JPH10309194A - トポイソメラーゼｉ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なトポイソメラーゼＩおよび該タンパク
質をコードするＤＮＡが望まれている。 【解決手段】 本発明は （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から６９１を有してな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
質をコードするＤＮＡが望まれている。 【解決手段】 本発明は （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から６９１を有してな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本特許出願は、１９９６年１
０月８日に提出された米国仮特許出願番号６０／０２７
９７３号の利益を享受する。本発明は、一つに、新規に
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導
体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、および
その変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよ
びアンタゴニストの使用に関するものである。特に、こ
れらの点および他の点に関して、本発明は、細菌性「ト
ポイソメラーゼＩ」のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドに関する。
０月８日に提出された米国仮特許出願番号６０／０２７
９７３号の利益を享受する。本発明は、一つに、新規に
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導
体；該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチド、および
その変種および誘導体の製造方法；該ポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよ
びアンタゴニストの使用に関するものである。特に、こ
れらの点および他の点に関して、本発明は、細菌性「ト
ポイソメラーゼＩ」のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドに関する。
【０００２】
【従来の技術】さらに効果的な抗生物質は、細菌性遺伝
子の発現、制御または活性の共通するモードを妨害する
ものである。近年、ＤＮＡのスーパーコイリングが毒性
遺伝子制御の一つの様式であり得ることが示唆された。
スーパーコイリングに因るＤＮＡ密度の局所的な増加ま
たは減少は、温度、嫌気生活、および重量オスモル濃度
のごとき種々環境条件に関係している。空間的に構成さ
れた遺伝子のスーパーコイリングの増加または減少によ
る、遺伝子群の転写装置の構成要素に対する影響を適宜
制御することにより、かかる環境条件に対する感染性病
原体の有効な応答が示されるかもしれない。１型トポイ
ソメラーゼおよびＤＮＡジラーゼ（ＤＮＡgyrase）を含
む、ＤＮＡスーパーコイリングのレベルに影響するよう
に作用する、ＤＮＡトポイソメラーゼなどの酵素が同定
されている。かかる酵素は潜在的抗生物質としての化合
物をスクリーニングするための有用な標的に相当する。
子の発現、制御または活性の共通するモードを妨害する
ものである。近年、ＤＮＡのスーパーコイリングが毒性
遺伝子制御の一つの様式であり得ることが示唆された。
スーパーコイリングに因るＤＮＡ密度の局所的な増加ま
たは減少は、温度、嫌気生活、および重量オスモル濃度
のごとき種々環境条件に関係している。空間的に構成さ
れた遺伝子のスーパーコイリングの増加または減少によ
る、遺伝子群の転写装置の構成要素に対する影響を適宜
制御することにより、かかる環境条件に対する感染性病
原体の有効な応答が示されるかもしれない。１型トポイ
ソメラーゼおよびＤＮＡジラーゼ（ＤＮＡgyrase）を含
む、ＤＮＡスーパーコイリングのレベルに影響するよう
に作用する、ＤＮＡトポイソメラーゼなどの酵素が同定
されている。かかる酵素は潜在的抗生物質としての化合
物をスクリーニングするための有用な標的に相当する。
【０００３】ＤＮＡトポイソメラーゼによるＤＮＡ形質
転換は、一本鎖または二本鎖のどちらかの開裂により達
成される。かかる形質転換により得られる連結番号（Li
nking number：Ｌｋ）におけるユニット変化が２種のト
ポイソメラーゼの間の最も操作しやすい違いである
（P．O.Brown & N.R.Cozzarelli、Science 206:1081-10
83（1979））。連結番号（Ｌｋ）は一本の鎖がもう一本
の鎖に広がる表面と交差する時間の代数である。一過性
の一本鎖切断を介して反応が進行し、Ｌｋが一段階にて
変化するＤＮＡトポイソメラーゼは１型と分類され、二
本鎖切断を介して反応が進行し、Ｌｋが二段階にて変化
する酵素は２型と分類される。
転換は、一本鎖または二本鎖のどちらかの開裂により達
成される。かかる形質転換により得られる連結番号（Li
nking number：Ｌｋ）におけるユニット変化が２種のト
ポイソメラーゼの間の最も操作しやすい違いである
（P．O.Brown & N.R.Cozzarelli、Science 206:1081-10
83（1979））。連結番号（Ｌｋ）は一本の鎖がもう一本
の鎖に広がる表面と交差する時間の代数である。一過性
の一本鎖切断を介して反応が進行し、Ｌｋが一段階にて
変化するＤＮＡトポイソメラーゼは１型と分類され、二
本鎖切断を介して反応が進行し、Ｌｋが二段階にて変化
する酵素は２型と分類される。
【０００４】２型トポイソメラーゼファミリーのメンバ
ーは、ＤＮＡジラーゼ、細菌性トポイソメラーゼＩＶ、
Ｔ−線状ＤＮＡトポイソメラーゼ、真核生物ＤＮＡトポ
イソメラーゼＩＩおよびサルフォロバス・アシドカルダ
リウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の好熱性ト
ポイソメラーゼＩＩを包含する（A.Kikuchiら、Syst.Ap
pl.Microbiol.7:72-78（1986）；J.Katoら、J.Biol.Che
m.267:25676-25684（1992）；W.M.Huang、ＤＮＡトポロ
ジーおよびその生物学的効果（N.R.CozzarelliおよびJ.
C.Wang編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、ニューヨーク）264-284（1990）；T.-S.
Hsich、ＤＮＡトポロジーおよびその生物学的効果（N.
R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク）24
3-263（1990）を参照のこと）。１２ほどの２型酵素の
コーディング配列が決定されており、そのデータにより
これらの全ての酵素は進化的および構造的に関連してい
ることが示唆される。２型トポイソメラーゼにより触媒
されるトポロジー反応にはＤＮＡ（ＤＮＡジラーゼ）へ
の陰性スーパーコイルの導入、スーパーコイル化ＤＮＡ
の緩和、らせん環の鎖状化（脱鎖状化）、ＤＮＡの結節
および未結節を包含する。
ーは、ＤＮＡジラーゼ、細菌性トポイソメラーゼＩＶ、
Ｔ−線状ＤＮＡトポイソメラーゼ、真核生物ＤＮＡトポ
イソメラーゼＩＩおよびサルフォロバス・アシドカルダ
リウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の好熱性ト
ポイソメラーゼＩＩを包含する（A.Kikuchiら、Syst.Ap
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C.Wang編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、ニューヨーク）264-284（1990）；T.-S.
Hsich、ＤＮＡトポロジーおよびその生物学的効果（N.
R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク）24
3-263（1990）を参照のこと）。１２ほどの２型酵素の
コーディング配列が決定されており、そのデータにより
これらの全ての酵素は進化的および構造的に関連してい
ることが示唆される。２型トポイソメラーゼにより触媒
されるトポロジー反応にはＤＮＡ（ＤＮＡジラーゼ）へ
の陰性スーパーコイルの導入、スーパーコイル化ＤＮＡ
の緩和、らせん環の鎖状化（脱鎖状化）、ＤＮＡの結節
および未結節を包含する。
【０００５】１型トポイソメラーゼのファミリーは、細
菌性トポイソメラーゼＩ、イー・コリ（E.coli）トポイ
ソメラーゼＩＩＩ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ（R.A.Kim & J.C.Wang、J.B
iol.Chem.267:17178-17185（1992））、ヒトトポイソメ
ラーゼＩＩＩ（Hanaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:3653-
3657（1996））、細菌性酵素に正確に類似した葉緑体由
来の１型トポイソメラーゼ（J.Siedleckiら、Nucleic A
cids Res.11:1523-1536（1983）、好熱性逆ジラーゼ
（A.Kikuchi、ＤＮＡ「ＤＮＡトポロジーおよびその生
物学的効果」（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、
ニューヨーク）285-298（1990）：C.Bouthier de la To
urら、J.Bact.173:3921-3923（1991））、好熱性ディー
・アミロリティカス（D.amylolyticus）トポイソメラー
ゼＩＩＩ（A.I.Slesarvら、J.Biol.Chem.266:12321-123
28（1991））、核トポイソメラーゼＩおよびミトコンド
リアおよびポックスウイルス由来の正確に関連する酵素
（N.Osheroff、Pharmac.Ther.41:223-241（1989））か
らなる。触媒機構に関して、これらのトポイソメラーゼ
は二つの群に分けられる。Ａ群は作用するのに２価のカ
チオンを必要とし、５’リン酸末端で一過性の共有結合
性複合体を形成する酵素からなる（原核生物性１型トポ
イソメラーゼ、エス・セレヴィシア（S.cerevisiae）ト
ポイソメラーゼＩＩＩ、およびヒトトポイソメラーゼＩ
ＩＩ）。Ｂ群は、作用するのに２価のカチオンを必要と
せず、３’リン酸末端で一過性の共有結合する１型トポ
イソメラーゼを含む（核トポイソメラーゼＩ、共通して
真核生物性トポイソメラーゼＩと称せられるミトコンド
リアおよびポックスウイルスに由来する酵素）。１型ト
ポイソメラーゼは以下のトポロジー反応を実施できる：
これらはスーパーコイル化したＤＮＡ（逆ジラーゼを除
く）を緩和し、少なくとも一つの分子がニックまたはギ
ャップを含有する場合、一本鎖環状ＤＮＡまたはらせん
を鎖状化（脱鎖状化）するか、または1本鎖環と相互作
用し、トポロジーカルな結節を導入する（１型−Ａ群ト
ポイソメラーゼ）。１型−Ａ群トポイソメラーゼに属す
る逆ジラーゼはｃＤＮＡに陽性スーパーコイルを導入で
きる唯一のトポイソメラーゼである。
菌性トポイソメラーゼＩ、イー・コリ（E.coli）トポイ
ソメラーゼＩＩＩ、エス・セレヴィシア（S.cerevisia
e）トポイソメラーゼＩＩＩ（R.A.Kim & J.C.Wang、J.B
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ラーゼＩＩＩ（Hanaiら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:3653-
3657（1996））、細菌性酵素に正確に類似した葉緑体由
来の１型トポイソメラーゼ（J.Siedleckiら、Nucleic A
cids Res.11:1523-1536（1983）、好熱性逆ジラーゼ
（A.Kikuchi、ＤＮＡ「ＤＮＡトポロジーおよびその生
物学的効果」（N.R.CozzarelliおよびJ.C.Wang編、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、
ニューヨーク）285-298（1990）：C.Bouthier de la To
urら、J.Bact.173:3921-3923（1991））、好熱性ディー
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ゼＩＩＩ（A.I.Slesarvら、J.Biol.Chem.266:12321-123
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（N.Osheroff、Pharmac.Ther.41:223-241（1989））か
らなる。触媒機構に関して、これらのトポイソメラーゼ
は二つの群に分けられる。Ａ群は作用するのに２価のカ
チオンを必要とし、５’リン酸末端で一過性の共有結合
性複合体を形成する酵素からなる（原核生物性１型トポ
イソメラーゼ、エス・セレヴィシア（S.cerevisiae）ト
ポイソメラーゼＩＩＩ、およびヒトトポイソメラーゼＩ
ＩＩ）。Ｂ群は、作用するのに２価のカチオンを必要と
せず、３’リン酸末端で一過性の共有結合する１型トポ
イソメラーゼを含む（核トポイソメラーゼＩ、共通して
真核生物性トポイソメラーゼＩと称せられるミトコンド
リアおよびポックスウイルスに由来する酵素）。１型ト
ポイソメラーゼは以下のトポロジー反応を実施できる：
これらはスーパーコイル化したＤＮＡ（逆ジラーゼを除
く）を緩和し、少なくとも一つの分子がニックまたはギ
ャップを含有する場合、一本鎖環状ＤＮＡまたはらせん
を鎖状化（脱鎖状化）するか、または1本鎖環と相互作
用し、トポロジーカルな結節を導入する（１型−Ａ群ト
ポイソメラーゼ）。１型−Ａ群トポイソメラーゼに属す
る逆ジラーゼはｃＤＮＡに陽性スーパーコイルを導入で
きる唯一のトポイソメラーゼである。
【０００６】ＤＮＡトポイソメラーゼに関する研究は、
ＤＮＡ酵素学から開発療法へと進歩している。細菌性Ｄ
ＮＡトポイソメラーゼＩＩはキノロン抗生物質の治療上
重要な標的である；哺乳動物ＤＮＡトポイソメラーゼＩ
Ｉは多くの強力な抗腫瘍薬の細胞性標的である（K.Drli
ca、Microbiol.Rev.48:273-289（1984）およびBiochemi
stry 27:2253-2259（1988）；B.S.Glisson & W.E.Ros
s、Pharmacol.Ther.32:89-106（1987）；A.L.Bodley &
L.F.Liu、Biotechnology 6:1315-1319（1988）；L.F.Li
u、Annu.Rev.Biochem.58:351-375（1989））。トポイソ
メラーゼＩＩ毒と称するこれらの薬物は、開裂可能な複
合体と称する主要な共有結合反応中間体を捕捉すること
により、ＩＩ型トポイソメラーゼの切断−再結合反応を
妨害する。哺乳動物トポイソメラーゼＩは、これもまた
共有結合反応中間体を捕捉する抗腫瘍薬トポテカン（米
国特許番号第５００４７５８号）の細胞性標的である。
ＤＮＡ酵素学から開発療法へと進歩している。細菌性Ｄ
ＮＡトポイソメラーゼＩＩはキノロン抗生物質の治療上
重要な標的である；哺乳動物ＤＮＡトポイソメラーゼＩ
Ｉは多くの強力な抗腫瘍薬の細胞性標的である（K.Drli
ca、Microbiol.Rev.48:273-289（1984）およびBiochemi
stry 27:2253-2259（1988）；B.S.Glisson & W.E.Ros
s、Pharmacol.Ther.32:89-106（1987）；A.L.Bodley &
L.F.Liu、Biotechnology 6:1315-1319（1988）；L.F.Li
u、Annu.Rev.Biochem.58:351-375（1989））。トポイソ
メラーゼＩＩ毒と称するこれらの薬物は、開裂可能な複
合体と称する主要な共有結合反応中間体を捕捉すること
により、ＩＩ型トポイソメラーゼの切断−再結合反応を
妨害する。哺乳動物トポイソメラーゼＩは、これもまた
共有結合反応中間体を捕捉する抗腫瘍薬トポテカン（米
国特許番号第５００４７５８号）の細胞性標的である。
【０００７】前記したように、細菌性Ｉ型トポイソメラ
ーゼ（トポイソメラーゼＩ＆ＩＩＩ）はＤＮＡトポロジ
ーを変化させる酵素であり、複製、転写および組換えを
含め、多くの極めて重要な細胞性工程に関与する（Lutt
inger,A.、Molecular Microbiol.15(4):601-608（199
5））。これらの酵素は一過性のＤＮＡ一本鎖を切断
し、裂け目にＤＮＡ一本鎖または二本鎖を通し、最終的
に裂け目を再閉する。ＤＮＡ基質の開裂により、酵素の
チロシン残基およびＤＮＡ鎖の開裂部位における５’間
の共有結合が形成される（Roca,J.A.、TTBS 20:156-160
（1995））。
ーゼ（トポイソメラーゼＩ＆ＩＩＩ）はＤＮＡトポロジ
ーを変化させる酵素であり、複製、転写および組換えを
含め、多くの極めて重要な細胞性工程に関与する（Lutt
inger,A.、Molecular Microbiol.15(4):601-608（199
5））。これらの酵素は一過性のＤＮＡ一本鎖を切断
し、裂け目にＤＮＡ一本鎖または二本鎖を通し、最終的
に裂け目を再閉する。ＤＮＡ基質の開裂により、酵素の
チロシン残基およびＤＮＡ鎖の開裂部位における５’間
の共有結合が形成される（Roca,J.A.、TTBS 20:156-160
（1995））。
【０００８】共有結合−酵素−ＤＮＡ複合体（開裂可能
な複合体）を安定化させる酵素阻害は染色体損傷および
細菌細胞死を引き起こす。さらに、この機構は１回の阻
害により細胞死を引き起こす潜在力を有する。開裂可能
な複合体を安定化することにより作用する、特に活性部
位の領域におけるトポイソメラーゼＩおよびＩＩＩのア
ミノ酸配列が広範に類似しているために、分子量の小さ
い阻害物質はトポイソメラーゼＩおよびＩＩＩの両方で
作用できる。点突然変異から生じるかかる薬物に対する
抵抗性が、将来的に高レベルになる可能性を低く抑える
ことができる。
な複合体）を安定化させる酵素阻害は染色体損傷および
細菌細胞死を引き起こす。さらに、この機構は１回の阻
害により細胞死を引き起こす潜在力を有する。開裂可能
な複合体を安定化することにより作用する、特に活性部
位の領域におけるトポイソメラーゼＩおよびＩＩＩのア
ミノ酸配列が広範に類似しているために、分子量の小さ
い阻害物質はトポイソメラーゼＩおよびＩＩＩの両方で
作用できる。点突然変異から生じるかかる薬物に対する
抵抗性が、将来的に高レベルになる可能性を低く抑える
ことができる。
【０００９】Ｉ型トポメラーゼの阻害物質は、例えば、
ＤＮＡとの共有結合複合体においてタンパク質を安定化
できるものであり、細菌に対して致死的または抑制的で
あり、そのため抗細菌治療においてる有用である。スタ
フィロコッカス属遺伝子および遺伝子生成物を抗生物質
の開発のための標的として用いることは特に好ましいこ
とである。スタフィロコッカス属は微生物の医学的に重
要な属を成している。これらは浸潤性および毒素性の二
つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤性感
染は一般に皮膚表面および組織深部に影響する膿瘍を形
成する特徴がある。エス・アウレウス（S.aureus）は癌
患者における菌血症の２次誘発原因である。骨髄炎、敗
血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心
内膜炎もまた比較的一般的である。スタフィロコッカス
属の毒素特性の結果、少なくとも３種の臨床症状があ
る。これらの疾病の出現は、組織浸潤および菌血症に対
抗するように、外毒素の作用をもたらす。これらの症状
は：スタフィロコッカス食中毒、熱傷様皮膚症候群およ
びトキシックショック症候群を包含する。
ＤＮＡとの共有結合複合体においてタンパク質を安定化
できるものであり、細菌に対して致死的または抑制的で
あり、そのため抗細菌治療においてる有用である。スタ
フィロコッカス属遺伝子および遺伝子生成物を抗生物質
の開発のための標的として用いることは特に好ましいこ
とである。スタフィロコッカス属は微生物の医学的に重
要な属を成している。これらは浸潤性および毒素性の二
つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤性感
染は一般に皮膚表面および組織深部に影響する膿瘍を形
成する特徴がある。エス・アウレウス（S.aureus）は癌
患者における菌血症の２次誘発原因である。骨髄炎、敗
血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心
内膜炎もまた比較的一般的である。スタフィロコッカス
属の毒素特性の結果、少なくとも３種の臨床症状があ
る。これらの疾病の出現は、組織浸潤および菌血症に対
抗するように、外毒素の作用をもたらす。これらの症状
は：スタフィロコッカス食中毒、熱傷様皮膚症候群およ
びトキシックショック症候群を包含する。
【００１０】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、ポリペプチド、とりわけ図２（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列およびバシラス・サチリス（Bacillus s
ubtilis）トポイソメラーゼＩ（これは図２の配列に対
して同一性６８％、類似性８０％である）などの他のタ
ンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性により、新規ト
ポイソメラーゼＩとして同定されたポリペプチドを提供
することである。本発明のさらなる目的は、さらに、ト
ポイソメラーゼＩをコードするポリヌクレオチド、特に
本明細書において細菌性トポイソメラーゼＩと称するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するこ
とである。
は、ポリペプチド、とりわけ図２（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列およびバシラス・サチリス（Bacillus s
ubtilis）トポイソメラーゼＩ（これは図２の配列に対
して同一性６８％、類似性８０％である）などの他のタ
ンパク質の既知アミノ酸配列間の相同性により、新規ト
ポイソメラーゼＩとして同定されたポリペプチドを提供
することである。本発明のさらなる目的は、さらに、ト
ポイソメラーゼＩをコードするポリヌクレオチド、特に
本明細書において細菌性トポイソメラーゼＩと称するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するこ
とである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号：１）に示す配列における、トポイソメラー
ゼＩをコードする領域を有する。本発明の別の特に好ま
しい具体例には、（配列番号：２）のアミノ酸配列を含
んでなるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco
ccus aureus）由来の新規トポイソメラーゼＩタンパク
質、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体が
ある。本発明のこの態様によれば、寄託株ＮＣＩＭＢ４
０７７１に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）ポリヌクレオチドにより発
現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が
提供される。
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号：１）に示す配列における、トポイソメラー
ゼＩをコードする領域を有する。本発明の別の特に好ま
しい具体例には、（配列番号：２）のアミノ酸配列を含
んでなるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco
ccus aureus）由来の新規トポイソメラーゼＩタンパク
質、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体が
ある。本発明のこの態様によれば、寄託株ＮＣＩＭＢ４
０７７１に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）ポリヌクレオチドにより発
現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が
提供される。
【００１２】本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは
治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、ま
たは変種、アナログもしくは誘導体のフラグメントを含
め、そのフラグメントを包含する、トポイソメラーゼ
Ｉ、特にスタフィロコッカス・トポイソメラーゼＩをコ
ードする単離された核酸分子が提供される。本発明のこ
の態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラーゼＩ
の天然の対立遺伝子変種がある。
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断学的、臨床的もしくは
治療的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体、ま
たは変種、アナログもしくは誘導体のフラグメントを含
め、そのフラグメントを包含する、トポイソメラーゼ
Ｉ、特にスタフィロコッカス・トポイソメラーゼＩをコ
ードする単離された核酸分子が提供される。本発明のこ
の態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラーゼＩ
の天然の対立遺伝子変種がある。
【００１３】本発明のこの態様によれば、本明細書にお
いてトポイソメラーゼＩと称されるスタフィロコッカス
属起源の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学
的、もしくは治療的に有用なそのフラグメント、および
前記した変種、誘導体およびアナログ、およびそのフラ
グメントが提供される。治療を目的として、例えば、ス
タフィロコッカス感染などの細菌感染に対して宿主に免
疫を付与することによる治療を含め、疾患を治療するの
に用いることができるトポイソメラーゼＩポリペプチ
ド、特に細菌性トポイソメラーゼＩポリペプチドを提供
することも本発明の目的である。
いてトポイソメラーゼＩと称されるスタフィロコッカス
属起源の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学
的、もしくは治療的に有用なそのフラグメント、および
前記した変種、誘導体およびアナログ、およびそのフラ
グメントが提供される。治療を目的として、例えば、ス
タフィロコッカス感染などの細菌感染に対して宿主に免
疫を付与することによる治療を含め、疾患を治療するの
に用いることができるトポイソメラーゼＩポリペプチ
ド、特に細菌性トポイソメラーゼＩポリペプチドを提供
することも本発明の目的である。
【００１４】本発明のさらなる態様によれば、治療また
は予防を目的として、例えば抗菌剤またはワクチンとし
ての、本発明のポリペプチド、とりわけそのフラグメン
トの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、治
療または予防を目的として、特に遺伝的免疫における、
本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラー
ゼＩ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるトポ
イソメラーゼＩの変種がある。
は予防を目的として、例えば抗菌剤またはワクチンとし
ての、本発明のポリペプチド、とりわけそのフラグメン
トの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、治
療または予防を目的として、特に遺伝的免疫における、
本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例には、トポイソメラー
ゼＩ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコードされるトポ
イソメラーゼＩの変種がある。
【００１５】本発明の別の目的は、前記のポリペプチ
ド、ポリペプチドのフラグメント、変種および誘導体、
その変種および誘導体のフラグメント、並びに前記した
ものの類似体の製造方法を提供することである。本発明
のこの態様の好ましい具体例では、外因的に誘導された
トポイソメラーゼＩのコード化ポリヌクレオチドを発現
可能なように挿入した宿主細胞を、宿主においてトポイ
ソメラーゼＩを発現するような条件下で培養し、次いで
発現したポリペプチドを回収することからなる、前記し
たトポイソメラーゼＩポリペプチドの製造方法を提供す
る。
ド、ポリペプチドのフラグメント、変種および誘導体、
その変種および誘導体のフラグメント、並びに前記した
ものの類似体の製造方法を提供することである。本発明
のこの態様の好ましい具体例では、外因的に誘導された
トポイソメラーゼＩのコード化ポリヌクレオチドを発現
可能なように挿入した宿主細胞を、宿主においてトポイ
ソメラーゼＩを発現するような条件下で培養し、次いで
発現したポリペプチドを回収することからなる、前記し
たトポイソメラーゼＩポリペプチドの製造方法を提供す
る。
【００１６】本発明の別の目的によれば、とりわけ研
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組成
物、工程および方法が提供される。本発明のさらに別の
態様によれば、抗菌剤として有用なかかるポリペプチド
の阻害物質が提供される。特にかかるポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明のこの態様および他の態
様のある種の好ましい具体例によれば、細菌感染を検出
するのに有用な、細菌性トポイソメラーゼＩ配列にハイ
ブリダイゼーションするプローブが提供される。
究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組成
物、工程および方法が提供される。本発明のさらに別の
態様によれば、抗菌剤として有用なかかるポリペプチド
の阻害物質が提供される。特にかかるポリペプチドに対
する抗体が提供される。本発明のこの態様および他の態
様のある種の好ましい具体例によれば、細菌感染を検出
するのに有用な、細菌性トポイソメラーゼＩ配列にハイ
ブリダイゼーションするプローブが提供される。
【００１７】本発明のある種のさらなる好ましい具体例
では、トポイソメラーゼＩポリペプチドに対する抗体が
提供される。この点における特に好ましい具体例では、
その抗体はスタフィロコッカス・トポイソメラーゼＩに
対して選択的である。本発明の別の態様によれば、トポ
イソメラーゼＩアゴニストが提供される。好ましいアゴ
ニストには、トポイソメラーゼＩ結合分子に結合し、ト
ポイソメラーゼＩ誘起反応を惹起または増強する、トポ
イソメラーゼＩを模倣する分子がある。また、好ましい
アゴニストには、トポイソメラーゼＩをコードする遺伝
子もしくはトポイソメラーゼＩポリペプチド、または他
のトポイソメラーゼＩ活性のモジュレーターと相互作用
し、それにより、１またはそれ以上のトポイソメラーゼ
Ｉの効果を強化または増強する分子があり、好ましくは
静菌性または殺菌性でもある。
では、トポイソメラーゼＩポリペプチドに対する抗体が
提供される。この点における特に好ましい具体例では、
その抗体はスタフィロコッカス・トポイソメラーゼＩに
対して選択的である。本発明の別の態様によれば、トポ
イソメラーゼＩアゴニストが提供される。好ましいアゴ
ニストには、トポイソメラーゼＩ結合分子に結合し、ト
ポイソメラーゼＩ誘起反応を惹起または増強する、トポ
イソメラーゼＩを模倣する分子がある。また、好ましい
アゴニストには、トポイソメラーゼＩをコードする遺伝
子もしくはトポイソメラーゼＩポリペプチド、または他
のトポイソメラーゼＩ活性のモジュレーターと相互作用
し、それにより、１またはそれ以上のトポイソメラーゼ
Ｉの効果を強化または増強する分子があり、好ましくは
静菌性または殺菌性でもある。
【００１８】本発明のさらに別の態様によれば、トポイ
ソメラーゼＩアンタゴニストが提供される。好ましいア
ンタゴニストには、トポイソメラーゼＩに結合し、トポ
イソメラーゼＩ結合分子の結合を阻害するか、またはト
ポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩ結合分子の
間で形成される複合体を安定化し、トポイソメラーゼＩ
から生じるさらなる生物学的活性を防御するアンタゴニ
ストがある。また好ましいアンタゴニストには、トポイ
ソメラーゼＩに結合するかまたは相互作用し、１または
それ以上のトポイソメラーゼＩの効果を阻害するか、ま
たはトポイソメラーゼＩの発現を妨げ、また好ましくは
静菌性または殺菌性でもある分子がある。
ソメラーゼＩアンタゴニストが提供される。好ましいア
ンタゴニストには、トポイソメラーゼＩに結合し、トポ
イソメラーゼＩ結合分子の結合を阻害するか、またはト
ポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩ結合分子の
間で形成される複合体を安定化し、トポイソメラーゼＩ
から生じるさらなる生物学的活性を防御するアンタゴニ
ストがある。また好ましいアンタゴニストには、トポイ
ソメラーゼＩに結合するかまたは相互作用し、１または
それ以上のトポイソメラーゼＩの効果を阻害するか、ま
たはトポイソメラーゼＩの発現を妨げ、また好ましくは
静菌性または殺菌性でもある分子がある。
【００１９】本発明のさらなる態様では、インビトロで
細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、
または多細胞生物に投与するための、トポイソメラーゼ
ＩポリヌクレオチドまたはトポイソメラーゼＩポリペプ
チドを含んでなる組成物を提供する。本発明のこの態様
のある種の好ましい具体例において、該組成物は、宿主
生物においてトポイソメラーゼＩポリペプチドを発現
し、免疫学的応答、好ましくはスタフィロコッカスまた
は関連生物に対するかかる宿主の免疫性を亢進させるた
めのトポイソメラーゼＩポリヌクレオチドを含んでな
る。
細胞に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、
または多細胞生物に投与するための、トポイソメラーゼ
ＩポリヌクレオチドまたはトポイソメラーゼＩポリペプ
チドを含んでなる組成物を提供する。本発明のこの態様
のある種の好ましい具体例において、該組成物は、宿主
生物においてトポイソメラーゼＩポリペプチドを発現
し、免疫学的応答、好ましくはスタフィロコッカスまた
は関連生物に対するかかる宿主の免疫性を亢進させるた
めのトポイソメラーゼＩポリヌクレオチドを含んでな
る。
【００２０】本発明のその他の目的、特徴、利点および
態様は、以下の記載より当業者に明らかとなろう。しか
しながら、以下の記載および明確な実施例は、本発明の
好ましい具体例を示すものであり、単に説明として示さ
れるものであると認識すべきである。開示した本発明の
精神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の
記載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読む
ことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
態様は、以下の記載より当業者に明らかとなろう。しか
しながら、以下の記載および明確な実施例は、本発明の
好ましい具体例を示すものであり、単に説明として示さ
れるものであると認識すべきである。開示した本発明の
精神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の
記載を読むこと、および本明細書のその他の部分を読む
ことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００２１】
定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるトポイソメラーゼＩ結
合分子は、本発明のトポイソメラーゼＩポリペプチドま
たはポリヌクレオチドと特異的に結合または相互作用す
る分子またはイオンを意味し、例えばスーパーコイル化
ＤＮＡなどの酵素基質、細胞膜成分および古典的なレセ
プターを包含する。本発明のポリペプチドと、結合また
は相互作用分子等の分子間の結合は、本発明のポリペプ
チドに対して独占的であり、これは好ましく、またはそ
の結合は本発明のポリペプチドに高度に特異的であり、
これもまた好ましく、その結合は本発明のポリペプチド
を包含するタンパク質群に高度に特異的であり、これは
好ましく、または少なくとも一つが本発明のポリペプチ
ドを包含するいくつかのタンパク質群に特異的である。
結合分子はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合
する抗体および抗体由来の物質をも包含する。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定する
ものではない。本明細書で用いるトポイソメラーゼＩ結
合分子は、本発明のトポイソメラーゼＩポリペプチドま
たはポリヌクレオチドと特異的に結合または相互作用す
る分子またはイオンを意味し、例えばスーパーコイル化
ＤＮＡなどの酵素基質、細胞膜成分および古典的なレセ
プターを包含する。本発明のポリペプチドと、結合また
は相互作用分子等の分子間の結合は、本発明のポリペプ
チドに対して独占的であり、これは好ましく、またはそ
の結合は本発明のポリペプチドに高度に特異的であり、
これもまた好ましく、その結合は本発明のポリペプチド
を包含するタンパク質群に高度に特異的であり、これは
好ましく、または少なくとも一つが本発明のポリペプチ
ドを包含するいくつかのタンパク質群に特異的である。
結合分子はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合
する抗体および抗体由来の物質をも包含する。
【００２２】「遺伝的エレメント」は、一般に、ポリペ
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として複製するベクター内に含まれていてもよい。これ
らはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝的エレメ
ントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単離、クロー
ニングおよび宿主細胞への導入のような操作の後に、精
製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはとりわけベク
ター内にも含まれ得る。
プチドをコードする領域、もしくは複製、転写もしくは
翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現す
るのに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド
領域を有してなるポリヌクレオチド、またはポリペプチ
ドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発
現を制御する領域の両方を有してなるポリヌクレオチド
を意味する。遺伝的エレメントは、エピソームエレメン
ト、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子
として複製するベクター内に含まれていてもよい。これ
らはプラスミド内に含まれていてもよい。遺伝的エレメ
ントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単離、クロー
ニングおよび宿主細胞への導入のような操作の後に、精
製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはとりわけベク
ター内にも含まれ得る。
【００２３】「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクトされ得る細
胞である。当該分野にて周知であるように「同一性」
