WO2024019642A1 - ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ - Google Patents

ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ Download PDF

Info

Publication number
WO2024019642A1
WO2024019642A1 PCT/RU2023/050176 RU2023050176W WO2024019642A1 WO 2024019642 A1 WO2024019642 A1 WO 2024019642A1 RU 2023050176 W RU2023050176 W RU 2023050176W WO 2024019642 A1 WO2024019642 A1 WO 2024019642A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
hybrid protein
protein construct
trail
sequence
Prior art date
Application number
PCT/RU2023/050176
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Марине Эдуардовна ГАСПАРЯН
Анна Валерьевна ЯГОЛОВИЧ
Артем Александрович АРТЫКОВ
Алина Алексеевна ИСАКОВА
Дмитрий Александрович ДОЛГИХ
Михаил Петрович КИРПИЧНИКОВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Манебио"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2022120069A external-priority patent/RU2802488C1/ru
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Манебио" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Манебио"
Publication of WO2024019642A1 publication Critical patent/WO2024019642A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • This invention relates to biotechnology and medicine, in particular, to new protein constructs based on a receptor-specific variant of the TRAIL cytokine that specifically binds to the death receptor DR5, and can be used for the preparation of therapeutic drugs for the treatment of DR5-no3HTHBHbix solid tumors.
  • cytokine TRAIL TNF-related-apoptosis inducing ligand
  • TRAIL TNF-related-apoptosis inducing ligand
  • TRAIL is part of the immunological surveillance system for modified cells in the body.
  • TRAIL is able to selectively cause the death of tumor cells without affecting normal cells.
  • TRAIL has five receptors, two of which, DR4 and DR5, are capable of transmitting the apoptotic signal, while the decoy receptors DcRl, DcR2 and OPG block TRAIL-induced apoptosis (O'Leary L. et al. Oncogene. 2016. Vol. 35, pp. 1261-1270).
  • DR5-mediated cell death is of particular scientific and practical interest, since in most tumors TRAIL causes apoptosis when interacting with the DR5 receptor (Kelley, RF, Totpal, K., Lindstrom, SH, et al., J. Biol. Chem., 2010 , vol. 280, pp. 2205-2212).
  • the DR5 receptor is overexpressed in most tumors; this opens up the prospect of using DR5 receptor agonists in a wide range of tumor diseases.
  • TRAIL a receptor-specific variant of TRAIL was obtained with substitutions of amino acid residues Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H in the TRAIL protein, which selectively binds only one of the five TRAIL receptors, the death receptor DR5 (Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA , Yagolovich AV et al. Apoptosis, 2009, 14:778-787).
  • This mutant version of TRAIL induces apoptosis in tumor cells much more effectively than wild-type TRAIL in vitro and in vivo and overcomes the receptor-dependent resistance of tumor cells to TRAIL (Gasparian M.E.
  • these constructs were better associated with endothelial cells of tumor vessels.
  • these protein constructs do not have specificity for the DR5 receptor, which is extremely important given that of all TRAIL receptors, the DR5 receptor plays a major role in transmitting the apoptotic signal in most tumors.
  • the objective of the present invention is to create an antitumor hybrid protein construct based on a DR5-specific mutant variant of the TRAIL cytokine, which has an increased antitumor effect due to the addition of additional valence for binding to a tumor-specific receptor (integrin alpha v beta 3 (avP3)), which leads to more rapid accumulation in tumor structures.
  • Another objective of the present invention is to expand the range of agents for suppressing the proliferation and inducing death of tumor cells expressing the DR5 receptor and avP3 integrin on the surface.
  • This problem is solved by creating a hybrid protein construct containing at the N-terminus of the polypeptide chain the antitumor DR5-selective variant of the cytokine TRAIL, and at the C-terminus the peptide CRGDKGPDC (SEQ ID NO: 4), with the two domains connected by a linker sequence.
  • the peptide CRGDKGPDC was previously shown to be able to bind with affinity to the avP3 integrin (Sugahara KN, et al. Cancer Cell 2009; 16:510).
  • the avP3 integrin is overexpressed in many tumors. Therefore, this hybrid protein construct is a promising tool for inducing the death of tumor cells characterized by the presence of the DR5 receptor and avP3 integrin on the surface.
  • the hybrid protein construct is the sequence described in SEQ ID NO: 1, and has the general formula A-X-B, where "A” has the sequence described in SEQ ID NO: 2, which at its C-terminus attached to "X"; "X” represents the sequence characterized in SEQ III: NO 3, and "B” represents the peptide characterized in SEQ GO: NO 4.
  • "A” is a TRAIL receptor-specific cytokine variant sequence that is at least 90% homologous, at least 95% homologous, at least 98% homologous, or at least 99% homologous to SEQ GO NO : 2, capable of specifically binding to the DR5 receptor and containing substitutions of amino acid residues that increase the specificity of binding to the DR5 receptor compared to wild type TRAIL.
  • "X" is a chemical bond or a suitable linker of the formula (X1X1X1X1X2) n (X1X1X1X2)t, where Xi is a glycine residue, Xr is a serine residue, and any of Xi and Xr may be independently absent; n and m have an integer value from 0 to 4, with n+m having an integer a value from 1 to 4 (or, in some embodiments, "X” represents a chemical bond or suitable linker of the formula (XiXiXiXiX2)n, wherein Xi is or is not a glycine residue, X is or is not a serine residue, and n is an integer value from 1 to 4).
  • "B” is a peptide N-terminally attached to "X" that is at least 75% homologous, at least 80% homologous, at least 85% homologous, or at least 88% homologous to SEQ ⁇ NO: 4, and capable of specifically binding to integrin avP3.
  • such a nucleic acid molecule has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5.
  • the nucleic acid molecule encoding such a protein construct has a sequence homology of at least 90%, at least 95%, or at least 98% or at least 99% SEQ ID NO: 5.
  • a new bispecific hybrid protein construct (preferably having the sequence SEQ ID NO: 1) has been created that is capable of simultaneously binding the DR5 receptor and the avP3 integrin, which makes it more effective than the original OK5-selective version of the cytokine TRAIL (SEQ ID NO: 2) bind to tumor structures and accumulate in them faster;
  • Fig. 3 Determination of dissociation constants (Kd) for the death receptor DR5 (A) of the original DR5-selective variant of the TRAIL cytokine and (B) of the hybrid protein construct.
  • Fig. 4 Determination of the dissociation constant (Kd) for the avP3 integrin (A) of the original BB5-selective variant of the TRAIL cytokine and (B) of the hybrid protein construct.
  • Fig. 5 Assessment of the viability of multicellular SV spheroids from the U87MG glioblastoma line under the influence of (A) the original DR5-selective variant of the TRAIL cytokine and (B) a hybrid protein construct.
  • Fig. 6. Assessment of the accumulation of (A) the original BB5-selective variant of the TRAIL cytokine and (B) a hybrid protein construct in tumor structures based on multicellular ZO-spheroids from the U87MG glioblastoma line.
  • Fig. 7. Expression and purification of a hybrid protein construct of composition A-X-B, where A is the antitumor DRS-selective variant of the cytokine TRAIL (SEQ III NO: 2), X is the GGGGSGGGGSGG linker (SEQ ID NO: 3), and B is the peptide AGGCRGDRGPDC , 75% homologous to the amino acid sequence SEQ ⁇ NO: 4.
  • Samples containing 10-15 ⁇ g of protein are analyzed in a 15% polyacrylamide gel.
  • the calculated mass of the monomeric hybrid protein construct is 21375 Da.
  • Fig. 8 Determination of dissociation constants (Kd) of a hybrid protein construct with an element of construct B of CRGDKGPDC or AGGCRGDRGPDC to the VEGFR2 receptor using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ligands are added to VEGFR2 precoated wells and binding is detected using anti-TRAIL monoclonal antibodies. Kd values are calculated using the nonlinear regression option in GraphPad Prism 8.0 software.
