KR20200018123A

KR20200018123A - 폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200018123A
Application number: KR1020180093969A
Authority: KR
Inventors: 이봉진; 김도희; 강성민
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-02-19
Also published as: KR102097040B1; WO2020032324A1

Abstract

본 발명은 폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 항생 펩타이드는 독소의 활성부위에는 영향을 미치지 않으면서 폐렴구균의 독소-항독소 복합체 형성을 억제하고, 그에 따라 분리된 독소의 RNA 분해 활성에 의해 폐렴구균의 사멸을 유도하며, 다른 균들에 대해서도 항생 활성을 나타내므로, 항생용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이의 용도{Antibiotic peptides targeting toxin-antitoxin system of Streptococcus pneumoniae and use thereof}

본 발명은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 독소-항독소 체계(toxin-antitoxin system)를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 그람 양성 및 조건적 혐기성(facultative anaerobic) 세균으로 중이염, 축농증, 폐렴 및 뇌수막염을 유발하는 주요 병원체이며, 보통 호흡기로 흡입되어 인두(pharynx) 및 비강(nasal cavity)에 머물면서 병을 유발한다. 폐렴구균의 제거 및 상기와 같은 질병들의 증상 완화를 위하여, 반코마이신(vancomycin) 및 페니실린(penicillin)과 같은 글리코펩타이드(glycopeptide) 항생제가 주로 사용되어 왔으나, 기존의 항생제에 내성을 갖는 폐렴구균이 지속적으로 등장하면서, 새로운 전략의 항생제 개발 필요성이 대두되고 있다.

박테리아는 일반적으로 독소-항독소 체계를 갖추고 있으며, 이는 유전자 조절, 성장, 생존 및 세포 자멸사 등과 같은 생리적 과정에서 중요한 역할을 한다. 정상적인 성장 환경에서는 독소와 그 동종의 항독소는 안정한 복합체를 형성하고 있으나, 스트레스 상태에서는 불안정한 항독소가 분해되면서 유리 독소가 방출된다. 방출된 독소는 숙주세포의 RNA를 분해하거나, 토포이소머라제(topoisomerase) 또는 리보솜에 결합함으로써, DNA 복제, 단백질 합성 및 세포벽 합성 등을 억제하여 독성을 나타낸다.

독소-항독소 체계는 항독소가 독소의 독성을 억제하는 방법에 따라 6가지 종류(type I 내지 VI)로 분류된다. 타입 I 체계에서는 항독소가 독소 mRNA에 결합할 수 있는 안티센스(antisense) RNA로, 독소의 번역을 억제하고, 타입 II 체계에서는 단백질 형태의 독소 및 항독소가 서로 결합함으로써 비독성 단백질 복합체를 형성한다. 타입 III 체계에서는 RNA 형태의 항독소가 독소 단백질에 직접적으로 결합하여 비독성 RNA-단백질 복합체를 형성하며, 타입 IV 체계에서는 독소 및 항독소가 서로 결합하지 않고, 동일한 세포 표적에 대하여 경쟁적으로 작용한다. 타입 V 체계에서는 단백질 형태의 항독소가 독소 mRNA를 분해하고, 타입 VI 체계에서는 단백질 형태의 항독소가 독소 단백질을 세포 내 프로테아제에 전달하여 독소 단백질의 분해를 유도한다(Ki-Young Lee et al., Toxins, 8(10), 2016).

폐렴구균은 몇 가지 독소-항독소 체계를 갖고 있으며, 그 중 HicBA 독소-항독소 체계는 타입 II 체계에 해당한다. 독소-항독소 복합체의 형성을 인위적으로 억제할 수 있으면 독성을 갖는 독소가 중화되지 못하여 결국 세포가 사멸하기 때문에 독소-항독소 체계는 새로운 항생제 개발을 위한 매력적인 표적이 될 수 있다.

본 발명의 목적은 폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항생 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 폐렴구균의 독소-항독소 결합체인 HicBA 복합체의 형성을 억제하는 항생 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 의약외품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 외용제를 제공한다.

본 발명의 항생 펩타이드는 독소의 활성부위에는 영향을 미치지 않으면서 폐렴구균의 독소-항독소 복합체 형성을 억제하고, 그에 따라 분리된 독소의 RNA 분해 활성에 의해 폐렴구균의 사멸을 유도하며, 다른 균들에 대해서도 항생 활성을 나타내므로, 항생용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 폐렴구균(S. pneumoniae) HicBA 단백질 복합체의 헤테로-테트라머(A), 헤테로-옥타머(B) 및 헤테로다이머(C) 구조, 페스트균(Y. pestis) HicBA 단백질 복합체의 헤테로다이머 구조(D), 폐렴구균 HicB 단백질의 테트라머 구조(E), 및 폐렴구균과 페스트균의 HicB 단백질 구조 비교(F 및 G)를 나타낸 도면이다(C 및 D: 검은 점선으로 표시된 사각형 부분은 페스트균의 HicB 단백질에는 존재하지 않고, 폐렴구균의 HicB 단백질에만 존재하는 C-말단의 DNA-결합 도메인 부위를 나타낸다).
도 2는 폐렴구균의 HicBA 단백질 복합체(A) 및 HicB 단백질(B)의 멀티-앵글 광 산란(multi-angle light scattering, MALS)이 결합된 크기 배제 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 페스트균(Y. pestis) 및 폐렴구균(S. pneumoniae)의 HicB 단백질(A) 및 HicA 단백질(B)의 2차 구조를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 폐렴구균의 HicA 단백질, 및 결핵균의 VapC26 및 VapC30 단백질의 RNA 분해 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 폐렴구균 HicA 단백질의 아미노산 서열을 다른 HicA 단백질 등의 아미노산 서열과 함께 정렬한 결과(A), 폐렴구균 HicA 단백질의 RNA 분해 활성 부위 및 그 주변 잔기들의 HicB 단백질과의 상호작용(B), 및 폐렴구균 HicA 단백질의 구조를 다른 HicA 단백질 등의 구조와 비교한 결과(C)를 나타낸 도면이다(A: 빨간 원으로 표시한 잔기는 RNA 분해 활성에 필수적인 잔기를 나타낸다; B: 검은 점선은 각 잔기들 간의 수소결합 및 염다리(salt bridge)를 의미한다; C: 노란 원은 RNA 분해 활성에 필수적인 잔기들이 있는 부위를 나타낸다).
도 6은 폐렴구균의 HicA 단백질의 정전기적 표면전위(electrostatic surface potential)(A 및 B) 및 RNA가 결합된 HicA 단백질의 이중가닥 RNA 결합 도메인 표면 부분(A)을 나타낸 도면이다.
도 7은 폐렴구균 HicA 단백질의 히스티딘36을 알라닌으로 치환한 단백질(H36A)의 RNA 분해활성을 HicA 단백질의 RNA 분해 활성과 비교한 결과 그래프(A) 및 이들 단백질 또는 HicBA 단백질 복합체를 발현하는 대장균의 성장곡선(B)이다.
도 8은 폐렴구균 HicB 단백질 및 HicA 단백질의 소수성(A) 및 친수성(B) 상호작용을 나타낸 결과, 및 HicB 단백질 돌연변이체와 HicA 단백질의 복합체를 발현하는 대장균의 세포독성 여부를 확인한 도면(C)이다(B: 검은 점선은 수소결합 및 염다리(salt bridge)를 의미하며, 삽입된 표는 상호작용에 관여하는 각 염기들을 나타낸다).
도 9는 펩타이드 I 내지 IV를 첨가한 HicBA 단백질 복합체의 RNA 분해 활성(A), 펩타이드 I을 첨가한 경우의 RNA 분해 활성을 100%로 하여 펩타이드 II 내지 IV을 첨가한 경우의 RNA 분해 활성(B), 및 각 펩타이드의 원평광 이색성(circular dichroism)(C)을 나타낸 도면이다.
도 10은 HicBA 단백질 복합체, 펩타이드 I을 첨가한 HicBA 단백질 복합체 및 HicA 단백질의 RNA 분해 활성(A), 및 HicBA 단백질 복합체 단독의 RNA 분해 활성을 0%로 하고, HicA 단백질 단독의 RNA 분해 활성을 100%로 한 경우의 펩타이드 I을 첨가한 HicBA 단백질 복합체의 RNA 분해 활성(B)을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 폐렴구균의 독소-항독소 결합체인 HicBA 복합체의 형성을 억제하는 항생 펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드는 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA의 아미노산 잔기 56-66에 해당하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 α2 영역이 항독소 단백질 HicB와 결합하는 것을 억제하는 것일 수 있다.