は、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または二
つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であ
り、配列を比較して決定する。当該分野において、「同
一性」とはまた、時には、かかる配列の鎖の間の合致に
より決定されるようなポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」お
よび「類似性」は公知手段により容易に算出できる（Co
mputational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オック
スフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨー
ク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome P
rojects，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニュ
ーヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence Da
ta，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒ
ューマナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequen
ce Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、
アカデミック・プレス、1987年；およびSequence Analy
sis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍスト
ックトン・プレス、ニューヨーク、1991年；およびＣar
illo,Ｈ、およびＬipman,Ｄ.，ＳＩＡＭ，Ｊ.Ａpplied
Ｍath.,48：1073（1988））。同一性を決定するため
の好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適合する
ように設計される。同一性および類似性を測定する方法
は、コンピュータープログラムで集成されている。二つ
の配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコン
ピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケー
ジ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):38
7（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.
ら、J.Molec.Biol.215:403−410（1990）））を包含す
るが、これらに限定するものではない。ＢＬＡＳＴ Ｘ
プログラムはＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に手に
入れることができる（BLAST Manual, Altschul, S., et
al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altschul,
S., et al., J. Mol.Biol. 215:403-410(1990)）。一例
として、例えば、配列番号：１の参照ポリヌクレオチド
配列と少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドは、そのポリヌクレ
オチド配列が配列番号：１の参照ヌクレオチド配列の各
１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を有し
てもよいことを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレ
オチド配列が対照配列と同一であることを意図とする。
言い換えると、対照ヌクレオチド配列と少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを得るためには、対照配列においてヌクレオチドの５
％までが欠失または他のヌクレオチドで置換されていて
もよく、あるいは参照配列における全ヌクレオチドの５
％までの数のヌクレオチドが対照配列中に挿入されてい
てもよい。対照配列のこれらの変異は、対照配列の５'
または３'末端部位、またはそれらの末端部位の間のど
こで起こってもよく、対照配列中のヌクレオチドの間に
別々に散在しても、あるいは、対照配列中の一つまたは
それ以上の連続したグループ中に存在してもよい。同様
に、例えば、配列番号：２の対照アミノ酸配列と少なく
とも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドは、そのポリペプチド配列が配列番号：２の対
照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５つまでのア
ミノ酸変異を有してもよいことを意図とする。言い換え
ると、対照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である
アミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対
照配列においてアミノ酸残基の５％までが欠失または他
のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは、参照配
列における全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が
参照配列中に挿入されていてもよい。対照配列のこれら
の変化は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ
末端部位、またはそれらの末端部位の間のどこで起こっ
てもよく、対照配列中の残基の間に別々に散在しても、
あるいは対照配列中の一つまたはそれ以上の連続したグ
ループ中に存在してもよい。
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクトされ得る細
胞である。当該分野にて周知であるように「同一性」
は、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または二
つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であ
り、配列を比較して決定する。当該分野において、「同
一性」とはまた、時には、かかる配列の鎖の間の合致に
より決定されるようなポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」お
よび「類似性」は公知手段により容易に算出できる（Co
mputational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オック
スフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨー
ク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome P
rojects，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニュ
ーヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence Da
ta，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒ
ューマナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequen
ce Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、
アカデミック・プレス、1987年；およびSequence Analy
sis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍスト
ックトン・プレス、ニューヨーク、1991年；およびＣar
illo,Ｈ、およびＬipman,Ｄ.，ＳＩＡＭ，Ｊ.Ａpplied
Ｍath.,48：1073（1988））。同一性を決定するため
の好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適合する
ように設計される。同一性および類似性を測定する方法
は、コンピュータープログラムで集成されている。二つ
の配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコン
ピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケー
ジ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):38
7（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.
ら、J.Molec.Biol.215:403−410（1990）））を包含す
るが、これらに限定するものではない。ＢＬＡＳＴ Ｘ
プログラムはＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に手に
入れることができる（BLAST Manual, Altschul, S., et
al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altschul,
S., et al., J. Mol.Biol. 215:403-410(1990)）。一例
として、例えば、配列番号：１の参照ポリヌクレオチド
配列と少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドは、そのポリヌクレ
オチド配列が配列番号：１の参照ヌクレオチド配列の各
１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を有し
てもよいことを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレ
オチド配列が対照配列と同一であることを意図とする。
言い換えると、対照ヌクレオチド配列と少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを得るためには、対照配列においてヌクレオチドの５
％までが欠失または他のヌクレオチドで置換されていて
もよく、あるいは参照配列における全ヌクレオチドの５
％までの数のヌクレオチドが対照配列中に挿入されてい
てもよい。対照配列のこれらの変異は、対照配列の５'
または３'末端部位、またはそれらの末端部位の間のど
こで起こってもよく、対照配列中のヌクレオチドの間に
別々に散在しても、あるいは、対照配列中の一つまたは
それ以上の連続したグループ中に存在してもよい。同様
に、例えば、配列番号：２の対照アミノ酸配列と少なく
とも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドは、そのポリペプチド配列が配列番号：２の対
照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５つまでのア
ミノ酸変異を有してもよいことを意図とする。言い換え
ると、対照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である
アミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対
照配列においてアミノ酸残基の５％までが欠失または他
のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは、参照配
列における全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が
参照配列中に挿入されていてもよい。対照配列のこれら
の変化は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ
末端部位、またはそれらの末端部位の間のどこで起こっ
てもよく、対照配列中の残基の間に別々に散在しても、
あるいは対照配列中の一つまたはそれ以上の連続したグ
ループ中に存在してもよい。
【００２４】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、それが天然に存在する場
合、その元来の環境から変化または除去されたこと、ま
たはその両方が行われたことを意味する。例えば自然発
生のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状
態で生存動物に存在する場合は、「単離」されていない
が、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天
然に共存する物質のから分離されている場合は、本明細
書に用いる用語で「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関する場合、「単離された」なる用語
は、自然発生の染色体および細胞から分離されているこ
とを意味する。単離の一部として、または単離の後に、
かかるポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡなどの他の
ポリヌクレオチドに結合して突然変異を誘発したり、融
合タンパク質を形成したり、宿主中で伸長または発現し
たりすることができる。単離ポリヌクレオチドは単独
で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合
して、培養物中または全生物中の宿主細胞に導入でき
る。培養物中または全生物中の宿主細胞に導入されたか
かるＤＮＡも本明細書に用いる用語である、「単離され
た」といえる。というのはこれらは自然発生の形態また
は環境にはないからである。同様に、ポリヌクレオチド
およびポリペプチドは組成物例えば、培地製剤、例えば
細胞にポリヌクレオチドまたはポリペプチドを導入する
ための溶液、化学的または酵素的反応のための組成物ま
たは溶液にも存在でき、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離された」ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
ら変化させられた、すなわち、それが天然に存在する場
合、その元来の環境から変化または除去されたこと、ま
たはその両方が行われたことを意味する。例えば自然発
生のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状
態で生存動物に存在する場合は、「単離」されていない
が、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天
然に共存する物質のから分離されている場合は、本明細
書に用いる用語で「単離」がなされている。例えば、ポ
リヌクレオチドに関する場合、「単離された」なる用語
は、自然発生の染色体および細胞から分離されているこ
とを意味する。単離の一部として、または単離の後に、
かかるポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡなどの他の
ポリヌクレオチドに結合して突然変異を誘発したり、融
合タンパク質を形成したり、宿主中で伸長または発現し
たりすることができる。単離ポリヌクレオチドは単独
で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合
して、培養物中または全生物中の宿主細胞に導入でき
る。培養物中または全生物中の宿主細胞に導入されたか
かるＤＮＡも本明細書に用いる用語である、「単離され
た」といえる。というのはこれらは自然発生の形態また
は環境にはないからである。同様に、ポリヌクレオチド
およびポリペプチドは組成物例えば、培地製剤、例えば
細胞にポリヌクレオチドまたはポリペプチドを導入する
ための溶液、化学的または酵素的反応のための組成物ま
たは溶液にも存在でき、これらは自然には存在しない組
成物であり、本明細書に用いる用語の「単離された」ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの範囲内である。
【００２５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌ
クレオチドを意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリ
ッド分子を意味する。加えて、本明細書で用いるポリヌ
クレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤ
ＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味する。かかる
領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のも
のでよい。この領域は一つまたはそれ以上の分子の全体
を包含し得るが、より典型的にはいくつかの分子の一領
域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、オリゴ
ヌクレオチドであることがしばしばである。本明細書で
用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそ
れ以上の修飾した塩基を含有する、前記したＤＮＡまた
はＲＮＡを包含する。このように、安定性または他の理
由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明
細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さら
に、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩
基等の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡも（二
つの例だけを示す）、かかる用語を本明細書で用いる場
合の「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多く
の有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に
多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場
合、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的また
は代謝的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ
単純型細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤ
ＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチ
ド（複数でも可）なる語は、オリゴヌクレオチドをいう
ことがしばしばある短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いず
れかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌ
クレオチドを意味する。従って、例えば、本明細書で用
いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリ
ッド分子を意味する。加えて、本明細書で用いるポリヌ
クレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤ
ＮＡの両方を有してなる三本鎖領域を意味する。かかる
領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のも
のでよい。この領域は一つまたはそれ以上の分子の全体
を包含し得るが、より典型的にはいくつかの分子の一領
域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、オリゴ
ヌクレオチドであることがしばしばである。本明細書で
用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそ
れ以上の修飾した塩基を含有する、前記したＤＮＡまた
はＲＮＡを包含する。このように、安定性または他の理
由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明
細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さら
に、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩
基等の修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡも（二
つの例だけを示す）、かかる用語を本明細書で用いる場
合の「ポリヌクレオチド」である。当業者に既知の多く
の有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に
多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場
合、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的また
は代謝的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ
単純型細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤ
ＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリペプチ
ド（複数でも可）なる語は、オリゴヌクレオチドをいう
ことがしばしばある短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００２６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野のその他の発行物に記載されている。
これに鑑み、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称する短鎖、および多くの型
があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖の
両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に２
０種の自然発生アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以
外のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸等の多くのアミノ
酸は、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾のよう
な天然のプロッセッシングにより所定のポリペプチドで
修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学的修
飾技術によっても修飾できることは理解されよう。ポリ
ペプチドに自然に起こる一般的な修飾でさえ余りにも多
いので、余すところなく掲示することはできないが、基
礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに多数の
研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に
周知である。本発明のポリペプチドに施すことができる
既知の修飾には、２ないし３例示として示すと、アセチ
ル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラ
ビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドま
たはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘
導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結
合、クロスリンキング、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有結合クロスリンキング形成、シスチン
形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマー−
カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、
タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニ
ル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化
などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ
媒介付加、およびユビキチネーションがある。かかる修
飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に記載
されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えばグリ
コシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化は
最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Structure and
Molecular Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Fr
eeman and Company、ニューヨーク（1993）に記載され
ている。例えば、Posttranslational Covalent Modific
ation of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslatio
nal Protein Modifications ：Perspective and Prospe
cts、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646
（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttra
nslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.S
ci.663:48-62（1992）で提供される論文などの多くの詳
細な論文が、本主題に利用できる。ポリペプチドはいつ
も完全に直鎖であるとは限らないということは周知であ
り、前記した通りであると理解されよう。例えばポリペ
プチドはユビキチネーションの結果分岐していてもよ
く、一般には、天然のプロセッシング事象を含む翻訳後
の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも
たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない
環状にできる。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同
様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。実際、
共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシル基またはその両方の遮断は、自然発生および
合成ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に本発明
のポリペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ
（E.coli.）または他の細胞で作られるポリペプチドの
アミノ末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシングの
前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろ
う。ペプチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端でメチ
オニン残基を除去できる。従って、本発明は、本発明の
タンパク質のメチオニン含有およびメチオニン不含の両
方のアミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに
起こる修飾はしばしばそれの作り方に影響される。例え
ば、宿主にクローン化遺伝子を発現することにより作ら
れるポリペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部
分、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミ
ノ酸配列に存在する修飾シグナルにより決定される。例
えば、周知のように、グリコシル化はイー・コリ（E.co
li）のような細菌宿主では起こらないことがはしばしば
である。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペ
プチドをグリコシル化宿主、一般に、真核細胞に発現さ
せるべきである。昆虫細胞がしばしば哺乳動物細胞と同
じ翻訳後グリコシル化を行い、この理由で昆虫細胞発現
系が、グリコシル化の本来のパターンを有する哺乳動物
タンパク質を効率よく発現するように開発されている。
同様の考察が他の修飾にも適用される。修飾の同一の型
が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じまた
は異なる程度で存在し得ることは理解されよう。また、
所定のポリペプチドは多くの型の修飾を有していてもよ
い。一般に、本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」
なる用語は、全てのこのような修飾、特に宿主細胞にお
いてポリヌクレオチドを発現することにより合成したポ
リペプチドに存在する修飾を包含する。
下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプ
チドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキス
トおよび当該分野のその他の発行物に記載されている。
これに鑑み、この用語は、本明細書において、ペプチド
結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ以
上のアミノ酸を有してなるいずれかのペプチドまたはタ
ンパク質をいうのに用いる。本明細書で用いる場合、こ
の用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプ
チドおよびオリゴマーとも称する短鎖、および多くの型
があり、当該分野で一般的にタンパク質と称する長鎖の
両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に２
０種の自然発生アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以
外のアミノ酸を含有し、末端アミノ酸等の多くのアミノ
酸は、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾のよう
な天然のプロッセッシングにより所定のポリペプチドで
修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学的修
飾技術によっても修飾できることは理解されよう。ポリ
ペプチドに自然に起こる一般的な修飾でさえ余りにも多
いので、余すところなく掲示することはできないが、基
礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに多数の
研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に
周知である。本発明のポリペプチドに施すことができる
既知の修飾には、２ないし３例示として示すと、アセチ
ル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラ
ビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドま
たはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘
導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結
合、クロスリンキング、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有結合クロスリンキング形成、シスチン
形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマー−
カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、
タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニ
ル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化
などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ
媒介付加、およびユビキチネーションがある。かかる修
飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に記載
されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えばグリ
コシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガン
マーカルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化は
最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Structure and
Molecular Properties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Fr
eeman and Company、ニューヨーク（1993）に記載され
ている。例えば、Posttranslational Covalent Modific
ation of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslatio
nal Protein Modifications ：Perspective and Prospe
cts、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646
（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttra
nslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.S
ci.663:48-62（1992）で提供される論文などの多くの詳
細な論文が、本主題に利用できる。ポリペプチドはいつ
も完全に直鎖であるとは限らないということは周知であ
り、前記した通りであると理解されよう。例えばポリペ
プチドはユビキチネーションの結果分岐していてもよ
く、一般には、天然のプロセッシング事象を含む翻訳後
の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも
たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない
環状にできる。環状、分岐および分岐した環状ポリペプ
チドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同
様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。実際、
共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシル基またはその両方の遮断は、自然発生および
合成ポリペプチドに共通し、かかる修飾は同様に本発明
のポリペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ
（E.coli.）または他の細胞で作られるポリペプチドの
アミノ末端残基は、タンパク質溶解のプロセッシングの
前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろ
う。ペプチドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ2末端でメチ
オニン残基を除去できる。従って、本発明は、本発明の
タンパク質のメチオニン含有およびメチオニン不含の両
方のアミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに
起こる修飾はしばしばそれの作り方に影響される。例え
ば、宿主にクローン化遺伝子を発現することにより作ら
れるポリペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部
分、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミ
ノ酸配列に存在する修飾シグナルにより決定される。例
えば、周知のように、グリコシル化はイー・コリ（E.co
li）のような細菌宿主では起こらないことがはしばしば
である。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペ
プチドをグリコシル化宿主、一般に、真核細胞に発現さ
せるべきである。昆虫細胞がしばしば哺乳動物細胞と同
じ翻訳後グリコシル化を行い、この理由で昆虫細胞発現
系が、グリコシル化の本来のパターンを有する哺乳動物
タンパク質を効率よく発現するように開発されている。
同様の考察が他の修飾にも適用される。修飾の同一の型
が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じまた
は異なる程度で存在し得ることは理解されよう。また、
所定のポリペプチドは多くの型の修飾を有していてもよ
い。一般に、本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」
なる用語は、全てのこのような修飾、特に宿主細胞にお
いてポリヌクレオチドを発現することにより合成したポ
リペプチドに存在する修飾を包含する。
【００２７】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの「変種」なる用語は、対照ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドとは各々異なるポリヌク
レオチドまたはポリペプチドである。この意味の変種
は、本明細書の以下およびその他の部分でより詳細に記
載する。ヌクレオチドに関して、違いは、一般に、対照
と変種のヌクレオチド配列が、全体的に非常に類似して
おり、多くの領域で同一であるものに限られる。以下に
記すように、変種におけるヌクレオチドの配列の変化は
サイレントであってもよい。すなわち、その変化がポリ
ヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変えなくて
もよい。変化がこの型のサイレント変化に限定される場
合、変種は、対照と同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードする。また以下に記すように、変種のヌ
クレオチド配列における変化が、対照ポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化
させてもよい。このようなヌクレオチドの変化は、以下
に論じるように、対照配列によりコードされるポリペプ
チドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切
断をもたらす。ポリペプチドに関して、違いは、一般
に、対照と変種の配列が全体的に非常に類似しており、
