 이상의 결정을 얻을 수 있으며, 고분해능의 구조를 얻을 수 있다. 상기 구조를 기반으로 하여, IL-33과 저해제 물질이 형성한 복합체의 구조 분석이 가능한바, 본 발명은 사이토카인 단백질의 구조 연구 및 다양한 저해 화합물, 펩타이드 등의 약물에 대한 스크리닝을 위한 플랫폼 단백질로서 활용될 것으로 기대된다. 또한, 단백질의 결정화 등 여러 단계에 효과를 끼칠 수 있는 부분을 제거한 변이체를 활용하여 사이토카인 단백질의 특성을 연구하는 플랫폼으로 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 야생형 IL-33에서 정제를 위한 태깅 구조와 TEV 효소 절단 사이트의 위치 및 T4L의 삽입 부분에 관한 일차구조 그림(위)과 야생형 T4-Lysozyme(wT4L)과 최소형(minimal) T4L(mT4L)의 일차구조 정보(아래)를 나타낸 도이다.
도 2는 IL-33의 전체 구조를 나타낸 이미지이며, T4L이 삽입된 부분을 PDB 상에 빨간색으로 매핑(mapping) 한 이미지를 보여주는 도이다.
도 3은 인간 IL-33의 117-270번째 아미노산 서열 및 그 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 융합할 단백질 T4-Lysozyme(T4L)의 아미노산 서열 및 그 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 융합 단백질의 DNA 시퀀스 융합을 위한 PCR 전략을 나타낸 모식도를 보여주는 도이다.
도 6은 두 가지 단백질의 DNA 시퀀스 융합을 위한 또 다른 PCR 전략인 다중 중첩 확장 PCR의 개념을 나타낸 모식도를 보여주는 도이다.
도 7은 기존의 단백질 시퀀스 삽입 플라스미드에 T4L 시퀀스 삽입을 위한 또 다른 PCR 전략인 다중 중첩 확장 PCR의 응용을 나타낸 모식도를 보여주는 도이다.
도 8은 목적 플라스미드(pProEx) 내에 융합된 T4L 융합 IL-33의 완성도를 보여주는 도이다.
도 9는 T4L 융합 IL-33(117-270)(IL33-wT4L로 명명)의 전체 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 10은 T4L 융합 IL-33(117-270)(IL33-wT4L)의 전체 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 11은 최소형(minimal) T4L(mT4L) 융합 IL-33(117-270)(IL33-mT4L로 명명)의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 12는 최소형(minimal) T4L(mT4L) 융합 IL-33(117-270)(IL33-mT4L)의 전체 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 13은 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 후의 정제된 야생형(IL33-wT4L, A 도면)과 최소형 T4L(IL33-mT4L, B 도면) 융합 IL-33의 profile과 그 결과의 SDS-PAGE 결과 및 그 결정 사진(오른쪽)을 보여주는 도이다.
도 14는 정제된 야생형 T4L(wtT4L) 융합 IL-33(IL33-wT4L)의 2.79 Å 분해능의 엑스선 결정구조를 나타낸 도이다. IL-33 부분(아래)과 wtT4L 부분(위)을 화살표로 표시했다. 왼쪽의 그림을 90도 회전한 그림을 오른쪽에 나타내었다.
도 15는 정제된 야생형 T4L(wtT4L) 융합 IL-33(IL33-wT4L) 단백질의 결정 내에서의 겹침 구조를 나타낸 도이다.
도 16은 정제된 최소형 T4L(mT4L) 융합 IL-33(IL33-mT4L)의 2.43 Å 분해능의 엑스선 결정구조를 나타낸 도이다. IL-33 부분(아래)과 mT4L 부분(위)을 화살표로 표시했다. 왼쪽의 그림을 90도 회전한 그림을 오른쪽에 나타내었다.
도 17은 정제된 최소형 T4L(mT4L) 융합 IL-33(IL33-mT4L) 단백질의 결정 내에서의 겹침 구조를 나타내었다.
도 18은 융합 단백질 IL33-wT4L(시안색)과 IL33-mT4L(노란색)의 구조, NMR IL-33(2KLL; 회색), 복합체 내 IL-33(4KC3; 초록색)의 구조를 겹쳐(superpose) 비교한 도이다. 중심의 트레포일(세잎) 구조가 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다.
도 19a는 KB1518 합성 화합물과 IL33-mT4L의 복합체 구조를 나타낸 것으로, 화합물과 결합하는 잔기 정보를 삽입 그림에 나타낸 도이다.
도 19b는 화합물 구조와 1시그마 윤곽선 레벨로 나타낸 전자밀도를 나타낸 도이다.
도 20은 최소형 T4L(mT4L) 융합 IL-33(117-270) 비산화형 변이체의 아미노산 서열의 예시를 나타낸 도이다.
도 21은 최소형 T4L(mT4L) 융합 IL-33(117-270) 비산화형 변이체의 DNA 서열의 예시를 나타낸 도이다.
도 20 및 21에서 빨간색 표시된 잔기는 기존 시스테인 잔기가 세린 또는 알라닌으로 치환된 부분을 나타내며, 검정색과 밑줄로 표시된 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있는 잔기를 나타낸다.
본 발명은 IL-33(Interleukin-33) 또는 이의 단편인 융합 성분 1, 및 T4L(T4-Lysozyme) 또는 이의 변이체인 융합 성분 2를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 융합 성분 2가 융합 성분 1의 β12-β13 루프(loop) 영역에 삽입되고, 융합 성분 2가 삽입된 융합 성분 1의 아미노산 서열이 결실된 것인 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “융합 단백질” 이란 각각의 부분이 별개의 기능을 포함하는 적어도 2개의 부분을 포함하는 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질)의 중합체를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 융합 성분 1(IL-33 또는 이의 단편)의 특정 영역(β12-β13 loop)에 융합 성분 2(T4L 또는 이의 변이체)가 삽입된 형태의 폴리펩타이드로서, 상기 융합 성분 2는 IL-33의 결정화를 위한 융합 파트너로서 융합 단백질에 도입된다.
본 발명에 있어서, 상기 IL-33은 인간 유래의 인터류킨 또는 이의 단편일 수 있다. 하나의 특정예에서, 상기 IL-33의 단편은 인간 IL-33의 117 내지 270번째 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 단편일 수 있다(도 3 참조).