상기 펩타이드는 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.

상기 펩타이드는 폐렴구균, 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(S. epidermidis), 대장균(Escherichia coli), 이질균(Shigella dysenteriae), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대한 항생 활성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 펩타이드는 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성될 수 있으며, 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성될 수 있고, 더욱 구체적으로는 고상 펩타이드 합성법으로 합성될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 하기와 같은 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied Biosystems 사의 제품)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다.

상기 DNA 서열은 이에 작동 가능하게 연결되어 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입한다. 그리고 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환한 다음, 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양한다. 그 다음, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 암호화된 실질적으로 순수한 펩타이드를 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 회수한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 등.

상기 펩타이드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 펩타이드는 본 발명의 펩타이드와 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 폐렴구균의 독소-항독소(HicBA) 단백질 복합체를 분리 및 정제한 후, X-선 회절(diffraction) 분석을 통해 구조를 결정하고, HicA 독소 단백질의 RNA 분해 활성 및 그에 따른 세포 독성에 필수적인 아미노산 잔기를 확인하였다(도 1 내지 7 참조).

또한, HicBA 단백질 복합체를 형성하는 HicB 및 HicA 단백질 간의 상호작용을 확인하고, 복합체 형성에 필수적인 HicB 단백질의 아미노산 잔기를 확인하였다(도 8 참조).

아울러, HicB 단백질과 결합하는 HicA 단백질의 α2 영역을 모방하는 펩타이드 I 내지 IV를 제작하고, 상기 펩타이드들의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제에 따라 분리된 HicA 독소 단백질 증가에 따른 RNA 분해 활성 증가 효과를 확인하였으며, 펩타이드 I의 폐렴구균 외의 8종 세균에 대한 항생 활성을 확인하였다(도 9, 도 10 및 표 6 참조).

따라서, 상기 HicA 단백질의 α2 영역을 모방하는 펩타이드는 폐렴구균의 독소-항독소 복합체인 HicBA의 결합을 억제하여, 폐렴구균의 사멸을 유도하며, 다른 균들에 대해서도 항생 활성을 나타냄으로써, 항생용 펩타이드로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 항생 펩타이드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

상기 조성물은 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA의 아미노산 잔기 56-66에 해당하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 α2 영역이 항독소 단백질 HicB와 결합하는 것을 억제하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 폐렴구균, 고초균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 대장균, 이질균, 살모넬라 티피무리움, 폐렴막대균 및 녹농균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대한 항생 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 펩타이드 I 내지 IV의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제에 따라 분리된 HicA 독소 단백질 증가에 따른 RNA 분해 활성 증가 효과를 확인하였고(도 9 및 10 참조), 펩타이드 I의 고초균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 대장균, 이질균, 살모넬라 티피무리움, 폐렴막대균 및 녹농균에 대한 항생 활성을 확인하였다(표 6 참조). 따라서, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물은 항생용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항생 펩타이드를 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항생 펩타이드의 유효용량은 0.001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.01 내지 10 mg/kg일 수 있으며, 하루에 1회 내지 수회 투여될 수 있다.

본 발명의 항생용 조성물은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.

상기 의약외품은 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA의 아미노산 잔기 56-66에 해당하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 α2 영역이 항독소 단백질 HicB와 결합하는 것을 억제하는 것일 수 있고, 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 펩타이드 I 내지 IV의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제에 따라 분리된 HicA 독소 단백질 증가에 따른 RNA 분해 활성 증가 효과를 확인하였고(도 9 및 10 참조), 펩타이드 I의 고초균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 대장균, 이질균, 살모넬라 티피무리움, 폐렴막대균 및 녹농균에 대한 항생 활성을 확인하였다(표 6 참조). 따라서, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약외품은 항생용 의약외품으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.

상기 외용제는 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA의 아미노산 잔기 56-66에 해당하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 α2 영역이 항독소 단백질 HicB와 결합하는 것을 억제하는 것일 수 있고, 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 펩타이드 I 내지 IV의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제에 따라 분리된 HicA 독소 단백질 증가에 따른 RNA 분해 활성 증가 효과를 확인하였고(도 9 및 10 참조), 펩타이드 I의 고초균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 대장균, 이질균, 살모넬라 티피무리움, 폐렴막대균 및 녹농균에 대한 항생 활성을 확인하였다(표 6 참조). 따라서, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 외용제는 항생용 외용제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

HicBA 단백질 복합체 및 셀레노메티오닌(selenomethionine, SeMet) 표지된 HicBA 단백질 복합체의 분리 및 정제

1-1. HicB 및 HicA 유전자의 클로닝 및 형질전환

먼저, 폐렴구균(S. pneumoniae)의 항독소 단백질 HicB를 암호화하는 유전자 SP1786 및 독소 단백질 HicA를 암호화하는 유전자 SP1787을 하기 표 1에 기재된 프라이머들을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭시켰다.