多くの領域で同一であるものに限られる。変種および対
照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じてい
てもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていてもよ
い。
またはポリペプチドの「変種」なる用語は、対照ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドとは各々異なるポリヌク
レオチドまたはポリペプチドである。この意味の変種
は、本明細書の以下およびその他の部分でより詳細に記
載する。ヌクレオチドに関して、違いは、一般に、対照
と変種のヌクレオチド配列が、全体的に非常に類似して
おり、多くの領域で同一であるものに限られる。以下に
記すように、変種におけるヌクレオチドの配列の変化は
サイレントであってもよい。すなわち、その変化がポリ
ヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変えなくて
もよい。変化がこの型のサイレント変化に限定される場
合、変種は、対照と同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードする。また以下に記すように、変種のヌ
クレオチド配列における変化が、対照ポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化
させてもよい。このようなヌクレオチドの変化は、以下
に論じるように、対照配列によりコードされるポリペプ
チドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切
断をもたらす。ポリペプチドに関して、違いは、一般
に、対照と変種の配列が全体的に非常に類似しており、
多くの領域で同一であるものに限られる。変種および対
照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断（いずれかの組み合わせで生じてい
てもよい）により、アミノ酸配列にて異なっていてもよ
い。
【００２８】本発明は、とりわけ、以下により詳細に記
載する、新規トポイソメラーゼＩポリペプチドおよびそ
れをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、本発
明は、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）のト
ポイソメラーゼＩポリペプチドに対するアミノ酸配列相
同性により関連付けられる、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）の新規トポイソメラ
ーゼＩ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に図１ないし５（配列番号：１）お
よび図６ないし８（配列番号：２）および図10ないし１
２に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するスタ
フィロコッカス・トポイソメラーゼＩ、ならびに本明細
書において「寄託生物」または「寄託生物のＤＮＡ」と
称するＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１より単離可能なDN
AのトポイソメラーゼＩヌクレオチドおよびアミノ酸配
列に関する。図１ないし５（配列番号：１）および図６
ないし８（配列番号：２）に示すヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列は、寄託生物のＤＮＡを配列決定することに
より得られたことは理解されよう。従って、寄託クロー
ンの配列（およびそれをコードする配列）と図１ないし
５（配列番号：１）および図６ないし８（配列番号：
２）の配列の間のいずれの不一致に関しても、寄託クロ
ーンの配列に従うものとする。
載する、新規トポイソメラーゼＩポリペプチドおよびそ
れをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、本発
明は、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）のト
ポイソメラーゼＩポリペプチドに対するアミノ酸配列相
同性により関連付けられる、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）の新規トポイソメラ
ーゼＩ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に図１ないし５（配列番号：１）お
よび図６ないし８（配列番号：２）および図10ないし１
２に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するスタ
フィロコッカス・トポイソメラーゼＩ、ならびに本明細
書において「寄託生物」または「寄託生物のＤＮＡ」と
称するＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１より単離可能なDN
AのトポイソメラーゼＩヌクレオチドおよびアミノ酸配
列に関する。図１ないし５（配列番号：１）および図６
ないし８（配列番号：２）に示すヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列は、寄託生物のＤＮＡを配列決定することに
より得られたことは理解されよう。従って、寄託クロー
ンの配列（およびそれをコードする配列）と図１ないし
５（配列番号：１）および図６ないし８（配列番号：
２）の配列の間のいずれの不一致に関しても、寄託クロ
ーンの配列に従うものとする。
【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図６ないし８（配列番
号：２）の推定アミノ酸配列を有するスタフィロコッカ
ス・トポイソメラーゼＩポリペプチドをコードする単離
ポリヌクレオチドを提供する。図１ないし５（配列番
号：１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書に
て提供される情報を用いて、トポイソメラーゼＩポリペ
プチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準
的なクローニングおよび配列決定の手法を用いて得るこ
とができる。配列番号：１に示すDNA配列を用いてタン
パク質をコードするポリヌクレオチドを得るためには、
典型的には、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの他
の適当な宿主における、スタフィロコッカス・アウレウ
スWCUH２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリー
を、図1ないし５の配列に由来する、好ましくは１７量
体またはそれ以上の長さの、放射性標識オリゴヌクレオ
チドにてプローブする。プローブのＤＮＡと同一のＤＮ
Ａを担持するクローンは、ついで非常に厳密に洗浄する
ことにより区別できる。元の配列から設計した配列決定
プライマーを用いてこのように同定した個々のクローン
を配列決定することにより、ついで両方向に配列を伸長
し、全遺伝子配列を決定できる。都合よくは、かかる配
列決定をプラスミドクローンから調製した変性二本鎖Ｄ
ＮＡを用いて実施する。適当な技術については、Maniat
is,T.、Fritsch,E.F.およびSambrook、J．、Molecular
Cloning，A Laboratory Manual（第2版；コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（1989）；ハイブリ
ダイゼーションによるスクリーニング1.９０および変性
二本鎖DNA鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）に記
載されている。本発明の一例として図１ないし５に示す
ポリヌクレオチドは、実施例１に記載されているよう
に、スタフィロコッカス・アウレウスNCIMB４０７７１
に由来するＤＮＡライブラリーで発見された。
号：２）の推定アミノ酸配列を有するスタフィロコッカ
ス・トポイソメラーゼＩポリペプチドをコードする単離
ポリヌクレオチドを提供する。図１ないし５（配列番
号：１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書に
て提供される情報を用いて、トポイソメラーゼＩポリペ
プチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準
的なクローニングおよび配列決定の手法を用いて得るこ
とができる。配列番号：１に示すDNA配列を用いてタン
パク質をコードするポリヌクレオチドを得るためには、
典型的には、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの他
の適当な宿主における、スタフィロコッカス・アウレウ
スWCUH２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリー
を、図1ないし５の配列に由来する、好ましくは１７量
体またはそれ以上の長さの、放射性標識オリゴヌクレオ
チドにてプローブする。プローブのＤＮＡと同一のＤＮ
Ａを担持するクローンは、ついで非常に厳密に洗浄する
ことにより区別できる。元の配列から設計した配列決定
プライマーを用いてこのように同定した個々のクローン
を配列決定することにより、ついで両方向に配列を伸長
し、全遺伝子配列を決定できる。都合よくは、かかる配
列決定をプラスミドクローンから調製した変性二本鎖Ｄ
ＮＡを用いて実施する。適当な技術については、Maniat
is,T.、Fritsch,E.F.およびSambrook、J．、Molecular
Cloning，A Laboratory Manual（第2版；コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（1989）；ハイブリ
ダイゼーションによるスクリーニング1.９０および変性
二本鎖DNA鋳型の配列決定１３.７０を参照のこと）に記
載されている。本発明の一例として図１ないし５に示す
ポリヌクレオチドは、実施例１に記載されているよう
に、スタフィロコッカス・アウレウスNCIMB４０７７１
に由来するＤＮＡライブラリーで発見された。
【００３０】寄託クローンのトポイソメラーゼＩをコー
ドする配列を文献に報告されている配列と比較すること
によりわかるように、本発明のトポイソメラーゼＩは細
菌性トポイソメラーゼＩファミリーの他のタンパク質に
構造的に関連している。好ましいＤＮＡ配列を図1ない
し５（配列番号：１）に示す。これは、約７９.２９２
ｋDaの推定分子量の約６９１個のアミノ酸残基を有する
タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含有する。このタンパク質は、既知タンパク質の中
で、バシラス・サチリス・トポイソメラーゼＩタンパク
質に対して最大の相同性を示す。図６ないし８（配列番
号：２）のトポイソメラーゼＩは、バシラス・サチリス
・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を含め、約６８％
の同一性、および約８０％の類似性を有する。
ドする配列を文献に報告されている配列と比較すること
によりわかるように、本発明のトポイソメラーゼＩは細
菌性トポイソメラーゼＩファミリーの他のタンパク質に
構造的に関連している。好ましいＤＮＡ配列を図1ない
し５（配列番号：１）に示す。これは、約７９.２９２
ｋDaの推定分子量の約６９１個のアミノ酸残基を有する
タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含有する。このタンパク質は、既知タンパク質の中
で、バシラス・サチリス・トポイソメラーゼＩタンパク
質に対して最大の相同性を示す。図６ないし８（配列番
号：２）のトポイソメラーゼＩは、バシラス・サチリス
・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を含め、約６８％
の同一性、および約８０％の類似性を有する。
【００３１】本発明のポリヌクレオチドは、クローニン
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖でよい。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても知
られているコーディング鎖でよく、またはアンチセンス
鎖とも称される非コーディング鎖でもよい。ポリペプチ
ドをコードするコーディング配列は、図１ないし５（配
列番号：１）に示すポリヌクレオチドのコーディング配
列と同一でよい。さらに、それは、遺伝暗号の重複性
（同義性）の結果、図６ないし８（配列番号：２）のポ
リペプチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレ
オチドであってもよい。図9ないし１２はすべてのかか
るコーディング配列を示す。
グにより得るか、もしくは化学合成技術により生成する
か、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲ
ＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖でよい。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても知
られているコーディング鎖でよく、またはアンチセンス
鎖とも称される非コーディング鎖でもよい。ポリペプチ
ドをコードするコーディング配列は、図１ないし５（配
列番号：１）に示すポリヌクレオチドのコーディング配
列と同一でよい。さらに、それは、遺伝暗号の重複性
（同義性）の結果、図６ないし８（配列番号：２）のポ
リペプチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレ
オチドであってもよい。図9ないし１２はすべてのかか
るコーディング配列を示す。
【００３２】図６ないし８（配列番号：２）のポリペプ
チドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポ
リペプチドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチド
のコーディング配列および付加コーディング配列、例え
ばプレ、プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーま
たは分泌配列をコードするコーディング配列；例えば、
転写（例えば停止シグナルを包含する）、リボソーム結
合およびｍＲＮＡの安定性エレメントにおいて役割を有
する、転写された非翻訳配列などの非コーディング５’
および３’列（これに限定するものではない）等の付加
非コーディング配列と共に、前記の付加コーディング配
列を有するかまたは有しない成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列および；付加機能性を付与する配列のごとき
付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列を包含
するが、これらに限定するものではない。ＤＮＡはま
た、本発明のトポイソメラーゼIをコードするｍＲＮＡ
の転写を指令するように機能するプロモーター領域を有
していてもよい。そのようなプロモーターは、独立し
て、組換え発現系における異種遺伝子の転写を指令する
のに有用であるかもしれない。さらには、該ポリペプチ
ドは、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどの
マーカー配列に融合していてもよい。本発明のこの態様
のある具体例において、マーカー配列はヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キア
ゲン、インコーポレーティッド）にて提供されるタグで
あり、多くが市販により入手可能である。例えばGentz
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク
質の精製に便宜的に提供される。ＨＡタグもまた融合タ
ンパク質の生成に使用でき、インフルエンザ・ヘマググ
ルチニン・タンパク質由来のエピトープに対応し、これ
については例えばWilsonら、Cell，37:767（1984）に記
載されている。
チドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポ
リペプチドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチド
のコーディング配列および付加コーディング配列、例え
ばプレ、プロ、プレプロタンパク質配列等のリーダーま
たは分泌配列をコードするコーディング配列；例えば、
転写（例えば停止シグナルを包含する）、リボソーム結
合およびｍＲＮＡの安定性エレメントにおいて役割を有
する、転写された非翻訳配列などの非コーディング５’
および３’列（これに限定するものではない）等の付加
非コーディング配列と共に、前記の付加コーディング配
列を有するかまたは有しない成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列および；付加機能性を付与する配列のごとき
付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列を包含
するが、これらに限定するものではない。ＤＮＡはま
た、本発明のトポイソメラーゼIをコードするｍＲＮＡ
の転写を指令するように機能するプロモーター領域を有
していてもよい。そのようなプロモーターは、独立し
て、組換え発現系における異種遺伝子の転写を指令する
のに有用であるかもしれない。さらには、該ポリペプチ
ドは、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどの
マーカー配列に融合していてもよい。本発明のこの態様
のある具体例において、マーカー配列はヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キア
ゲン、インコーポレーティッド）にて提供されるタグで
あり、多くが市販により入手可能である。例えばGentz
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク
質の精製に便宜的に提供される。ＨＡタグもまた融合タ
ンパク質の生成に使用でき、インフルエンザ・ヘマググ
ルチニン・タンパク質由来のエピトープに対応し、これ
については例えばWilsonら、Cell，37:767（1984）に記
載されている。
【００３３】前記によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
６ないし８（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有す
る、スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラー
ゼＩのポリペプチドをコードする配列を有するポリヌク
レオチド包含する。この用語は、付加領域と共にポリペ
プチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば組み込まれたファージもしくは挿入配列または
エディティング（editing）により分断される）を含
み、さらにコーディングおよび／または非コーディング
配列を含有していてもよいポリヌクレオチドをも包含す
る。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図
６ないし８（配列番号：２）に示すアミノ酸配列を有す
る、スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラー
ゼＩのポリペプチドをコードする配列を有するポリヌク
レオチド包含する。この用語は、付加領域と共にポリペ
プチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば組み込まれたファージもしくは挿入配列または
エディティング（editing）により分断される）を含
み、さらにコーディングおよび／または非コーディング
配列を含有していてもよいポリヌクレオチドをも包含す
る。
【００３４】本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）n−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ 式中、分子の５’で、Ｘは水素であり、分子の３’で、
Ｙは水素または金属であり、Ｒ1とＲ3はいずれかの核酸
残基であり、ｎは１と３０００の間の整数であり、Ｒ2
は本発明の核酸配列、特に配列番号：１のポリヌクレオ
チド配列である。ポリヌクレオチドにおいて、前記した
式のＲ2はその５’残基が左側で、Ｒ1と共有結合し、そ
の３’残基が右側で、Ｒ3に共有結合している。Ｒが１
よりも大きい場合、Ｒ基で示される核酸残基の鎖はヘテ
ロポリマーまたはホモポリマーのいずれであってもよ
く、好ましくはヘテロポリマーである。好ましい具体例
において、ｎは１と１０００の間の整数である。
Ｙは水素または金属であり、Ｒ1とＲ3はいずれかの核酸
残基であり、ｎは１と３０００の間の整数であり、Ｒ2
は本発明の核酸配列、特に配列番号：１のポリヌクレオ
チド配列である。ポリヌクレオチドにおいて、前記した
式のＲ2はその５’残基が左側で、Ｒ1と共有結合し、そ
の３’残基が右側で、Ｒ3に共有結合している。Ｒが１
よりも大きい場合、Ｒ基で示される核酸残基の鎖はヘテ
ロポリマーまたはホモポリマーのいずれであってもよ
く、好ましくはヘテロポリマーである。好ましい具体例
において、ｎは１と１０００の間の整数である。
【００３５】本発明はさらに、図６ないし８（配列番
号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、本明
細書で前記したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリ
ヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天
然の変種であってもよく、または自然に発生することが
知られていない変種であってもよい。このようなポリヌ
クレオチドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞ま
たは生物に適用される方法を含め、突然変異誘発技術に
より作ることができる。
号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、本明
細書で前記したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリ
ヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天
然の変種であってもよく、または自然に発生することが
知られていない変種であってもよい。このようなポリヌ
クレオチドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞ま
たは生物に適用される方法を含め、突然変異誘発技術に
より作ることができる。
【００３６】この点における変種には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換は１またはそれ以上のヌクレオ
チドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディ
ング領域またはその両方において変化していてもよい。
コーディング領域における変化が同類または非同類アミ
ノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれない。こ
の点に関する本発明の特に好ましい具体例には、図６な
いし８（配列番号：２）に示すスタフィロコッカス・ト
ポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド；それらの変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメントがある。
換、欠失または付加により前記のポリヌクレオチドとは
異なる変種がある。置換は１またはそれ以上のヌクレオ
チドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディ
ング領域またはその両方において変化していてもよい。
コーディング領域における変化が同類または非同類アミ
ノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれない。こ
の点に関する本発明の特に好ましい具体例には、図６な
いし８（配列番号：２）に示すスタフィロコッカス・ト
ポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド；それらの変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメントがある。
【００３７】図６ないし８（配列番号：２）のスタフィ
ロコッカス・トポイソメラーゼＩポリペプチドで、その
うち、数個、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、
１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有す
る、トポイソメラーゼＩ変種、アナログ、誘導体および
フラグメント、ならびにそのフラグメントの変種、アナ
ログおよび誘導体をコードするポリヌクレオチドが、さ
らに特に好ましい。中でもとりわけ好ましいものは、サ
イレント置換、付加および欠失であり、トポイソメラー
ゼＩの特性および活性を変えないものである。また、こ
の点に関してとりわけ好ましいものは、同類置換であ
る。最も好ましいものは、置換していない、図６ないし
８（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のさら
に好ましい態様は、図６ないし８（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列を有するトポイソメラーゼＩポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７
０％同一のポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドである。また、寄託
クローンのスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡのト
ポイソメラーゼＩポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに対して少なくとも８０％同一である領域を有す
るポリヌクレオチド、およびそれらに相補的なポリヌク
レオチドが最も非常に好ましい。この点において、その
同じものに対して少なくとも９０％の同一性を有するポ
リヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも
９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに
は、少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少
なくとも９７％であるのがより好ましく、その中でも少
なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特に
好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好ま
しい。
ロコッカス・トポイソメラーゼＩポリペプチドで、その
うち、数個、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、
１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されているアミノ酸配列を有す
る、トポイソメラーゼＩ変種、アナログ、誘導体および
フラグメント、ならびにそのフラグメントの変種、アナ
ログおよび誘導体をコードするポリヌクレオチドが、さ
らに特に好ましい。中でもとりわけ好ましいものは、サ
イレント置換、付加および欠失であり、トポイソメラー
ゼＩの特性および活性を変えないものである。また、こ
の点に関してとりわけ好ましいものは、同類置換であ
る。最も好ましいものは、置換していない、図６ないし
８（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のさら
に好ましい態様は、図６ないし８（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列を有するトポイソメラーゼＩポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７
０％同一のポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドである。また、寄託
クローンのスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡのト
ポイソメラーゼＩポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに対して少なくとも８０％同一である領域を有す
るポリヌクレオチド、およびそれらに相補的なポリヌク
レオチドが最も非常に好ましい。この点において、その
同じものに対して少なくとも９０％の同一性を有するポ
リヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも
９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに
は、少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少
なくとも９７％であるのがより好ましく、その中でも少
なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特に
好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好ま
しい。
【００３８】この点に関してとりわけ好ましい具体例
は、さらには、図１ないし５（配列番号：１）のＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の
生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドである。本発明はさらに本明細
書で前記した配列にハイブリダイゼーションするポリヌ
クレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下で本明細書で前記したポ
リヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関する。本明細書で用いる「ストリンジェン
トな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列
間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の
同一性がある場合にのみ起こることを意味する。ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ7.6）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性
され剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を洗浄す
るものである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
は周知であり、Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、Second Edition, Cold Spring H
arbor, N. Y.（1989）、特にその第11章に例示されてい
る。
は、さらには、図１ないし５（配列番号：１）のＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の
生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドである。本発明はさらに本明細
書で前記した配列にハイブリダイゼーションするポリヌ
クレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下で本明細書で前記したポ
リヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関する。本明細書で用いる「ストリンジェン
トな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列
間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の
同一性がある場合にのみ起こることを意味する。ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ7.6）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性
され剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を洗浄す
るものである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
は周知であり、Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、Second Edition, Cold Spring H
arbor, N. Y.（1989）、特にその第11章に例示されてい
る。
【００３９】本明細書にてさらに本発明のポリヌクレオ
チドアッセイについて論じるが、例えば、前記したよう
に本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとし
て用い、トポイソメラーゼＩをコードする全長ｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離し、ならびにトポイソメラ
ーゼＩ遺伝子に対して高度な配列類似性を有する他の遺
伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することが
できる。かかるプローブは、一般に、少なくとも１５塩
基を有してなる。好ましくは、かかるプローブは少なく
とも３０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有する。特
に好ましいプローブは少なくとも３０塩基を有し、５０
塩基以下である。例えば、トポイソメラーゼＩ遺伝子の
コーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌ
クレオチドプローブを合成し、スクリーニングすること
により単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相
補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いて、
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリー
をスクリーニングし、プローブがハイブリッド形成する
ライブラリーのメンバーを決定する。
チドアッセイについて論じるが、例えば、前記したよう
に本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとし
て用い、トポイソメラーゼＩをコードする全長ｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離し、ならびにトポイソメラ
ーゼＩ遺伝子に対して高度な配列類似性を有する他の遺
伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することが
できる。かかるプローブは、一般に、少なくとも１５塩
基を有してなる。好ましくは、かかるプローブは少なく
とも３０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有する。特
に好ましいプローブは少なくとも３０塩基を有し、５０
塩基以下である。例えば、トポイソメラーゼＩ遺伝子の
コーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌ
クレオチドプローブを合成し、スクリーニングすること
により単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相
補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いて、
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリー
をスクリーニングし、プローブがハイブリッド形成する
ライブラリーのメンバーを決定する。
【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、疾患、特にヒト疾患の治療法および診断法の発
見のための研究試薬および材料として使用でき、さらに
はポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさら
に論じる。オリゴヌクレオチドであり、配列（配列番
号：１）より誘導される、本発明のポリヌクレオチド
は、本明細書において同定されたスタフィロコッカス・
アウレウス遺伝子がすべてまたは一部、感染組織にて転
写されたかどうかを決定するために、本明細書に前記し
た方法でのＰＣＲプライマーとして使用できる。かかる
配列は感染の段階、および病因が到達した感染の型の診
断にも有用であると思われる。ポリヌクレオチドは、さ
らにアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸を加えた
成熟タンパク質、または成熟ポリペプチドに内在するア
ミノ酸である（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチ
ド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードできる。かか
る配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッ
シングにおいて役割を有し、タンパク質の輸送を可能に
し、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し、または
とりわけアッセイもしくは生成のためのタンパク質の操
作を容易にすることができる。一般に、インビボの場
合、付加アミノ酸は、細胞酵素によりプロセッシングさ
れ、成熟タンパク質から取り除かれる。
チドは、疾患、特にヒト疾患の治療法および診断法の発
見のための研究試薬および材料として使用でき、さらに
はポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさら
に論じる。オリゴヌクレオチドであり、配列（配列番
号：１）より誘導される、本発明のポリヌクレオチド
は、本明細書において同定されたスタフィロコッカス・
アウレウス遺伝子がすべてまたは一部、感染組織にて転
写されたかどうかを決定するために、本明細書に前記し
た方法でのＰＣＲプライマーとして使用できる。かかる
配列は感染の段階、および病因が到達した感染の型の診
断にも有用であると思われる。ポリヌクレオチドは、さ
らにアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸を加えた
成熟タンパク質、または成熟ポリペプチドに内在するア
ミノ酸である（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチ
ド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードできる。かか
る配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッ
シングにおいて役割を有し、タンパク質の輸送を可能に
し、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し、または