본 발명에 있어서, 상기 T4L 또는 이의 변이체는 IL-33 또는 이의 단편의 β12-β13 루프 영역에 삽입되며, T4L 또는 이의 변이체가 삽입됨에 따라 결실되는 IL-33(또는 이의 단편)의 β12-β13 루프 내 서열은 서열번호 2로 표시될 수 있다(도 2 참조).
상기 T4L은 나선 도메인 A(Helix A), N-말단 도메인, 나선 도메인 C(Helix C) 및 C-말단 도메인 등 네 개의 도메인으로 구성된 단백질로서(도 1의 하단 이미지 참조), 천연 T4L은 54 및 97 위치에 두 개의 시스테인 잔기를 가지고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 T4L은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 천연 T4L의 54 및 97에 위치한 두 개의 시스테인 잔기가 각각 트레오닌(C54T)과 알라닌(C97A)으로 치환된 서열이다(도 4 참조). 본 명세서에서는 상기 서열번호 3의 T4L을 “야생형 T4L(wtT4L)”로 명명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 T4L의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 14 내지 60번째 아미노산 서열(N-말단 도메인)이 결실되고, 상기 결실 부분에 펩타이드 링커가 삽입된 형태의 변이체일 수 있다(도 1의 하단 참조). 본 발명의 실시예에서는, 상술한 wtT4L의 유연한 N-말단 도메인을 삭제한 후, 펩타이드 링커(GGSGG, 서열번호 4)를 삽입하여 나선 도메인 A(Helix A)와 나선 도메인 C(Helix C)를 연결하여 T4L 변이체를 제조하였으며, 이 변이체를 “최소 T4L(mT4L)”로 명명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열로 표시될 수 있다(도 9 및 11 참조).
본 발명의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물들도 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 이에 포함되는 각 융합 성분의 야생형의 아미노산 서열에 추가적인 변형을 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 융합 단백질의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 각 융합 성분의 서열뿐만 아니라, 이들 융합 성분의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 IL-33 또는 이의 단편은 IL-33의 3개의 시스테인 잔기(C208, C227 및 C232)가 알라닌 또는 세린으로 치환된 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 치환 변이체는 C208S, C227A, C232A 또는 이들의 조합을 갖는 변이체일 수 있다(도 20 및 21 참조). 본 발명자들은 상술한 wt 또는 mT4L을 포함하는 융합 단백질에서 IL-33의 산화의 영향을 받기 쉬운 3개의 시스테인을 알라닌 또는 세린으로 치환한 변이체를 제조하였으며, 이 변이체를 “비산화형(non-oxi)”으로 명명하였다. 상기 비산화형 변이체는 실시예에 기재된 IL33-wT4L 및 IL33-mT4L의 단백질 발현 및 정제 방법과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 비산화형(non-oxi) 변이체는 일부 아미노산이 시스테인으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 변이체는 E269, L267, N226 또는 V228이 시스테인으로 치환된 변이체(non-oxi_IL33-wt(m)T4L_E269C, non-oxi_IL33-wt(m)T4L_L267C, non-oxi_IL33-wt(m)T4L_N226C 또는 non-oxi_IL33-wt(m)T4L_V228C) 일 수 있다(도 20 및 21 참조).
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 IL-33의 결정화(crystallization) 및 IL-33의 구조분석을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 정제하여 얻은 두 종의 융합 단백질(IL33-wT4L 및 IL33-mT4L)을 결정화하여 결정을 얻었으며(실시예 3 및 도 13 참조), 실시예 3에서 얻어진 IL33-wT4L과 IL33-mT4L 결정을 이용하여 3세대 입자가속기 연구소에서 회절 실험을 진행한 결과, IL33-wT4L의 결정의 경우 최고 분해능이 2.79 Å으로서 IL-33와 T4L의 도메인이 각각 나란히 겹침 구조를 나타내고 있음을 확인하였다(실시예 4 및 도 14, 15 참조). 또한, IL33-mT4L의 경우에는 2.43 Å의 최고 분해능을 나타내었고, 비대칭 최소 단위 안에 3분자의 IL33-mT4L의 겹침 구조를 확인하였다(실시예 4 및 도 16 참조).
더불어, IL-33 도메인의 핵심 구조인 트레포일(trefoil) 구조의 구조 변화가 없는지 기존의 NMR 구조(PDB ID: 2KLL) 및 인간 유래 이종 이합체 구조 내의 IL-33의 구조(PDB ID: 4KC3)와 비교 분석한 결과, IL33-wT4L의 구조 내 IL-33와 NMR(2KLL) 구조에서는 RMSD값이 0.812 Å 정도로 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였고, IL33-wT4L와 이종 이합체 내의 IL-33(4KC3)와의 비교에서는 RMSD값이 0.639 Å로 NMR 구조 보다 더 유사한 IL-33의 구조를 볼 수 있었으며(실시예 4 및 도 18 참조), 이러한 구조 비교분석을 통하여 IL-33의 핵심인 트레포일 구조에서 큰 차이가 없이 유사함을 확인하였다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 IL-33와 IL-33에 결합하는 저해제가 형성한 복합체의 결정화 및 상기 복합체의 구조분석을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 실시예 3에 기술된 방법에 따라 몇몇 저해제와의 복합체 결정화를 시도한 후 구조분석을 실시하여, 한 단량체에서 저해제의 결합구조를 확인하였다(도 19 참조).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “폴리뉴클레오티드”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 가질 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기한 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 예컨대 최소 90%의 상동성 또는 최소 95% 의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “벡터”는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 벡터에서 폴리뉴클레오티드(핵산분자)는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, “작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 발현 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., (1984) 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., (1980) 14:399-445)가 조절부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터가 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 발현 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상술한 발현 벡터가 도입되어 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 곤충유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다.
본 명세서에서, 숙주세포로의 “형질전환”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양 상등액으로부터 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁 배양과 부착 배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 배양된 형질전환체를 용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁한 후 파쇄 및 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 상층액으로부터 친화성 크로마토그래피 및 겔 투과 크로마토그래피를 실시하여 융합 단백질을 정제할 수 있다.