  • the DR5 receptor is herein referred to as the death receptor, also referred to as TRAIL-R2 or TNFRSF10B, referred to as O14763-TR10B_HUMAN in the UniProt database (https://www.uniprot.org/).
  • avP3 integrin refers to receptors containing one av integrin subunit, P06756 (ITAV_HUMAN), and one R3 subunit, P05106 (ITB3_HUMAN), capable of recognizing the RGD motif on various ligands.
  • percentage homology of two sequences is equivalent to the term “percentage identity of two sequences.”
  • the percentage identity of two sequences is determined by the number of identical amino acid positions in the two sequences, taking into account the number of gaps and the length of each gap that must be introduced to optimally match the two sequences by alignment.
  • the percent identity is equal to the number of identical amino acids at given positions, taking into account the sequence alignment, divided by the total number of positions and multiplied by 100.
  • the percent identity of two amino acid sequences can be determined, for example, using the NCBI Protein BLAST program
  • hybrid protein construct described in the invention can be produced using recombinant expression vectors and expression producer cells known to those skilled in the art. Selection of promoters and other regulatory elements, as well as producer cells and expression strains may vary.
  • a possible embodiment of the invention by expressing a recombinant hybrid protein construct in E. coli cells is described in patent No. RU2687435C1.
  • a nucleotide sequence is constructed that encodes an amino acid sequence containing a DR5-specific variant of the TRAIL cytokine at the N-terminus of the polypeptide chain, a linker sequence, and the CRGDKGPDC peptide at the C-terminus of the polypeptide chain.
  • the specified nucleotide sequence is inserted into a suitable genetic vector for expression of the hybrid protein construct in the form of a single polypeptide chain in cells of bacterial strains or eukaryotic lines intended for the expression of recombinant proteins.
  • Purification of the expressed target protein is carried out (but is not limited to) using standard techniques, for example, metal affinity and ion exchange chromatography.
  • the affinity of the purified hybrid protein construct for the DR5 receptors and avP3 integrin is determined by enzyme immunoassay, surface plasmon resonance, or other validated methods.
  • the resulting hybrid protein was shown to have high binding affinity to the DR5 receptor and avP3 integrin.
  • the biological activity of the hybrid protein construct is studied in tumor models in vitro and in vivo, in particular in multicellular 3D spheroid models obtained from tumor cell lines.
  • the increased antitumor effect of the protein construct of the DR5-selective variant of the TRAIL cytokine with the CRGDKGPDC peptide is confirmed by the results of a comparative study of the rate of accumulation in multicellular spheroids based on the U87MG glioblastoma cell line expressing the DR5 receptor and Pete green avP3, as well as the results of a comparative study of cytotoxic activity against the same culture multicellular spheroids.
  • a method for inducing the death of U87MG tumor cells using the resulting hybrid protein, which has an increased cytotoxic effect compared to the original DR5-selective variant of the TRAIL cytokine.
  • Example 1 Method for obtaining a genetic construct encoding the amino acid sequence of a hybrid protein construct of a DR5-selective variant of the cytokine TRAIL with the peptide CRGDKGPDC.
  • the sequence encoding the linker GGGGSGGGGSGG and the peptide CRGDKGPDC is added to the 3'-terminal sequence of DNA encoding the OK5-selective variant of the TRAIL cytokine in the pET32a plasmid vector using the synthetic oligonucleotide ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggttgtcgtggtgacaaaggtcct gattgctaa (SEQ ID NO: 6) by PCR .
  • the genes of the hybrid proteins are recloned into the original vector at the Ndel and Xhol restriction sites. Subsequence the gene encoding the hybrid protein construct of the OK5-selective variant of the cytokine TRAIL with the peptide CRGDKGPDC is confirmed by sequencing.
  • Example 2 Method for expressing a recombinant protein construct of a DR5-selective variant of the cytokine TRAIL with the peptide CRGDKGPDC.
  • the resulting plasmid vector pET32a encoding the amino acid sequence of the protein construct, is transformed into competent cells of the E. coli strain SHuffle B. Expression is carried out in TV medium in the presence of 100 ⁇ g/ml ampicillin. Maximum expression is observed upon induction with 0.05 mM IPTG at 28°C for 18-20 hours with the incubator platform rotating at 180 rpm. Cells are collected by centrifugation at 5000 g for 10 minutes at 4°C, washed with a buffer containing 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride (pH 8.0) and stored at -80°C.
  • Protein expression in the cell lysate was assessed by SDS-PAGE on a 15% gel stained with Coomassie Brilliant Blue R-250.
  • the expression level of the hybrid DR5-selective variant of the TRAIL cytokine with the CRGDKGPDC peptide in 1 liter of cell culture is 350-370 mg.
  • Example 3 Method for purifying a recombinant protein construct of an OK5-selective variant of the cytokine TRAIL with the peptide CRGDKGPDC.
  • Cells are resuspended in lysis buffer containing 50 mM sodium phosphate and 300 mM sodium chloride (pH 8.0) and destroyed using a French press unit (Spectronic Instruments, Inc., USA) at a pressure of 1700 bar.
  • the cell lysate is centrifuged at 75,000 g at 4°C for 40 minutes.
  • the protein is expressed in a soluble form, allowing purification from the cytoplasmic fraction.
  • purification is carried out by metal affinity chromatography on a Ni-NTA agarose sorbent. Then the proteins are dialyzed and further purified on the ion exchange sorbent SP Sepharose.
  • the protein is dialyzed against a solution of 150 mM NaCl and sterilized through a 0.22 ⁇ m syringe filter with a PVDF membrane.
  • the purity of the resulting recombinant protein is analyzed using SDS-PAGE electrophoresis in a 15% gel stained with Coomassie Brilliant Blue R-250.
  • the purity of the drug in this example is at least 98%.
  • the protein concentration in the purified drug is determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm, taking into account the molar extinction coefficient of 26025 M -1, cm -1 for the OK5-selective variant of the TRAIL cytokine with the peptide CRGDKGPDC, determined by amino acid sequences using the ProtParam program on the ExPASy server (www.expasy.org).
  • the yield of purified protein is 22-25 mg from 200 ml of cell culture, while the drug exhibits high stability: when storing the protein solution for at least 6 months, no degradation or loss of biological activity is observed.
  • Example 4 Analysis of the affinity of the protein construct of the OE5-selective variant of the cytokine TRAIL with the peptide CRGDKGPDC to the DR5 receptor and avP3 integrin.
  • Analysis of the affinity of the hybrid protein for the death receptor DR5 is carried out by enzyme immunoassay.
  • a commercial preparation of the recombinant extracellular domain of the DR5 receptor is immobilized in an amount of 100 ng per well 96- well plate and determine the binding of the hybrid OK5-selective variant of the cytokine TRAIL with the CRGDKGPDC peptide in the concentration range from 0.1 to 50 nM.
  • the original DR5-selective variant of the TRAIL cytokine was used as a control at the same concentrations. Binding is determined using primary anti-TRAIL antibodies followed by incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies.
  • Determination of the affinity of the hybrid protein for integrin avP3 is carried out by enzyme immunoassay, immobilizing 200 ng of a commercial preparation of integrin avP3 per well of a 96-well plate. Fusion protein binding is determined over a concentration range from 0.1 to 400 nM. As a control, similar concentrations of the original OK5-selective variant of the cytokine TRAIL are used. Binding of the fusion protein to the avP3 integrin is detected in a similar manner as described above for binding to the DR5 receptor.