とりわけアッセイもしくは生成のためのタンパク質の操
作を容易にすることができる。一般に、インビボの場
合、付加アミノ酸は、細胞酵素によりプロセッシングさ
れ、成熟タンパク質から取り除かれる。
【００４１】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が一般に活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全ては、活性化の前に除
去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタンパ
ク質と称される。要するに、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が一般に活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全ては、活性化の前に除
去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタンパ
ク質と称される。要するに、本発明のポリヌクレオチド
は成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク
質（プレタンパク質と称することもできる）、プレタン
パク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ
配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー
配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性およ
び成熟形態を生じるプロセッシング工程で除去されるプ
ロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロ
タンパク質をコードできる。
【００４２】寄託材料 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９は、ナシ
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アン
ド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）、
アバディーン、スコットランドに１９９５年９月11日に
寄託され、ＮＣＩＭＢ番号４０７７１を付された。寄託
は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダ
ペスト条約の条件下で為されている。特許が発行される
と何らの制限または条件もなく、最終的には分譲され
る。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５
Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄託
が実施可能要件であることを承認するものではない。寄
託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそ
れによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書の配列の記載と矛盾があった場合に調節するも
のである。寄託材料を製造、使用または販売するために
はライセンスが必要であるが、そのようなライセンスは
ここで付与されるものではない。
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アン
ド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）、
アバディーン、スコットランドに１９９５年９月11日に
寄託され、ＮＣＩＭＢ番号４０７７１を付された。寄託
は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダ
ペスト条約の条件下で為されている。特許が発行される
と何らの制限または条件もなく、最終的には分譲され
る。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５
Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄託
が実施可能要件であることを承認するものではない。寄
託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそ
れによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書の配列の記載と矛盾があった場合に調節するも
のである。寄託材料を製造、使用または販売するために
はライセンスが必要であるが、そのようなライセンスは
ここで付与されるものではない。
【００４３】ポリペプチド 本発明はさらには図６ないし８（配列番号：２）の推定
アミノ酸配列を有する細菌性トポイソメラーゼＩポリペ
プチドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチドの
フラグメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語
は、図６ないし８（配列番号：２）のポリペプチドを称
していう場合、かかるポリペプチドと本質的に同一の生
物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。元のトポイソメラーゼＩの少なくとも９０％の活性
を保持するフラグメント、誘導体およびアナログが好ま
しい。元のトポイソメラーゼＩの少なくとも９５％の活
性を保持するフラグメント、誘導体およびアナログが好
ましい。従って、アナログは、プロタンパク質部分を切
断して活性成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプ
ロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは組換
えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプ
チドであってもよい。ある種の好ましい具体例では、こ
れは組換えポリペプチドである。
アミノ酸配列を有する細菌性トポイソメラーゼＩポリペ
プチドに関する。本発明はまたこれらのポリペプチドの
フラグメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語
は、図６ないし８（配列番号：２）のポリペプチドを称
していう場合、かかるポリペプチドと本質的に同一の生
物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。元のトポイソメラーゼＩの少なくとも９０％の活性
を保持するフラグメント、誘導体およびアナログが好ま
しい。元のトポイソメラーゼＩの少なくとも９５％の活
性を保持するフラグメント、誘導体およびアナログが好
ましい。従って、アナログは、プロタンパク質部分を切
断して活性成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプ
ロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは組換
えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプ
チドであってもよい。ある種の好ましい具体例では、こ
れは組換えポリペプチドである。
【００４４】図６ないし８（配列番号：２）のポリペプ
チドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、
（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が同類または非
同類アミノ酸残基（好ましくは同類アミノ酸残基）によ
り置換されたもので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗
号によりコードされたものであってもなくてもよい、ま
たは（ｉｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基
を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の
化合物、例えばポリペプチドの半減期を伸ばす化合物
（例えばポリエチレングリコール）と融合したもの、ま
たは（ｉｖ）付加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配
列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配
列の精製に用いられる配列などの成熟ポリペプチドと融
合したものでよい。かかるフラグメント、誘導体および
アナログは本明細書の教示より当業者の範疇であると考
えられる。
チドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、
（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が同類または非
同類アミノ酸残基（好ましくは同類アミノ酸残基）によ
り置換されたもので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝暗
号によりコードされたものであってもなくてもよい、ま
たは（ｉｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基
を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の
化合物、例えばポリペプチドの半減期を伸ばす化合物
（例えばポリエチレングリコール）と融合したもの、ま
たは（ｉｖ）付加アミノ酸がリーダーもしくは分泌配
列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配
列の精製に用いられる配列などの成熟ポリペプチドと融
合したものでよい。かかるフラグメント、誘導体および
アナログは本明細書の教示より当業者の範疇であると考
えられる。
【００４５】本発明はまた、式： Ｘ−（Ｒ1）n−（Ｒ2）−（Ｒ3）n−Ｙ 式中、アミノ末端で、Ｘは水素であり、カルボキシル末
端で、Ｙは水素または金属であり、Ｒ1とＲ3はいずれか
のアミノ酸残基であり、ｎは１と１０００の間の整数で
あり、Ｒ2は本発明のアミノ酸配列、特に配列番号：２
のポリペプチドである。式中、前記したＲ2はそのアミ
ノ末端残基が左側で、Ｒ1にペプチド結合を介して共有
結合し、そのカルボキシ末端残基が右側で、Ｒ3にペプ
チド結合を介して共有結合している。Ｒが１よりも大き
い場合、Ｒ基で示されるアミノ酸残基の鎖はヘテロポリ
マーまたはホモポリマーのいずれであってもよく、好ま
しくはヘテロポリマーである。
端で、Ｙは水素または金属であり、Ｒ1とＲ3はいずれか
のアミノ酸残基であり、ｎは１と１０００の間の整数で
あり、Ｒ2は本発明のアミノ酸配列、特に配列番号：２
のポリペプチドである。式中、前記したＲ2はそのアミ
ノ末端残基が左側で、Ｒ1にペプチド結合を介して共有
結合し、そのカルボキシ末端残基が右側で、Ｒ3にペプ
チド結合を介して共有結合している。Ｒが１よりも大き
い場合、Ｒ基で示されるアミノ酸残基の鎖はヘテロポリ
マーまたはホモポリマーのいずれであってもよく、好ま
しくはヘテロポリマーである。
【００４６】この点において、本発明の特に好ましい具
体例には、図６ないし８（配列番号：２）のスタフィロ
コッカス・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、そのフラグメント、アナログおよび誘導
体、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび誘
導体がある。好ましい変種には、同種アミノ酸置換によ
り対照と異なる変種がある。かかる置換は、ポリペプチ
ドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミノ酸で置
換したものである。典型的には、同類置換として認めら
れるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕおよ
びＩｌｅ間での相互の置き換え；水酸基ＳｅｒおよびＴ
ｈｒの交換、酸性基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り替え、ア
ミド基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性基Ｌｙｓ
およびＡｒｇの取り替えおよび芳香性基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
間での置き換えである。
体例には、図６ないし８（配列番号：２）のスタフィロ
コッカス・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、そのフラグメント、アナログおよび誘導
体、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび誘
導体がある。好ましい変種には、同種アミノ酸置換によ
り対照と異なる変種がある。かかる置換は、ポリペプチ
ドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミノ酸で置
換したものである。典型的には、同類置換として認めら
れるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕおよ
びＩｌｅ間での相互の置き換え；水酸基ＳｅｒおよびＴ
ｈｒの交換、酸性基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り替え、ア
ミド基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性基Ｌｙｓ
およびＡｒｇの取り替えおよび芳香性基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
間での置き換えである。
【００４７】この点に関するさらに好ましいのは、数
個、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または
０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠失
または付加した、図６ないし８（配列番号：２）のトポ
イソメラーゼＩポリペプチドのアミノ酸配列を有する、
変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに
そのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体であ
る。これらの中でもとりわけ好ましいのは、トポイソメ
ラーゼＩの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。またこの点において特に好
ましいのは、同類置換である。最も好ましいのは、置換
していない図６ないし８（配列番号：２）のアミノ酸配
列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチド
およびポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好
ましく、均質になるまで精製するのが好ましい。
個、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または
０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠失
または付加した、図６ないし８（配列番号：２）のトポ
イソメラーゼＩポリペプチドのアミノ酸配列を有する、
変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに
そのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体であ
る。これらの中でもとりわけ好ましいのは、トポイソメ
ラーゼＩの特性および活性を変化させないサイレント置
換、付加および欠失である。またこの点において特に好
ましいのは、同類置換である。最も好ましいのは、置換
していない図６ないし８（配列番号：２）のアミノ酸配
列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチド
およびポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好
ましく、均質になるまで精製するのが好ましい。
【００４８】本発明のポリペプチドは、図６ないし８
（配列番号：２）のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに図６ないし８（配列番号：２）のポ
リペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する
ポリペプチド、さらに好ましくは図６ないし８（配列番
号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類
似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）、
さらに好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するポ
リペプチド、なおさらに好ましくは図６ないし８（配列
番号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９５％の
同一性を有するポリペプチドを包含し、また一般に少な
くとも３０個の連続アミノ酸、さらに好ましくは少なく
とも５０個の連続アミノ酸を含むようなポリペプチド部
分を有する、かかるポリペプチド部分も包含する。本発
明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチ
ド合成により対応する完全長のポリペプチドを製造する
のに用いることができる；従って、該フラグメントは完
全長のポリペプチドを製造するための中間体として用い
ることができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオ
チドを合成することができる。
（配列番号：２）のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに図６ないし８（配列番号：２）のポ
リペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する
ポリペプチド、さらに好ましくは図６ないし８（配列番
号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類
似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）、
さらに好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するポ
リペプチド、なおさらに好ましくは図６ないし８（配列
番号：２）のポリペプチドに対して少なくとも９５％の
同一性を有するポリペプチドを包含し、また一般に少な
くとも３０個の連続アミノ酸、さらに好ましくは少なく
とも５０個の連続アミノ酸を含むようなポリペプチド部
分を有する、かかるポリペプチド部分も包含する。本発
明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチ
ド合成により対応する完全長のポリペプチドを製造する
のに用いることができる；従って、該フラグメントは完
全長のポリペプチドを製造するための中間体として用い
ることができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオ
チドを合成することができる。
【００４９】フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、トポイソ
メラーゼＩのフラグメント、特に図６ないし８（配列番
号：２）に示すアミノ酸を有するトポイソメラーゼＩの
フラグメント、および図６ないし８（配列番号：２）の
トポイソメラーゼＩの変種および誘導体のフラグメント
を有してなるポリペプチドがある。この点において、フ
ラグメントは前記のトポイソメラーゼＩポリペプチドお
よびその変種または誘導体のアミノ酸配列が、全てでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
メラーゼＩのフラグメント、特に図６ないし８（配列番
号：２）に示すアミノ酸を有するトポイソメラーゼＩの
フラグメント、および図６ないし８（配列番号：２）の
トポイソメラーゼＩの変種および誘導体のフラグメント
を有してなるポリペプチドがある。この点において、フ
ラグメントは前記のトポイソメラーゼＩポリペプチドお
よびその変種または誘導体のアミノ酸配列が、全てでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
【００５０】かかるフラグメントは「自立している」、
すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部ではな
いか、もしくはそれに融合したものか、または一部もし
くは領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれ
ていてもよい。より大きなポリペプチド内に含まれる場
合、本明細書で論じるフラグメントは単一の連続した領
域を形成するのが最も好ましい。しかしながら、フラグ
メントは単一の、より大きなポリペプチド内に含まれて
もよい。例えば、ある好ましい具体例は、トポイソメラ
ーゼＩフラグメントのアミノ末端に融合した異型のプレ
およびプロポリペプチド領域、および該フラグメントの
カルボキシル末端に融合した付加領域を有し、宿主中に
発現するように設計した前駆ポリペプチド内に含まれる
本発明のトポイソメラーゼＩポリペプチドのフラグメン
トに関する。従って、フラグメントは、本明細書の意図
する意味の一つの態様において、トポイソメラーゼＩ由
来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の一つのま
たは複数の部分を意味する。
すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部ではな
いか、もしくはそれに融合したものか、または一部もし
くは領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれ
ていてもよい。より大きなポリペプチド内に含まれる場
合、本明細書で論じるフラグメントは単一の連続した領
域を形成するのが最も好ましい。しかしながら、フラグ
メントは単一の、より大きなポリペプチド内に含まれて
もよい。例えば、ある好ましい具体例は、トポイソメラ
ーゼＩフラグメントのアミノ末端に融合した異型のプレ
およびプロポリペプチド領域、および該フラグメントの
カルボキシル末端に融合した付加領域を有し、宿主中に
発現するように設計した前駆ポリペプチド内に含まれる
本発明のトポイソメラーゼＩポリペプチドのフラグメン
トに関する。従って、フラグメントは、本明細書の意図
する意味の一つの態様において、トポイソメラーゼＩ由
来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の一つのま
たは複数の部分を意味する。
【００５１】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
例として、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４
０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９
０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１０
０〜１２５および１１０〜１４０、１２０〜１５０、２
００〜３００，１〜１７５または１〜６００のアミノ酸
の長さを有するポリヌクレオチドフラグメントが挙げら
れる。言及しうる本発明のポリヌクレオチドフラグメン
トの特定の例として、アミノ酸数１〜１７３、１〜５７
４および１９３〜４５１が挙げられる。これに鑑み、
「約」は特に言及した範囲、およびどちらかの末端また
は両方の末端で数個、少しの、５、４、３、２または1
個のアミノ酸が多いまたは少ない範囲を包含する。
例として、例えば、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４
０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９
０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１０
０〜１２５および１１０〜１４０、１２０〜１５０、２
００〜３００，１〜１７５または１〜６００のアミノ酸
の長さを有するポリヌクレオチドフラグメントが挙げら
れる。言及しうる本発明のポリヌクレオチドフラグメン
トの特定の例として、アミノ酸数１〜１７３、１〜５７
４および１９３〜４５１が挙げられる。これに鑑み、
「約」は特に言及した範囲、およびどちらかの末端また
は両方の末端で数個、少しの、５、４、３、２または1
個のアミノ酸が多いまたは少ない範囲を包含する。
【００５２】本発明の特に好ましいフラグメントには、
トポイソメラーゼＩの切断突然変異がある。切断突然変
異体は、アミノ末端を含む残基の一連の残基（すなわ
ち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル
末端を含む連続した一連の残基の欠失、または二重切断
突然変異のように一つはアミノ末端を含み、一つはカル
ボキシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を
除けば、図６ないし８（配列番号：２）のアミノ酸配列
を有するトポイソメラーゼＩポリペプチド、またはその
変種もしくは誘導体を包含する。前記した大きさの範囲
のフラグメントもまた切断フラグメントの好ましい具体
例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好まし
い。宿主細胞における本発明のポリヌクレオチドの減成
形態もまた好ましい。
トポイソメラーゼＩの切断突然変異がある。切断突然変
異体は、アミノ末端を含む残基の一連の残基（すなわ
ち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル
末端を含む連続した一連の残基の欠失、または二重切断
突然変異のように一つはアミノ末端を含み、一つはカル
ボキシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を
除けば、図６ないし８（配列番号：２）のアミノ酸配列
を有するトポイソメラーゼＩポリペプチド、またはその
変種もしくは誘導体を包含する。前記した大きさの範囲
のフラグメントもまた切断フラグメントの好ましい具体
例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好まし
い。宿主細胞における本発明のポリヌクレオチドの減成
形態もまた好ましい。
【００５３】また本発明のこの態様にて、トポイソメラ
ーゼＩの構造的または機能的属性により特徴づけられる
フラグメントも好ましい。この点において本発明の好ま
しい具体例は、トポイソメラーゼＩのアルファーヘリッ
クスおよびアルファーヘリックス形成領域（「アルファ
ー領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域
（「ベータ領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル領域」）、親水領域、疎水領域、アルファー
両親媒領域、ベータ両親媒領域、可変領域、表面形成領
域および高抗原性指標領域からなるフラグメントを包含
する。
ーゼＩの構造的または機能的属性により特徴づけられる
フラグメントも好ましい。この点において本発明の好ま
しい具体例は、トポイソメラーゼＩのアルファーヘリッ
クスおよびアルファーヘリックス形成領域（「アルファ
ー領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域
（「ベータ領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル領域」）、親水領域、疎水領域、アルファー
両親媒領域、ベータ両親媒領域、可変領域、表面形成領
域および高抗原性指標領域からなるフラグメントを包含
する。
【００５４】さらに好ましい領域は、トポイソメラーゼ
Ｉの活性を媒介する領域である。この点において、類似
活性もしくは改善された活性のある、または望ましくな
い活性を減じたフラグメントを含め、トポイソメラーゼ
Ｉの化学的、生物学的またはその他の活性を有するフラ
グメントが最も好ましい。慣用的に、周知方法にてフラ
グメントを生成し、ついで後記するような常法にてフラ
グメントの活性を天然のトポイソメラーゼＩと比較す
る。この点において、配列もしくは位置または両方にお
いて、バシラス・サチリス・トポイソメラーゼＩおよび
イー・コリトポイソメラーゼＩを包含する、図６ないし
８（配列番号：２）に示す関連ポリペプチドなどの関連
ポリペプチドの活性な領域に対して相同である領域を有
するフラグメントが非常に好ましい。この点に関して、
特に好ましいフラグメントには、本前記した切断突然変
異体がある。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメ
ントは、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的で
あるフラグメントである。本発明はまたとりわけ前記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌ
クレオチドに関する。この点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記するような、好ましいフラグメント
に対応するポリヌクレオチドである。
Ｉの活性を媒介する領域である。この点において、類似
活性もしくは改善された活性のある、または望ましくな
い活性を減じたフラグメントを含め、トポイソメラーゼ
Ｉの化学的、生物学的またはその他の活性を有するフラ
グメントが最も好ましい。慣用的に、周知方法にてフラ
グメントを生成し、ついで後記するような常法にてフラ
グメントの活性を天然のトポイソメラーゼＩと比較す
る。この点において、配列もしくは位置または両方にお
いて、バシラス・サチリス・トポイソメラーゼＩおよび
イー・コリトポイソメラーゼＩを包含する、図６ないし
８（配列番号：２）に示す関連ポリペプチドなどの関連
ポリペプチドの活性な領域に対して相同である領域を有
するフラグメントが非常に好ましい。この点に関して、
特に好ましいフラグメントには、本前記した切断突然変
異体がある。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメ
ントは、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的で
あるフラグメントである。本発明はまたとりわけ前記の
フラグメントをコードするポリヌクレオチド、そのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチド、特にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌ
クレオチドに関する。この点において、好ましいポリヌ
クレオチドは、前記するような、好ましいフラグメント
に対応するポリヌクレオチドである。
【００５５】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを有してなるベクター、本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発
明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞は、遺伝
子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポ
リペプチドを発現することができる。ポリヌクレオチド
の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒
介トランスフェクション、トランスポレーション、形質
導入、スクレイプ・負荷、バリスティック導入、感染ま
たは他の方法により行うことができる。かかる方法は多
くの標準的実験室マニュアル、例えばDavisら、Basic M
ethods in Molecular Biology，（1986）およびSambroo
kら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
クレオチドを有してなるベクター、本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発
明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞は、遺伝
子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポ
リペプチドを発現することができる。ポリヌクレオチド
の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒
介トランスフェクション、トランスポレーション、形質
導入、スクレイプ・負荷、バリスティック導入、感染ま
たは他の方法により行うことができる。かかる方法は多
くの標準的実験室マニュアル、例えばDavisら、Basic M
ethods in Molecular Biology，（1986）およびSambroo
kら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている。
【００５６】従来の方法で、宿主細胞内のポリヌクレオ
チド構築物を用いて、組換え配列によりコードされる遺
伝子産物を製造することができる。また、本発明のポリ
ペプチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現され
得る。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構築物に
由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を製造するこ
ともできる。原核および真核生物宿主を用いる適当なク
ローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecu
lar Cloning ：A Laboratory Manual，第２版、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コ
ールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）
に記載されている。
チド構築物を用いて、組換え配列によりコードされる遺
伝子産物を製造することができる。また、本発明のポリ
ペプチドは従来のペプチド合成により合成的に製造でき
る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌また
は他の細胞中、適当なプロモーターの制御下で発現され
得る。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構築物に
由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を製造するこ
ともできる。原核および真核生物宿主を用いる適当なク
ローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecu
lar Cloning ：A Laboratory Manual，第２版、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コ
ールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）
に記載されている。
【００５７】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および数字が続くように
デザインされている。本明細書に記載の出発プラスミド
は、市販されているか、汎用されているか、または周知
の汎用的操作を用いることにより利用可能なプラスミド
より構築することができる。本発明に従って用いること
のできる、多くのプラスミドおよび他のクローニングお
よび発現ベクターが周知であり、当業者であれば容易に
利用することもできる。
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
ウイルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般
に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字ｐ
を前に、および／または大文字および数字が続くように
デザインされている。本明細書に記載の出発プラスミド
は、市販されているか、汎用されているか、または周知
の汎用的操作を用いることにより利用可能なプラスミド
より構築することができる。本発明に従って用いること
のできる、多くのプラスミドおよび他のクローニングお
よび発現ベクターが周知であり、当業者であれば容易に
利用することもできる。
【００５８】ある点において中でも好ましいベクター
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現すべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、宿主
における発現に有効なシス作用調節領域を有してなる。
適当なトランス作用因子は宿主により供給されるか、補
足ベクターにより供給されるか、または宿主への導入時
にベクター自身により供給されるかのいずれかである。
この点におけるある好ましい具体例では、ベクターは特
異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導可能な
発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現する
か、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現であ
ってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ましい
ベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容易で
ある環境因子により発現を誘導できるベクターである。
本発明のこの態様に対して適当な種々ベクターは、原核
および真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現
ベクターを含め、当業者に周知であり、慣用されてい
る。
は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチの発現
のためのベクターである。一般に、かかるべクターは、
発現すべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、宿主
における発現に有効なシス作用調節領域を有してなる。
適当なトランス作用因子は宿主により供給されるか、補
足ベクターにより供給されるか、または宿主への導入時
にベクター自身により供給されるかのいずれかである。
この点におけるある好ましい具体例では、ベクターは特
異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘導可能な
発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発現する
か、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現であ
ってもよい。誘導可能なベクターのうち、特に好ましい
ベクターは、温度および栄養添加物などの操作が容易で
ある環境因子により発現を誘導できるベクターである。
本発明のこの態様に対して適当な種々ベクターは、原核
および真核宿主で用いられる構成および誘導可能な発現
ベクターを含め、当業者に周知であり、慣用されてい
る。
【００５９】非常に多くの種類の発現ベクターを用い