하나의 특정예에서, 상기 용해 버퍼로는 Tris-HCl(예컨대, 50-200 mM, 70-150 mM 또는 80-120 mM; pH 7.0-7.6 또는 7.3-7.5), NaCl(예컨대, 200-400 mM, 250-350 mM 또는 280-320 mM), 2-머캅토에탄올(예컨대, 3-10 mM, 3-7 mM 또는 4-6 mM), Triton X-100 및 PMSF(페닐메탄설포닐플루오라이드)(예컨대, 0.05-0.30 mM, 0.07-0.20 mM 또는 0.08-0.15 mM) 조성의 버퍼를 사용할 수 있다. 상기 용해 버퍼의 2-머캅토에탄올은 DTT(Dithiothreitol) 또는 TCEP로 대체할 수 있으며, 예를 들어, 0.5-3.0 mM, 0.5-2.0 mM 또는 0.5-1.5 mM의 DTT 또는 TCEP로 대체할 수 있다.
하나의 특정예에서, 상기 친화성 크로마토그래피는, 평형 용액으로 평형화 시킨 레진이 들어 있는 컬럼에 원심분리하여 얻은 상층액을 결합시킨 후 세척 용액으로 세척 후 용출 용액으로 융합 단백질을 용출하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 상기 친화성 크로마토그래피에서는 HisPurTM 코발트 레진이 들어있는 컬럼을 사용할 수 있으며, 상기 평형 용액으로는 상술한 용해 버퍼에서 PMSF와 Triton X-100가 제외된 버퍼를 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 세척 용액으로는 인산나트륨 버퍼(예컨대, 10-30 mM, 15-25 mM 또는 17-23 mM; pH 7.0-7.6 또는 7.3-7.5), NaCl(예컨대, 200-400 mM, 250-350 mM 또는 280-320 mM) 및 2-머캅토에탄올(예컨대, 3-10 mM, 3-7 mM 또는 4-6 mM)을 포함하는 버퍼를 사용할 수 있다.
상기 정제방법에서는, 비특이적 결합을 제거하기 위하여 추가적인 세척을 실시할 수 있으며, 예를 들어, 상술한 세척 용액에 이미다졸(예컨대, 20-50 mM, 25-45 mM, 25-40 mM 또는 25-35 mM)이 추가적으로 함유된 버퍼로 실시할 수 있다. 상기 용출 용액으로는, 예를 들어, 상기 추가적인 세척을 위하여 사용한 세척 용액에서 이미다졸을 더 과량으로 함유(예컨대, 250-700 mM, 400-600 mM, 450-600 mM 또는 450-550 mM)하는 용액으로 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피를 실시하여 얻은 용액(용출된 용액)으로 투석을 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 투석은 Tris-HCl 버퍼(예컨대, 10-30 mM, 15-25 mM 또는 17-23 mM; pH 7.0-7.6 또는 7.3-7.5), NaCl(예컨대, 200-400 mM, 250-350 mM 또는 280-320 mM) 및 2-머캅토에탄올(예컨대, 3-10 mM, 3-7 mM 또는 4-6 mM)을 사용할 수 있다. 이때, TEV 효소를 사용하여 단백질의 N-말단에 붙어있는 His-Tag을 제거할 수 있으며, 제거된 His-tag 단편과 TEV는 상술한 바와 같이 친화성 크로마토그래피(예컨대, HisPurTM 코발트 레진 컬럼 이용)를 실시하여 제거할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 겔 투과 크로마토그래피는 인산나트륨(예컨대, 10-30 mM, 15-25 mM 또는 17-23 mM; pH 6.5-7.0 또는 6.7-6.9), NaCl(예컨대, 200-400 mM, 250-350 mM 또는 280-320 mM) 및 2-머캅토에탄올(예컨대, 3-10 mM, 3-7 mM 또는 4-6 mM)을 포함하는 버퍼로 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 융합 단백질을 결정화하는 단계를 포함하는 융합 단백질 결정형의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 결정화는 말론산 나트륨(sodium malonate) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액에서 결정화하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 결정화는 150-250 mM, 170-230 mM 또는 180-220 mM의 말론산 나트륨(예컨대, pH 5.5-6.5, 5.8-6.3 또는 5.9-6.1) 및 10-40% w/v, 15-35% w/v 또는 20-35% w/v 폴리에틸렌글리콜(예컨대, 폴리에틸렌글리콜 3,350)을 포함하는 용액에서 결정화하여 실시될 수 있다. 하나의 특정예에서, 상기 용액은 IL-33과 야생형 T4L을 포함하는 융합 단백질(IL33-wT4L)의 결정화에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 결정화는 Bis-tris, 리튬 설페이트(lithium sulfate) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액에서 결정화하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 결정화는 5-30 mM, 5-20 mM 또는 8-15 mM Bis-tris(예컨대, pH 6-7, 6.3-6.8 또는 6.4-6.6), 150-250 mM, 170-230 mM 또는 180-220 mM의 리튬 설페이트, 10-40% w/v, 15-35% w/v 또는 22-35% w/v 폴리에틸렌글리콜(예컨대, 폴리에틸렌글리콜 3,350)을 포함하는 용액에서 결정화하여 실시될 수 있다. 하나의 특정예에서, 상기 용액은 IL-33과 T4L 변이체를 포함하는 융합 단백질(IL33-mT4L)의 결정화에 사용될 수 있다.
상기 결정화 방법은 통상적인 농도 평형을 이용한 방법일 수 있으며, 구체적으로는 증기 확산 평형법 또는 투석법일 수 있다. 상기 증기 확산 평형법에는 시팅 드롭 증기 확산법 및 행잉 드롭 증기 확산 방식일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 결정화 방법으로 행잉 드롭 증기 확산 방식(Hanging-drop vapour diffusion method)을 사용하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 융합 단백질의 결정형을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 융합 단백질과, 상기 융합 단백질의 IL-33에 결합한 IL-33 저해제가 형성한 복합체의 결정형을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 결정형은 결정의 분해능 한계가 2.79 Å 또는 2.43 Å인 X-선 결정 구조를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 결정형은 결정공간군 C2인 X-선 결정 구조를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 결정형은 격자 단위가 a=216.442 Å, b=40.544 Å, c=88.512 Å, α=90°, β=101.314°, γ=90° 인 X-선 결정 구조, 또는 a=123.605 Å, b=69.071 Å, c=108.79 Å, α=90°, β=105.297°, γ=90°인 X-선 결정 구조를 가질 수 있다. 하나의 특정예에서, 상기 융합 단백질의 결정형은 결정의 분해능 한계: 2.79 Å, 결정공간군: C2, 및 격자 단위: a=216.442 Å, b=40.544 Å, c=88.512 Å, α=90°, β=101.314°, γ=90°인 X-선 결정 구조를 가질 수 있다. 다른 특정예에서, 상기 융합 단백질의 결정형은 결정의 분해능 한계: 2.43 Å, 결정공간군: C2, 및 격자 단위: a=123.605 Å, b=69.071 Å, c=108.79 Å, α=90°, β=105.297°, γ=90°인 X-선 결정 구조를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 저해제는 IL-33에 결합하는 활성을 갖는 물질로서, 예를 들면, 화합물, 펩타이드, 올리고 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 핵산 분자를 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. IL-33의 유전자 클로닝, T4-Lysozyme 융합 위치 선정 및 유전자 클로닝
실시예 1-1. IL-33의 유전자 클로닝
N-말단이 아미노산 117번(세린-프롤린-이소루이신)으로부터 시작되는 IL-33(117-270 a.a.) 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 통해 합성하고 증폭하기 위하여, 각각의 프라이머 올리고 뉴클레오티드(표 1)를 다음과 같은 과정으로 고안하여 유전자 증폭을 수행하였다.