  • the original DR5-selective variant of the cytokine TRAIL practically does not bind to the avP3 integrin, while the hybrid protein with the CRGDKGPDC peptide shows high affinity with a dissociation constant of 1.89 ⁇ 0.59 nM, which is comparable to the affinity of the peptide itself (Kd 10-20 nM). This proves that the CRGDKGPDC peptide as part of the fusion protein does not lose affinity for the avP3 integrin.
  • Example 5 Analysis of the antitumor activity of the hybrid protein construct of the DR5-selective variant of the cytokine TRAIL with the peptide CRGDKGPDC.
  • the antitumor activity of the hybrid protein construct is studied using the WST-1 test on multicellular 3 D-spheroids obtained from the U87MG glioblastoma tumor cell line.
  • Cell spheroids are cultured in DMEM nutrient medium supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • 10 ⁇ l of medium with dilutions of the original DR5-selective variant of the TRAIL cytokine and a hybrid protein with the CRGDKGPDC peptide in the range from 0.05 to 500 nM is added to the culture medium.
  • 10 ⁇ l of WST-1 reagent is added to each well and the plates are incubated for 2 hours at 37°C.
  • Optical density is measured using a plate spectrophotometer at a wavelength of 450 nm with background subtraction at 655 nm.
  • IC50 values 273.1 ng/ml and 12.09 ng/ml are obtained for the original and hybrid proteins, respectively, after 24 hours of incubation, and 5.5 ng/ml and 184.8 ng/ml, respectively, after 48 hours of incubation, which indicates increased antitumor activity of the hybrid protein construct.
  • Example 6 Comparative analysis of the rate of protein accumulation in tumor 3D structures.
  • accumulation analysis is carried out using scanning confocal microscopy of cells in the 3D model of the glioblastoma cell line U87MG.
  • Multicellular spheroids based on the U87MG line are cultured in DMEM nutrient medium supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • the nutrient medium in the wells is replaced with serum-free medium containing Hoechst 33258 dye (10 ⁇ g/ml).
  • the cells are incubated for 15-20 minutes in a CO2 incubator (5% CO2, 37° C), after which the dye solution is removed and washed 2-3 times with 0.5 ml of saline. solution from unbound dye molecules.
  • ligand proteins are added to the cells at a concentration of 1000 ng/ml.
  • proteins are preliminarily modified with the amino acid substitution Vall l4Cys Ha N-coyce of the polypeptide chain, after which they are conjugated with the fluorescent dye sulfo-cyanine-3-maleimide (Cy3) (Lumiprobe, Russia).
  • the cells After incubating the cells with ligand proteins for time periods of 15 minutes and 1 hour, the cells are washed three times to remove unbound proteins with 0.5 ml of saline. solution. The spheroids are carefully transferred to coverslips and then mounted using CC/MountTM. Samples are studied on a Nikon TE-2000 inverted microscope (Japan) equipped with a confocal laser system. Thus, they show that the hybrid DR5-selective variant of the TRAIL cytokine with the CRGDKGPDC peptide is capable of accumulating faster in tumor 3D structures compared to the original DR5-selective variant of the TRAIL cytokine.
  • Example 7 Antitumor hybrid protein construct having a sequence different from that described in SEQ III NO: 1.
  • a plasmid vector is constructed for the expression of a hybrid protein construct by introducing nucleotide substitutions into the DNA sequence encoding element A of the construct, namely the receptor-specific variant of the TRAIL cytokine (SEQ ID NO: 2), so that the D267Q and H269D substitutions are introduced into the amino acid sequence .
  • the resulting amino acid sequence is 98% homologous to the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • substitutions are made in the plasmid vector pET32a, encoding the amino acid sequence of the protein construct, by site-specific mutagenesis using oligonucleotide primers ctgtaacaaatgagcgcttgctagacatggaccatgaagccag (SEQ ID NO: 7) and ctggctcatggtccatgtc tagcaagcgctcattgtacag (SEQ ID NO: 8) using polymerase chain reaction.
  • the resulting plasmid vector is used to transform the bacterial strain E. coli SHuffle B, express and purify the hybrid protein construct as described in examples 2 and 3, respectively.
  • a plasmid vector is constructed for the expression of a hybrid protein construct by replacing the DNA sequence ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt (SEQ ID NO: 9), encoding element X of the construct, namely a linker with the amino acid sequence GGGGSGGGGSGG (SEQ III NO: 3), with the sequence ggtggaggtagtggaggaggtagtggtggtggtggtagt (SEQ ID NO: 10 ), encoding a linker with the amino acid sequence GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 11).
  • the specified replacement is made in the plasmid vector pET32a, encoding the amino acid sequence of the protein construct, by site-specific mutagenesis using oligonucleotide primers ggggcctttttagttggcggtggaggtagtggaggaggtagtggtggtggtggtagttgtcgtggtgac (SEQ GO NO: 12) and gtcaccacgacaactaccaccaccaccactacctcctccactacct ccaccgccaactaaaaggcccc (SEQ ID NO: 13) using polymerase chain reaction.
  • the resulting plasmid vector is used to transform the bacterial strain E.
  • coli SHuffle B express and purify the hybrid protein construct as described in examples 2 and 3, respectively. It is shown by polyacrylamide gel electrophoresis that the resulting hybrid protein construct with construct element X of composition GGGSGGGSGGGS has a molecular weight of 21191 Yes and stability similar to the hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ GO NO: 1. Shown by enzyme immunoassay as described in example 4, that the resulting hybrid protein construct with construct element X of composition GGGSGGGSGGGS binds to integrin avP3 with the same affinity as the hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • Example 9 Antitumor hybrid protein construct having a sequence different from that described in SEQ GO NO: 1.
  • a plasmid vector is constructed for the expression of a hybrid protein construct by replacing the DNA sequence ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt (SEQ ID NO: 9), encoding element X of the construct, namely a linker with the amino acid sequence GGGGSGGGGSGG (SEQ GO NO: 3), with the sequence ggtagtggaggtggaggaagtggtggtggtggtagt (SEQ ID NO: 14 ), encoding a linker with the amino acid sequence GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 15).
  • This replacement is made in the plasmid vector pET32a, encoding the amino acid sequence of the protein construct, by site-specific mutagenesis using oligonucleotide primers ggggcctttttagttggcggtagtggaggtggaggaaagtggtggtggtggtggtagttgtcgtggtgac (SEQ GO NO: 16) and gtcaccacgacaactaccaccaccaccaccacttcctcacctcc actaccgccaactaaaaaggcccc (SEQ ID NO: 17) using polymerase chain reaction.
  • the resulting plasmid vector is used to transform the bacterial strain E.
  • coli SHuffle B express and purify the hybrid protein construct as described in examples 2 and 3, respectively. It is shown by polyacrylamide gel electrophoresis that the resulting hybrid protein construct with construct element X of composition GSGGGGSGGGGS has a molecular weight of 21191 Yes and stability similar to the hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ GO NO: 1. Shown by enzyme immunoassay as described in example 4, that the resulting hybrid protein the construct with construct element X of composition GSGGGGSGGGGS binds to integrin avP3 with the same affinity as the fusion protein construct with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • Example 10 Antitumor hybrid protein construct having a sequence different from that described in SEQ GO NO: 1.
  • a plasmid vector is constructed for the expression of a hybrid protein construct by replacing the DNA sequence tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 18), encoding element B of the construct, namely a peptide with the amino acid sequence CRGDKGPDC (SEQ GO NO: 4), with the sequence gcatgtcgtggtgacagaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 19 ), encoding a peptide with the amino acid sequence ACRGDRGPDC (SEQ ID NO: 20), which is 90% homologous to the amino acid sequence SEQ GO NO: 4.