프라이머명^a	서열(5'→3')^b	서열번호
HicB-F	GGAATTCCATATGATGTTAGTTACGTATCC	7
HicB-R	CCGCTCGAGCGGTTAGGCTTGAACTTTCTTATC	8
HicA-F	GGAATTCCATATGATGGTGTTGTCAGGAGG	9
HicA-R	CCGCTCGAGCGGTTACAACCCAGCTTGCTTTC	10

^aF는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 의미한다.

^b밑줄로 표시된 서열은 제한효소 부위를 의미한다.

상기 HicB 및 HicA 단백질을 암호화하는 유전자의 PCR 산물들을 제한효소인 Nde1 및 Xho1으로 이중 절단하고 동일한 효소로 절단한, 태그(tag)가 없는 pET21a 및 pET28b에 각각 연결하였고, HicA 단백질을 암호화하는 유전자가 연결된 pET28b에는 N-말단(N-terminal) 잔류 태그(서열번호 6: MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH)를 첨가하였다. 상기 제조된 각 플라스미드들을 대장균(Escherichia coli) Rosetta2(DE3) pLysS 수용체 세포에 공-형질전환시켰다(co-transformed).

1-2. HicBA 단백질 복합체의 발현 및 정제

상기 실시예 1-1에서 제작한 HicB 및 HicA 유전자를 포함하는 플라스미드들로 공-형질전환된 세포를 이용하여 HicBA 단백질 복합체를 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 상기 세포를 OD₆₀₀값이 0.8에 도달할 때까지 LB(Luria Bertani) 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다. 이후, 0.5 mM의 IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 단백질 과발현을 유도하고, 37℃에서 4시간 동안 더 배양하였다. 배양된 세포를 4℃에서 11,355×로 원심분리하여 회수하였고, -80℃에 보관하였다. 수득된 세포를 5%(v/v) 글리세롤(glycerol)을 포함하는 버퍼 A(20 mM의 Tris-HCl(pH 7.9) 및 500 mM의 NaCl)에 현탁시키고 초음파를 이용하여 파쇄한 뒤, 파쇄된 세포는 다시 28,306×에서 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 가용성 단백질을 포함하는 상기 상층액을 버퍼 A로 평형화된 Ni²⁺ 친화 오픈 컬럼(Ni²⁺ affinity open column, Bio-Rad)에 충진하고, 50 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 버퍼 A로 컬럼을 세척하였다. Ni²⁺ 컬럼에 결합한 단백질은 100 내지 700 mM의 이미다졸 농도구배를 이용하여 용출시켰고, 용출된 분획 내에 존재하는 HicBA 단백질 복합체를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하였다. HiLoad 16/600 Superdex 200 prep-grade 컬럼(GE Healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 수행하여 HicBA 단백질 복합체를 포함하는 버퍼를 20 mM의 Tris(pH 7.5) 및 150 mM의 NaCl을 포함하는 버퍼로 교환하였고, 교환한 시료를 아미콘 초원심분리 필터 유닛(Amicon Ultra centrifugal filter unit, Milipore)을 이용하여 10 mg/mL의 농도로 농축하였다. 농축한 HicBA 단백질 복합체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다.

1-3. SeMet 표지된 HicBA 단백질 복합체의 발현 및 정제

단백질 결정 구조 분석에서의 위상차 해결을 위해 SeMet 표지된 HicBA 단백질 복합체를 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제작한 세포를 배양할 때 여분의 필수 아미노산을 포함하는 M9 배지에서 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 SeMet 표지된 HicBA 단백질 복합체를 수득하였다.

HicBA 단백질 복합체의 구조 분석

2-1. 단백질의 결정화(crystallization)

상기 실시예 1에서 분리 및 정제한 HicBA 단백질 복합체 및 SeMet 표지된 HicBA 단백질 복합체의 결정 구조를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl 용액에 10 mg/mL 농도로 포함된 각 단백질 복합체 용액 1 ㎕를 저장 용액(reservoir solution) 1 ㎕와 혼합하고, 크리스탈 스크리닝(Crystal Screening) 1, 2 및 인덱스(Index) 키트들(Hampton Research)을 이용하여 초기 결정 스크리닝을 수행하였다. 각 결정은 4℃에서 싯팅 드롭 증발법(sitting-drop vapor diffusion method)을 이용하여 성장시켰으며, 결정화 용액으로 0.1 M Tris(pH 8.5) 및 2.0 M 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)로 구성된 용액을 사용하였다. HicBA 단백질 복합체의 동결보호(cryoprotection)를 위하여 20% 글리세롤을 용액에 첨가하였다. 상기 결정은 데이터 모음 전에 액체 질소에서 즉시 동결하였다.

2-2. X-선 회절 분석 데이터 모음

상기 실시예 2-1에서 수득한 결정을 이용하여 X-선 회절 분석(X-ray diffraction analysis)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 결정의 X-선 회절 분석 데이터는 포항 가속기 센터(대한민국)의 5C 및 7A 빔라인(beamline)에서 ADSC Quantum Q270r CCD 검출기를 이용하여 수집하였고, HKL2000 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각 결정의 데이터 모음을 하기 표 2에 나타냈으며, N-말단 히스티딘 태그를 포함한 HicBA 단백질 복합체의 계산된 총 질량은 26349.7 Da였다.

	SeMet 표지된 HicBA 결정	원형 HicBA 결정
X-ray source	5C beamline^a	7A beamline^a
X-ray wavelength^b (Å)	0.9795	1.0000
Space group^c	P2₁2₁2	P2₁2₁2
Unit cell parameters^d
a, b, c (Å)	106.88, 116.58, 42.67	106.93, 116.62, 42.68
α, β, γ (°)	90.0, 90.0, 90.0	90.0, 90.0, 90.0
Resolution range^e (Å)	50.0-2.80	50.0-2.30
Molecules per ASU^f	2 HicBA homodimers	2 HicBA homodimers
Observed reflections^g (>1σ)	294913	237881
Unique reflections^h	12859	24090
<I /σ(I)>ⁱ	50.69 (6.86)ⁿ	30.2 (5.27)ⁿ
Completeness^j (%)	96.7 (87.8)ⁿ	100.0 (100.0)ⁿ
Multiplicity^k	22.9 (22.8)ⁿ	9.9 (10.1)ⁿ
R_merge(%)^l	11.0 (66.6)ⁿ	9.2 (53.7)ⁿ
CC_1/2, CC^m		(0.906, 0.975)ⁿ

^a포항 가속기 센터(대한민국)의 빔라인

^b사용된 X-선의 파장 길이

^c공간군: 결정의 단위 세포(unit cell)의 대칭성을 의미하며, 대칭요소들을 조합하면 군(group)을 형성하는데 총 230개의 공간군이 존재한다.