프라이머 서열번호
5’- GGATCATATGTCACCTATTACAGAGTATCTTGCTT-3’ 9
5’- GGATGTCGACTCAAGTTTCAGAGAGCTTAAA-3’ 10
서열번호 9의 염기서열을 가지는 프라이머는 NdeI 제한효소 인지부위(도 3의 밑줄 부분)에 해당하는 염기서열을 포함하고, 서열번호 10의 염기서열을 가지는 프라이머는 종결코돈(TGA), 제한효소 SalI 인지부위(도 3의 밑줄 부분)에 해당하는 염기서열을 포함한다.
호모사피엔스의 DNA를 주형으로 사용해 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 100 ng/㎕의 주형 DNA 1 ㎕, 2 ㎕의 10 mM dNTP(최종 농도:0.4 mM), 각 2 ㎕의 10 pmol 서열번호 9 및 10의 프라이머(최종 농도: 0.4 pmol), Solg™ Pfu DNA 중합효소 1.0 ㎕(5.0 U/㎕, Solgent, Korea), 5 ㎕ PCR 완충용액(Solgent)에 37 ㎕ 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분을 둔 뒤, 95℃ 30초; 55℃ 1분; 72℃ 1분의 반응을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 반응시켰다. 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 확인한 후, 약 750 염기쌍으로 이루어진 IL-33 유전자를 DNA 추출 키트를 사용하여 추출하였다. 이 추출액 16 ㎕에 10배 농축 제한효소 반응 완충액 2 ㎕와 제한효소 NdeI, SalI을 각 1 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 이 반응액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 확인한 후, 원하는 DNA 절편을 아가로즈 젤에서 추출해 30 ㎕의 용출 버퍼에 용존시켰다.
실시예 1-2. IL-33 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제조
6His-tag이 10His-tag으로 교체되고, 뒤이어 cccggg(Pro-Gly)의 시퀀스가 추가로 삽입되고, TEV 효소 인식 사이트 바로 뒤에 NdeI 제한효소 사이트가 삽입된, 개량된 pProEx HTa 플라스미드를 제한효소 NdeI과 SalI을 이용하여 완전히 절단하고, 1% 아가로즈 젤 상에서 분리하였다. 분리된 IL-33(117-270 a.a.) 100 ng과 위의 플라스미드 400 ng(인서트:플라스미드=5:1)을 반응 튜브에 넣은 후 4 ㎕의 5배의 Ligation 버퍼(250 mM Tris-HCl, pH 7.8, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 5 mM ATP)와 10 U의 T4 DNA 리가아제를 넣고, 총 부피가 20 ㎕가 되도록 증류수를 넣어준 다음 상온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응 용액을 대장균의 DH5α 컴피턴트 세포에 첨가하여 형질전환 시킨 다음, 50 μg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB 고체 배지에 도말하여 대장균 형질전환체를 선발하였다. 생성된 콜로니를 14 ml 둥근 바닥 튜브에서 3 ml의 LB 배지를 사용하여 하루 동안 배양하고, 세포를 모아 플라스미드를 추출하고, 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 pProEX-HTa에 IL-33(117-270 a.a.)의 유전자의 삽입 유무를 확인하였다.
실시예 1-3. IL33-wT4L의 발현 벡터 제조
IL-33의 T4L(T4-Lysozyme) 융합 위치는 기존의 이형 이량체의 구조를 참고하여, 복합체 형성에 방해가 되지 않으며, 전체 구조의 변화를 야기시키지 않을 루프(loop) 구조를 선택하였다. IL-33의 117-270의 구조 중에서, β12-β13 loop(Deletion loop, 252-260 a.a.)의 구조에 야생형 T4L(wT4L)의 유전자를 삽입하였다. 구체적으로, 먼저 표 2에 기재된 서열번호 11 및 12와 같이 고안된 프라이머를 사용하여 일반 PCR과 site-directed mutagenesis PCR을 병합시킨 PCR을 사용하여 유전자 융합을 수행하였다.
프라이머 서열번호
T4L 융합을 위한 정방향 프라이머
5’- GTA AAG GAT AAT CAT CTT GCT CTG ATT AAA ATG AAC ATC TTC -3’
11
T4L 융합을 위한 역방향 상보적 프라이머 서열
5’- AGT TTC AGA GAG CTT AAA CAA GAT ATT TTC ATC CCA GGT -3’
12
먼저, T4L의 DNA를 주형을 사용하여 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 100 ng/㎕의 주형 DNA 1 ㎕, 2 ㎕의 10 mM dNTP(최종 농도:0.4 mM), 각 2 ㎕의 10 pmol 서열번호 11 및 12의 프라이머(최종 농도: 0.4 pmol), Solg™ Pfu DNA 중합효소 1.0 ㎕(5.0 U/㎕, Solgent, Korea), 5 ㎕ PCR 완충용액(Solgent)에 37 ㎕ 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분을 둔 뒤, 95℃ 30초; 55℃ 1분; 72℃ 1분의 반응을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 반응시켰다.