  • This replacement is made in the plasmid vector pET32a, encoding the amino acid sequence of the protein construct, by site-specific mutagenesis using oligonucleotide primers ggtggtgggagtggcgcatgtcgtggtgacagaggtcctgattgctaa (SEQ ID NO: 21) and ttagcaatcaggacctctgtcaccacgacatgcgccactccaccacc (SEQ ID NO: 22) using polymerase chain reaction.
  • the resulting plasmid vector is used to transform the bacterial strain E. coli SHuffle B, express and purify the hybrid protein construct as described in examples 2 and 3, respectively.
  • the resulting hybrid protein construct with construct element B of ACRGDRGPDC has a molecular weight of 21260 Da and stability similar to the hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ GO NO: 1. It is shown by enzyme immunoassay as described in example 4, that the resulting hybrid protein construct with construct element B of ACRGDRGPDC binds to integrin avP3 with the same affinity as the hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ GO NO: 1.
  • Example 11 Antitumor hybrid protein construct having a sequence different from that described in SEQ GO NO: 1.
  • a plasmid vector for expression of the hybrid protein is constructed by replacing the DNA sequence tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 18), encoding element B of the construct, namely a peptide with the amino acid sequence CRGDKGPDC (SEQ ID NO: 4), with the sequence gcaggtgggtgtcgtggtgacagaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 23) , encoding a peptide with the amino acid sequence AGGCRGDRGPDC (SEQ ID NO: 24), which is 75% homologous to the amino acid sequence SEQ GO NO: 4.
  • This replacement is made in the plasmid vector pET32a, encoding the amino acid sequence of the protein construct, by site-specific mutagenesis using oligonucleotides primers ggtggtgggagtggcgcaggtgggtgtcgtggtgacagaggtcctgattgctaa (SEQ ID NO: 25) and ttagcaatcaggacctctgtcaccacgacacccacctgcgccactcccaccacc (SEQ ID NO: 26) using polymerase chain reaction.
  • the resulting plasmid vector is used to transform the bacterial strain E. coli SHuffle B, express and purify the hybrid protein construct as described in examples 2 and 3, respectively.
  • the resulting hybrid protein construct with construct element B of the AGGCRGDRGPDC composition has a molecular weight of 21375 And stability, similar to the hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ III NO: 1. It is shown by enzyme immunoassay, as described in example 4, that the resulting hybrid protein construct with the construct element B of the composition AGGCRGDRGPDC binds to integrin avP3 with the same affinity as hybrid protein construct with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • Example 12 Antitumor hybrid protein construct having a sequence different from that described in SEQ III NO: 1.
  • the plasmid vector pET32a containing the sequence of the nucleic acid molecule SEQ III NO: 5, is encoded with nucleotide substitutions A126G, A129T, A132G, G135A, T138C, G141C, T144C, A147T, C150T, G153C encoding alternative codons using primers ggccgcaaaataaactcctgggagtcttcg agaagcggccactcttttctcagcaacttgc (SEQ ID NO: 27) and gcaagttgctgagaaaagagtggccgcttctcgaagactcccaggagtttattttgcggcc (SEQ ID NO: 28), and T381C, C384G, C387A, T390C, A393G, G396C, A399T, A402T, T405A, G408A
  • the resulting plasmid vector is used to transform the bacterial strain E. coli SHuffle B, express and purify the hybrid protein construct as described in examples 2 and 3, respectively.
  • polyacrylamide gel electrophoresis it is shown that the resulting nucleic acid molecule, which is 95% homologous to the sequence SEQ III NO: 5, expresses the protein construct according to claim 1.
  • the protein construct according to the invention can be used as an active ingredient in pharmaceutical compositions intended for the treatment of solid oncological diseases characterized by the expression of the DR5 receptor and avP3 integrin on the surface of tumor cells, such as, for example, glioblastoma, pancreatic adenocarcinoma and others.
  • the invention allows for an increased level of effectiveness due to dual tumor specificity and enhanced accumulation in tumor tissues compared to the DR5-specific mutant version of the antitumor cytokine TRAIL.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для терапии опухолей. Предложена гибридная белковая конструкция, содержащая на N-конце полипептидной цепи рецептор-селективный вариант цитокина TRAIL, специфически связывающийся с рецептором смерти DR5, а на С-конце пептид, специфически связывающийся с интегрином αvβ3, что обеспечивает повышенное накопление в опухолях. Указанную конструкцию используют в качестве активного действующего вещества в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения онкологических заболеваний, характеризующихся экспрессией рецептора DR5 и интегрина αvβ3 на поверхности опухолевых клеток, таких как глиобластома, аденокарцинома поджелудочной железы и другие. За счет биспецифичности изобретение обеспечивает более быстрое накопление в опухолевых структурах и повышенный уровень эффективности по сравнению с DR5-специфичным мутантным вариантом противоопухолевого цитокина TRAIL.

Description

ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР- СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К аУрЗ-ИНТЕГРИНУ
Область техники
Данное изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, к новым белковым конструкциям на основе рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, специфически связывающегося с рецептором смерти DR5, и может использоваться для приготовления терапевтических препаратов для лечения DR5-no3HTHBHbix солидных опухолей.
Уровень техники
Цитокин TRAIL (TNF-related-apoptosis inducing ligand) является частью системы иммунологического надзора за модифицированными клетками в организме. TRAIL способен селективно вызывать гибель опухолевых клеток, не затрагивая нормальные клетки. TRAIL имеет пять рецепторов, два из которых, DR4 и DR5, способны передавать сигнал апоптоза, в то время как рецепторы-«ловушки» DcRl, DcR2 и OPG блокируют TRAIL-индуцированный апоптоз (O'Leary L. et al. Oncogene. 2016. Vol. 35, pp. 1261-1270). Однако эффективность единственного препарата для таргетной терапии на основе цитокина TRAIL дикого типа, прошедшего 3 фазу клинических испытаний (Dulanermin®) оказалась ограниченной и в основном заключалась в частичных ответах или стабилизации заболевания (Ouyang X. et al. Invest. New Drugs. 36 (2018) 315-322). Основные причины - конкурентное взаимодействие с рецепторами-«ловушками» и короткий период полувыведения из организма.