^d단위 세포 치수: 공간 격자(space lattice)를 구성하는 가장 해석이 용이한 최소 반복 단위인 단위 세포를 규정하는 값으로, 3개의 결정학상 축(crystallographic axes)으로 정의되며, 3방향 벡터(vector)들의 길이(a, b 및 c)와 이들이 서로 이루는 각(α, β 및 γ)을 의미한다.

^e수집된 데이터를 통해 얻을 수 있는 모델의 해상도의 한계

^f한 분자에 포함되는 비대칭 단위(asymmetric unit, ASU)

^gX-선 회절 분석 데이터의 총 반사 횟수

^hX-선 회절 분석 데이터 중 수집한 범위 내에 존재하는 반사 횟수

ⁱ각 쉘(shell)에서 얻은 반사 데이터의 강도(intensity, I)를 오류값으로 나눈 값으로, 높을수록 신뢰성 높은 결과임을 의미한다.

^j완성도: 특정 해상도에 존재하는 반사(reflection)의 총 수를 백분율로 나타낸 값으로, 높을수록 고해상도임을 의미한다.

^k다중도: 고유한 반사의 총 수(number of unique reflections)에 대한 실제 측정된 반사의 총 수(number of measured reflections)인 반복도(redundancy)와 동일한 의미이며, 대칭도가 높은 결정의 경우 고유한 반사의 총 수가 낮아 대칭도가 낮은 결정에 비하여 높은 다중도(반복도)를 나타낸다.

^lR_merge = Σ(I - <I>) / Σ<I>

R_merge: 대칭(symmetry)으로 연관된 측정 데이터 간의 일치하는 정도로, 낮을수록 신뢰성 높은 결과임을 의미하는 R_sym과 동일한 의미를 나타낸다.

^mCC(correlation coefficient): X-선 데이터 중 구조 결정에 사용된 데이터들의 정확도를 나타내는 척도로, 높을수록 정확도가 높음을 의미한다.

CC_1/2: CC의 정확도를 증명하기 위한 척도로, 무작위로 선정된 절반의 데이터세트(dataset)를 이용하여 산출된다.

ⁿ괄호 안의 값은 가장 높은 해상도 쉘의 값이다.

2-3. 단백질 구조 결정 및 구조 개선(refinement)

HicBA 단백질 복합체의 구조는 SeMet 표지된 결정을 이용한 단일 파장 변칙 분산(single-wavelength anomalous dispersion)에 의하여 2.80Å의 해상도로 분석하였고, 최종 구조는 분자 치환법(molecular replacement)으로 결정되었다. 먼저, 피닉스(PHENIX)를 이용하여 모델을 형성하고, 쿠트(COOT) 프로그램을 이용하여 구조 개선의 초기 모델을 형성하였다. 전반적인 기하 구조는 몰프로비티(MolProbity)로 검증하였고, 개선된 구조는 파이몰(PyMOL)을 이용하여 시각화하였으며, 각 결정의 구조 개선 통계 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	SeMet 표지된 HicBA 결정	원형 HicBA 결정
R_work ^a (%)	20.2	20.5
R_free ^b (%)	24.0	23.6
No. of atoms / average B factor^c (Å²)
Protein	3266 / 55.6	3354 / 40.4
Water oxygen	50 / 50.14	85 / 34.06
RMSD^d from ideal geometry
Bond distance (Å)	0.007	0.005
Bond angle (°)	1.314	0.963
Ramachandran statistics^e
Most favoured regions (%)	96.3	98.0
Additional allowed regions (%)	3.2	2.0
Disallowed regions (%)	0.5	0.0
MolProbity score^f	2.12 (98^th percentile)	1.66 (98^th percentile)
PDB accession code		5YRZ

^a실제 X-선 회절 데이터와 모델 사이의 일치하는 정도. 낮을수록 일치도가 높다. (R = Σ_hkl||F_obs| - k|F_calc|| / Σ_hkl|F_obs|)

^b무작위로 선택된 데이터와 모델 사이의 일치하는 정도. 수득된 데이터 중 무작위로 선택된 5%의 데이터를 R_work와 동일한 식으로 계산하여 얻었다.

^c모델에 제시된 원자의 위치로부터 원자가 진동하여 움직이는 범위를 의미한다.

^d평균 제곱근 편차(Root mean square deviation): 결정된 모델의 구조가 통상적인 분자들이 지닌 결합 길이 및 각도와 부합하는 정도를 나타내며, 레프맥(REFMAC)을 사용하여 얻었다.

^e라마찬드란 분석: 폴리펩타이드의 주 사슬(main chain)의 공간 상 각도를 나타내는 분석으로, 입체 장애(steric repulsion)를 반영하여 사슬이 어느 각도로 존재하는 것이 모순이 없는지를 보여주며, 이에 따라 모델을 평가하는 지표로 활용된다.

^f단백질 및 핵산의 구조 모델 품질을 평가하는 척도로, 백분위가 높을수록 고품질을 의미한다.

2-4. HicBA 단백질 복합체의 구조적 특성 확인

상기 실시예 2-2 및 2-3에서 얻은 데이터를 기반으로 하여, HicBA 단백질 복합체의 구조적 특성을 확인하고, 멀티-앵글 광 산란(multi-angle light scattering, MALS)이 결합된 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 HicBA 단백질 올리고머의 구조를 결정하였다.

구체적으로, BioSep SEC-x3000 컬럼(Phenomenex) 및 1260 Infinity HPLC 시스템(Agilent Technologies)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였으며, 산란(scattering) 데이터는 방출 파장 657.4 nm에서 miniDAWN-TREOS 라인(Wyatt Technology)으로 수득하였고, ASTRA 6.0.1.10 소프트웨어(Wyatt Technology)를 이용하여 분석하였다. 실험에는 100 μM의 HicBA 단백질 헤테로다이머를 사용하였으며, 단백질 결정화 실험의 조건인 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl으로 구성된 용액 내에서 분석하였고, 모든 실험은 상온에서 수행하였다.

X-선 회절 분석 데이터를 기반으로 분석한 결과, HicBA 단백질 복합체 결정 구조는 2개의 HicBA 단백질 복합체 헤테로다이머(heterodimer)를 포함하며, 2개의 HicB 항독소 단백질과 2개의 HicA 독소 단백질이 헤테로-테트라머(hetero-tetramer) 구조를 형성함을 확인하였다(도 1A). 그러나, MALS가 결합된 크기 배제 크로마토그래피로부터 계산된 HicBA 단백질 복합체의 분자량이 105 ±0.1 kDa이었고, 이는 HicBA 단백질 복합체의 헤테로-옥타머(hetero-octamer) 형태의 이론적 분자량(105.4 kDa)과 거의 일치하여, HicBA 단백질 복합체가 헤테로-옥타머 형태로 존재함을 확인하였다(도 1B 및 2A).