PCR 정제 키트를 사용하여, 상기의 PCR 결과물을 정제한 후 30 ㎕ 볼륨으로 추출하였다. 그 다음, 호모사피엔스의 IL-33 DNA를 주형으로 사용하고, 결과물을 프라이머로 사용하여 다음과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다. 100 ng/㎕의 주형 DNA 1 ㎕, 2 ㎕의 10 mM dNTP(최종 농도:0.4 mM), 상기의 wT4L의 PCR 결과물을 10 ㎕ 추가하고, Solg™ Pfu DNA 중합효소 1.0 ㎕(5.0 U/㎕, Solgent, Korea), 5 ㎕ PCR 완충용액(Solgent)을 추가한 후 증류수를 추가해서 50 ㎕ 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분을 둔 뒤, 95℃ 30초; 65℃ 1분; 72℃ 5분의 반응을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 반응시켰다. 반응 용액은 DpnI 제한 효소로 37℃에서 1시간 배양하여, 프렙(prep)법을 사용하여 추출한 기존의 IL-33 DNA 주형을 모두 제거하였다. 그리고 대량 복제용 컴피턴트 세포인 DH5α를 사용하여 형질전환을 실시하였다. 하룻밤 동안 배양하여 생성된 각각의 세포 콜로니를 사용하여, M13/pUC Reverse-F와 pTrcHis Reverse-R의 두개의 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하였고, 융합 단백질이 코돈 된 유전자의 삽입을 확인할 수 있었다. 선택된 콜로니를 배양, 프렙을 하여 시퀀스 분석을 진행하여 각각의 시퀀스를 확인하였고, wT4L의 삽입을 확인하였다.
실시예 1-4. IL33-mT4L의 발현 벡터 제조
IL33-wT4L 융합 단백질의 발현 벡터를 사용해서 IL33-mT4L 발현 벡터를 제조하였다. PCR을 기본으로 한 site directed mutagenesis를 사용하여 IL33-wT4L의 한 도메인(N-말단 도메인, 14-60 a.a., 도 1)을 삭제하고, 특정 시퀀스(5’-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-3’)를 삽입하였다. 표 3의 서열번호 13과 14의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 서열번호
정방향 프라이머(야생형 T4L 내의 N-말단 도메인 삭제 및 링커 삽입을 위함)
5‘-AG ATG CTC AGG ATC GAC GAA GGA CTC AGA GGT GGC TCT GGC GGT GAG GCC GAA A-3‘
13
역방향 프라이머(야생형 T4L 내의 N-말단 도메인 삭제 및 링커 삽입을 위함)
5’- GAC GTC CTG GTT GAA CAG CTT TTC GGC CTC ACC GCC AGA GCC ACC TCT GAG TCC-3’
14
구체적으로, 100 ng/㎕의 주형 DNA인 IL33-wT4L 포함된 pProEX 플라스미드 1 ㎕, 2 ㎕의 10 mM dNTP(최종 농도:0.4 mM), 서열번호 13과 14의 10 pmol 프라이머 2 ㎕씩을 추가하고, Solg™ Pfu DNA 중합효소 1.0 ㎕(5.0 U/㎕, Solgent, Korea), 5 ㎕ PCR 완충용액(Solgent)을 추가한 후 증류수를 추가해서 50 ㎕ 반응액을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 5분 가열 후, 95℃ 30초; 65℃ 1분; 72℃ 5분의 반응을 35회 반복한 후, 72℃ 5분의 조건으로 반응시켰다. PCR 반응 종료 후, 이 반응 용액은 DpnI 제한 효소로 37℃에서 1시간 배양하여, 프렙하여 추출한 기존의 IL33-wT4L DNA 주형을 모두 제거하였다. 그리고 대량 복제용 컴피턴트 세포인 DH5α를 사용하여 형질전환을 실시하였다. 하룻밤 동안 배양하여 생성된 각각의 콜로니를 사용하여 M13/pUC Reverse-F와 pTrcHis Reverse-R의 두개의 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하였고, 융합 단백질 내의 도메인 삭제를 확인할 수 있었다. 사이즈에서 차이를 보인 콜로니를 배양, 프렙을 하여 시퀀스 분석을 진행하여 각각의 시퀀스를 확인하였고, wT4L의 N-말단 도메인의 삭제와 GGSGG(서열번호 4)의 5개 아미노산의 삽입을 확인하였다.
실시예 2. IL-33 및 IL33-wT4L, IL33-mT4L의 발현, 배양 및 정제
실시예 2-1. 각 단백질의 대장균에서 발현
실시예 1에서 얻은 각각의 발현 벡터 중 pProEX-HTa-IL33(117-270), pProEX-HTa-IL33-wT4L의 두 가지는 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시켰고, pPrpEX-HTa-IL33-mT4L은 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL을 사용해 형질전환을 하였다. 형질전환 된 대장균 균주를 50 μg/ml의 암피실린이 함유된 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 넣은 3 ml의 LB 배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 후, 이중 100 ㎕를 3 ml의 LB 배지에 옮겨 37℃에서 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.4-0.6 정도가 될 때, IPTG를 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 후 37℃에서는 4시간, 18℃에서는 16시간이 지난 박테리아를 4,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 각각 세포 펠릿을 수거하였다. 수거한 펠릿을 램리 등의 방법(Laemmli, et al. 1970. Nature. 227:680)에 따라 15% SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마시 블루(Coomasie Brilliant Blue)로 단백질을 염색/분석하여 단백질의 발현을 확인할 수 있었다.
실시예 2-2. 대장균 세포의 배양 및 파쇄
실시예 1에서 제조된 IL-33 및 IL33-wT4L, IL33-mT4L이 발현된 대장균 세포를, 실시예 2-1과 같은 방법으로 50 μg/ml의 암피실린이 함유된 200 ml의 멸균된 삼각 플라스크에 넣은 50 ml의 LB 배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 후, 이 중 1/100 volume이 되도록 7.5 ml의 배양액을 2 L의 삼각 플라스크에 멸균된 750 mL의 LB 배지 4개에 각각 옮겨 37℃에서 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.4-0.6 정도가 될 때까지 배양하였다. OD가 0.4-0.6 정도가 되었을 때 18℃로 온도를 낮춘 후, 배지의 온도가 완전히 떨어지고 난 후 IPTG가 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하였다.