DR5-oпocpeдoвaннaя гибель клеток представляет особый научно-практический интерес, поскольку в большинстве опухолей TRAIL вызывает апоптоз при взаимодействии с рецептором DR5 (Kelley, R.F., Totpal, К., Lindstrom, S.H., et al., J. Biol. Chem., 2010, vol. 280, pp. 2205-2212). Рецептор DR5 гиперэкспрессирован в большинстве опухолей; это открывает перспективу применения агонистов рецептора DR5 при широком спектре опухолевых заболеваний. Ранее был получен рецептор-специфичный вариант TRAIL с заменами аминокислотных остатков Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H в белке TRAIL, который селективно связывается лишь с одним из пяти рецепторов TRAIL, рецептором смерти DR5 (Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV et al. Apoptosis, 2009, 14:778-787). Данный мутантный вариант TRAIL индуцирует апоптоз в опухолевых клетках значительно эффективнее, чем TRAIL дикого типа in vitro и in vivo и преодолевает рецептор-зависимую резистетность опухолевых клеток к TRAIL (Gasparian М.Е. et al. Biochemistry (Mose). 2015;80(8):1080-1091; Yagolovich A.V. et al. Transl Oncol. 2020; 13(4): 100762; патент РФ № 2620165 от 23.05.2017 г.; патент РФ №2727059 от 26.04.2019 г). Благодаря высокой рецепторной специфичности и, следовательно, более низкому связыванию с тканями, указанный препарат обладает улучшенными фармакокинетическими характеристиками: его период полураспада у мышей составляет 12,54 минуты, что в 3 раза дольше, чем у TRAIL (3,64 минуты). Тем не менее, эти показатели могут быть недостаточны для значительного клинического эффекта. В связи с этим существует потребность в разработке модифицированных вариантов агонистов рецептора DR5 с дополнительными свойствами, позволяющими улучшить потенциальный противоопухолевый эффект. Близкими к заявляемому изобретению являются решения Wang X с соавторами, которые получили белковые конструкции RGD-TRAIL и TRAIL-NGR, содержащие на N- либо на С-конце полипептидной цепи TRAIL дикого типа пептиды RGD (ACDCRGDCFC) либо NGR (CNGRCVSGCAGRC) и соединенные линкерной последовательностью GGGGS (Wang X, Qiao X, Shang Y, et al. RGD and NGR modified TRAIL protein exhibited potent antimetastasis effects on TRAIL-insensitive cancer cells in vitro and in vivo. Amino Acids. 2017;49(5):931-941. doi:10.1007/s00726-017-2395-4). Благодаря специфичности пептидов к к интегрину avP3 и CD 13 указанные конструкции лучше связывались с эндотелиальными клетками опухолевых сосудов. Однако, в отличие от DR5-ceлeктивнoгo варианта цитокина TRAIL, данные белковые конструкции не обладают специфичностью рецептору DR5, которая чрезвычайно важна, учитывая, что из всех рецепторов TRAIL, рецептор DR5 играет главную роль в проведении сигнала апоптоза в большинстве опухолей.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание противоопухолевой гибридной белковой конструкции на основе DR5-cпeцифичнoгo мутантного варианта цитокина TRAIL, обладающей повышенным противоопухолевым действием за счет добавления дополнительной валентности для связывания с опухоле-специфичным рецептором (интегрином альфа v бета 3 (avP3)), что приводит к более быстрому накоплению в опухолевых структурах. Также задачей настоящего изобретения является расширение спектра средств для подавления пролиферации и индукции гибели опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор DR5 и интегрин avP3 на поверхности.
Указанная задача решается путем создания гибридной белковой конструкции, содержащей на N-конце полипептидной цепи противоопухолевый DR5-ceлeктивный варианта цитокина TRAIL, а на С-конце - пептид CRGDKGPDC (SEQ ID NO: 4), при этом два домена соединены линкерной последовательностью. Ранее было показано, что пептид CRGDKGPDC способен аффинно связываться с интегрином avP3 (Sugahara KN, et al. Cancer Cell 2009; 16:510). Интегрин avP3 гиперэкспрессирован во многих опухолях. Поэтому указанная гибридная белковая конструкция является перспективным средством для индукции гибели опухолевых клеток, характеризующихся присутствием рецептора DR5 и интегрином avP3 на поверхности.
В предпочтительном варианте изобретения гибридная белковая конструкция представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ ID NO: 1, и имеет общую формулу А-Х-В, где «А» имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ Ш: NO: 2, которая своим С-концом присоединена к «X»; «X» представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ Ш: NO 3, а «В» представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ГО: NO 4.
В других вариантах изобретения «А» представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, гомологичную по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% последовательности SEQ ГО NO: 2, способного специфически связываться с рецептором DR5 и содержащий замены аминокислотных остатков, способствующие повышению специфичности связывания с рецептором DR5 по сравнению с TRAIL дикого типа.
В некоторых вариантах изобретения «X» представляет собой химическую связь или подходящий линкер формулы(Х1Х1Х1Х1Х2)п(Х1Х1Х1Х1Х2)т , где Xi представляет собой остаток глицина, Хг представляет собой остаток серина, причем любой из Xi и Хг могут независимо отсутствовать; п и т имеют целое значение от 0 до 4, причем n+m имеет целое значение от 1 до 4 (или, в некоторых вариантах изобретения «X» представляет собой химическую связь или подходящий линкер формулы (XiXiXiXiX2)n, при этом Xi представляет собой остаток глицина или отсутствует, Хг представляет собой остаток серина или отсутствует, а п имеет целое значение от 1 до 4).
В некоторых вариантах изобретения «В» представляет собой пептид, N-концом присоединенный к «X», гомологичный по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 88% последовательности SEQ Ш NO: 4, и способный специфически связываться с интегрином avP3.
Указанная задача также решается путем создания молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую белковую конструкцию.
В предпочтительном варианте изобретения такая молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш NO: 5. В некоторых других вариантах изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такую белковую конструкцию, имеет последовательность, гомологичную по меньшей на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% SEQ ID NO: 5.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: создана новая биспецифическая гибридная белковая конструкция (в предпочтительном варианте имеющая последовательность SEQ ID NO: 1), способная связывать одновременно рецептор DR5 и интегрин avP3, что позволяет эффективнее чем исходный ОК5-селективный варианта цитокина TRAIL (SEQ ID NO: 2) связываться с опухолевыми структурами и быстрее накапливаться в них;
- разработан новый эффективный способ уничтожения опухолевых клеток в организме субъекта, на поверхности которых находятся рецепторы DR5 и интегрин avP3.
Краткое описание рисунков.
Фиг. 1. Экспрессия (А) исходного ОЕ5-селективного варианта цитокина TRAIL (М =19,61 кДа) и (В) гибридной белковой конструкции (М = 21,29 кДа), содержащей на N- конце полипептидной цепи противоопухолевый DR5-ceлeктивный варианта цитокина TRAIL, а на С-конце - пептид CRGDKGPDC, в штамме E.coli SHuffle В Т7. Дорожки: 1 - маркеры молекулярных масс; 2 -3 - по 20 мкл ночных культур клеток, выращенных в колбах №1 и №2.
Фиг. 2. Анализ чистоты (А) исходного DR5- селективного варианта цитокина TRAIL (М =19,61 кДа) и (В) гибридной белковой конструкции (М=21,29 кДа) в 15% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - маркеры молекулярных масс; 2, 3 - пробы, содержащие по 4 мкг белков.
Фиг. 3. Определение констант диссоциации (Kd) к рецептору смерти DR5 (А) исходного DR5 -селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции.
Фиг. 4. Определение константы диссоциации (Kd) к интегрину avP3 (А) исходного ВВ5-селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции.
Фиг. 5. Оценка жизнеспособности мультиклеточных ЗВ-сфероидов из линии глиобластомы U87MG под действием (А) исходного DR5 -селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции.
Фиг. 6. Оценка накопления (А) исходного ВВ5-селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции в опухолевых структурах на основе мультиклеточных ЗО-сфероидов из линии глиобластомы U87MG. Фиг. 7. Экспрессия и очистка гибридной белковой конструкции состава А-Х-В, где А - противоопухолевый DRS-селективный варианта цитокина TRAIL (SEQ Ш NO: 2), X - линкер GGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 3), а В - пептид AGGCRGDRGPDC, на 75% гомологичный аминокислотной последовательности SEQ Ш NO: 4. Пробы, содержащие 10-15 мкг белка, анализируют в 15% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - маркеры молекулярных масс; 2 - экспрессия белка в штамме E.coli SHuffle В; 3 - растворимая фракция цитоплазматических белков; 4 - фракция белков, не связанных cNi-NTA агарозой; 5 - фракции белков, отмытые буфером, содержащим 20 мМ имидазола; 6 - белок, элюированный буфером, содержащим 250 мМ имидазола, 7 - белковая фракция после очистки на сорбенте SP сефароза; 8 - образец белка после ночного диализа. Расчетная масса мономерной гибридной белковой конструкции составляет 21375 Да.
Фиг. 8. Определение констант диссоциации (Kd) гибридной белковой конструкции с элементом конструкции В состава CRGDKGPDC либо AGGCRGDRGPDC к рецептору VEGFR2 с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Лиганды добавляют в лунки, предварительно покрытые рецептором VEGFR2, и выявляют связывание с помощью моноклональных антител против TRAIL. Значения Kd рассчитывают с помощью опции нелинейной регрессии в программном обеспечении GraphPad Prism 8.0.