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパーボ（papo
va）ウイルス、ワクシナウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、擬狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルス由来のベクター、ならびにその組み合わせに
由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオ
ファージ遺伝的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド（phagemids）等があり、全て
本発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。
一般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌ
クレオチドを保持、伸長または発現するのに適したいず
れのベクターも、この点における発現に使用できる。
て、本発明のポリペプチドを発現できる。かかるベクタ
ーには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、
例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパーボ（papo
va）ウイルス、ワクシナウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、擬狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルス由来のベクター、ならびにその組み合わせに
由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオ
ファージ遺伝的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド（phagemids）等があり、全て
本発明のこの態様に準じた発現に用いることができる。
一般に、宿主にてポリペプチドを発現するためにポリヌ
クレオチドを保持、伸長または発現するのに適したいず
れのベクターも、この点における発現に使用できる。
【００６０】適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、適当な発現調節配列（複数でも
可）、例えばｍＲＮＡ転写を指示するプロモーター等に
機能的に連結する。かかるプロモーターの代表例として
は、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コリ・ｌ
ａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期
および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲ
のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を含み、
転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合部位を
含む。構築物により発現される成熟転写物のコーディン
グ部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻訳され
るポリペプチドの終末部分に適当に位置する終止コドン
を含む。
ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（1989）に記載されている方法などの種々の周知かつ
慣用的技法によりベクターに挿入できる。発現ベクター
におけるＤＮＡ配列は、適当な発現調節配列（複数でも
可）、例えばｍＲＮＡ転写を指示するプロモーター等に
機能的に連結する。かかるプロモーターの代表例として
は、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コリ・ｌ
ａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期
および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲ
のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を含み、
転写された領域では翻訳のためのリボソーム結合部位を
含む。構築物により発現される成熟転写物のコーディン
グ部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻訳され
るポリペプチドの終末部分に適当に位置する終止コドン
を含む。
【００６１】加えて、構築物は、発現を制御および誘起
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止を調節すること
により機能するであろう。伸長および発現のためのベク
ターは、一般に、選別可能なマーカーおよび増幅領域、
例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Laborator
y Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を包含
する。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばストレ
プトコッカス、スタフィロコッカス、イー・コリ、スト
レプトマイセスおよびバシラス・サチリス細胞；真菌細
胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロソフィラS２およびスポドプテラSf９細
胞；動物細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C１２７、３T
３、BHK、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；な
らびに植物細胞を含有する。
する調節領域を含有してもよい。一般に、多くの常套手
段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写
因子、レプレッサー結合部位および終止を調節すること
により機能するであろう。伸長および発現のためのベク
ターは、一般に、選別可能なマーカーおよび増幅領域、
例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Laborator
y Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を包含
する。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばストレ
プトコッカス、スタフィロコッカス、イー・コリ、スト
レプトマイセスおよびバシラス・サチリス細胞；真菌細
胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロソフィラS２およびスポドプテラSf９細
胞；動物細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C１２７、３T
３、BHK、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；な
らびに植物細胞を含有する。
【００６２】市販されている以下のベクターを例示とし
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラッタジーン（Ｓtratagen
e）より入手可能なｐＢＳベクター、ファジェスクリプ
ト（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Blues
cript）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐha
rmacia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；
およびｐBR322(ATCC37017)等がある。真核生物ベクター
で好ましいものは、ストラッタジーンより入手可能なｐ
ＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１お
よびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能なｐＳ
ＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ等がある。
これらのベクターは単に多くの市販のおよび周知のベク
ターの説明のために列挙しており、本発明のこの態様に
より使用するために、当業者に入手可能なベクターであ
る。宿主にて本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドを、例えば、導入、保持、伸長または発現するのに
適した他のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの
態様において使用できることは理解されよう。
て示す。細菌中で使用するのに好ましいベクターには、
キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０およびｐＱＥ−９；ストラッタジーン（Ｓtratagen
e）より入手可能なｐＢＳベクター、ファジェスクリプ
ト（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Blues
cript）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８ＡおよびｐＮＨ46Ａ；ならびにファルマシア（Ｐha
rmacia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；
およびｐBR322(ATCC37017)等がある。真核生物ベクター
で好ましいものは、ストラッタジーンより入手可能なｐ
ＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１お
よびｐＳＧ；ならびにファルマシアより入手可能なｐＳ
ＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ等がある。
これらのベクターは単に多くの市販のおよび周知のベク
ターの説明のために列挙しており、本発明のこの態様に
より使用するために、当業者に入手可能なベクターであ
る。宿主にて本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドを、例えば、導入、保持、伸長または発現するのに
適した他のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの
態様において使用できることは理解されよう。
【００６３】制限部位または候補プロモーター（candid
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有していてもよいフラグメントを導入するための部位の
下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユニ
ット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベクタ
ーを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモーター
領域を選択することができる。周知の様に、プロモター
含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位でベ
クターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こし、
標準的なＣＡＴアッセイにより検出できる。この目的に
適するベクター、ｐKK232-8およびｐCM7などは周知であ
り、容易に入手可能である。このように本発明のポリヌ
クレオチドを発現するためのプロモーターには、周知で
容易に入手できるプロモーターのみならず、リポーター
遺伝子を用いて前記の技術により容易に得ることができ
るプロモーターもある。
ate promoter）フラグメント、すなわちプロモーターを
有していてもよいフラグメントを導入するための部位の
下流に、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユニ
ット、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベクタ
ーを用いて、いずれか望ましい遺伝子からプロモーター
領域を選択することができる。周知の様に、プロモター
含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位でベ
クターに導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こし、
標準的なＣＡＴアッセイにより検出できる。この目的に
適するベクター、ｐKK232-8およびｐCM7などは周知であ
り、容易に入手可能である。このように本発明のポリヌ
クレオチドを発現するためのプロモーターには、周知で
容易に入手できるプロモーターのみならず、リポーター
遺伝子を用いて前記の技術により容易に得ることができ
るプロモーターもある。
【００６４】本発明によるポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（”ＲＳＶ”）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製の起源、好ましくは下流
の構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子に由来
のプロモーターおよびベクターへの暴露後の細胞を含有
するベクターの単離を可能とするための選択可能なマー
カーを含む。
ペプチドの発現に適した公知の原核生物プロモーターに
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモ
ーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモー
ター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロ
モーターがある。この点において適当な公知の真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、例えばラウス肉腫ウイルス（”ＲＳＶ”）のプロモ
ーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマ
ウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。組換え
発現ベクターは、例えば、複製の起源、好ましくは下流
の構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子に由来
のプロモーターおよびベクターへの暴露後の細胞を含有
するベクターの単離を可能とするための選択可能なマー
カーを含む。
【００６５】本発明のポリペプチドの異種性の構造配列
をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一般に標準
法を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機
能的に連結する。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５’にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現すべきポリペプチ
ドの翻訳を開始するＡＵＧの５’にある。一般に、開始
コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位およ
び開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフレー
ムは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端に翻
訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構築物
には、ポリアデニル化シグナルがある。転写領域の３’
末端に適宜配置される転写終止シグナルはまた、ポリヌ
クレオチド構築物に含まれていてもよい。
をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一般に標準
法を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機
能的に連結する。ポリヌクレオチドを、転写開始部位が
リボソーム結合部位に対して適宜５’にあるように位置
させる。リボソーム結合部位は、発現すべきポリペプチ
ドの翻訳を開始するＡＵＧの５’にある。一般に、開始
コドン、通常ＡＵＧで始まり、リボソーム結合部位およ
び開始ＡＵＧの間にある、オープンリーディングフレー
ムは他にない。また、一般に、ポリペプチドの末端に翻
訳停止コドンがあり、真核生物宿主で用いられる構築物
には、ポリアデニル化シグナルがある。転写領域の３’
末端に適宜配置される転写終止シグナルはまた、ポリヌ
クレオチド構築物に含まれていてもよい。
【００６６】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
を発現するポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに対して内在性であっても
よく、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチ
ドは、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で
発現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種
機能領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加され、精製中またはその後の
操作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続
性を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペ
プチドに領域を付加することもできる。かかる領域はポ
リペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド
部分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放
出を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にす
るのは、当該分野でよくあることであり、慣用される技
術である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを
可溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来
する異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国、対応特許２０４５８６９）は、免
疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタン
パク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示
する。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高
処理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部
分と融合させ、アンタゴニストを同定することができ
る。D.Bennettら、Journal of Molecular Recognitio
n，8：52-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal
of Biological Chemistry，270（16)：9459-9471（19
95）を参照のこと。
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
を発現するポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに対して内在性であっても
よく、または異種シグナルであってもよい。ポリペプチ
ドは、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で
発現してもよく、分泌シグナルのみならず付加的な異種
機能領域を有していてもよい。このように、例えば付加
アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、ポリペプチドの
Ｎ−またはＣ−末端に付加され、精製中またはその後の
操作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性および持続
性を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペ
プチドに領域を付加することもできる。かかる領域はポ
リペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチド
部分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放
出を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にす
るのは、当該分野でよくあることであり、慣用される技
術である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドを
可溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来
する異種領域を有してなる。例えばＥＰ−Ａ−０４６４
５３３（カナダ国、対応特許２０４５８６９）は、免
疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタン
パク質またはその一部とからなる融合タンパク質を開示
する。薬物の開発において、例えば、タンパク質を、高
処理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部
分と融合させ、アンタゴニストを同定することができ
る。D.Bennettら、Journal of Molecular Recognitio
n，8：52-58（1995）およびK.Johansonら、The Journal
of Biological Chemistry，270（16)：9459-9471（19
95）を参照のこと。
【００６７】ついで、典型的には、細胞を遠心分離によ
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解物質の
使用を含め、従来の方法により破壊でき、かかる方法は
当業者に周知である。
り収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得ら
れた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパ
ク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイク
ル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解物質の
使用を含め、従来の方法により破壊でき、かかる方法は
当業者に周知である。
【００６８】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’隣接非転写配列を有
してしてなる。この点におけるある好ましい具体例で
は、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位由来のＤＮＡ配列は、これらの型の必要とされ
る非転写遺伝的エレメントに用いられる。トポイソメラ
ーゼＩポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノ
ール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマ
トグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、周
知の方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製で
きる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離
および／または精製中に変性する場合、再び活性な立体
配座にするために、タンパク質を再生するための周知の
技術を用いることができる。
なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転
写終止配列および発現に必要な５’隣接非転写配列を有
してしてなる。この点におけるある好ましい具体例で
は、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニ
ル化部位由来のＤＮＡ配列は、これらの型の必要とされ
る非転写遺伝的エレメントに用いられる。トポイソメラ
ーゼＩポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノ
ール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマ
トグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、周
知の方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製で
きる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチドが単離
および／または精製中に変性する場合、再び活性な立体
配座にするために、タンパク質を再生するための周知の
技術を用いることができる。
【００６９】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、化学合成法の産物および組換え技法により原核
または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞から製造した産物を包含する。組
換え産生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドはグリコシル化されてもいてもまたはされてい
なくてもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、
ある場合は宿主媒介工程の結果として、開始修飾メチオ
ニン残基をも含んでいてもよい。トポイソメラーゼＩポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って
種々の用途、特にトポイソメラーゼＩの化学的および生
物学的特性を利用する用途に使用することができる。さ
らなる用途は、細胞、組織および生物の障害の診断およ
び治療に関する。本発明のこれらの態様を、以下におい
てさらに説明する。
た産物、化学合成法の産物および組換え技法により原核
または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆
虫および哺乳動物細胞から製造した産物を包含する。組
換え産生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドはグリコシル化されてもいてもまたはされてい
なくてもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、
ある場合は宿主媒介工程の結果として、開始修飾メチオ
ニン残基をも含んでいてもよい。トポイソメラーゼＩポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って
種々の用途、特にトポイソメラーゼＩの化学的および生
物学的特性を利用する用途に使用することができる。さ
らなる用途は、細胞、組織および生物の障害の診断およ
び治療に関する。本発明のこれらの態様を、以下におい
てさらに説明する。
【００７０】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのトポイソメラーゼＩポリヌク
レオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、
特にヒトにおいて細菌性トポイソメラーゼＩを検出する
ことにより、疾患の診断に加え、診断を限定し、または
診断を可能とする診断方法が得られる。トポイソメラー
ゼＩ産生細菌に感染した真核生物（本明細書において
「個体」とも称する）、特に哺乳動物、特にヒトを、種
々の技術により、ＤＮＡまたはRNAレベルで検出でき
る。診断用の核酸は個体の細胞および組織、例えば骨、
血液、筋肉、軟骨および皮膚から入手できる。組織生検
および剖検素材もまた、診断アッセイに用いるための個
体由来のサンプルとして好ましい。細菌性ＤＮＡは検出
に直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いて
酵素的に増幅してもよい。ＰＣＲ（Saikiら、Nature 32
4：163-166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同
様に用いることができる。一例として、トポイソメラー
ゼＩをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用
いて、トポイソメラーゼＩの存在および発現を同定およ
び分析できる。ＰＣＲを用いて、真核生物、特に哺乳動
物、特にヒトに存在する原核生物の株を、原核生物遺伝
子の遺伝子型の分析により特徴づけできる。例えば、対
照配列の遺伝子型との比較における、増幅産生の大きさ
の変化により欠失および挿入を検出できる。本発明の診
断方法にて特に有用なポリヌクレオチドは、配列番号：
３、４、５、６、７、１１、１２および１３からなる群
より選択されるプローブを包含する。点突然変異は増幅
したＤＮＡを放射標識したトポイソメラーゼＩＲＮＡ
に、また別法として放射標識したトポイソメラーゼＩア
ンチセンス ＤＮＡにハイブリダイゼーションすること
により同定できる。完全に対合する配列は、ＲＮａｓｅ
Ａ消化により、または融解温度の差異により、誤対合二
重らせんから区別できる。
レオチドを検出するためのトポイソメラーゼＩポリヌク
レオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、
特にヒトにおいて細菌性トポイソメラーゼＩを検出する
ことにより、疾患の診断に加え、診断を限定し、または
診断を可能とする診断方法が得られる。トポイソメラー
ゼＩ産生細菌に感染した真核生物（本明細書において
「個体」とも称する）、特に哺乳動物、特にヒトを、種
々の技術により、ＤＮＡまたはRNAレベルで検出でき
る。診断用の核酸は個体の細胞および組織、例えば骨、
血液、筋肉、軟骨および皮膚から入手できる。組織生検
および剖検素材もまた、診断アッセイに用いるための個
体由来のサンプルとして好ましい。細菌性ＤＮＡは検出
に直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いて
酵素的に増幅してもよい。ＰＣＲ（Saikiら、Nature 32
4：163-166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同
様に用いることができる。一例として、トポイソメラー
ゼＩをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用
いて、トポイソメラーゼＩの存在および発現を同定およ
び分析できる。ＰＣＲを用いて、真核生物、特に哺乳動
物、特にヒトに存在する原核生物の株を、原核生物遺伝
子の遺伝子型の分析により特徴づけできる。例えば、対
照配列の遺伝子型との比較における、増幅産生の大きさ
の変化により欠失および挿入を検出できる。本発明の診
断方法にて特に有用なポリヌクレオチドは、配列番号：
３、４、５、６、７、１１、１２および１３からなる群
より選択されるプローブを包含する。点突然変異は増幅
したＤＮＡを放射標識したトポイソメラーゼＩＲＮＡ
に、また別法として放射標識したトポイソメラーゼＩア
ンチセンス ＤＮＡにハイブリダイゼーションすること
により同定できる。完全に対合する配列は、ＲＮａｓｅ
Ａ消化により、または融解温度の差異により、誤対合二
重らせんから区別できる。
【００７１】対照遺伝子および突然変異を有する遺伝子
間の配列の違いはまた、直接的なＤＮＡ配列決定により
明らかにすることもできる。加えて、クローン化ＤＮＡ
セグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するための
プローブとして用いることができる。かかる方法の感度
は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することによ
り、非常に増強させることができる。例えば、配列決定
プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲによ
り生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、放
射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、ま
たは蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うことが
できる。ＤＮＡ配列の差異に基づく細菌の種々の株の遺
伝的タイピングは、変性剤を含むまたは含まないゲル中
のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出するこ
とにより達成できる。小型の配列の欠失および挿入は高
分析能ゲル電気泳動により可視化できる。種々の配列の
ＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融
解温度によって、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が
ゲル中の異なる位置で遅れるとする、変性ホルムアミド
勾配ゲル上にて区別できる（例えばMeyersら、Scienc
e，230:1242（1985）参照）。
間の配列の違いはまた、直接的なＤＮＡ配列決定により
明らかにすることもできる。加えて、クローン化ＤＮＡ
セグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するための
プローブとして用いることができる。かかる方法の感度
は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用することによ
り、非常に増強させることができる。例えば、配列決定
プライマーを二本鎖ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲによ
り生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、放
射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、ま
たは蛍光タグを用いる自動配列決定法により行うことが
できる。ＤＮＡ配列の差異に基づく細菌の種々の株の遺
伝的タイピングは、変性剤を含むまたは含まないゲル中
のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出するこ
とにより達成できる。小型の配列の欠失および挿入は高
分析能ゲル電気泳動により可視化できる。種々の配列の
ＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融
解温度によって、種々のＤＮＡフラグメントの移動度が
ゲル中の異なる位置で遅れるとする、変性ホルムアミド
勾配ゲル上にて区別できる（例えばMeyersら、Scienc
e，230:1242（1985）参照）。
【００７２】特異的な位置での配列の変化はまた、ＲＮ
ａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレアーゼ保護アッセ
イまたは化学的切断法によって明らかにすることができ
る（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:
4397-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼー
ション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配
列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメン
ト長多形性（restriction fragment length polymorphi
sm「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッ
ティングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出で
きる。従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加え
て、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ analys
is）により検出できる。
ａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレアーゼ保護アッセ
イまたは化学的切断法によって明らかにすることができ
る（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:
4397-4401（1985））。このように、ハイブリダイゼー
ション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配
列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメン
ト長多形性（restriction fragment length polymorphi
sm「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッ
ティングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出で
きる。従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加え
て、突然変異をまたインサイトウ分析（in situ analys
is）により検出できる。
【００７３】本発明の遺伝子の突然変異または多形型を
有する細胞をまた、例えば、セロタイピングを可能とす
る種々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもで
きる。診断用の核酸は、限定されるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検材を含む、感染した
固体の細胞、または上記した供給源より単離または培養
した細菌から得ることもできる。細菌性ＤＮＡを直接的
に検出するのに用いてもよく、または分析前にＰＣＲ
（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））を用いて酵
素的に増幅させてもよい。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変異
を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、
ＧeneＳcanなどの自動検出系と組み合わせて用いるのが
特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。一例
として、トポイソメラーゼＩをコードする核酸に相補的
なＰＣＲプライマーを用いて突然変異を同定および分析
することができる。プライマーの代表例を以下の表１に
示す。例えば、欠失および挿入を、正常の遺伝子型との
比較において、増幅産生の大きさの変化により検出でき