한편, 2Struc 서버를 이용하여 2차 구조 분석을 수행한 결과, HicB 단백질은 3개의 α-헬릭스(α-helices), 3개의 3₁₀-헬릭스(η) 및 4개의 β-가닥(β-strands)을 포함하고, HicA 단백질은 2개의 α-헬릭스 및 3개의 β-가닥을 포함하며, α-β-β-β-α의 이중 가닥 RNA 결합 도메인 접힘 위상(fold topology)을 가짐을 확인하였다(도 1C). 또한, 기존에 유일하게 알려진 페스트균(Yersinia pestis)의 HicBA 단백질 복합체 구조와 비교할 때, 폐렴구균의 HicBA 단백질 복합체는 HicB 단백질의 η1과 η2 사이의 길고 유연한 루프가 존재하며, 특히 DNA 결합 도메인으로 예측되는 HicB 단백질의 C-말단 부위가 페스트균의 HicBA 단백질 복합체에는 존재하지 않음을 확인하였다(도 1C, 1D, 1F, 1G 및 도 3).

2-5. HicB 단백질의 구조적 특성 확인

상기 실시예 2-2 내지 2-4에서 얻은 데이터를 기반으로 하여, HicB 단백질의 구조적 특성을 확인하였다.

그 결과, 2개의 HicB 단백질 모노머가 각 모노머의 N-말단 도메인 중 주로 β1, α4 및 β4를 통하여 호모다이머(homodimer)를 형성함을 확인하였다. 그러나, MALS가 결합된 크기 배제 크로마토그래피로부터 계산된 HicB 단백질의 분자량이 71.8 ±0.8 kDa이었고, 이는 HicB 단백질 테트라머의 이론적 분자량(71.3 kDa)과 거의 일치하여, HicB 단백질이 테트라머 형태로 존재함을 확인하였다(도 1E 및 2B).

HicA 단백질의 분리 및 정제

상기 실시예 1-1에서 제작한 HicA 단백질을 암호화하는 유전자가 연결된 pET28b 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) Rosetta2(DE3) pLysS 수용체 세포에 형질전환시킨 후, 상기 세포를 IPTG 처리 후 2시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 HicA 단백질을 분리 및 정제하였다.

HicA-H36A 단백질의 분리 및 정제

HicA 단백질을 암호화하는 유전자 SP1787을 주형으로 하고, 하기 표 4에 기재된 프라이머들(서열번호 11 및 12) 및 부위-특이적 돌연변이 유도 키트(EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit, Enzynomics)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 PCR을 수행함으로써 HicA 단백질의 히스티딘36이 알라닌으로 치환된 돌연변이 유전자를 수득하였다. HicA 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭시킨 PCR 산물 대신 상기 PCR 산물을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 HicA-H36A 단백질을 발현하는 세포를 제작하였다. 이후, 상기 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 HicA-H36A 단백질을 분리 및 정제하였다.

프라이머명^a	서열(5'→3')	서열번호
HicA-H36A-F	TAGAGGCGGTAAAGGCTCCGCTATTAAAATGGAAAAGCAAG	11
HicA-H36A-R	CTTGCTTTTCCATTTTAATAGCGGAGCCTTTACCGCCTCTA	12
HicB-F22A-F	GGAACAGAAGCGACTTATGCTGTCCATTTCCCAGATTTT	13
HicB-F22A-R	AAAATCTGGGAAATGGACAGCATAAGTCGCTTCTGTTCC	14
HicB-T33A-F	GATTTTGAATACTCAGCTACACAAGGAGAGGGGATTTCT	15
HicB-T33A-R	AGAAATCCCCTCTCCTTGTGTAGCTGAGTATTCAAAATC	16
HicB-Q34A-F	TTTGAATACTCAGCTACAGCAGGAGAGGGGATTTCTGAG	17
HicB-Q34A-R	CTCAGAAATCCCCTCTCCTGCTGTAGCTGAGTATTCAAA	18
HicB-E47A-F	GCTTTGGCTATGGGGTCGGCGTGGCTAGGGATAACTGTT	19
HicB-E47A-R	AACAGTTATCCCTAGCCACGCCGACCCCATAGCCAAAGC	20
HicB-F80A-F	TTAATTGATAATGATCCTGCTAAAGATGATGAAGATTTC	21
HicB-F80A-R	GAAATCTTCATCATCTTTAGCAGGATCATTATCAATTAA	22
HicB-T89A-F	GATGAAGATTTCGTGTCAGCCTATGACCTTGATAAATCT	23
HicB-T89A-R	AGATTTATCAAGGTCATAGGCTGACACGAAATCTTCATC	24

실험예 1. HicA 단백질의 RNA 분해 활성 확인

폐렴구균의 HicA 단백질의 RNA 분해 활성을 확인하고, 이를 다른 RNA 분해 활성을 갖는 독소 단백질인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 VapC26 및 VapC30 단백질의 RNA 분해 활성과 비교하였다.

구체적으로, 결핵균의 VapC26 및 VapC30 단백질은 국내 등록특허 제10-1849347호 및 제10-1746160호에 각각 기재된 방법으로 분리 및 정제하였다. 각 단백질의 RNA 분해 활성은 키트(RNase Alert Kit, IDT)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 기질로 사용한 합성 RNA는 양 말단에 각각 형광단(fluorophore)과 소광제(quencher)가 붙어있어, RNA가 분해되면 형광단 및 소광제가 분리되어 490 nm에서 여기(excitation) 후 520 nm에서 형광이 방출된다. 실시예 3에서 정제한 HicA 단백질 4 μM, VapC26 단백질 4 μM, VapC30 단백질 4 μM 또는 RNase A 3 ×10^-5 units을 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl로 구성된 용액에 오염을 방지하기 위해 RNase 억제제(40 units, RiboLock^TM, Thermo Scientific)를 첨가하여 준비한 후, 상기 합성 RNA와 각각 혼합하고, 방출되는 형광을 분광형광계(SPECTRAmax GEMINI XS spectrofluorometer)로 시간에 따라 측정하였다.

그 결과, 일반적인 RNA 분해 효소인 RNase A나 결핵균의 독소 단백질인 VapC26 및 VapC30 단백질에 비하여 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA 단백질의 RNA 분해 활성이 가장 높게 나타났다(도 4).