18℃에서 16시간 동안 IPTG를 사용하여 단백질의 발현을 유도한 이후, 원심분리기를 이용하여 7,000~8,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다. 0.1 M Tris-HCl pH 7.4, 0.3 M NaCl, 5 mM β-머캅토에탄올, 0.1% Triton X-100, 0.1 mM PMSF 조성의 용해용 버퍼(Lysis buffer)에 세포 침전물을 현탁시킨 후, 융해된 세포를 얼음중탕에서 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator, Fisher, USA)를 이용하여, 35% pulse intensity, pulse on/off=3/9초(sec.)로 pulse on time을 10분 동안 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 용액을 원심분리기로 15,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후, 그 상층액을 이용해 정제를 진행하였다.
실시예 2-3. 단백질의 정제
실시예 2-2에서 얻은 상청액을 0.8 μm 사이즈의 실린지 필터(syringe filter, Sartorius, Co.)를 사용하여 세포 잔해물(cell debris)을 제거하였다. 필터를 통과한 용액은 IMAC(HisPur cobalt resin, Thermo Fisher Scientific Korea Ltd.)를 사용하여 정제하였다. 먼저, PMSF와 Triton X-100가 없는 실시예 2-2의 완충용액(실시예 2-2의 용해용 버퍼)으로 미리 평형화된 HisPurTM 코발트 레진이 들어있는 컬럼(Thermo Scientific™, USA)에 결합시켰다. 그 후, pH 7.4의 20 mM 인산나트륨 버퍼, 300 mM NaCl 및 5 mM 2-머캅토에탄올을 포함하는 50 ml의 버퍼 용액으로 세척하였다. 비특이적 결합(non-specific binding)을 제거하기 위한 추가 세척은, 상기의 조성에 30 mM 이미다졸이 포함된 버퍼로 실시하였다. 단백질의 용출에는 위의 버퍼 조성에 500 mM 이미다졸이 포함된 버퍼 50 ml이 사용되었다. SDS-PAGE를 통하여 His-TEV site-IL33-wT4L와 His-TEV site-IL33-mT4L의 단백질 부분을 확인하여 모았다.
이 용액을 가지고 투석을 진행하였다. 투석 버퍼는 pH 7.4의 20 mM Tris-HCl 버퍼, 300 mM NaCl 및 5 mM 2-머캅토에탄올을 사용하였다. 이때, TEV 효소를 사용하여 단백질의 N-말단에 붙어있는 His-Tag을 제거하였다. 단백질과 TEV는 100:1의 비율로 혼합하였다. 제거된 His-tag 단편(fragments)과 TEV는 두 번째 HisPurTM 코발트 레진 컬럼으로의 결합을 통해 제거하였다. 이어서, pH 6.8 20 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl 및 5 mM 2-머캅토에탄올을 포함하는 버퍼를 사용하여 겔 투과 크로마토그래피(HiLoad 16/60 Superdex75, GE healthcare)법으로 분자량에 따라 분리 및 정제하였다(도 13의 왼쪽).
실시예 3. 정제된 IL33-wT4L 및 이의 변이체 단백질 IL33-mT4L의 결정화
상기 실시예 2에서 정제된 IL33-wT4L과 IL33-mT4L 단백질을 이용하여 결정화를 각각 실시하였다. 대량으로 정제된 순수한 단백질들은 hanging drop 증기 확산 방식을 사용하여 결정화를 진행하였다. 결정화 조건은 IL33-wT4L과 IL33-mT4L이 각각 200 mM 말론산 나트륨(Sodium malonate) pH 6.0와 20% w/v 폴리에틸렌글리콜 3,350의 조건과, 10 mM Bis-tris pH 6.5, 200 mM 리튬 설페이트 일수화물(Lithium sulfate monohydrate), 22% w/v 폴리에틸렌글리콜 3,350의 조건으로, 여러 차례의 최적화 과정을 거쳐서 위의 최적화된 조건을 확립하였으며, 최적의 결정을 얻을 수 있었다(도 13의 오른쪽 사진). 단백질의 농도는, IL33-wT4L의 경우 0.99 mM(34 mg/ml), 그리고 IL33-mT4L의 경우에는 0.5 mM(14.5 mg/ml)로 결정화를 진행하였다.
IL-33을 타겟으로 하는 저분자 저해제와의 복합체의 결정구조 분석은 결정화 단백질과 저분자 화합물의 농도비율을 1:1 및 1:5로 섞어서 결정화를 실시했고, 15℃에서 배양하였다.
실시예 4. IL33-wT4L 와 IL33-mT4L을 이용한 회절 실험 및 구조 분석
상기 실시예 3에서 얻어진 IL33-wT4L과 IL33-mT4L 결정을 이용하여 3세대 입자가속기 연구소에서 회절 실험을 진행하였다. 결정의 동결 작업을 위한 동결 방지제는 각각의 조건에서 폴리에틸렌글리콜 3,350의 농도를 35%로 올린 조건의 용액을 사용하였다. 포항 가속기 연구소의 5C와 7A의 빔라인을 주로 사용하였다.
IL33-wT4L의 결정의 경우에는, 최고 분해능이 2.79 Å으로서 IL-33와 T4L의 도메인이 각각 나란히 겹침 구조를 나타내고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 14 및 15). 이러한 결과는 T4L 융합 도메인으로 인한 결정화의 개선을 확인할 수 있는 직접적인 증거가 되는 것으로, 이 구조를 바탕으로 다양한 저해제와 결합된 구조 분석을 진행할 수 있음을 보여준다.
또한, 상기 IL33-wT4L의 결정의 결정공간군은 C2였으며, 격자 단위는 a=216.442 Å, b=40.544 Å, c=88.512 Å, α=90°, β=101.314°, γ=90°이었다.
또한, 정제된 IL33-mT4L(최소형 T4L 융합 IL-33 단백질)의 경우에는, 2.43 Å의 최고 분해능을 나타내었다. 비대칭 최소 단위 안에 3분자의 IL33-mT4L의 구조의 겹침 구조를 확인할 수 있었다(도 16). 그리고, 전체 겹침 구조 뿐만 아니라, 비대칭 단위 내의 구조에서도 mT4L과 IL-33의 도메인이 각각의 도메인별로 나열되어 있는 구조를 통해서 T4L의 융합으로 결정화가 용이하게 이루어 질 수 있는 구조를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다(도 17).
또한, IL33-mT4L 결정의 결정공간군은 C2였으며, 격자 단위는 a=123.605 Å, b=69.071 Å, c=108.79 Å, α=90°, β=105.297°, γ=90°이었다.