る。点突然変異は放射標識したＲＮＡ、また別法として
放射標識したアンチセンスＤＮＡ配列に増幅したＤＮＡ
をハイブリダイゼーションすることにより同定できる。
完全に対合した配列は、ＲＮaseＡ消化により、または
融解温度の差により、誤対合二重らせんと区別できる。
有する細胞をまた、例えば、セロタイピングを可能とす
る種々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもで
きる。診断用の核酸は、限定されるものではないが、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検材を含む、感染した
固体の細胞、または上記した供給源より単離または培養
した細菌から得ることもできる。細菌性ＤＮＡを直接的
に検出するのに用いてもよく、または分析前にＰＣＲ
（Saikiら、Nature 324：163-166（1986））を用いて酵
素的に増幅させてもよい。ＲＴ−ＰＣＲもまた突然変異
を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、
ＧeneＳcanなどの自動検出系と組み合わせて用いるのが
特に好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。一例
として、トポイソメラーゼＩをコードする核酸に相補的
なＰＣＲプライマーを用いて突然変異を同定および分析
することができる。プライマーの代表例を以下の表１に
示す。例えば、欠失および挿入を、正常の遺伝子型との
比較において、増幅産生の大きさの変化により検出でき
る。点突然変異は放射標識したＲＮＡ、また別法として
放射標識したアンチセンスＤＮＡ配列に増幅したＤＮＡ
をハイブリダイゼーションすることにより同定できる。
完全に対合した配列は、ＲＮaseＡ消化により、または
融解温度の差により、誤対合二重らせんと区別できる。
【００７４】
【表１】 トポイソメラーゼＩ遺伝子における突然変異または多形型の検出に用いたプライ マー 配列番号： ５’-GGGAAATGACATTGGCAGATA-３’ ３ ５’-CTTAAAATGTCTCTAGGGAATAA-３’ ４
【００７５】前記のプライマーは個体由来のサンプルか
ら単離したトポイソメラーゼＩｃＤＮＡの増幅に用いる
ことができる。本発明はまた、表１のプライマーの５’
および／または３’末端から１、２、３または４ヌクレ
オチドを除去したプライマーも提供する。該プライマー
を用いて個体から単離した遺伝子を増幅し、ついでその
遺伝子をＤＮＡ配列を明らかにするための種々の技法に
供してもよい。このようにして、ＤＮＡ配列における突
然変異を診断できる。
ら単離したトポイソメラーゼＩｃＤＮＡの増幅に用いる
ことができる。本発明はまた、表１のプライマーの５’
および／または３’末端から１、２、３または４ヌクレ
オチドを除去したプライマーも提供する。該プライマー
を用いて個体から単離した遺伝子を増幅し、ついでその
遺伝子をＤＮＡ配列を明らかにするための種々の技法に
供してもよい。このようにして、ＤＮＡ配列における突
然変異を診断できる。
【００７６】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、
細胞および組織中のトポイソメラーゼＩのレベルを検出
するための定量および診断アッセイなどの診断アッセイ
に関する。このように、例えば、正常な対照組織サンプ
ルと比較したトポイソメラーゼＩタンパク質の発現を検
出するための本発明に係る診断アッセイを用いて、感染
の存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中
の本発明のトポイソメラーゼＩタンパク質などのタンパ
ク質のレベルを測定するために用いることができるアッ
セイ技法は当業者に周知である。かかるアッセイ方法
は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含す
る。このうちＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡアッセ
イではまず、トポイソメラーゼＩに特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製する。加えて、モノク
ローナル抗体に結合するリポーター抗体が、一般に、調
製される。リポーター抗体は放射性、蛍光または酵素試
薬、この例においては西洋ワサビペルオキシダーゼなど
の検出可能な試薬に結合する。
細胞および組織中のトポイソメラーゼＩのレベルを検出
するための定量および診断アッセイなどの診断アッセイ
に関する。このように、例えば、正常な対照組織サンプ
ルと比較したトポイソメラーゼＩタンパク質の発現を検
出するための本発明に係る診断アッセイを用いて、感染
の存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中
の本発明のトポイソメラーゼＩタンパク質などのタンパ
ク質のレベルを測定するために用いることができるアッ
セイ技法は当業者に周知である。かかるアッセイ方法
は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含す
る。このうちＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡアッセ
イではまず、トポイソメラーゼＩに特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製する。加えて、モノク
ローナル抗体に結合するリポーター抗体が、一般に、調
製される。リポーター抗体は放射性、蛍光または酵素試
薬、この例においては西洋ワサビペルオキシダーゼなど
の検出可能な試薬に結合する。
【００７７】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元の全ポリペプチド
に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる抗
体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリペ
プチドを単離することができる。
またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、
それらに対する抗体を生成する免疫原として用いること
ができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、
ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラ
リーの産物を包含する。発明の配列に対応するポリペプ
チドに拮抗して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物
に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好まし
くはヒト以外の動物に投与することにより得ることがで
きる。このようにして得られた抗体はポリペプチドその
物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列であっても元の全ポリペプチド
に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる抗
体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリペ
プチドを単離することができる。
【００７８】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において知られているいずれかの技術を用いることがで
きる。例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Natur
e，256：495-497（1975）；Kozborら、Immunology Toda
y，4：72（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodiesa
nd Cancer Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（198
5）に記載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本
鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９
４６７７８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプ
チド産物に対する一本鎖抗体を産生することができる。
また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物な
どの他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド
産物に対するヒト化抗体を発現することができる。
的細胞系培養により産生される抗体を提供する当該分野
において知られているいずれかの技術を用いることがで
きる。例えば、Kohler，G.およびMilstein,C.，Natur
e，256：495-497（1975）；Kozborら、Immunology Toda
y，4：72（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodiesa
nd Cancer Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（198
5）に記載の方法などの種々の方法が挙げられる。一本
鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９
４６７７８号）を適用して、本発明の免疫原性ポリペプ
チド産物に対する一本鎖抗体を産生することができる。
また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物な
どの他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド
産物に対するヒト化抗体を発現することができる。
【００７９】別法として、ファージディスプレイ技術を
利用して、抗トポイソメラーゼI活性の保持に関してス
クリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅した
ｖ遺伝子のレパートリー由来の、または未処理のライブ
ラリー由来のポリペプチドに対する結合活性を有する抗
体遺伝子を選択することができる（McCafferty,J.ら、N
ature 348：552-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnol
ogy 10：779-783（1992））。これらの抗体の親和性
は、チェーンシャフリング（chain shuffling）（Clack
son,T.ら、Nature 352：624-628（1991））により改善
することもできる。２つの抗原結合ドメインがあるなら
ば、各ドメインは、「二特異的」抗体と称される、異な
るエピトープに対して方向づけられるかもしれない。
利用して、抗トポイソメラーゼI活性の保持に関してス
クリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅した
ｖ遺伝子のレパートリー由来の、または未処理のライブ
ラリー由来のポリペプチドに対する結合活性を有する抗
体遺伝子を選択することができる（McCafferty,J.ら、N
ature 348：552-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnol
ogy 10：779-783（1992））。これらの抗体の親和性
は、チェーンシャフリング（chain shuffling）（Clack
son,T.ら、Nature 352：624-628（1991））により改善
することもできる。２つの抗原結合ドメインがあるなら
ば、各ドメインは、「二特異的」抗体と称される、異な
るエピトープに対して方向づけられるかもしれない。
【００８０】前記の抗体を用いて、アフィニティクロマ
トグラフィーにより単離および／または精製するために
固体支持体へ抗体を結合させることにより、本発明のポ
リペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定し、
該ポリペプチドを精製することができる。従って、とり
わけトポイソメラーゼＩに対する抗体を用いて、感染、
特に細菌感染、特にスタフィロコッカス感染を阻害およ
び／または治療し、ならびに抗生物質治療の効能をモニ
ターすることができる。
トグラフィーにより単離および／または精製するために
固体支持体へ抗体を結合させることにより、本発明のポ
リペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定し、
該ポリペプチドを精製することができる。従って、とり
わけトポイソメラーゼＩに対する抗体を用いて、感染、
特に細菌感染、特にスタフィロコッカス感染を阻害およ
び／または治療し、ならびに抗生物質治療の効能をモニ
ターすることができる。
【００８１】ポリペプチド誘導体は，抗原的に、エピト
ープ的にまたは免疫学的に等価な誘導体を包含し、本発
明の特定の態様を成す。本明細書で用いる「抗原的に等
価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タンパク質
またはポリペプチドに対して誘起された場合、病原体お
よび哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨げ
るある種の抗体により特異的に認識されるであろうポリ
ペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細書で用
いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物
において抗体を誘起させるのに適した処方にて用いた場
合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時的な物
理的相互作用を妨げるように作用するペプチドまたはそ
れの同等物を包含する。
ープ的にまたは免疫学的に等価な誘導体を包含し、本発
明の特定の態様を成す。本明細書で用いる「抗原的に等
価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、タンパク質
またはポリペプチドに対して誘起された場合、病原体お
よび哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨げ
るある種の抗体により特異的に認識されるであろうポリ
ペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細書で用
いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物
において抗体を誘起させるのに適した処方にて用いた場
合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時的な物
理的相互作用を妨げるように作用するペプチドまたはそ
れの同等物を包含する。
【００８２】ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学
的に等価な誘導体またはそれらの融合タンパク質は、マ
ウスまたはその他の動物、例えばラットもしくはニワト
リを免疫するための抗原として使用できる。融合タンパ
ク質はポリペプチドに安定性を付与する。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれら
の抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重
コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良す
るために十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用
しなくてすむ。
的に等価な誘導体またはそれらの融合タンパク質は、マ
ウスまたはその他の動物、例えばラットもしくはニワト
リを免疫するための抗原として使用できる。融合タンパ
ク質はポリペプチドに安定性を付与する。抗原は、例え
ば、接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク
質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホ
ール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hae
mocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別法と
して、タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれら
の抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重
コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良す
るために十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用
しなくてすむ。
【００８３】抗体またはそれらの誘導体を修飾して、個
体における免疫原性を低下させるのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されてい
るのが最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の
抗体の相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクロー
ナル抗体に移されており、例えばJones,P.ら、Nature32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。
体における免疫原性を低下させるのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されてい
るのが最も好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の
抗体の相補性決定領域（複数でも可）がヒトモノクロー
ナル抗体に移されており、例えばJones,P.ら、Nature32
1：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology
9：266-273（1991）に記載されている。
【００８４】本発明のポリヌクレオチドを遺伝的免疫に
使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの
筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（19
92）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264：16985（1989））、リ
ン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Res
hef、Proc.Nat'l.Acad.Sci.83：9551（1986））、種々
の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（Kanedaら、Scie
nce 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature
356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.1
2：791（1993））およびクローン化レトロウイルスを用
いたインビボ感染（Seegerら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. 8
1：5849（1984））などの適当な送達方法を用いる。
使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの
筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（19
92）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4：419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡ
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264：16985（1989））、リ
ン酸カルシウムを用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Res
hef、Proc.Nat'l.Acad.Sci.83：9551（1986））、種々
の形態のリポソーム中のＤＮＡ封入化（Kanedaら、Scie
nce 243：375（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature
356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.1
2：791（1993））およびクローン化レトロウイルスを用
いたインビボ感染（Seegerら、Proc.Nat'l.Acad.Sci. 8
1：5849（1984））などの適当な送達方法を用いる。
【００８５】トポイソメラーゼＩ結合分子およびアッセ
イ 本発明はまた、トポイソメラーゼＩに結合する結合分子
のごとき分子の同定方法をも提供する。トポイソメラー
ゼＩに結合するタンパク質、例えば結合タンパク質をコ
ードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、例えば
リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティングより同
定できる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例え
ばColiganら、Current Protocols in Immunology、1
(2)：第5章（1991）に記載されている。例えば発現クロ
ーニングはこの目的のために用いることができる。この
目的のために、ポリアデニル化ＲＮＡをトポイソメラー
ゼＩを発現する細胞から調製し、このＲＮＡからｃＤＮ
Ａライブラリーを作り、ライブラリーをプールに分割
し、プールをトポイソメラーゼＩを発現しない細胞に個
々にトランスフェクトする。ついで、トランスフェクト
した細胞を標識したトポイソメラーゼＩに曝露する。ト
ポイソメラーゼＩは、放射性ヨウ素化または部位特異的
タンパク質キナーゼ用の認識部位の封入の標準法を包含
する種々の周知の技術により標識できる。曝露した後、
細胞を固定し、トポイソメラーゼＩの結合を測定する。
これらの方法は便宜上ガラススライド上で実施する。
イ 本発明はまた、トポイソメラーゼＩに結合する結合分子
のごとき分子の同定方法をも提供する。トポイソメラー
ゼＩに結合するタンパク質、例えば結合タンパク質をコ
ードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、例えば
リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティングより同
定できる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例え
ばColiganら、Current Protocols in Immunology、1
(2)：第5章（1991）に記載されている。例えば発現クロ
ーニングはこの目的のために用いることができる。この
目的のために、ポリアデニル化ＲＮＡをトポイソメラー
ゼＩを発現する細胞から調製し、このＲＮＡからｃＤＮ
Ａライブラリーを作り、ライブラリーをプールに分割
し、プールをトポイソメラーゼＩを発現しない細胞に個
々にトランスフェクトする。ついで、トランスフェクト
した細胞を標識したトポイソメラーゼＩに曝露する。ト
ポイソメラーゼＩは、放射性ヨウ素化または部位特異的
タンパク質キナーゼ用の認識部位の封入の標準法を包含
する種々の周知の技術により標識できる。曝露した後、
細胞を固定し、トポイソメラーゼＩの結合を測定する。
これらの方法は便宜上ガラススライド上で実施する。
【００８６】トポイソメラーゼＩ結合細胞を生成するｃ
ＤＮＡのプールを同定する。これらの陽性体からサブプ
ールを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、前記の
とおりスクリーニングする。サブプール化および再スク
リーニング法を繰り返し、結合分子などの推定される結
合分子をコードする１またはそれ以上の単一のクローン
を単離できる。別法として、標識リガンドを、結合分子
のごときそれが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和的に連
結できる。架橋した物質をポリアクリルアミドゲル電気
泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離し、Ｘ線フィルムに曝
露する。リガンド結合を含有する標識複合体を切除し、
ペプチドフラグメントに分解し、タンパク質マイクロシ
ークエンシングに供することができる。マイクロシーク
エンシングにより得られたアミノ酸配列を用いて、推定
される結合分子をコードする遺伝子を同定する、ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングする独特なまたは同義
性オリゴヌクレオチドプローブを設計することができ
る。本発明のポリペプチドはまた、細胞中、または無細
胞調製物中の、トポイソメラーゼＩ結合分子、例えば結
合分子のトポイソメラーゼＩ結合能力を評価するために
使用できる。本発明のポリペプチドを用いて、例えば細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然の
生成物混合物中の小型分子基質とリガンドとの結合を評
価することもできる。
ＤＮＡのプールを同定する。これらの陽性体からサブプ
ールを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、前記の
とおりスクリーニングする。サブプール化および再スク
リーニング法を繰り返し、結合分子などの推定される結
合分子をコードする１またはそれ以上の単一のクローン
を単離できる。別法として、標識リガンドを、結合分子
のごときそれが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和的に連
結できる。架橋した物質をポリアクリルアミドゲル電気
泳動（「ＰＡＧＥ」）により分離し、Ｘ線フィルムに曝
露する。リガンド結合を含有する標識複合体を切除し、
ペプチドフラグメントに分解し、タンパク質マイクロシ
ークエンシングに供することができる。マイクロシーク
エンシングにより得られたアミノ酸配列を用いて、推定
される結合分子をコードする遺伝子を同定する、ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングする独特なまたは同義
性オリゴヌクレオチドプローブを設計することができ
る。本発明のポリペプチドはまた、細胞中、または無細
胞調製物中の、トポイソメラーゼＩ結合分子、例えば結
合分子のトポイソメラーゼＩ結合能力を評価するために
使用できる。本発明のポリペプチドを用いて、例えば細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然の
生成物混合物中の小型分子基質とリガンドとの結合を評
価することもできる。
【００８７】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 前記したように、ＤＮＡ密度の増加および減少は、環境
攻撃に対する細菌応答に付随している。従って、調節す
ること、すなわち、作動または拮抗することで、適当な
応答が潜在的抗生物質効果をもたらしうる。本発明はま
た、細胞上のトポイソメラーゼＩの作用、例えば、スー
パーコイル化ＤＮＡなどの基質との相互作用を亢進また
は遮断する化合物を同定するための化合物のスクリーニ
ング方法をも提供する。細胞にてトポイソメラーゼIの
作用を遮断する化合物は毒として作用し、ＤＮＡとの共
有結合にてトポイソメラーゼIを安定化し、細胞成長に
おいて阻害効果をもたらす、化合物を包含する。アンタ
ゴニストはトポイソメラーゼＩの天然の生物学的機能を
低下させる化合物である。アゴニストはトポイソメラー
ゼＩの天然の生物学的機能を増強する化合物である。
イおよび分子 前記したように、ＤＮＡ密度の増加および減少は、環境
攻撃に対する細菌応答に付随している。従って、調節す
ること、すなわち、作動または拮抗することで、適当な
応答が潜在的抗生物質効果をもたらしうる。本発明はま
た、細胞上のトポイソメラーゼＩの作用、例えば、スー
パーコイル化ＤＮＡなどの基質との相互作用を亢進また
は遮断する化合物を同定するための化合物のスクリーニ
ング方法をも提供する。細胞にてトポイソメラーゼIの
作用を遮断する化合物は毒として作用し、ＤＮＡとの共
有結合にてトポイソメラーゼIを安定化し、細胞成長に
おいて阻害効果をもたらす、化合物を包含する。アンタ
ゴニストはトポイソメラーゼＩの天然の生物学的機能を
低下させる化合物である。アゴニストはトポイソメラー
ゼＩの天然の生物学的機能を増強する化合物である。
【００８８】Barrettら、Antimicrob.Ａgents.Ｃhemocb
er. 34：1（1990）は、トポイソメラーゼの阻害を測定
するのに用いることのできるインビトロアッセイを報告
する。これらのアッセイは触媒アッセイと非触媒アッセ
イに分類できる。細菌性トポイソメラーゼI用の触媒ア
ッセイは、例えば、スーパーコイル化DNAの緩和を測定
することからなる。「切断複合体」アッセイとしても知
られている非触媒アッセイは、鍵となる共有反応中間体
の形成をするものである。Ｆroelich−ＡmmonおよびＯs
heroff Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 270：21429（1995）はトポイ
ソメラーゼ毒の非触媒アッセイの機構的原理を開示して
いる。
er. 34：1（1990）は、トポイソメラーゼの阻害を測定
するのに用いることのできるインビトロアッセイを報告
する。これらのアッセイは触媒アッセイと非触媒アッセ
イに分類できる。細菌性トポイソメラーゼI用の触媒ア
ッセイは、例えば、スーパーコイル化DNAの緩和を測定
することからなる。「切断複合体」アッセイとしても知
られている非触媒アッセイは、鍵となる共有反応中間体
の形成をするものである。Ｆroelich−ＡmmonおよびＯs
heroff Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 270：21429（1995）はトポイ
ソメラーゼ毒の非触媒アッセイの機構的原理を開示して
いる。
【００８９】スーパーコイル化DNA緩和アッセイ 緩和反応の阻害剤についてスクリーニングするために、
候補の阻害剤およびトポイソメラーゼＩの調製物を、Ｍ
ｇ2+または別の二価金属イオン含有の適当な緩衝液中、
スーパーコイル化ＤＮＡ基質、例えば、プラスミドまた
はファージＤＮＡと一緒にインキュベートする。反応生
成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチ
ジウム染色により可視化し、密度計により定量する。
候補の阻害剤およびトポイソメラーゼＩの調製物を、Ｍ
ｇ2+または別の二価金属イオン含有の適当な緩衝液中、
スーパーコイル化ＤＮＡ基質、例えば、プラスミドまた
はファージＤＮＡと一緒にインキュベートする。反応生
成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチ
ジウム染色により可視化し、密度計により定量する。
【００９０】ＤＮＡオリゴマー切断アッセイ 適当な切断部位、例えば２２量体、ＧＡＡＴＧＡＧＣＣ
ＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴ（配列番号：１１）を含有
する単鎖ＤＮＡオリゴマーまたは適宜標識した誘導体を
基質として用いる。適当な標識は、使用する個々のアッ
セイに従って、オリゴの５’または３’で結合した放射
性標識または蛍光発色団である。緩衝液はＭｇ2+または
別の二価金属イオンを含有してもよい。 Ｍｇ2+は切断
反応に必須ではないが、それを含んでいることがある種
の阻害剤の相互反応を促進するのに望ましい。反応を適
当な変性剤、例えば１％ＳＤＳまたは１００ｍＭ Ｎａ
ＯＨを添加することで停止させる。切断可能な複合体の
形成（鍵となる共有反応の中間体の安定化）は、多くの
方法により測定することができる。例えば、変性ポリア
クリルアミドゲルを用いる電気泳動を使用して、密度計
により定量することのできる５’標識化切断ＤＮＡ産物
を分離する。また、３’標識化ＤＮＡ産物をトポイソメ
ラーゼＩとの共有結合により検定してもよい。これは、
沈殿タンパク質に伴う放射標識したＤＮＡを測定する、
ＳＤＳ／Ｋ沈殿アッセイにより、またはトポイソメラー
ゼＩを抗体を用いて固定する、捕獲アッセイフォーマッ
トにより行い、結合した標識ＤＮＡの量を測定すること
ができる。
ＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴ（配列番号：１１）を含有
する単鎖ＤＮＡオリゴマーまたは適宜標識した誘導体を
基質として用いる。適当な標識は、使用する個々のアッ
セイに従って、オリゴの５’または３’で結合した放射
性標識または蛍光発色団である。緩衝液はＭｇ2+または
別の二価金属イオンを含有してもよい。 Ｍｇ2+は切断
反応に必須ではないが、それを含んでいることがある種
の阻害剤の相互反応を促進するのに望ましい。反応を適
当な変性剤、例えば１％ＳＤＳまたは１００ｍＭ Ｎａ
ＯＨを添加することで停止させる。切断可能な複合体の
形成（鍵となる共有反応の中間体の安定化）は、多くの
方法により測定することができる。例えば、変性ポリア
クリルアミドゲルを用いる電気泳動を使用して、密度計
により定量することのできる５’標識化切断ＤＮＡ産物
を分離する。また、３’標識化ＤＮＡ産物をトポイソメ
ラーゼＩとの共有結合により検定してもよい。これは、
沈殿タンパク質に伴う放射標識したＤＮＡを測定する、
ＳＤＳ／Ｋ沈殿アッセイにより、またはトポイソメラー
ゼＩを抗体を用いて固定する、捕獲アッセイフォーマッ
トにより行い、結合した標識ＤＮＡの量を測定すること
ができる。
【００９１】全細胞アッセイ 潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストならびに毒の
トポイソメラーゼＩ様効果は、例えば、候補分子と細胞
または適当な細胞調製物との相互作用の後の遺伝子発現
における変化に感受的なリポーターステムの活性を決定
することにより測定できる。この点において有用なリポ
ーターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、
トポイソメラーゼＩ活性の変化に応答するリポーター遺
伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを包含する
が、これらに限定するものではない。
トポイソメラーゼＩ様効果は、例えば、候補分子と細胞
または適当な細胞調製物との相互作用の後の遺伝子発現
における変化に感受的なリポーターステムの活性を決定
することにより測定できる。この点において有用なリポ
ーターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、
トポイソメラーゼＩ活性の変化に応答するリポーター遺
伝子、および当該分野で公知の結合アッセイを包含する
が、これらに限定するものではない。
【００９２】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
滅させるか、またはＤＮＡとのキー共有結合反応中間体
を安定化する、小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド
および抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、
トポイソメラーゼＩ誘導活性を誘発することなく、結合
分子などの結合分子の同一の部位に結合する、密接に関
連したタンパク質または抗体などの小型有機分子、ペプ
チド、ポリペプチドであってもよく、それによりトポイ
ソメラーゼＩを結合から排除してトポイソメラーゼＩの
作用を妨げる。潜在的アンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合し、結合部位を占領し、それにより結
合分子などの細胞性結合分子への結合を妨げ、正常の生
物学的活性を妨げる、小型分子を包含する。小型分子と
しては、例えば、小型有機分子、ペプチドまたはペプチ
ド様分子を包含するが、これらに限定するものではな
い。
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
滅させるか、またはＤＮＡとのキー共有結合反応中間体
を安定化する、小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド
および抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、
トポイソメラーゼＩ誘導活性を誘発することなく、結合
分子などの結合分子の同一の部位に結合する、密接に関
連したタンパク質または抗体などの小型有機分子、ペプ
チド、ポリペプチドであってもよく、それによりトポイ
ソメラーゼＩを結合から排除してトポイソメラーゼＩの
作用を妨げる。潜在的アンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合し、結合部位を占領し、それにより結
合分子などの細胞性結合分子への結合を妨げ、正常の生
物学的活性を妨げる、小型分子を包含する。小型分子と
しては、例えば、小型有機分子、ペプチドまたはペプチ
ド様分子を包含するが、これらに限定するものではな
い。
【００９３】その他の潜在的なアンタゴニストはアンチ
センス分子を包含する。アンチセンス技術を用いて、ア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または二重も
しくは三重らせん形成により遺伝子発現を調節すること
ができる。アンチセンス技術については、例えばOkano,
J.、Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，Ｃ
ＲＣプレス、ボッカ・ラートン、フロリダ（1988）に記
載されている。三重らせん形成については、例えばLee
ら、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；Cooney
ら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Scie
nce 251：1360（1991）に記載されている。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの
結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの５‘コーディング部
分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であり、それによりトポイソメラーゼＩの転
写および生成を妨げるように設計する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、ｍＲＮＡ分子のトポイソメラーゼＩポリペ
プチドへの翻訳を遮断する。前記のオリゴヌクレオチド
はまた、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡをインビボで発現し、トポイソメラーゼＩの生成を
阻害することもできる。
センス分子を包含する。アンチセンス技術を用いて、ア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または二重も
しくは三重らせん形成により遺伝子発現を調節すること
ができる。アンチセンス技術については、例えばOkano,
J.、Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，Ｃ