실험예 2. HicA 단백질의 RNA 분해 활성에 필수적인 히스티딘 잔기 확인

상기 실시예 3에서 정제한 HicA 단백질의 RNA 분해 활성에 필수적인 히스티딘 잔기를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험들을 수행하였다.

2-1. 서열 정렬(sequence alignment) 및 구조 분석

폐렴구균의 HicA 단백질의 아미노산 서열을 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)의 가설 단백질(hypothetical protein), 페스트균의 HicA 단백질, 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)의 HicA 단백질 및 대장균의 HicA 단백질의 아미노산 서열과 함께 클러스탈 오메가 1.2.1(Clustal Omega 1.2.1)을 이용하여 정렬하였고, 이를 에스프리트 3.0(ESPript 3.0)으로 시각화하였다. 또한, 보다 구체적인 비교 분석을 위하여, 상기 비교 단백질 중 아직 구조가 밝혀지지 않은 대장균의 HicA 단백질을 제외한 나머지 단백질들의 구조를 대상으로 달리(DALI)를 이용하여 폐렴구균의 HicA 단백질 구조와의 구조적 유사성을 분석하였다.

그 결과, 모든 HicA 단백질에서 β2 가닥의 히스티딘 잔기가 고도로 보존되어 있었고, β1 및 β2 가닥 사이 루프의 글리신 잔기가 잘 보존되어 있었다(도 5A). 또한, 테르무스 테르모필루스의 가설 단백질(PDB code 1WHZ(사슬 A)), 페스트균의 HicA 단백질(PDB code 4P78(사슬 C 및 D)) 및 버크홀데리아 슈도말레이의 HicA 단백질(PDB code 4C26(사슬 A))의 서열 동등성(sequence identity)은 각각 29%, 34% 및 28%였다(도 5C).

구조 분석 결과, 폐렴구균의 HicA 단백질의 RNA 분해 활성 부위 중 주요 잔기(key residue)인 히스티딘36은 HicB 단백질의 트레오닌33 및 글루타메이트47 잔기와 수소결합을 형성하고, 특히 글루타메이트47 잔기와는 염다리(salt bridge)를 형성함으로써 상호작용함을 확인하였다(도 5B). 또한, 폐렴구균의 HicA 단백질은 이중가닥 RNA 결합 도메인을 형성하는데, RNA가 결합된 이중가닥 RNA 결합 도메인(PDB code 1DI2)에서 α1은 RNA의 작은 홈(minor groove)과 상호작용하고, α2는 RNA의 큰 홈(major groove)과 상호작용함을 확인하였다(도 6).

2-2. HicA 단백질의 히스티딘36이 RNA 분해 활성에 필수적인지 여부 확인

상기 실시예 3 및 4에서 정제한 HicA 단백질 및 HicA-H36A 단백질의 RNA 분해 활성을 측정하여, HicA 단백질의 RNA 분해 활성에 히스티딘36 잔기가 필수적인지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 1, 2, 4 또는 8 μM의 HicA 단백질 및 8 μM의 HicA-H36A 단백질을 합성 RNA와 각각 혼합한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 RNA 분해 활성을 측정하였다.

그 결과, HicA 단백질은 반응 시간 및 처리 농도에 의존적인 RNA 분해 활성을 나타낸 반면, 히스티딘36잔기가 알라닌으로 치환된 HicA-H36A 단백질은 RNA 분해 활성을 전혀 나타내지 못했다(도 7A). 이는 HicA 단백질의 RNA 분해 활성에 있어 히스티딘36 잔기가 필수적임을 제시한다.

2-3. HicA 단백질의 히스티딘36이 세포 독성에 필수적인지 여부 확인

상기 실험예 2-1 및 2-2에서 확인한 결과에 따라, HicA 단백질의 RNA 분해 활성에 따른 세포 독성도 동일한 결과로 나타나는지 확인하기 위하여, HicBA 단백질 복합체, HicA 단백질 또는 HicA-H36A 단백질을 발현하는 세포의 생존율을 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제작한 HicB 및 HicA 유전자를 포함하는 플라스미드들을 대장균 BL21(DE3)에 공-형질전환시키고, 실시예 1-1에서 제작한 HicA 단백질을 발현하는 플라스미드 및 실시예 4에서 제작한 HicA-H36A 단백질을 발현하는 플라스미드를 각각 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 0.1% 글루코스를 포함하는 M9 배지 플레이트에서 자란 형질전환된 세포의 단일 콜로니를 각각 밤새 배양하고, OD₆₀₀값이 0.1이 되도록 희석하였다. 희석된 세포를 세포 현탁액의 OD₆₀₀값이 0.4가 될 때까지 더 배양한 후, 단백질 발현을 유도하기 위하여 0.5 mM IPTG를 첨가하였다. 상기 세포는 IPTG 첨가 후 8시간 동안 37℃에서 더 배양하였고, 1시간 간격으로 흡광도를 측정하여 세포 성장곡선을 수득하였다.

그 결과, HicBA 단백질 복합체를 발현하는 대장균 및 HicA-H36A 단백질을 발현하는 대장균은 대조군과 동일한 성장곡선을 보인 반면, HicA 단백질을 발현하는 대장균은 대조군에 비하여 현저히 낮은 성장곡선을 나타냈다(도 7B). 이는 HicA 단백질이 RNA 분해 활성을 통해 세포 독성을 나타내고, HicBA 단백질 복합체를 형성하면 세포 독성이 중화되며, HicA 단백질의 히스티딘36 잔기가 HicA 단백질의 독성에 필수적임을 제시한다.

실험예 3. HicBA 단백질 복합체 형성에 필수적인 아미노산 잔기 확인

HicBA 단백질 복합체 형성에 필수적인 HicB 단백질의 아미노산 잔기를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험들을 수행하였다.

3-1. HicB 및 HicA 단백질 간의 상호작용 확인

상기 실시예 2에서 수득한 데이터를 분석하여 HicBA 단백질 복합체 내에서의 HicB 및 HicA 단백질 간의 상호작용을 확인하였다.