더불어, IL-33 도메인의 핵심 구조인 트레포일(trefoil) 구조의 구조 변화가 없는지 기존의 NMR 구조(PDB ID: 2KLL) 및 인간 유래 이종 이합체 구조 내의 IL-33의 구조(PDB ID: 4KC3)와 비교 분석하였고, 결과를 도 18에 나타내었다. IL33-wT4L의 구조 내 IL-33와 NMR(2KLL) 구조에서는 RMSD 값이 0.812 Å 정도로 큰 차이를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. IL33-wT4L와 이종 이합체 내의 IL-33(4KC3)와의 비교에서는 RMSD 값이 0.639 Å로 NMR 구조 보다 더 유사한 IL-33의 구조를 볼 수 있었다. IL33-wT4L와 IL33-mT4L 사이의 RMSD 값인 0.344 Å와 비교해 볼 때 그 값이 2-3배 정도의 차이는 보이지만, 그 차이가 큰 값이 아님을 알 수 있었다. 이러한 구조의 비교분석을 통하여 IL-33의 핵심 트레포일 구조에서는 큰 차이 없이 유사한 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통하여, T4L 융합 단백질이 사이토카인에 큰 구조적 변화를 주지 않으면서, 결정화가 쉽게 이루어지도록 할 수 있음을 확인할 수 있었고, 고 분해능의 구조분석이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 5. IL33-T4L 융합 단백질의 구조분석의 활용, 저해제 스크리닝 및 저해제 구조 최적화
실시예 3에 기술된 방법에 따라 몇몇 저해제와의 복합체 결정화를 시도했고, 구조분석을 실시하였다. 다수의 스크리닝 중 한 단량체에서 저해제 결합구조를 확인할 수 있었다(도 19a). 결합에 관여한 잔기들과의 세부 상호작용을 삽입된 그림에서 확인할 수 있다. 도 19b에 기재된 그림은 1 σ contour 레벨에서의 전자 밀도와 함께 저해제의 구조를 나타낸 구조이다.
이러한 결과를 통하여, 본 발명의 융합 단백질을 여러 IL-33 저해제와의 복합체 구조분석에 활용하여, 약물 작용 기전 및 신약 발굴 등의 연구에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 145 150 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta12-beta13 loop a.a. sequence of human IL-33 <400> 2 Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr 1 5 <210> 3 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of T4 Lysozyme <400> 3 Asn Ile Phe Glu Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys Ile 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu 20 25 30 Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala 35 40 45 Ile Gly Arg Asn Thr Asn Gly Val Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys 50 55 60 Leu Phe Asn Gln Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn 65 70 75 80 Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala 85 90 95 Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly 100 105 110 Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala 115 120 125 Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg 130 135 140 Ala Lys Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr 145 150 155 160 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 4 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T4L fusion hIL-33 protein sequence <400> 5 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val 100 105 110 Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Met Asn Ile Phe Glu Met Leu Arg Ile 130 135 140 Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr 145 150 155 160 Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala 165 170 175 Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala Ile Gly Arg Asn Thr Asn Gly Val 180 185 190 Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys Leu Phe Asn Gln Asp Val Asp Ala 195 200 205 Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp 210 215 220 Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln 225 230 235 240 Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu 245 250 255 Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg 260 265 270 Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Thr Thr Phe 275 280 285 Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser 290 295 300 Glu Thr 305 <210> 6 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal T4L(mT4L) fusion hIL-33 protein sequence <400> 6 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val 100 105 110 Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Met Asn Ile Phe Glu Met Leu Arg Ile 130 135 140 Asp Glu Gly Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Glu Lys Leu Phe 145 150 155 160 Asn Gln Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Ala Lys 165 170 175 Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu 180 185 190 Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala Ala Val 210 215 220 Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys 225 230 235 240 Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Asn 245 250 255 Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 260 <210> 7 <211> 918 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4L fusion hIL-33 DNA sequence <400> 7 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtgtgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac tgtgtttcat ttgaatgcaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaaatgaa catcttcgag 420 atgctcagga tcgacgaagg actcagattg aagatttaca aggatacaga gggttactac 480 accatcggta tcggccactt gctgaccaag agcccatcat tgaacgctgc caagtctgaa 540 ctggacaagg ctatcggcag aaacactaac ggagtgatca caaaggatga ggccgaaaag 600 ctgttcaacc aggacgtcga tgctgccgtt cgtggaatcc tccgcaacgc taagttgaag 660 ccggtttacg acagcctcga tgccgtgcgt agagctgcct tgatcaacat ggttttccaa 720 atgggcgaga ctggagtggc tggtttcaca aactcactgc gtatgctcca gcaaaagcgc 780 tgggacgaag ctgccgtcaa cctggctaag tcgcgttggt acaaccagac ccccaacagg 840 gccaagagag tgatcaccac tttccgcaca ggcacctggg atgcttacga aaatatcttg 900 tttaagctct ctgaaact 918 <210> 8 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal T4L(mT4L) fusion hIL-33 DNA sequence <400> 8 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtgtgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac tgtgtttcat ttgaatgcaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaaatgaa catcttcgag 420 atgctcagga tcgacgaagg actcagaggt ggctctggcg gtgaggccga aaagctgttc 480 aaccaggacg tcgatgctgc cgttcgtgga atcctccgca acgctaagtt gaagccggtt 540 tacgacagcc tcgatgccgt gcgtagagct gccttgatca acatggtttt ccaaatgggc 600 gagactggag tggctggttt cacaaactca ctgcgtatgc tccagcaaaa gcgctgggac 660 gaagctgccg tcaacctggc taagtcgcgt tggtacaacc agacccccaa cagggccaag 720 agagtgatca ccactttccg cacaggcacc tgggatgctt acgaaaatat cttgtttaag 780 ctctctgaaa ct 792 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-33 <400> 9 ggatcatatg tcacctatta cagagtatct tgctt 35 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-33 <400> 10 ggatgtcgac tcaagtttca gagagcttaa a 31 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for fusion of IL-33 and T4L <400> 11 gtaaaggata atcatcttgc tctgattaaa atgaacatct tc 42 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for fusion of IL-33 and T4L <400> 12 agtttcagag agcttaaaca agatattttc atcccaggt 39 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for deletion