JPH11235178A - 新規ＭｕｒＢ - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＭｕｒＢポリペプチドおよびＭｕｒＢポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み
換え法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに
抗細菌化合物のスク−ニングのためのＭｕｒＢポリペプ
チドの使用方法を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド。
プチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み
換え法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに
抗細菌化合物のスク−ニングのためのＭｕｒＢポリペプ
チドの使用方法を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一つには、新たに
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、なら
びにそれらの製造および使用、ならびにそれらの変種、
アゴニストおよびアンタゴニスト、そしてそれらの使用
に関する。詳細には、これらの点および他の点に関し
て、本発明は、ＭｕｒＢファミリーのポリヌクレオチド
およびポリペプチド（以下、ＭｕｒＢという）に関す
る。
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、なら
びにそれらの製造および使用、ならびにそれらの変種、
アゴニストおよびアンタゴニスト、そしてそれらの使用
に関する。詳細には、これらの点および他の点に関し
て、本発明は、ＭｕｒＢファミリーのポリヌクレオチド
およびポリペプチド（以下、ＭｕｒＢという）に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】スタフィロコッカス属（Staphylococc
i）の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質の開発に用い
ることは特に好ましい。スタフィロコッカス属は医学的
に重要な微生物属を形成している。それらは２つのタイ
プの疾病、すなわち、侵入的および毒素生成的疾病を引
き起こすことが知られている。一般的には、侵入的感染
は皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形成に
より特徴づけられる。エス・アウレウス（S. aureus）
は癌患者における菌血症の第２の主要原因である。骨髄
炎、敗血性関節炎、敗血性の血栓性静脈炎および急性細
菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロコッカ
ス属の毒素生成的特性により生じる３つの臨床的症状が
ある。これらの疾病の明らかな徴候は、組織侵入および
菌血症に対立するものとしてのエンドトキシンの作用に
より生じる。これらの症状は、スタフィロコッカス食品
汚染、熱傷皮膚症候群およびトキシンショック症候群を
包含する。
i）の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質の開発に用い
ることは特に好ましい。スタフィロコッカス属は医学的
に重要な微生物属を形成している。それらは２つのタイ
プの疾病、すなわち、侵入的および毒素生成的疾病を引
き起こすことが知られている。一般的には、侵入的感染
は皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形成に
より特徴づけられる。エス・アウレウス（S. aureus）
は癌患者における菌血症の第２の主要原因である。骨髄
炎、敗血性関節炎、敗血性の血栓性静脈炎および急性細
菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロコッカ
ス属の毒素生成的特性により生じる３つの臨床的症状が
ある。これらの疾病の明らかな徴候は、組織侵入および
菌血症に対立するものとしてのエンドトキシンの作用に
より生じる。これらの症状は、スタフィロコッカス食品
汚染、熱傷皮膚症候群およびトキシンショック症候群を
包含する。
【０００３】スタフィロコッカス・アウレウス感染の頻
度は過去２０年間に劇的に上昇している。これは多重抗
生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団
の増加に起因している。いくつかのまたはすべての標準
的な抗生物質に対して耐性を有するスタフィロコッカス
・アウレウス株を単離することはもはやめずらしいこと
ではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、
ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成した。
度は過去２０年間に劇的に上昇している。これは多重抗
生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団
の増加に起因している。いくつかのまたはすべての標準
的な抗生物質に対して耐性を有するスタフィロコッカス
・アウレウス株を単離することはもはやめずらしいこと
ではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、
ワクチンおよび診断試験についての必要性を形成した。
【０００４】遺伝子ＭｕｒＢによりコ−ドされる酵素Ｕ
ＤＰ−Ｎ−アセチレノールピルビルグルコサミンレダク
ターゼは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルピルビルグルコサミン
のＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラメートへの還元を触媒し、
同時にＮＡＤＰＨの酸化を触媒する。Ｎ−アセチルムラ
メートはペプチドグリカン生合成の前駆体である。当該
遺伝子はエシャリシア・コリ（Escherichia coli）から
配列決定され（Pucci, M. J., Discotto, L. F. & Doug
herty, T. J., 1992, J. Bacteriol., 174, 1690-169
3）、当該酵素は過剰発現され、精製され、反応論的に
特徴づけされている（Benson, T. E., Marquardt, J.
L., Marquardt, A. C., Etzkorn, F. A. & Walsh, C.
T. (1993) Biochemistry, 32, 2024-2030）。この酵素
の結晶構造も存在する（Benson, T. E., Walsh, C. T.,
& Hogle, J. M., (1996) Structure, 4, 47-54）。当
該遺伝子はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s）からも配列決定されており、必須のものであること
が示されている（Roeland, S. L., Errington,J. & Wak
e, R. G., (1995) Gene 164, 113-116）。ヒト病原体で
あるスタフィロコッカス・アウレウス（スタフィロコッ
カス・アウレウス）におけるＭｕｒＢ相同体の発見は、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチレノールピルビルグルコサミンレダ
クターゼ酵素の製造を可能にし、該酵素は抗生物質のス
クリーニングに使用可能である。この酵素の阻害剤を抗
細菌療法に用いれば、細菌細胞壁の構築を妨害するであ
ろう。
ＤＰ−Ｎ−アセチレノールピルビルグルコサミンレダク
ターゼは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルピルビルグルコサミン
のＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラメートへの還元を触媒し、
同時にＮＡＤＰＨの酸化を触媒する。Ｎ−アセチルムラ
メートはペプチドグリカン生合成の前駆体である。当該
遺伝子はエシャリシア・コリ（Escherichia coli）から
配列決定され（Pucci, M. J., Discotto, L. F. & Doug
herty, T. J., 1992, J. Bacteriol., 174, 1690-169
3）、当該酵素は過剰発現され、精製され、反応論的に
特徴づけされている（Benson, T. E., Marquardt, J.