그 결과, HicBA 단백질 복합체 내에서, HicB 단백질은 HicA 단백질의 1,183 Å²을 차지하고, HicA 단백질 사슬 D의 잔기 중 약 43%가 복합체 형성에 관여하며, HicA 단백질의 전체 표면적 중 약 28%가 결합 부위를 차지함을 확인하였다. 두 단백질 결합부위에서 소수성 상호작용은 HicB 단백질의 페닐알라닌22, 메티오닌44, 페닐알라닌80, 페닐알라닌86 및 티로신90 및 HicA 단백질의 루신50 및 티로신57 잔기에 의하여 이루어지며, 그 중에서도 HicA 단백질의 티로신57 잔기에 의한 방향족성 상호작용이 중요한 역할을 함을 확인하였다(도 8A). 또한, 친수성 상호작용은 HicB 단백질의 아스파르트산12, 알라닌19, 티로신30, 트레오닌33, 글루타민34, 글루타메이트47, 트레오닌89, 글루타메이트106 및 글루타민111 잔기가 HicA 단백질의 아르기닌30, 라이신33, 세린35, 히스티딘36, 라이신38, 글루타메이트53, 아스파라긴55, 라이신56, 티로신57, 트레오닌58 및 글루타민65 잔기와 상호작용함으로써 이루어지며, 특히 HicB 단백질의 아스파르트산12, 글루타메이트47, 아스파르트산55 및 아스파르트산83 잔기와 HicA 단백질의 히스티딘36, 라이신38, 라이신56 및 라이신64 잔기와의 상호작용으로 추가적인 염다리가 형성됨을 확인하였다(도 8B).

3-2. HicBA 단백질 복합체 형성에 필수적인 HicB 단백질의 아미노산 잔기 확인

HicBA 단백질 복합체 형성에 관여하는 HicB 단백질의 아미노산 잔기 중 친수성 상호작용에 관여하는 트레오닌33, 글루타민34, 글루타메이트47 및 트레오닌89 잔기와 소수성 상호작용에 관여하는 페닐알라닌22 및 페닐알라닌80 잔기를 선정하여 상기 잔기를 알라닌으로 치환한 단백질들을 제작하였다.

구체적으로, HicB 단백질을 암호화하는 유전자 SP1786을 주형으로 하고, 상기 표 4에 기재된 프라이머들(서열번호 13 내지 24) 및 부위-특이적 돌연변이 유도 키트(EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit, Enzynomics)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 PCR을 수행함으로써 각 돌연변이 유전자를 수득하고, 이를 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 pET21a에 연결하였다. 상기 실시예 1-1에서 제작한 pET28b-HicA 및 pET21a-HicB를 대장균 BL21(DE3)에 공-형질전환시키고, 실시예 1-1에서 제작한 pET28b-HicA 및 상기 pET21a-HicB 돌연변이체(F22A, T33A, Q34A, E47A, F80A 또는 T89A)를 대장균 BL21(DE3)에 공-형질전환시켰다. 형질전환된 각 세포는 0.5 mM IPTG가 포함된 LB 플레이트에서 37℃ 조건으로 18시간 동안 배양하였다.

배양 세포를 관찰한 결과, 공 벡터를 삽입한 대조군 및 HicBA 단뱁질 복합체를 발현하는 대장균에서는 세포 독성 없이 대장균이 잘 자라났고, HicB 단백질의 돌연변이체 중 T33A, Q34A, F80A 또는 T89A와 HicA 단백질의 복합체를 발현하는 대장균에서는 대조군과 유사하게 세포 독성이 나타나지 않은 반면, HicB 단백질의 돌연변이체 중 F22A 또는 E47A와 HicA 단백질의 복합체를 발현하는 대장균에서 세포 생장이 현저히 억제되었다(도 8C). 이는 HicB 단백질이 HicA 독소 단백질과의 복합체 형성을 통하여 독성을 억제할 때, HicB 단백질의 아미노산 잔기 중 페닐알라닌22 및 글루타메이트47 잔기가 필수적임을 제시한다.

HicA 단백질의 모방 펩타이드 제작

HicA 단백질의 α2 헬릭스 영역인 11개 잔기(라이신56부터 알라닌66까지, KYTERGIRKQA, 서열번호 5)를 포함하고, HicB 단백질과 복합체를 형성하는데 관여하는 7개 잔기(글루타메이트53, 아스파라긴55, 라이신56, 티로신57, 트레오닌58, 라이신64 및 글루타민65)를 포함하는 HicA 단백질 모방 펩타이드 4종을 디자인하고, 애니젠(ANYGEN, http://www.anygen.com)에 의뢰하여 제작하였다(표 5). 펩타이드 제작 시, 단백질 가수분해를 방지하기 위하여 헬릭스 구조를 모방하는 것이 유리하고, 선택성 감소 및 자가 응집(self-aggregation)을 방지하기 위한 최적 길이의 펩타이드를 제작하는 것이 중요하므로, 이를 고려하여 펩타이드를 제작하였다.

펩타이드명	서열	펩타이드 길이(aa)	분자량(Da)	서열번호
펩타이드 I	ELNKYTERGIRKQAG (53-67)^a	15	1,763	1
펩타이드 II	GELNKYTERGIRKQAG (52-67)^a	16	1,820	2
펩타이드 III	ELNKYTERGIRKQAGL (53-68)^a	16	1,876	3
펩타이드 IV	GELNKYTERGIRKQAGL (52-68)^a	17	1,933	4

^a괄호 안의 숫자는 전체 HicA 단백질의 아미노산 서열 중 해당 서열의 아미노산 순서를 나타내는 번호이다.

실험예 4. HicA 단백질 모방 펩타이드의 원평광 이색성(circular dichroism, CD) 확인

상기 실시예 5에서 제작한 HicA 단백질 모방 펩타이드의 CD 분광 분석을 수행하여 각 펩타이드의 헬리시티(helicity)를 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5에서 제작한 펩타이드 I 내지 IV를 각각 25 μM 농도로 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl로 구성된 용액에 용해하고, 20℃에서 1 mm의 광 경로(light path)를 갖는 셀(cell)을 이용하여 분광편광계(Chirascan Plus spectropolarimeter, Applied Photophysics, Ltd.)로 CD 분광 분석을 수행하였다. CD 스캔은 260에서 190 nm까지 1 nm의 밴드 폭으로 측정하였고, 스캔 속도는 100 nm/분이었다. 각 펩타이드의 헬리시티는 평균 잔기 타원율(mean residue ellipticity, [θ]₂₂₂)에 기초하여 정량적으로 측정하였다.

그 결과, 펩타이드 I, II, III 및 IV의 헬리시티는 각각 39.8, 25.5, 25.5 및 33.3%였고, 펩타이드 I이 가장 높은 헬리시티를 나타냈다(도 9C).

실험예 5. HicA 단백질 모방 펩타이드들의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제 효과 확인

상기 실시예 5에서 제작한 HicA 단백질 모방 펩타이드의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제 효과를 확인하기 위하여, HicBA 단백질 복합체에 HicA 단백질 모방 펩타이드를 첨가한 후, RNA 분해 활성을 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 정제한 HicBA 단백질 복합체를 최종 농도 4 μM로 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl로 구성된 용액에 준비하고, 상기 펩타이드 I 내지 IV를 동일한 용매에 최종 농도 4 μM로 하여 HicBA 단백질 복합체와 각각 혼합한 후, 37℃에서 30분간 배양하였다. 이후, 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 RNA 분해 활성을 측정하였다.