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Рецептором DR5 в настоящем описании называется рецептор смерти, также именуемый TRAIL-R2 либо TNFRSF10B, обозначаемый как O14763-TR10B_HUMAN в базе данных UniProt (https://www.uniprot.org/).
Интегрином avP3 в настоящем описании называются рецепторы, содержащие по одной субъединице интегрина av, Р06756 (ITAV_HUMAN), и по одной субъединице РЗ, Р05106 (ITB3_HUMAN), способные узнавать RGD-мотив на различных лигандах.
Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен, например, с помощью программы NCBI Protein BLAST
Figure imgf000006_0001
Подробное раскрытие изобретения
Описываемая в изобретении гибридная белковая конструкция может быть получена с использованием векторов для рекомбинантной экспрессии и экспрессирующих клеток-продуцентов, известных специалистам. Выбор промоторов и других регуляторных элементов, а также клеток-продуцентов и экспрессионных штаммов может варьироваться. Возможный вариант воплощения изобретения путем экспрессии рекомбинантной гибридной белковой конструкции в клетках E.coli описан в патенте № RU2687435C1. Для создания гибридной белковой конструкции, сначала методами генной инженерии конструируется нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, содержащую DR5 -специфичный вариант цитокина TRAIL на N-конце полипептидной цепи, линкерную последовательность, и пептид CRGDKGPDC на С-конце полипептидной цепи. Указанная нуклеотидная последовательность встраивается в подходящий генетический вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции в виде единой полипептидной цепи в клетках бактериальных штаммов либо эукариотических линий, предназначенных для экспрессии рекомбинантных белков. Очистка экспрессированного целевого белка осуществляется (но не ограничивается) с помощью стандартных методик, к примеру, металл-аффинной и ионобменной хроматографии. Аффинность очищенной гибридной белковой конструкции к рецепторам DR5 и интегрину avP3 определяется методами иммуноферментного анализа, поверхностного плазмонного резонанса, либо другими валидированными методами. Показана высокая аффинность связывания полученного гибридного белка с рецептором DR5 и интегрином avP3. Биологическая активность гибридной белковой конструкции исследуется на моделях опухолей in vitro и in vivo, в частности на мультиклеточных 3 D-моделях сфероидов, полученных из опухолевых клеточных линий. Повышенное противоопухолевое действие белковой конструкции DR5- селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC подтверждается результатами сравнительного исследования скорости накопления в мультиклеточных сфероидах на основе клеточной линии глиобластомы U87MG, экспрессирующей рецептор DR5 и пите грин avP3, а также результатами сравнительного исследования цитотоксической активности в отношении той же культуры мультиклеточных сфероидов. В частном случае реализации изобретения описывается способ индукции гибели опухолевых клеток U87MG с помощью полученного гибридного белка, имеющего повышенный цитотоксический эффект по сравнению с исходным DR5-ceлeктивным вариантом цитокина TRAIL.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Способ получения генетической конструкции, кодирующей аминокислотную последовательность гибридной белковой конструкции DR5-ceлeктивнoгo варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Для получения генетической конструкции, последовательность, кодирующую линкер GGGGSGGGGSGG и пептид CRGDKGPDC, вносят на 3’ -концевую последовательность ДНК, кодирующей ОК5-селективный вариант цитокина TRAIL в составе плазмидного вектора рЕТ32а, с помощью синтетического олигонуклеотида ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggttgtcgtggtgacaaaggtcctgattgctaa (SEQ ID NO: 6) методом ПЦР. Для исключения случайных мутаций в векторе в ходе ПНР гены гибридных белков переклонируют в исходный вектор по сайтам рестрикции Ndel и Xhol. Последовательность гена, кодирующего гибридную белковую конструкцию ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC, подтверждают секвенированием.
Пример 2. Способ экспрессии рекомбинантной белковой конструкции DR5-ceлeктивнoгo варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Для экспрессии гибридного белка полученный плазмидный вектор рЕТ32а, кодирующий аминокислотную последовательность белковой конструкции, трансформируют в компетентные клетки штамма Е. coli SHuffle В. Экспрессию проводят в среде ТВ в присутствии 100 мкг/мл ампициллина. Максимальная экспрессия наблюдается при индукции с помощью 0.05 мМ ИПТГ при 28°С в течение 18-20 часов при ротации платформы инкубатора 180 об/мин. Клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут при 4°С, отмывают буфером, содержащим 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия (pH 8.0) и хранят при - 80°С. Экспрессию белка в клеточном лизате оценивают с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза в 15% геле с окрашиванием краской кумасси бриллиантовый синий R-250. В данном примере уровень экспрессии гибридного DR5 -селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC в 1 литре культуры клеток составляет 350-370 мг.
Пример 3. Способ очистки рекомбинантной белковой конструкции ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Клетки ресуспендируют в лизис-буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия и 300 мМ хлорида натрия (pH 8.0), и разрушают с помощью установки «French press» (Spectronic Instruments, Inc., США) под давлением 1700 бар. Клеточный лизат центрифугируют при 75000 g при 4°С в течение 40 минут. В вышеописанном примере белок экспрессируется в растворимой форме, что позволяет проводить очистку из цитоплазматической фракции. На первом этапе очистку проводят путем металл-аффинной хроматографии на сорбенте Ni- NTA агарозе. Затем белки диализуют и проводят дополнительную очистку на ионообменном сорбенте SP сефарозе. После очистки белок диализуют против раствора 150 мМ NaCl и стерилизуют через шприцевой фильтр с порами 0,22 мкм с мембраной PVDF. Чистоту полученного рекомбинантного белка анализируют с помощью ДСН-ПААГ- электрофореза в 15% геле с окрашиванием краской кумасси бриллиантовый синий R-250. Чистота препарата в данном примере составляет не менее 98%, Концентрацию белка в очищенном препарате определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм с учетом молярного коэффициента экстинкции 26025 М-1 ,см-1 для ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC, определенного по аминокислотной последовательности с помощью программы ProtParam на сервере ExPASy (www.expasy.org). При очистке вышеописанным способом выход очищенного белка составляет 22-25 мг из 200 мл культуры клеток, при этом препарат проявляет высокую стабильность: при хранении белкового раствора в течение как минимум 6 месяцев не наблюдается ни деградации, ни потери биологической активности.
Пример 4. Анализ аффинности белковой конструкции ОЕ5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC к рецептору DR5 и интегрину avP3.
Анализ аффинности гибридного белка к рецептору смерти DR5 проводят методом иммуноферментного анализа. Для этого коммерческий препарат рекомбинантного внеклеточного домена рецептора DR5 иммобилизуют в количестве 100 нг на лунку 96- луночного планшета и определяют связывание гибридного ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC в диапазоне концентраций от 0,1 до 50 нМ. В качестве контроля используют исходный DR5-ceлeктивный вариант цитокина TRAIL в тех же концентрациях. Связывание определяют с помощью первичных анти-TRAIL антител с последующей инкубацией с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. После 15-минутной инкубации с колориметрическим субстратом OPD реакцию останавливают раствором IN H2SO4. Оптическую плотность определяют спектрофотометрически при 450 нм. Значения константы диссоциации (Kd) рассчитывают с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8, используя опцию нелинейной регрессии в разделе XY-анализа. В результате оценки аффинности таким способом показывают, что аффинность гибридного белка к рецептору DR5 сопоставима с исходным ОК5-селективным вариантом цитокина TRAIL (Kd 1,43 ± 0,31 нМ и 1,66 ± 0,41 нМ для исходного и гибридного белков, соответственно). Это доказывает, что внесение пептида CRGDKGPDC на С- конец ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL не влияет на сродство к рецептору смерти DR5.