ＲＣプレス、ボッカ・ラートン、フロリダ（1988）に記
載されている。三重らせん形成については、例えばLee
ら、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；Cooney
ら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Scie
nce 251：1360（1991）に記載されている。この方法
は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの
結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの５‘コーディング部
分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であり、それによりトポイソメラーゼＩの転
写および生成を妨げるように設計する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、ｍＲＮＡ分子のトポイソメラーゼＩポリペ
プチドへの翻訳を遮断する。前記のオリゴヌクレオチド
はまた、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡをインビボで発現し、トポイソメラーゼＩの生成を
阻害することもできる。
【００９４】好ましい潜在的アンタゴニストは、本明細
書で提供する各々のＤＮＡ配列が、抗細菌化合物の発見
および開発に用いられる化合物およびその誘導体を包含
する。発現でコードされたタンパク質は、抗菌剤のスク
リーニングのための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質またはShine-Delgarnoの
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列または他の個々
のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的のコーディ
ング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築する
ことがきる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニスト
は、例えば以下に記載するような、医薬上許容できる担
体と共に組成物として用いることができる。このアンタ
ゴニストおよびアゴニストを用いて、スタフィロコッカ
ス感染を阻害することができる。
書で提供する各々のＤＮＡ配列が、抗細菌化合物の発見
および開発に用いられる化合物およびその誘導体を包含
する。発現でコードされたタンパク質は、抗菌剤のスク
リーニングのための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質またはShine-Delgarnoの
アミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列または他の個々
のｍＲＮＡの翻訳容易化配列を用いて、目的のコーディ
ング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築する
ことがきる。本発明のアンタゴニストおよびアゴニスト
は、例えば以下に記載するような、医薬上許容できる担
体と共に組成物として用いることができる。このアンタ
ゴニストおよびアゴニストを用いて、スタフィロコッカ
ス感染を阻害することができる。
【００９５】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なトポイソメラーゼＩ、またはその抗原性フラグメ
ントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、特に
細菌感染、とりわけスタフィロコッカス感染から保護す
ることからなる方法に関する。本発明のまた別の態様
は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、遺
伝子治療により免疫学的応答を誘発させるためにトポイ
ソメラーゼＩまたはそのフラグメントもしくは変種をイ
ンビボで発現させるのにトポイソメラーゼＩまたはその
フラグメントもしくは変種をコードする遺伝子を送達
し、抗体を生成し、該個体を疾患から保護する方法に関
する。
学的応答を誘起する方法であって、抗体を生成するのに
適当なトポイソメラーゼＩ、またはその抗原性フラグメ
ントもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、特に
細菌感染、とりわけスタフィロコッカス感染から保護す
ることからなる方法に関する。本発明のまた別の態様
は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、遺
伝子治療により免疫学的応答を誘発させるためにトポイ
ソメラーゼＩまたはそのフラグメントもしくは変種をイ
ンビボで発現させるのにトポイソメラーゼＩまたはその
フラグメントもしくは変種をコードする遺伝子を送達
し、抗体を生成し、該個体を疾患から保護する方法に関
する。
【００９６】本発明のさらなる態様は、免疫学的応答を
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、そのような宿主中でトポイソメラーゼＩまたはそれ
によりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、該トポイソメラーゼ
Ｉの抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそれにより
コードされるタンパク質を含んでなる、組換えトポイソ
メラーゼＩまたはそれによりコードされるタンパク質を
有してなる組成物に関する。トポイソメラーゼＩまたは
そのフラグメントは、それ自身は抗体を産生しないが、
第１のタンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性
を有する融合タンパク質を形成することができる補タン
パク質（co-protein）と融合できる。このように融合し
た組換えタンパク質は、好ましくはさらに抗原性補タン
パク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ、タンパク
質を可溶化し、その生成および精製を容易にする比較的
大きな補タンパク質を有してなる。さらには、補タンパ
ク質は、免疫系の汎用刺激を提供するという意味で、ア
ジュバントとして作用し得る。補タンパク質は第１のタ
ンパク質のアミノまたはカルボキシル末端のいずれに結
合してもよい。
宿主内に誘起できる、または誘起した宿主に導入した場
合、そのような宿主中でトポイソメラーゼＩまたはそれ
によりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、該トポイソメラーゼ
Ｉの抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそれにより
コードされるタンパク質を含んでなる、組換えトポイソ
メラーゼＩまたはそれによりコードされるタンパク質を
有してなる組成物に関する。トポイソメラーゼＩまたは
そのフラグメントは、それ自身は抗体を産生しないが、
第１のタンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性
を有する融合タンパク質を形成することができる補タン
パク質（co-protein）と融合できる。このように融合し
た組換えタンパク質は、好ましくはさらに抗原性補タン
パク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ、タンパク
質を可溶化し、その生成および精製を容易にする比較的
大きな補タンパク質を有してなる。さらには、補タンパ
ク質は、免疫系の汎用刺激を提供するという意味で、ア
ジュバントとして作用し得る。補タンパク質は第１のタ
ンパク質のアミノまたはカルボキシル末端のいずれに結
合してもよい。
【００９７】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮膚内投与を含め、非経口的に投与するの
が好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩
衝液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは
血液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水
性滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有して
いてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処
方は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封した
アンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌
液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵して
もよい。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高める
アジュバント系、例えば水中油系または当該分野で公知
の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活
性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定できる。
本発明はある種のトポイソメラーゼＩに関して記載され
ているが、これは天然のタンパク質および、実質的に組
換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失ま
たは置換を施した類似のタンパク質のフラグメント（例
えば、５０％またはそれ以上の配列相同性を有する）を
包含することが理解されよう。
と、適当な担体とからなるワクチン処方を包含する。タ
ンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、
静脈内または皮膚内投与を含め、非経口的に投与するの
が好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩
衝液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは
血液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水
性滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有して
いてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処
方は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封した
アンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌
液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵して
もよい。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高める
アジュバント系、例えば水中油系または当該分野で公知
の他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活
性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定できる。
本発明はある種のトポイソメラーゼＩに関して記載され
ているが、これは天然のタンパク質および、実質的に組
換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失ま
たは置換を施した類似のタンパク質のフラグメント（例
えば、５０％またはそれ以上の配列相同性を有する）を
包含することが理解されよう。
【００９８】組成物 本発明はまた前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物と共に使用するための滅菌していな
いもしくは滅菌した担体と組み合わせて用いることがで
きる。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治
療上有効量の本発明のポリペプチド、および医薬上許容
できる担体または賦形剤からなる。このような担体は、
食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロー
ル、エタノールおよびそれらの組み合わせを包含する
が、これらに限定するものではない。処方は投与法に適
合させなければならない。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチ
ドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細
胞、組織または生物と共に使用するための滅菌していな
いもしくは滅菌した担体と組み合わせて用いることがで
きる。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治
療上有効量の本発明のポリペプチド、および医薬上許容
できる担体または賦形剤からなる。このような担体は、
食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロー
ル、エタノールおよびそれらの組み合わせを包含する
が、これらに限定するものではない。処方は投与法に適
合させなければならない。
【００９９】キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を1ま
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製造、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
たはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器からな
る診断用および医薬用パックおよびキットに関する。こ
のような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生
成物の製造、使用または販売を規制する政府機関による
命令形態の、ヒトへの投与用の産物の製造、使用または
販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付す
ることができる。
【０１００】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまた
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症の状態
等を考慮に入れて、各々の治療様式および適応症につい
ての標準法により決定されることは理解されよう。
は治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いる
ことができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、
経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合の
よい方法で投与できる。医薬組成物は、一般に、個々の
適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量
にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。大抵の場合、投与
量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与
される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり
約１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投
与量は、適応症、その重篤度、投与経路、合併症の状態
等を考慮に入れて、各々の治療様式および適応症につい
ての標準法により決定されることは理解されよう。
【０１０１】治療において、または予防用に、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、浸透包帯および縫合糸
ならびにエアロゾールの形態に処方してもよく、例えば
保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およ
びクリームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤
を含有してもよい。このような局所用処方はまた、適合
可能な慣用的担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、お
よびローションの場合、エタノールまたはオレイルアル
コールを含めてもよい。このような担体は処方の約１％
から約９８重量％であってもよく；より一般的には、処
方の約８０重量％までとする。
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の滅菌
水性分散物として個体に投与できる。また、組成物は、
局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼
軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、浸透包帯および縫合糸
ならびにエアロゾールの形態に処方してもよく、例えば
保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およ
びクリームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤
を含有してもよい。このような局所用処方はまた、適合
可能な慣用的担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、お
よびローションの場合、エタノールまたはオレイルアル
コールを含めてもよい。このような担体は処方の約１％
から約９８重量％であってもよく；より一般的には、処
方の約８０重量％までとする。
【０１０２】哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効
成分の1日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、年齢、体重および個々の個体の応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高量および低量の範囲が適合する個々
の例もあり、これらは本発明の範囲内である。内在デバ
イスには外科的インプラント、プロテーゼデバイスおよ
びカテーテル、即ち個体の体内に導入し、長時間その位
置に存在するデバイスを包含する。このようなデバイス
には、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管
移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテー
テル、持続的外来腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテル等を
包含する。
成分の1日あたりの投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投
与量を決定し、年齢、体重および個々の個体の応答に応
じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例で
ある。もちろん、高量および低量の範囲が適合する個々
の例もあり、これらは本発明の範囲内である。内在デバ
イスには外科的インプラント、プロテーゼデバイスおよ
びカテーテル、即ち個体の体内に導入し、長時間その位
置に存在するデバイスを包含する。このようなデバイス
には、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管
移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテー
テル、持続的外来腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテル等を
包含する。
【０１０３】本発明の組成物は注射により投与し、内在
デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的
な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内に
在る時間、治療を続けてよい。加えて、外科的手技のた
めに手術中用カバーを広げて、スタフィロコッカス創傷
感染を防御するために用いることができる。多くの整形
外科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生
じ得る歯科的治療の前に、抗生物質予防法を考慮すべき
であると考える。遅延性の重篤な感染は、時にはプロテ
ーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のあ
る羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防
的な抗生物質の代わりに、活性物質の用途を拡張するこ
とが可能である。
デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的
な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内に
在る時間、治療を続けてよい。加えて、外科的手技のた
めに手術中用カバーを広げて、スタフィロコッカス創傷
感染を防御するために用いることができる。多くの整形
外科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生
じ得る歯科的治療の前に、抗生物質予防法を考慮すべき
であると考える。遅延性の重篤な感染は、時にはプロテ
ーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のあ
る羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防
的な抗生物質の代わりに、活性物質の用途を拡張するこ
とが可能である。
【０１０４】前記の治療に加え、本発明の組成物は、一
般に、創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露し
たマトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、
歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、または
それと組み合わせて、予防的に使用できる。また、本発
明の組成物を用いて、挿入直前に内在デバイスを浸して
もよい。有効成分は創傷または内在デバイスを浸すため
に１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好
ましい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが
都合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高める
ために用いることができる。ワクチン化に適した単位投
与量は、抗原０．５〜５μｇ／ｋｇであり、このような
投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好まし
い。提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当
な個体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察
されない。前記の抗体もまた、トポイソメラーゼを含有
する細菌の存在を検出するための診断試薬として使用で
きる。本明細書に開示されている文献を、出典明示によ
りその全内容を本明細書の一部とする。本願が先に請求
するいずれの親出願も出典明示によりその全内容を本明
細書の一部とする。以下の実施例を容易に理解するため
に、特定の汎用する方法および／または用語を記載す
る。
般に、創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露し
たマトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、
歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、または
それと組み合わせて、予防的に使用できる。また、本発
明の組成物を用いて、挿入直前に内在デバイスを浸して
もよい。有効成分は創傷または内在デバイスを浸すため
に１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好
ましい。ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが
都合がよい。慣用的なアジュバントは免疫応答を高める
ために用いることができる。ワクチン化に適した単位投
与量は、抗原０．５〜５μｇ／ｋｇであり、このような
投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好まし
い。提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当
な個体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察
されない。前記の抗体もまた、トポイソメラーゼを含有
する細菌の存在を検出するための診断試薬として使用で
きる。本明細書に開示されている文献を、出典明示によ
りその全内容を本明細書の一部とする。本願が先に請求
するいずれの親出願も出典明示によりその全内容を本明
細書の一部とする。以下の実施例を容易に理解するため
に、特定の汎用する方法および／または用語を記載す
る。
【０１０５】
【実施例】本発明は以下の実施例によりさらに記載す
る。実施例は単に具体的な態様に対する参考として本発
明を説明するために提供するものである。これらの実例
提示は本発明の特定の具体的な態様を説明するものであ
るが、本発明に開示する請求の範囲の限定または規定を
表すものではない。本明細書で用いる特定の用語は前記
した用語説明で説明する。全ての実施例は、別に詳細に
記載するもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法
を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学
的技術は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A L
aboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング
・ハーバー、ニューヨーク州（1989）ような標準的な研
究室マニュアルに記載されるように実施できる。以下の
実施例で示す全ての部分または量は、特記しない限り、
重量で示す。
る。実施例は単に具体的な態様に対する参考として本発
明を説明するために提供するものである。これらの実例
提示は本発明の特定の具体的な態様を説明するものであ
るが、本発明に開示する請求の範囲の限定または規定を
表すものではない。本明細書で用いる特定の用語は前記
した用語説明で説明する。全ての実施例は、別に詳細に
記載するもの以外は、当業者に周知で慣用される標準法
を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学
的技術は、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A L
aboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング
・ハーバー、ニューヨーク州（1989）ような標準的な研
究室マニュアルに記載されるように実施できる。以下の
実施例で示す全ての部分または量は、特記しない限り、
重量で示す。
【０１０６】以下の実施例におけるフラグメントのサイ
ズ分離は特記しない限り、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）および多
くの他の文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.8:4
057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法を用いて実
施した。特記しない限り、連結は、標準的な緩衝液、イ
ンキュベーション温度および時間、ほぼ等モル濃度の量
の連結するＤＮＡフラグメントの、ならびにＤＮＡ０．
５μｇあたりほぼ１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成した。（配列番号：１）
に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イー・
コリ中スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の
染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを配列決定する
ことにより入手した。
ズ分離は特記しない限り、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）および多
くの他の文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.8:4
057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法を用いて実
施した。特記しない限り、連結は、標準的な緩衝液、イ
ンキュベーション温度および時間、ほぼ等モル濃度の量
の連結するＤＮＡフラグメントの、ならびにＤＮＡ０．
５μｇあたりほぼ１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成した。（配列番号：１）
に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イー・
コリ中スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の
染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを配列決定する
ことにより入手した。
【０１０７】（配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を用い
て、トポイソメラーゼＩタンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを得るために、通常、イー・コリ中のスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡ
のクローンのライブラリー、またはその他の適当な宿主
を、部分配列に由来する、好ましくは１７量体またはそ
れより長い放射性標識オリゴヌクレオチドでプロービン
グする。プローブのＤＮＡに同一のＤＮＡを担持するク
ローンを、次いで、非常に厳密に洗浄して区別した。原
配列から設計した配列決定プライマーを用いてこのよう
に同定した個々のクローンを配列決定することにより、
次に配列を両方向に伸長し、遺伝子を全長にわたって決
定することが可能になる。便利には、プラスミドクロー
ンから製造した変性二本鎖ＤＮＡを用いて、このような
配列決定を実施する。適当な技術については、Maniati
s,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）に記載さ
れている。（Screening By Hybridization 1.90 and Se
quencing DenaturedDouble-Stranded DNA Templates 1
3.70参照）
て、トポイソメラーゼＩタンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを得るために、通常、イー・コリ中のスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡ
のクローンのライブラリー、またはその他の適当な宿主
を、部分配列に由来する、好ましくは１７量体またはそ
れより長い放射性標識オリゴヌクレオチドでプロービン
グする。プローブのＤＮＡに同一のＤＮＡを担持するク
ローンを、次いで、非常に厳密に洗浄して区別した。原
配列から設計した配列決定プライマーを用いてこのよう
に同定した個々のクローンを配列決定することにより、
次に配列を両方向に伸長し、遺伝子を全長にわたって決
定することが可能になる。便利には、プラスミドクロー
ンから製造した変性二本鎖ＤＮＡを用いて、このような
配列決定を実施する。適当な技術については、Maniati
s,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989）に記載さ
れている。（Screening By Hybridization 1.90 and Se
quencing DenaturedDouble-Stranded DNA Templates 1
3.70参照）
【０１０８】実施例１：スタフィロコッカス・アウレウ
スからの新規トポイソメラーゼＩをコードするＤＮＡの
単離 （配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドをイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウ
レウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入
手した。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮ
Ａを含有する2個またはそれ以上のクローンの配列決定
データを、（配列番号：１）に示す連続したＤＮＡ配列
を構築するために使用する場合もある。ライブラリーは
慣用される方法、例えば以下の方法1および２により製
造できる。全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９株より、標準法に準じて単離し、二
つの方法のどちらかによりサイズ分画する。
スからの新規トポイソメラーゼＩをコードするＤＮＡの
単離 （配列番号：１）に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレ
オチドをイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウ
レウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入
手した。重複するスタフィロコッカス・アウレウスＤＮ
Ａを含有する2個またはそれ以上のクローンの配列決定
データを、（配列番号：１）に示す連続したＤＮＡ配列
を構築するために使用する場合もある。ライブラリーは
慣用される方法、例えば以下の方法1および２により製
造できる。全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９株より、標準法に準じて単離し、二
つの方法のどちらかによりサイズ分画する。
【０１０９】方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニ
ードルに通して機械的に剪断する。11kbpまでの大きさ
のＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
ードルに通して機械的に剪断する。11kbpまでの大きさ
のＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、お
よびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感
染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【０１１０】方法２ 全細胞ＤＮＡは、四種の制限酵素（ＲｓａＩ、Ｐａｌ
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
Ｉ、ＡｌｕＩおよびＢｓｈｌ２３５Ｉ）を組み合わせた
もので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画する。
ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結
し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐ
ＩＩにライゲートし、標準法によりライブラリーをパッ
ケージングし、そのパッケージングしたライブラリーで
イー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により
増幅する。
【０１１１】実施例２：トポイソメラーゼＩ遺伝子発現
の特性化 ａ）感染組織サンプルからのスタフィロコッカス・アウ
レウスＥＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌのサイロ保存チューブ（cyro-Soreage tubes）中
の感染組織サンプルを−８０℃の保存からドライアイス
エタノール浴中に取り出す。微生物安全キャビネット中
でサンプルを一度に８まで崩壊させるが、残ったサンプ
ルはドライアイスエタノール浴中で凍結させておく。組
織サンプル中で細菌を崩壊させるために、組織５０〜１
００ｍｇをシリカ／セラミック・マトリックス（ＢＩＯ
１０１）を含有するＦａｓｔＲＮＡチューブに移す。す
ぐに抽出試薬（ＦａｓｔＲＮＡ試薬、ＢＩＯ１０１）１
ｍｌを加え、サンプル：試薬の容積比を約１：２０にす
る。そのチューブをレシプロケーティング・シェーカー
（reciprocating shaker）（FastPrepＦＰ１２０、ＢＩ
Ｏ１０１）中、６０００ｒｐｍで２０〜１２０秒振とう
する。粗ＲＮＡ調製物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理／イソプロパノール沈
殿溶液（ＢＩＯ１０１）で沈殿させる。必要な場合、Ｒ
ＮＡ沈殿物をこのイソプロパノール溶液中で−８０℃で
保存する。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇで１
０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水中、容
量/容量）で洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、ＤＥＰ
Ｃ−処理水0.1ｍｌに再懸濁する。
の特性化 ａ）感染組織サンプルからのスタフィロコッカス・アウ
レウスＥＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌのサイロ保存チューブ（cyro-Soreage tubes）中
の感染組織サンプルを−８０℃の保存からドライアイス
エタノール浴中に取り出す。微生物安全キャビネット中
でサンプルを一度に８まで崩壊させるが、残ったサンプ
ルはドライアイスエタノール浴中で凍結させておく。組
織サンプル中で細菌を崩壊させるために、組織５０〜１
００ｍｇをシリカ／セラミック・マトリックス（ＢＩＯ
１０１）を含有するＦａｓｔＲＮＡチューブに移す。す
ぐに抽出試薬（ＦａｓｔＲＮＡ試薬、ＢＩＯ１０１）１
ｍｌを加え、サンプル：試薬の容積比を約１：２０にす
る。そのチューブをレシプロケーティング・シェーカー
（reciprocating shaker）（FastPrepＦＰ１２０、ＢＩ
Ｏ１０１）中、６０００ｒｐｍで２０〜１２０秒振とう
する。粗ＲＮＡ調製物をクロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、ＤＥＰＣ−処理／イソプロパノール沈
殿溶液（ＢＩＯ１０１）で沈殿させる。必要な場合、Ｒ
ＮＡ沈殿物をこのイソプロパノール溶液中で−８０℃で
保存する。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇで１