그 결과, HicBA 단백질 복합체에 HicA 단백질 모방 펩타이드들의 첨가 시, RNA 분해가 모두 증가하였으며, 그 중 펩타이드 I의 효과가 가장 크게 나타났다(도 9A 및 9B). 이는 상기 HicA 단백질 모방 펩타이드들의 첨가로 HicBA 단백질 복합체 형성이 경쟁적으로 저해됨으로써, 분리된 HicA 단백질이 늘어남에 따라 RNA 분해 정도가 증가한 결과로 해석되며, 펩타이드 I의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제 효과가 가장 우수함을 제시한다.

실험예 6. 펩타이드 I의 HicBA 단백질 복합체 형성 억제 효과 확인

상기 실험예 5에서 가장 우수한 HicBA 단백질 복합체 형성 억제 효과를 확인한 펩타이드 I의 농도 의존적 효과를 RNA 분해 활성을 측정하여 확인하였다.

구체적으로, 펩타이드 I 내지 IV 대신 펩타이드 I을 2, 4, 8 또는 16 μM로 HicBA 단백질 복합체 4 μM과 혼합한 경우와, 상기 실시예 3에서 정제한 HicA 단백질 4 μM 단독의 RNA 분해 활성을 측정한 것을 제외하고는 상기 실험예 5에 기재된 것과 동일한 방법으로 RNA 분해 활성을 측정하였다.

그 결과, HicA 단백질은 RNA 분해 활성을 나타냈고, HicBA 단백질 복합체는 RNA 분해 활성이 전혀 없는 반면, HicBA 단백질 복합체에 펩타이드 I을 첨가한 경우 농도 의존적으로 RNA 분해 활성이 증가하였다(도 10A 및 10B). 이는 펩타이드 I이 HicBA 단백질 복합체 형성을 경쟁적으로 저해하여 분리된 HicA 단백질이 늘어남에 따라 RNA 분해 정도가 증가한 것임을 제시한다.

실험예 7. 펩타이드 I의 항생 활성 확인

펩타이드 I의 항생 활성을 그람 양성 및 음성 세균들에 대한 최소 저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하여 확인하였다.

구체적으로, 하기 표 6에 기재된 그람 양성 균주 3종 및 그람 음성 균주 5종을 각각 0.4 내지 100 μM의 펩타이드 I과 함께 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 세포 생장이 완전히 억제되는 최소 농도를 MIC로 나타내었다.

분류	세균학명	ATCC 번호	MIC(μM)
그람 양성	Bacillus subtilis	6633	6.3 - 12.5
	Staphylococcus aureus	6538p	6.3
	Staphylococcus epidermis	12228	12.5
그람 음성	E. coli	25922	12.5 - 25
	Shigella dysenteriae	9752	25
	Salmonella typhimurium	14028	50
	Klebsiella pneumoniae	10031	6.3
	Pseudomonas aeruginosa	27853	12.5 - 25

^aAmerican Type Culture Collection

그 결과, 총 8종의 세균에 대하여 펩타이드 I은 6.3 내지 50 μM의 MIC를 나타냈고, 황색포도상구균(S. aureus) 및 폐렴막대균(K. pneumoniae)에 대하여 가장 강한 항생 활성을 보였다(표 6).

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Antibiotic peptides targeting toxin-antitoxin system of Streptococcus pneumoniae and use thereof <130> 2018P-07-025 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide I <400> 1 Glu Leu Asn Lys Tyr Thr Glu Arg Gly Ile Arg Lys Gln Ala Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide II <400> 2 Gly Glu Leu Asn Lys Tyr Thr Glu Arg Gly Ile Arg Lys Gln Ala Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide III <400> 3 Glu Leu Asn Lys Tyr Thr Glu Arg Gly Ile Arg Lys Gln Ala Gly Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide IV <400> 4 Gly Glu Leu Asn Lys Tyr Thr Glu Arg Gly Ile Arg Lys Gln Ala Gly 1 5 10 15 Leu <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha 2 region of HicA protein <400> 5 Lys Tyr Thr Glu Arg Gly Ile Arg Lys Gln Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-F <400> 7 ggaattccat atgatgttag ttacgtatcc 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-R <400> 8 ccgctcgagc ggttaggctt gaactttctt atc 33 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicA-F <400> 9 ggaattccat atgatggtgt tgtcaggagg 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicA-R <400> 10 ccgctcgagc ggttacaacc cagcttgctt tc 32 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicA-H36A-F <400> 11 tagaggcggt aaaggctccg ctattaaaat ggaaaagcaa g 41 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicA-H36A-R <400> 12 cttgcttttc cattttaata gcggagcctt taccgcctct a 41 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-F22A-F <400> 13 ggaacagaag cgacttatgc tgtccatttc ccagatttt 39 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-F22A-R <400> 14 aaaatctggg aaatggacag cataagtcgc ttctgttcc 39 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-T33A-F <400> 15 gattttgaat actcagctac acaaggagag gggatttct 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-T33A-R <400> 16 agaaatcccc tctccttgtg tagctgagta ttcaaaatc 39 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-Q34A-F <400> 17 tttgaatact cagctacagc aggagagggg atttctgag 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-Q34A-R <400> 18 ctcagaaatc ccctctcctg ctgtagctga gtattcaaa 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-E47A-F <400> 19 gctttggcta tggggtcggc gtggctaggg ataactgtt 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-E47A-R <400> 20 aacagttatc cctagccacg ccgaccccat agccaaagc 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-F80A-F <400> 21 ttaattgata atgatcctgc taaagatgat gaagatttc 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-F80A-R <400> 22 gaaatcttca tcatctttag caggatcatt atcaattaa 39 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-T89A-F <400> 23 gatgaagatt tcgtgtcagc ctatgacctt gataaatct 39 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HicB-T89A-R <400> 24 agatttatca aggtcatagg ctgacacgaa atcttcatc 39

Claims

서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 폐렴구균의 독소-항독소 결합체인 HicBA 복합체의 형성을 억제하는 항생 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA의 아미노산 잔기 56-66에 해당하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 α2 영역이 항독소 단백질 HicB와 결합하는 것을 억제하는, 항생 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않는, 항생 펩타이드.
제1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 폐렴구균의 독소 단백질인 HicA의 아미노산 잔기 56-66에 해당하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 α2 영역이 항독소 단백질 HicB와 결합하는 것을 억제하는, 항생용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 폐렴구균, 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(S. epidermidis), 대장균(Escherichia coli), 이질균(Shigella dysenteriae), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대한 항생 활성을 나타내는 것인, 항생용 조성물.
제1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 의약외품.
제1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생용 외용제.