of N-terminal domain in wtT4L <400> 13 agatgctcag gatcgacgaa ggactcagag gtggctctgg cggtgaggcc gaaa 54 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for deletion of N-terminal domain in wtT4L <400> 14 gacgtcctgg ttgaacagct tttcggcctc accgccagag ccacctctga gtcc 54 <210> 15 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IL-33 DNA sequence (349nt~810nt) <400> 15 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtgtgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac tgtgtttcat ttgaatgcaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaagtaga ctcttctgag 420 aatttgtgta ctgaaaatat cttgtttaag ctctctgaaa ct 462 <210> 16 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4 Lysozyme DNA sequence <400> 16 aacatcttcg agatgctcag gatcgacgaa ggactcagat tgaagattta caaggataca 60 gagggttact acaccatcgg tatcggccac ttgctgacca agagcccatc attgaacgct 120 gccaagtctg aactggacaa ggctatcggc agaaacacta acggagtgat cacaaaggat 180 gaggccgaaa agctgttcaa ccaggacgtc gatgctgccg ttcgtggaat cctccgcaac 240 gctaagttga agccggttta cgacagcctc gatgccgtgc gtagagctgc cttgatcaac 300 atggttttcc aaatgggcga gactggagtg gctggtttca caaactcact gcgtatgctc 360 cagcaaaagc gctgggacga agctgccgtc aacctggcta agtcgcgttg gtacaaccag 420 acccccaaca gggccaagag agtgatcacc actttccgca caggcacctg ggatgcttac 480 480 <210> 17 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of mT4L fusion hIL-33 non-oxidation mutant protein sequence <400> 17 Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr 35 40 45 Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys 50 55 60 Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala 65 70 75 80 Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu 85 90 95 Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ala Val 100 105 110 Ser Phe Glu Ala Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp 115 120 125 Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Met Asn Ile Phe Glu Met Leu Arg Ile 130 135 140 Asp Glu Gly Leu Arg Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Glu Lys Leu Phe 145 150 155 160 Asn Gln Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Ala Lys 165 170 175 Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu 180 185 190 Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala Ala Val 210 215 220 Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys 225 230 235 240 Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Asn 245 250 255 Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr 260 <210> 18 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of mT4L fusion hIL-33 non-oxidation mutant DNA sequence <400> 18 ccacctatta cagagtatct tgcttctcta agcacataca atgatcaatc cattactttt 60 gctttggagg atgaaagtta tgagatatat gttgaagact tgaaaaaaga tgaaaagaaa 120 gataaggtgt tactgagtta ctatgagtct caacacccct caaatgaatc aggtgacggt 180 gttgatggta agatgttaat ggtaaccctg agtcctacaa aagacttctg gttgcatgcc 240 aacaacaagg aacactctgt ggagctccat aagtctgaaa aaccactgcc agaccaggcc 300 ttctttgtcc ttcataatat gcactccaac gcggtttcat ttgaagcgaa gactgatcct 360 ggagtgttta taggtgtaaa ggataatcat cttgctctga ttaaaatgaa catcttcgag 420 atgctcagga tcgacgaagg actcagaggt ggctctggcg gtgaggccga aaagctgttc 480 aaccaggacg tcgatgctgc cgttcgtgga atcctccgca acgctaagtt gaagccggtt 540 tacgacagcc tcgatgccgt gcgtagagct gccttgatca acatggtttt ccaaatgggc 600 gagactggag tggctggttt cacaaactca ctgcgtatgc tccagcaaaa gcgctgggac 660 gaagctgccg tcaacctggc taagtcgcgt tggtacaacc agacccccaa cagggccaag 720 agagtgatca ccactttccg cacaggcacc tgggatgctt acgaaaatat cttgtttaag 780 ctctctgaaa ct 792

Claims (23)

  1. IL-33(Interleukin-33) 또는 이의 단편인 융합 성분 1, 및 T4L(T4-Lysozyme) 또는 이의 변이체인 융합 성분 2를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 융합 단백질은 융합 성분 2가 융합 성분 1의 β12-β13 루프(loop) 영역에 삽입되고, 융합 성분 2가 삽입된 융합 성분 1의 아미노산 서열이 결실된 것인, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IL-33은 인간 IL-33인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-33의 단편은 인간 IL-33의 117 내지 270번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 T4L이 삽입되는 β12-β13 루프 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 T4L은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 T4L의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 14 내지 60번째 아미노산 서열이 결실되고, 상기 결실 부분에 펩타이드 링커가 삽입된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 펩타이드 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 IL-33의 결정화(crystallization)를 위한 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 IL-33과 IL-33에 결합하는 저해제가 형성한 복합체의 결정화(crystallization)를 위한 것이고, 상기 IL-33에 결합하는 저해제는 IL-33에 결합하는 IL-33 저해제로서 저분자 화합물 저해제인 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항의 발현 벡터가 도입되어 형질전환 된 형질전환체.
  15. (a) 제14항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양 상등액으로부터 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 제1항의 융합 단백질의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 배양된 형질전환체를 용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁한 후 파쇄 및 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 상층액으로부터 친화성 크로마토그래피 및 겔 투과 크로마토그래피를 실시하여 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  17. 제15항의 방법으로 제조된 융합 단백질을 결정화하는 단계를 포함하는 융합 단백질 결정형의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 결정화는 (i) 말론산 나트륨(sodium malonate) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액, 또는 (ii) Bis-tris, 리튬 설페이트(lithium sulfate) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액에서 결정화하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 말론산 나트륨 및 리튬 설페이트는 각각 농도가 150-250 mM이고, Bis-tris는 농도가 5-30 mM인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 결정형.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 결정형은 결정의 분해능 한계가 2.79 Å 또는 2.43 Å인 X-선 결정 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질의 결정형.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 결정형은 하기와 같은 X-선 결정 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질의 결정형:
    결정의 분해능 한계: 2.79 Å,
    결정공간군: C2, 및
    격자 단위: a=216.442 Å, b=40.544 Å, c=88.512 Å, α=90°, β=101.314°, γ=90°; 또는
    결정의 분해능 한계: 2.43 Å,
    결정공간군: C2, 및
    격자 단위: a=123.605 Å, b=69.071 Å, c=108.79 Å, α=90°, β=105.297°, γ=90°.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질과, 상기 융합 단백질의 IL-33에 결합한 IL-33 저해제로서 저분자 화합물 저해제가 형성한 복합체의 결정형.
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