Определение аффинности гибридного белка к интегрину avP3 проводят методом иммуноферментного анализа, иммобилизуя по 200 нг коммерческого препарата интегрина avP3 на лунку 96-луночного планшета. Связывание гибридного белка определяют в диапазоне концентраций от 0, 1 до 400 нМ. В качестве контроля используют аналогичные концентрации исходного ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL. Связывание гибридного белка с интегрином avP3 детектируют аналогичным образом, как описано выше для связывания с рецептором DR5. Исходный DR5- селективный вариант цитокина TRAIL практически не связывается с интегрином avP3, тогда как гибридный белок с пептидом CRGDKGPDC показывает высокую аффинность с константой диссоциации 1,89 ± 0,59 нМ, что сопоставимо с аффинностью самого пептида (Kd 10-20 нМ). Это доказывает, что пептид CRGDKGPDC в составе гибридного белка не теряет аффинности к интегрину avP3.
Пример 5. Анализ противоопухолевой активности гибридной белковой конструкции DR5- селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Противоопухолевая активность гибридной белковой конструкции исследуется методом WST-1 теста на мультиклеточных 3 D-сфероидах, полученных из линии опухолевых клеток глиобластомы U87MG. Клеточные сфероиды культивируют в питательной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Далее в культуральную среду добавляют по 10 мкл среды с разведениями исходного DR5- селективного варианта цитокина TRAIL и гибридного белка с пептидом CRGDKGPDC в диапазоне от 0,05 до 500 нМ. После 24 ч или 48 ч инкубации в каждую лунку добавляют по 10 мкл реагента WST-1 и планшеты выдерживают в течение 2 ч при 37°С. Оптическую плотность измеряют с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм с вычитанием фона при 655 нм. В результате получают значения IC50 273.1 нг/мл и 12.09 нг/мл для исходного и гибридного белков, соответственно, спустя 24 часа инкубации, и 5.5 нг/мл и 184.8 нг/мл, соответственно, спустя 48 часов инкубации, что свидетельствует о повышенной противоопухолевой активности гибридной белковой конструкции.
Пример 6. Сравнительный анализ скорости накопления белков в опухолевых 3D- структурах. Чтобы оценить скорость накопления гибридной белковой конструкции DR5- селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC в опухолевых 3D- структурах, проводят анализ накопления методом сканирующей конфокальной микроскопии клеток в ЗО-модели клеточной линии глиобластомы U87MG. Мультиклеточные сфероиды на основе линии U87MG культивируют в питательной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Питательную среду в лунках заменяют средой без сыворотки, содержащей краситель Hoechst 33258 (10 мкг/мл). Затем клетки инкубируют в течение 15-20 мин в СОг-инкубаторе (5% СОг, 37° С), после чего удаляют раствор красителя и промывают 2-3 раза 0,5 мл физ. раствора от несвязавшихся молекул красителя. Далее к клеткам добавляют белки-лиганды в концентрации 1000 нг/мл. Для визуализации белки предварительно модифицируются аминокислотной заменой Vall l4Cys Ha N-коице полипептидной цепи, после чего конъюгируются с флуоресцентным красителем сульфо-цианин-3-малеимидом (СуЗ) (Lumiprobe, Россия). После инкубирования клеток с белками-лигандами в течение временных периодов 15 мин и 1 ч, проводится трехкратная отмывка клеток от несвязавшихся белков с помощью 0,5 мл физ. раствора. Сфероиды аккуратно переносят на покровные стекла, после чего фиксируют с помощью CC/Mount™. Образцы изучают на инвертированном микроскопе Nikon ТЕ-2000 (Япония), снабженном конфокальной лазерной системой. Таким образом показывают, что гибридный DR5-ceлeктивный вариант цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC способен быстрее накапливаться в опухолевых 3 D-структурах по сравнению с исходным DR5- селективным вариантом цитокина TRAIL.
Пример 7. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ Ш NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем внесения нуклеотидных замен в последовательность ДНК, кодирующую элемент А конструкции, а именно рецептор-специфичный вариант цитокина TRAIL (SEQ ID NO: 2), таким образом, чтобы в аминокислотную последовательность были введены замены D267Q и H269D. Полученная аминокислотная последовательность на 98% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Указанные замены производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт- специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ctgtaacaaatgagcgcttgctagacatggaccatgaagccag (SEQ ID NO: 7) и ctggctcatggtccatgtctagcaagcgctcattgtacag (SEQ ID NO: 8) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции А, содержащая замены D267Q и H269D, имеет молекулярную массу 21152 Да и стабильность, аналогичную гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции А, содержащая замены D267Q и H269D, сохраняет специфичность к рецептору DR5 аналогично гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Пример 8. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ Ш NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем замены последовательности ДНК ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt (SEQ ID NO: 9), кодирующей элемент X конструкции, а именно линкер с аминокислотной последовательностью GGGGSGGGGSGG (SEQ Ш NO: 3), на последовательность ggtggaggtagtggaggaggtagtggtggtggtagt (SEQ ID NO: 10), кодирующей линкер с аминокислотной последовательностью GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 11). Указанную замену производят в плазмид ном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggggcctttttagttggcggtggaggtagtggaggaggtagtggtggtggtagttgtcgtggtgac (SEQ ГО NO: 12) и gtcaccacgacaactaccaccaccactacctcctccactacctccaccgccaactaaaaaggcccc (SEQ ID NO: 13) c помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GGGSGGGSGGGS имеет молекулярную массу 21191 Да и стабильность, аналогичную гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GGGSGGGSGGGS связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 9. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ ГО NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем замены последовательности ДНК ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt (SEQ ID NO: 9), кодирующей элемент X конструкции, а именно линкер с аминокислотной последовательностью GGGGSGGGGSGG (SEQ ГО NO: 3), на последовательность ggtagtggaggtggaggaagtggtggtggtggtagt (SEQ ID NO: 14), кодирующей линкер с аминокислотной последовательностью GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 15). Указанную замену производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggggcctttttagttggcggtagtggaggtggaggaagtggtggtggtggtagttgtcgtggtgac (SEQ ГО NO: 16) и gtcaccacgacaactaccaccaccaccacttcctccacctccactaccgccaactaaaaaggcccc (SEQ ID NO: 17) c помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GSGGGGSGGGGS имеет молекулярную массу 21191 Да и стабильность, аналогичную гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GSGGGGSGGGGS связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 10. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ ГО NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем замены последовательности ДНК tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 18), кодирующей элемент В конструкции, а именно пептид с аминокислотной последовательностью CRGDKGPDC (SEQ ГО NO: 4), на последовательность gcatgtcgtggtgacagaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 19), кодирующей пептид с аминокислотной последовательностью ACRGDRGPDC (SEQ ID NO: 20), который на 90% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 4. Указанную замену производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт- специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggtggtgggagtggcgcatgtcgtggtgacagaggtcctgattgctaa (SEQ ID NO: 21) и ttagcaatcaggacctctgtcaccacgacatgcgccactcccaccacc (SEQ ID NO: 22) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава ACRGDRGPDC имеет молекулярную массу 21260 Да и стабильность, аналогичные гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава ACRGDRGPDC связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1.
Пример 11. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ ГО NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридного белка путем замены последовательности ДНК tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 18), кодирующей элемент В конструкции, а именно пептид с аминокислотной последовательностью CRGDKGPDC (SEQ ID NO: 4), на последовательность gcaggtgggtgtcgtggtgacagaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 23), кодирующей пептид с аминокислотной последовательностью AGGCRGDRGPDC (SEQ ID NO: 24), который на 75% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 4. Указанную замену производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggtggtgggagtggcgcaggtgggtgtcgtggtgacagaggtcctgattgctaa (SEQ ГО NO: 25) и ttagcaatcaggacctctgtcaccacgacacccacctgcgccactcccaccacc (SEQ ID NO: 26) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава AGGCRGDRGPDC имеет молекулярную массу 21375 Да и стабильность, аналогичные гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ Ш NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава AGGCRGDRGPDC связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 12. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ Ш NO: 1.