０分間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水中、容
量/容量）で洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、ＤＥＰ
Ｃ−処理水0.1ｍｌに再懸濁する。
【０１１２】１％寒天ゲル上をサンプルを走らせること
により、単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム
で染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＥＮＡ生成物を可
視化する。感染組織からの細菌性ＲＮＡの単離を示すた
めに、１ｘＭＯＰＳ、２.２Ｍホルムアルデヒドゲルを
走らせ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アメルシャム）にブロッテ
ィングしたものを吸引する。次にスタフィロコッカス・
アウレウスの１６ＳｒＲＮＡに特異的な３２Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチドプローブでブロットをハイブリダイゼー
ションする（K.Greisen、M.Loeffelholz、A.Purohitお
よびD.Leong、J.Clin.Microbiol.32:335-351（199
4））。配列５’−ｇｃｔｃｃｔａａａａｇｇｔｔａｃ
ｔｃｃａｃｃｇｇｃ−３’のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いる。ハイブリダイジングバンドの大きさ
はノーザンブロットにおいて、インビトロで成長したス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離し
た対照ＲＮＡのハイブリダイジングバンドと比較した。
ＴＢＥゲル上で可視化する場合、正確に大きさを測った
細菌性１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが、哺乳動物ＲＮＡの広
範な同義性を示す全ＲＮＡサンプル中で検出できる。
により、単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウム
で染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＥＮＡ生成物を可
視化する。感染組織からの細菌性ＲＮＡの単離を示すた
めに、１ｘＭＯＰＳ、２.２Ｍホルムアルデヒドゲルを
走らせ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アメルシャム）にブロッテ
ィングしたものを吸引する。次にスタフィロコッカス・
アウレウスの１６ＳｒＲＮＡに特異的な３２Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチドプローブでブロットをハイブリダイゼー
ションする（K.Greisen、M.Loeffelholz、A.Purohitお
よびD.Leong、J.Clin.Microbiol.32:335-351（199
4））。配列５’−ｇｃｔｃｃｔａａａａｇｇｔｔａｃ
ｔｃｃａｃｃｇｇｃ−３’のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いる。ハイブリダイジングバンドの大きさ
はノーザンブロットにおいて、インビトロで成長したス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離し
た対照ＲＮＡのハイブリダイジングバンドと比較した。
ＴＢＥゲル上で可視化する場合、正確に大きさを測った
細菌性１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが、哺乳動物ＲＮＡの広
範な同義性を示す全ＲＮＡサンプル中で検出できる。
【０１１３】ｂ）ＲＮＡ誘導したスタフィロコッカス・
アウレウスＷＣＵＨ２９からのＤＮＡの除去 最終容量５７μｌの緩衝液中ＲＮＡase-フリーＤＮＡas
eＩ（ジーンハンター）10単位と３７℃で３０分間処理
することにより、ＲＮＡサンプル５０μｇからＤＮＡを
除去した。ＤＮＡaseを不活性化し、フェノール：クロ
ロホルム抽出により除去した。３Ｍ ＮａＯＡｃ５μｌ
および１００％ＥｔＯＨ２００μｌでＲＮＡを沈殿さ
せ、１２０００ｇで１０分間遠心し、ペレット状にす
る。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇで１０分
間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水中、容量／
容量）で洗浄し、５−１０分間空気乾燥し、ＤＥＰＣ−
処理水１０〜２０μｌに再懸濁する。清浄ＲＮＡサンプ
ルの１：１０００希釈後、ＲＮＡ収量をＯＤ260により
定量する。必要な場合、ＲＮＡを−８０℃で保存し、１
週間以内に逆転写する。
アウレウスＷＣＵＨ２９からのＤＮＡの除去 最終容量５７μｌの緩衝液中ＲＮＡase-フリーＤＮＡas
eＩ（ジーンハンター）10単位と３７℃で３０分間処理
することにより、ＲＮＡサンプル５０μｇからＤＮＡを
除去した。ＤＮＡaseを不活性化し、フェノール：クロ
ロホルム抽出により除去した。３Ｍ ＮａＯＡｃ５μｌ
および１００％ＥｔＯＨ２００μｌでＲＮＡを沈殿さ
せ、１２０００ｇで１０分間遠心し、ペレット状にす
る。ＲＮＡをペレット状にし（１２０００ｇで１０分
間）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ−処理水中、容量／
容量）で洗浄し、５−１０分間空気乾燥し、ＤＥＰＣ−
処理水１０〜２０μｌに再懸濁する。清浄ＲＮＡサンプ
ルの１：１０００希釈後、ＲＮＡ収量をＯＤ260により
定量する。必要な場合、ＲＮＡを−８０℃で保存し、１
週間以内に逆転写する。
【０１１４】ｃ）感染組織由来のＲＮＡサンプルからの
ｃＤＮＡの製造 ＤＮＡase処理ＲＮＡのサンプル１０μｌをFirst Stran
d cDNA Synthesis kitのSuperScript Preamplification
System（ギブコＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ）を
用いて、製造者の指示書に従って逆転写する。ランダム
ヘキサマー１ｎｇを用いて各反応をプライムする。Supe
rScriptＩＩ逆転写酵素を添加しない対照もまた走らせ
る。ＰＣＲ反応の前に、＋／−ＲＴの両方のサンプルを
ＲＮaseＨで処理する。
ｃＤＮＡの製造 ＤＮＡase処理ＲＮＡのサンプル１０μｌをFirst Stran
d cDNA Synthesis kitのSuperScript Preamplification
System（ギブコＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ）を
用いて、製造者の指示書に従って逆転写する。ランダム
ヘキサマー１ｎｇを用いて各反応をプライムする。Supe
rScriptＩＩ逆転写酵素を添加しない対照もまた走らせ
る。ＰＣＲ反応の前に、＋／−ＲＴの両方のサンプルを
ＲＮaseＨで処理する。
【０１１５】ｄ）細菌性ｃＤＮＡ種の存在を決定するた
めのＰＣＲおよび蛍光原性プローブ（fluorogenic prob
es）の使用 二つのＰＣＲプライマー間でアニーリングする、５’お
よび３’末端でリポーターおよびクエンチャー（quench
er）蛍光色素で各々標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ＦＱプローブ）の存在下、PE Applied Biosystems
7700 SequenceDetection Systemにおいて標的配列を増
幅することにより、特異的配列を検出する。プライマー
間でプローブが結合した場合、特異的な生成物のみが検
出される。ＰＣＲ増幅を行うので、最初Ｔａｑポリメラ
ーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりローブからリポー
ター色素が開裂される。リポーター色素がクエンチャー
色素から物理的に分離された場合に生じるシグナルは、
装着したＣＣＤカメラでシグナルを測定することにより
検出できる。生じた各々のシグナルは、一つの標的鎖の
増幅に対応して開裂された一つのプローブに匹敵する。
めのＰＣＲおよび蛍光原性プローブ（fluorogenic prob
es）の使用 二つのＰＣＲプライマー間でアニーリングする、５’お
よび３’末端でリポーターおよびクエンチャー（quench
er）蛍光色素で各々標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ＦＱプローブ）の存在下、PE Applied Biosystems
7700 SequenceDetection Systemにおいて標的配列を増
幅することにより、特異的配列を検出する。プライマー
間でプローブが結合した場合、特異的な生成物のみが検
出される。ＰＣＲ増幅を行うので、最初Ｔａｑポリメラ
ーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりローブからリポー
ター色素が開裂される。リポーター色素がクエンチャー
色素から物理的に分離された場合に生じるシグナルは、
装着したＣＣＤカメラでシグナルを測定することにより
検出できる。生じた各々のシグナルは、一つの標的鎖の
増幅に対応して開裂された一つのプローブに匹敵する。
【０１１６】指示書に従って、PE Applied Biosystem T
aqMan PCR Core Regent Kitを用いてＰＣＲ反応を組み
立て、各反応物は１０ｘ ＰＣＲ 緩衝液ＩＩ ５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2７μｌ、３００ｎＭ正プライマー 5
μｌ，逆プライマー ５μｌ、特異的ＦＱプローブ 5μ
ｌ、１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１０ｍＭ
ｄＧＴＰおよび２０ｍＭ ｄＵＴＰを各々１μｌ、蒸留
水13.25μｌ、AmpEraseＵＮＧ0.5μｌ、およびAmpliTaq
DNAポリメラーゼ0.25μｌを含有し、全量４５μｌにす
る。以下の温度サイクル条件下で増幅する：５０℃で2
分間維持し、９５℃で１０分間維持し、９５℃の４０サ
イクルを１５秒間、および６０℃で１分間、続いてサン
プルが回収されるまで２５℃を維持する。検出は実時間
で行う。反応の最後にデータを回収する。
aqMan PCR Core Regent Kitを用いてＰＣＲ反応を組み
立て、各反応物は１０ｘ ＰＣＲ 緩衝液ＩＩ ５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2７μｌ、３００ｎＭ正プライマー 5
μｌ，逆プライマー ５μｌ、特異的ＦＱプローブ 5μ
ｌ、１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１０ｍＭ
ｄＧＴＰおよび２０ｍＭ ｄＵＴＰを各々１μｌ、蒸留
水13.25μｌ、AmpEraseＵＮＧ0.5μｌ、およびAmpliTaq
DNAポリメラーゼ0.25μｌを含有し、全量４５μｌにす
る。以下の温度サイクル条件下で増幅する：５０℃で2
分間維持し、９５℃で１０分間維持し、９５℃の４０サ
イクルを１５秒間、および６０℃で１分間、続いてサン
プルが回収されるまで２５℃を維持する。検出は実時間
で行う。反応の最後にデータを回収する。
【０１１７】ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写反応、実
験条件下で転写されることが知られている遺伝子に沿っ
た増幅およびゲノムＤＮＡ１μｇの増幅を包含できる。
ＤＮＡ ＰＣＲまたはＲＴ／ＰＣＲにおいてシグナルを
生じなかったプライマーおよび対応するプローブは、Ｐ
ＣＲに失敗したものであり、このようなものは有用でな
い。ＤＮＡ ＰＣＲでシグナルを生じたものの二つのク
ラスはＲＴ／ＰＣＲで区別される：1.インビボで転写さ
れなかった遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグナ
ルを生じることができない；および2..インビボで転写
した遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグナルを生
じ、＋ＲＴサンプルにおけるシグナルは−ＲＴ対照にお
けるシグナル（少しでも存在する場合）より強いことが
示される。これらの分析に基づいて、エス・アウレウス
（S.aureus）トポイソメラーゼＩ遺伝子がインビボで発
現されたことが発見された。
験条件下で転写されることが知られている遺伝子に沿っ
た増幅およびゲノムＤＮＡ１μｇの増幅を包含できる。
ＤＮＡ ＰＣＲまたはＲＴ／ＰＣＲにおいてシグナルを
生じなかったプライマーおよび対応するプローブは、Ｐ
ＣＲに失敗したものであり、このようなものは有用でな
い。ＤＮＡ ＰＣＲでシグナルを生じたものの二つのク
ラスはＲＴ／ＰＣＲで区別される：1.インビボで転写さ
れなかった遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグナ
ルを生じることができない；および2..インビボで転写
した遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲで再現可能なシグナルを生
じ、＋ＲＴサンプルにおけるシグナルは−ＲＴ対照にお
けるシグナル（少しでも存在する場合）より強いことが
示される。これらの分析に基づいて、エス・アウレウス
（S.aureus）トポイソメラーゼＩ遺伝子がインビボで発
現されたことが発見された。
【０１１８】実施例２で用いたプライマーは以下のとお
りである： topA fwdプライマー ＡＣＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＡＧ
ＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧ[配列番号：５] topA revプライマー ＧＣＧＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＧＣ
ＣＡＡＣＣＡＡＴＣ[配列番号：６] topAプローブ ＦＡＭ−ＡＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧＣＡ
ＣＡＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ[配列番号：７]
りである： topA fwdプライマー ＡＣＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＡＧ
ＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧ[配列番号：５] topA revプライマー ＧＣＧＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＧＣ
ＣＡＡＣＣＡＡＴＣ[配列番号：６] topAプローブ ＦＡＭ−ＡＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧＣＡ
ＣＡＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ[配列番号：７]
【０１１９】プライマーのＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ標識
およびかかるプライマーの使用については報告されてい
る（Lee,L.G.、Connell,C.R.およびBloch,W.、「蛍光原
性プローブを用いるニック翻訳ＰＣＲによる対立遺伝子
の区別」Nucleic Acids Research 21:3761-3766（199
3）；Livak,K.J.、Flood,S.J.A.、Marmaro,J.、Giusti,
W.およびDcetz,K.、「反対の末端で蛍光色素を有するオ
リゴヌクレオチドがＰＣＲ生成物および核酸ハイブリダ
イゼーションを検出するのに有用なクエンチングしたプ
ローブシステムを提供する」PCR Methods and Applicat
ion 4:357-362（1995））。
およびかかるプライマーの使用については報告されてい
る（Lee,L.G.、Connell,C.R.およびBloch,W.、「蛍光原
性プローブを用いるニック翻訳ＰＣＲによる対立遺伝子
の区別」Nucleic Acids Research 21:3761-3766（199
3）；Livak,K.J.、Flood,S.J.A.、Marmaro,J.、Giusti,
W.およびDcetz,K.、「反対の末端で蛍光色素を有するオ
リゴヌクレオチドがＰＣＲ生成物および核酸ハイブリダ
イゼーションを検出するのに有用なクエンチングしたプ
ローブシステムを提供する」PCR Methods and Applicat
ion 4:357-362（1995））。
【０１２０】実施例３：トポイソメラーゼＩの特性化 標準法を用いてエス・アウレウス（Ｓ.aureus）トポイ
ソメラーゼをコードするポリヌクレオチドをフレーム
内、および２０個のアミノ酸オープン・リーディング・
フレームの下流になるように発現ベクターｐＥＴ２８ａ
にクローン化し、、これは６個の連続したヒスチヂン残
基およびトロンビン認識部位を包含する。得られたオー
プン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドは以下のとおりである（各々配列番号：
８および９）：
ソメラーゼをコードするポリヌクレオチドをフレーム
内、および２０個のアミノ酸オープン・リーディング・
フレームの下流になるように発現ベクターｐＥＴ２８ａ
にクローン化し、、これは６個の連続したヒスチヂン残
基およびトロンビン認識部位を包含する。得られたオー
プン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドは以下のとおりである（各々配列番号：
８および９）：
【０１２１】[配列番号：８]
【化１】
【０１２２】[配列番号：９]
【化２】
【０１２３】発現プラスミド（ｐＥＴ−topoＩ）を発現
するためにイー・コリＫ１２株ＬＷ２９（ＤＥ３）：ｐ
Ｒ１９５２に形質転換した。プラスミドｐＲ１９５２
は、ｔＲＮＡをコードするａｒｇＵおよびｉｌｅＸ遺伝
子を含有し、各々ＡＧＧ／ＡＧＡおよびＡＵＡコドンを
解読する。これらのコドンはエス・アウレウスに比較し
てイー・コリにはまれであり、同種のｔＲＮＡの過剰発
現は、トポイソメラーゼＩのごとき特定のエス・アウレ
ウス遺伝子の翻訳効率を改善するのが認められた。
するためにイー・コリＫ１２株ＬＷ２９（ＤＥ３）：ｐ
Ｒ１９５２に形質転換した。プラスミドｐＲ１９５２
は、ｔＲＮＡをコードするａｒｇＵおよびｉｌｅＸ遺伝
子を含有し、各々ＡＧＧ／ＡＧＡおよびＡＵＡコドンを
解読する。これらのコドンはエス・アウレウスに比較し
てイー・コリにはまれであり、同種のｔＲＮＡの過剰発
現は、トポイソメラーゼＩのごとき特定のエス・アウレ
ウス遺伝子の翻訳効率を改善するのが認められた。
【０１２４】ｐＥＴ−topoＩ由来のポリペプチドの発現
に関しては、ＬＷ２９（ＤＥ３）：ｐＲ１９５２／ｐＥ
Ｔ−topoＩ細胞系を１％グルコース＋５０μｇ／ｍｌカ
ナマイシンを含有するＬＢ １ｌ中、３７℃／２５０ｒ
ｐｍで、６００ｎｍでのＯＤが1.0になるまで成長さ
せ、次いでＩＰＴＧを添加して１ｍＭにしすることによ
り発現を誘起し、３７℃／２５０ｒｐｍで３時間成長を
続けさせた。ソニケーションにより細胞を溶解し、ヘキ
サ−ヒスチジンタグ化トポイソメラーゼＩをニッケル−
ＮＴＡカラム（キアゲン）で、製造者の指示書に準じて
可溶性分画から精製した。ヘキサ−ヒスチジンタグ化ト
ポイソメラーゼＩの約１４ｍｇを２５０ｍＭ イミダゾ
ール含有緩衝液中、１.３ｍｇ／ｍｌの濃度で、純度９
０％近くで溶出した。
に関しては、ＬＷ２９（ＤＥ３）：ｐＲ１９５２／ｐＥ
Ｔ−topoＩ細胞系を１％グルコース＋５０μｇ／ｍｌカ
ナマイシンを含有するＬＢ １ｌ中、３７℃／２５０ｒ
ｐｍで、６００ｎｍでのＯＤが1.0になるまで成長さ
せ、次いでＩＰＴＧを添加して１ｍＭにしすることによ
り発現を誘起し、３７℃／２５０ｒｐｍで３時間成長を
続けさせた。ソニケーションにより細胞を溶解し、ヘキ
サ−ヒスチジンタグ化トポイソメラーゼＩをニッケル−
ＮＴＡカラム（キアゲン）で、製造者の指示書に準じて
可溶性分画から精製した。ヘキサ−ヒスチジンタグ化ト
ポイソメラーゼＩの約１４ｍｇを２５０ｍＭ イミダゾ
ール含有緩衝液中、１.３ｍｇ／ｍｌの濃度で、純度９
０％近くで溶出した。
【０１２５】最初の１７個のアミノ酸（ＭＧＳＳＨＨＨ
ＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲ）[配列番号：１０]をビオチニル
化トロンビン（ノヴァゲン）を用いて特異的に開裂し、
続いて、製造者の指示書に準じて、ストレプトアビジン
寒天クロマトグラフィーにより除去した。ヘキサ−ヒス
チジンタグを有するまたは有しないスタフ・アウレウス
（Staph.aureus）トポイソメラーゼＩの活性を、４０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８.０、２ｍＭ 酢酸マグネシウ
ム、０.１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１５％ グリ
セロール、トポイソメラーゼＩ（０.１−６μｇ）およ
びスーパーコイルｐＢＲ３２２基質 ０.５μｇを含有す
る反応物３０μｌ中、スーパーコイルＤＮＡ緩和アッセ
イにより測定した。反応物を３７℃で３０分間インキュ
ベーションした。ＳＤＳを添加して１％にするか、また
はＥＤＴＡを添加して５０ｍＭにして反応を停止させ、
寒天ゲルを負荷した緩衝液５μｌを加えた。次いでサン
プルを０.５ｘＴＢＥ緩衝液中０.８％寒天中で電気泳動
した。電気泳動した後、ゲルを０.５μｇ／ｍｌ 臭化エ
チジウムで染色し、ＤＮＡバンドをＵＶトランスイルミ
ネーター（ＵＶtransilluminator）で可視化した。いく
つかの反応物は、例えば０.３３ＭでＬ−グルタミン酸
カリウムを含有し、これはヘキサ−ヒスチジンを有する
または有さないスタフ・アウレウス（Staph.aureus）ト
ポイソメラーゼＩの緩和活性を刺激し、これは反作用的
にスーパーコイルＤＮＡを緩和することを示している。
ＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲ）[配列番号：１０]をビオチニル
化トロンビン（ノヴァゲン）を用いて特異的に開裂し、
続いて、製造者の指示書に準じて、ストレプトアビジン
寒天クロマトグラフィーにより除去した。ヘキサ−ヒス
チジンタグを有するまたは有しないスタフ・アウレウス
（Staph.aureus）トポイソメラーゼＩの活性を、４０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８.０、２ｍＭ 酢酸マグネシウ
ム、０.１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１５％ グリ
セロール、トポイソメラーゼＩ（０.１−６μｇ）およ
びスーパーコイルｐＢＲ３２２基質 ０.５μｇを含有す
る反応物３０μｌ中、スーパーコイルＤＮＡ緩和アッセ
イにより測定した。反応物を３７℃で３０分間インキュ
ベーションした。ＳＤＳを添加して１％にするか、また
はＥＤＴＡを添加して５０ｍＭにして反応を停止させ、
寒天ゲルを負荷した緩衝液５μｌを加えた。次いでサン
プルを０.５ｘＴＢＥ緩衝液中０.８％寒天中で電気泳動
した。電気泳動した後、ゲルを０.５μｇ／ｍｌ 臭化エ
チジウムで染色し、ＤＮＡバンドをＵＶトランスイルミ
ネーター（ＵＶtransilluminator）で可視化した。いく
つかの反応物は、例えば０.３３ＭでＬ−グルタミン酸
カリウムを含有し、これはヘキサ−ヒスチジンを有する
または有さないスタフ・アウレウス（Staph.aureus）ト
ポイソメラーゼＩの緩和活性を刺激し、これは反作用的
にスーパーコイルＤＮＡを緩和することを示している。
【０１２６】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：グウィン，ミカエル カレンダー，ハワード パーマー，レスリー （ｉｉ）発明の名称： トポイソメラーゼＩ （ｉｉｉ）配列の数：１３ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プロシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年１０月８日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０２７９７３ （Ｂ）出願日：１９９６年１０月８日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ジム，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５６０ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プロシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年１０月８日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０２７９７３ （Ｂ）出願日：１９９６年１０月８日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ジム，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８,８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５６０ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【０１２７】(1) 配列番号１についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２６９８ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号１:
【化３】
【０１２８】(2) 配列番号２についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ６９１ アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：タンパク質 (xi) 配列の記載: 配列番号２:
【化４】
【化５】
【０１２９】(2) 配列番号３についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２２ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号３:
【化６】
【０１３０】(2) 配列番号４についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２４ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号４:
【化７】
【０１３１】(2) 配列番号５についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２７ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号５:
【化８】
【０１３２】(2) 配列番号６についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２４ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号６:
【化９】
【０１３３】(2) 配列番号７についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２６ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号７:
【化１０】
【０１３４】(2) 配列番号８についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２１３６ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号８:
【化１１】
【０１３５】(2) 配列番号９についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ７１１アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：タンパク質 (xi) 配列の記載: 配列番号９:
【化１２】
【化１３】
【０１３６】(2) 配列番号１０についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: １７アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：タンパク質 (xi) 配列の記載: 配列番号１０:
【化１４】
【０１３７】(2) 配列番号１１についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ２２ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号１１:
【化１５】
【０１３８】(2) 配列番号１２についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ３９ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号１２:
【化１６】
【０１３９】(2) 配列番号１３についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: ３２ 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖数: 一本 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)分子の型：ゲノムＤＮＡ (xi) 配列の記載: 配列番号１３:
【化１７】
【図１】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
【図２】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
【図３】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
【図４】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
【図５】 スタフィロコッカス・アウレウス・トポイソ
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
メラーゼＩ（配列番号：１）のポリヌクレオチド配列を
示す。
【図６】 図１ないし５のポリヌクレオチド配列から推
定したスタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラ
ーゼＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
定したスタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラ
ーゼＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
【図７】 図１ないし５のポリヌクレオチド配列から推
定したスタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラ
ーゼＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
定したスタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラ
ーゼＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
【図８】 図１ないし５のポリヌクレオチド配列から推
定したスタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラ
ーゼＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
定したスタフィロコッカス・アウレウス・トポイソメラ
ーゼＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。
【図９】 配列番号：２のトポイソメラーゼＩをコード
する核酸の一般式を示す。
する核酸の一般式を示す。
【図１０】 配列番号：２のトポイソメラーゼＩをコー
ドする核酸の一般式を示す。
ドする核酸の一般式を示す。
【図１１】 配列番号：２のトポイソメラーゼＩをコー
ドする核酸の一般式を示す。
ドする核酸の一般式を示す。
【図１２】 配列番号：２のトポイソメラーゼＩをコー
ドする核酸の一般式を示す。
ドする核酸の一般式を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 9/90 33/531 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/531 Ａ６１Ｋ 37/52 33/566 37/64 ＡＤＺ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 マイケル・エヌ・グウィン アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州チ ェスター・スプリングス、カントリー・ウ ェイ1011番 (72)発明者 ハワード・カレンダー アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ビル・スミス・ブ ールバード1220番 (72)発明者 レスリー・エム・パーマー アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、チャールストン・グリーン919 番
Claims (27)
- 【請求項１】（ａ）配列番号：２のアミノ酸１から６９
１を有してなるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌ
クレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
２６９８を有してなる請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド１６６
から２２３８を有してなる請求項２記載のポリヌクレオ
チド。 - 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸１から６９１を
有してなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポ
リヌクレオチド。 - 【請求項７】（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１から
単離可能なスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）のトポイソメラーゼＩをコードするポ
リヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有
するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオチ
ド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドを有し
てなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項２記載のＤＮＡを有してなるベク
ター。 - 【請求項９】 請求項８記載のベクターを有してなる宿
主細胞。 - 【請求項１０】 トポイソメラーゼＩポリペプチドの製
造方法であって、請求項９に記載の宿主を、該ポリペプ
チドを発現するのに十分な培地中、および条件下で培養
し、その発現したポリペプチドを回収することを特徴と
する方法。 - 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、宿主細胞が、適当な培養条件下、請求項８
に記載のベクターに含まれるｃＤＮＡによりコードされ
るトポイソメラーゼ１ポリペプチドを発現するように、
該宿主細胞を該ベクターで形質転換またはトランスフェ
クションすることを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 配列番号：２のアミノ酸１から６９１
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。 - 【請求項１３】 配列番号：２に示すアミノ酸を有して
なるポリペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１５】 請求項１２に記載のポリペプチドの活
性を阻害するアンタゴニスト。 - 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１５に記載のア
ンタゴニストを個体に投与することからなる、トポイソ
メラーゼＩポリペプチドの阻害を必要とする個体の治療
方法。 - 【請求項１７】 分析用核酸プローブによりサンプル中
のトポイソメラーゼＩポリペプチドをコードする核酸を
検出することを特徴とするトポイソメラーゼＩポリペプ
チドの発現に付随する疾患の診断方法において、請求項
１に記載の核酸の少なくとも１５個の連続したヌクレオ
チド塩基の配列を有する核酸プローブを分析用プローブ
として用いることからなる診断方法。 - 【請求項１８】 核酸プローブ配列が配列番号：３、
４、５、６、７、１１、１２および１３からなる群より
選択される請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 サンプル中のトポイソメラーゼＩポリ
ペプチドの生物学的特性を検出することを特徴とするト
ポイソメラーゼＩポリペプチドの発現に付随する疾患の
診断方法において、請求項１２に記載のポリペプチドを
トポイソメラーゼＩとして用いることからなる診断方
法。 - 【請求項２０】 検出される生物学的特性が免疫学的特
性または酵素的特性である請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 モジュレーターであると思われる化合
物を、請求項１２に記載のトポイソメラーゼおよびその
基質からなる反応混合物と混合し、該化合物を含まない
対照となる反応混合物の活性と比較した場合の該トポイ
ソメラーゼＩ活性における調節作用を検出することから
なる、トポイソメラーゼＩ活性のモジュレーターの同定
方法。 - 【請求項２２】 化合物がアンタゴニストであり、その
調節作用がスーパーコイル化ＤＮＡ緩和アッセイにて測
定した場合にトポイソメラーゼＩ触媒活性を減少させる
ことにある請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 化合物がアンタゴニストであり、その
調節作用がＤＮＡオリゴマー開裂可能な複合体アッセイ
にて測定した場合にトポイソメラーゼＩ非触媒活性を減
少させることにある請求項２１記載の方法。 - 【請求項２４】 オリゴマー開裂可能な複合体アッセイ
にて配列番号：７の核酸を用いる請求項２３記載の方
法。 - 【請求項２５】 抗体を産生するのに十分な請求項１２
に記載のトポイソメラーゼＩまたはそのフラグメントも
しくは変種を哺乳動物に接種し、該動物をスタフィロコ
ッカス感染から保護することからなる、哺乳動物にて免
疫学的応答を誘起する方法。 - 【請求項２６】 遺伝子治療により、インビボでトポイ
ソメラーゼＩ、またはそのフラグメントもしくは変種を
発現させるために請求項１に記載のトポイソメラーゼＩ
またはそのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝
子を送達し、免疫学的応答を誘発させて抗体を産生し、
該動物をスタフィロコッカス疾患から保護することから
なる、哺乳動物にて免疫学的応答を誘起する方法。 - 【請求項２７】 哺乳動物宿主に導入した場合、哺乳動
物においてトポイソメラーゼＩに対する免疫学的応答を
誘起する免疫学的組成物であって、請求項１２に記載の
ポリヌクレオチドまたはその免疫学的フラグメントと、
担体とからなる免疫学的組成物。
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