В плазмидный вектор рЕТ32а, содержащий последовательность молекулы нуклеиновой кислоты SEQ Ш NO: 5, вносят кодирующие альтернативные кодоны нуклеотидные замены A126G, А129Т, A132G, G135A, Т138С, G141C, Т144С, А147Т, С150Т, G153C с использованием праймеров ggccgcaaaataaactcctgggagtcttcgagaagcggccactcttttctcagcaacttgc (SEQ ID NO: 27) и gcaagttgctgagaaaagagtggccgcttctcgaagactcccaggagtttattttgcggcc (SEQ ID NO: 28), и T381C, C384G, C387A, T390C, A393G, G396C, A399T, A402T, T405A, G408A, T411A c использованием праймеров gcagaatatggactctactcgatataccagggcggtattttagaactaaaggaaaatgac (SEQ ID NO: 29) и gtcattttcctttagttctaaaataccgccctggtatatcgagtagagtccatattctgc (SEQ ID NO: 30) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле показывают, что с полученной молекулы нуклеиновой кислоты, гомологичной на 95% последовательности SEQ Ш NO: 5, экспрессируется белковая конструкция по п.1.
Конкретные подробно описанные примеры экспериментов приведены для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Белковую конструкцию по изобретению можно использовать в качестве активного действующего вещества в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения солидных онкологических заболеваний, характеризующихся экспрессией рецептора DR5 и интегрина avP3 на поверхности опухолевых клеток, таких как, например, глиобластома, аденокарцинома поджелудочной железы и другие. Изобретение позволяет обеспечить повышенный уровень эффективности за счет двойной опухолеспецифичности и усиленному накоплению в опухолевых тканях по сравнению с DR5 -специфичным мутантным вариантом противоопухолевого цитокина TRAIL.

Claims

Формула изобретения
1. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция общей формулы:
А - Х - В, где А представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ Ш NO: 2, при этом селективно связывается с рецептором DR5, которая своим С-концом присоединена к X;
X представляет собой химическую связь или линкер;
В представляет собой пептид, N-концом присоединенный к X, гомологичный по меньшей мере на 75% последовательности SEQ Ш NO: 4 и способный специфически связываться с пите грином avP3.
2. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой X представляет собой линкер формулы (XiXiXiXiX2)n(XiXiXiXiX2)m , где Xi представляет собой остаток глицина, Хг представляет собой остаток серина, причем любой из Xi и Хг могут независимо отсутствовать; п и т имеют целое значение от 0 до 4, причем п+ш имеет целое значение от 1 до 4.
3. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой А имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% последовательности SEQ ГО NO: 2.
4. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой А имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ ГО NO: 2.
5. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой В имеет последовательность, гомологичную по меньшей на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 88% последовательности SEQ ГО NO: 4.
6. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой В представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ГО NO: 4.
7. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 2, в которой линкер представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ ID NO: 3.
8. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, которая имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ ГО NO: 1.
9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая противоопухолевую гибридную белковую конструкцию по любому из п.п.1-8.
10. Молекула нуклеиновой кислоты по и.9, которая имеет последовательность SEQ ГО NO: 5.
11. Молекула нуклеиновой кислоты по и.9, которая имеет последовательность, гомологичную по меньшей на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% SEQ ГО NO: 5.
PCT/RU2023/050176 2022-07-21 2023-07-21 ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ WO2024019642A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2022120069A RU2802488C1 (ru) 2022-07-21 Белковая конструкция на основе рецептор-специфичного мутантного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL в виде гибридного белка с пептидом, специфичным к интегрину αvβ3, для терапии солидных опухолей
RU2022120069 2022-07-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024019642A1 true WO2024019642A1 (ru) 2024-01-25

Family

ID=89618437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2023/050176 WO2024019642A1 (ru) 2022-07-21 2023-07-21 ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024019642A1 (ru)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PEDRO P.G. GUIMARãES, STEPHANIE GAGLIONE, TOMASZ SEWASTIANIK, RUBEN D. CARRASCO, ROBERT LANGER, MICHAEL J. MITCHELL: "Nanoparticles for Immune Cytokine TRAIL-Based Cancer Therapy", ACS NANO, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 12, no. 2, 27 February 2018 (2018-02-27), US , pages 912 - 931, XP055655208, ISSN: 1936-0851, DOI: 10.1021/acsnano.7b05876 *
S. SH. GAPIZOV; L. E. PETROVSKAYA; L. N. SHINGAROVA; E. A. KRYUKOVA; E. F. BOLDYREVA; E. P. LUKASHEV; S. A. YAKIMOV; E. V. SVIRSHC: "Fusion with an albumin‐binding domain improves pharmacokinetics of an αvβ3‐integrin binding fibronectin scaffold protein", BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS, US, vol. 66, no. 4, 8 July 2019 (2019-07-08), US , pages 617 - 625, XP071713579, ISSN: 0885-4513, DOI: 10.1002/bab.1762 *
YAGOLOVICH A. V.; ARTYKOV A. A.; DOLGIKH D. A.; KIRPICHNIKOV M. P.; GASPARIAN M. E.: "A New Efficient Method for Production of Recombinant Antitumor Cytokine TRAIL and Its Receptor-Selective Variant DR5-B", BIOCHEMISTRY (MOSCOW), PLEIADES PUBLISHING, MOSCOW, vol. 84, no. 6, 13 June 2019 (2019-06-13), Moscow, pages 627 - 636, XP036806266, ISSN: 0006-2979, DOI: 10.1134/S0006297919060051 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10898545B2 (en) Tear lipocalin muteins binding IL-4 r alpha
KR101971021B1 (ko) 세포 투과성의 향상을 위한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법, 이를 포함하는 aMTD 서열을 개발하는 방법
US9212208B2 (en) Muteins with tear lipocalin having affinity to human c-Met receptor tyrosine kinase and methods for obtaining the same
KR102675219B1 (ko) Ｓｉｒｐ-알파 변이체 구성체 및 이의 용도
JP2018519802A (ja) グリピカン−３（ｇｐｃ３）に対する親和性を有するヒトリポカリン２のムテイン
WO2011069992A2 (en) Muteins of human lipocalin 2 (lcn2, hngal) with affinity for a given target
KR20140036143A (ko) 항암 융합 단백질
KR20140019828A (ko) 항암 융합 단백질
JP2021536256A (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
JP6717725B2 (ja) 遺伝子操作した成長因子変異体
US6395875B1 (en) Recombinant soluble adenovirus receptor
CN112279921A (zh) 用于胞内递送分子的复合物
RU2802488C1 (ru) Белковая конструкция на основе рецептор-специфичного мутантного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL в виде гибридного белка с пептидом, специфичным к интегрину αvβ3, для терапии солидных опухолей
KR101263424B1 (ko) 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
WO2024019642A1 (ru) ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ
CA3185618A1 (en) Modified semaphorin 3a, compositions comprising the same and uses thereof
WO2014193176A1 (ko) 광활성 메티오닌 표지단백질 생합성을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소 및 이를 이용한 광활성 단백질 G 변이체 제조방법
US7691627B2 (en) Nucleic acid sequences encoding D1 and D1/D2 domains of human coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR)
WO2011079431A1 (zh) 具有端粒酶抑制活性的融合蛋白、其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23843461

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202491673

Country of ref document: EA