L., Marquardt, A. C., Etzkorn, F. A. & Walsh, C.
T. (1993) Biochemistry, 32, 2024-2030）。この酵素
の結晶構造も存在する（Benson, T. E., Walsh, C. T.,
& Hogle, J. M., (1996) Structure, 4, 47-54）。当
該遺伝子はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s）からも配列決定されており、必須のものであること
が示されている（Roeland, S. L., Errington,J. & Wak
e, R. G., (1995) Gene 164, 113-116）。ヒト病原体で
あるスタフィロコッカス・アウレウス（スタフィロコッ
カス・アウレウス）におけるＭｕｒＢ相同体の発見は、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチレノールピルビルグルコサミンレダ
クターゼ酵素の製造を可能にし、該酵素は抗生物質のス
クリーニングに使用可能である。この酵素の阻害剤を抗
細菌療法に用いれば、細菌細胞壁の構築を妨害するであ
ろう。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】明らかに、抗生物質活
性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である
という目下の利益を有する本発明新規化合物のごとき因
子に対する必要性がある。かかる因子は、感染、機能不
全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるのに
も有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改善
または修正方法を見いだすために、かかる因子ならびに
それらのアンタゴニストおよびアゴニストの同定および
特徴づけに対する必要性もある。
性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である
という目下の利益を有する本発明新規化合物のごとき因
子に対する必要性がある。かかる因子は、感染、機能不
全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるのに
も有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改善
または修正方法を見いだすために、かかる因子ならびに
それらのアンタゴニストおよびアゴニストの同定および
特徴づけに対する必要性もある。
【０００６】本発明のある種のポリペプチドは、既知の
バチルス・ズブチリスのＭｕｒＢ蛋白に対するアミノ酸
配列相同性を有する。
バチルス・ズブチリスのＭｕｒＢ蛋白に対するアミノ酸
配列相同性を有する。
【０００７】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
表１（配列番号：２または４）に示すアミノ酸配列およ
び既知アミノ酸配列またはバチルス・ズブチリスのＭｕ
ｒＢ蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性により、
新規ＭｕｒＢポリペプチドであると同定されたポリペプ
チド提供することが本発明の目的である。ＭｕｒＢポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には
本明細書でＭｕｒＢと命名されたポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドを提供することが本発明のさ
らなる目的である。本発明の特に好ましい具体例におい
て、ポリヌクレオチドは、表１（配列番号：１または
３）に示す配列を含むＭｕｒＢポリペプチドをコードす
る領域を含み、全長遺伝子またはその変種が包含され
る。本発明のもう１つの特に好ましい具体例において、
表１（配列番号：２または４）のアミノ酸配列を含むス
タフィロコッカス・アウレウス由来の新規ＭｕｒＢ蛋
白、またはその変種がある。本発明のもう１つの態様に
よれば、寄託株に含まれるスタフィロコッカス・アウレ
ウスＷＣＵＨ２９株により発現可能な成熟ポリペプチド
をコードしている単離核酸分子が提供される。
表１（配列番号：２または４）に示すアミノ酸配列およ
び既知アミノ酸配列またはバチルス・ズブチリスのＭｕ
ｒＢ蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性により、
新規ＭｕｒＢポリペプチドであると同定されたポリペプ
チド提供することが本発明の目的である。ＭｕｒＢポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には
本明細書でＭｕｒＢと命名されたポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドを提供することが本発明のさ
らなる目的である。本発明の特に好ましい具体例におい
て、ポリヌクレオチドは、表１（配列番号：１または
３）に示す配列を含むＭｕｒＢポリペプチドをコードす
る領域を含み、全長遺伝子またはその変種が包含され
る。本発明のもう１つの特に好ましい具体例において、
表１（配列番号：２または４）のアミノ酸配列を含むス
タフィロコッカス・アウレウス由来の新規ＭｕｒＢ蛋
白、またはその変種がある。本発明のもう１つの態様に
よれば、寄託株に含まれるスタフィロコッカス・アウレ
ウスＷＣＵＨ２９株により発現可能な成熟ポリペプチド
をコードしている単離核酸分子が提供される。
【０００８】本発明のさらなる態様は、ＭｕｒＢ、詳細
にはスタフィロコッカス・アウレウスのＭｕｒＢをコー
ドしている単離核酸分子が提供され、それにはｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさ
らなる具体例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、およびそれらを含む
組成物を包含する。本発明のもう１つの態様によれば、
治療または予防を目的とした、特に遺伝学的免疫を目的
とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の特に好ましい具体例には、ＭｕｒＢの天然の対
立遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチ
ドがある。
にはスタフィロコッカス・アウレウスのＭｕｒＢをコー
ドしている単離核酸分子が提供され、それにはｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさ
らなる具体例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、およびそれらを含む
組成物を包含する。本発明のもう１つの態様によれば、
治療または予防を目的とした、特に遺伝学的免疫を目的
とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の特に好ましい具体例には、ＭｕｒＢの天然の対
立遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチ
ドがある。
【０００９】本発明のもう１つの態様において、本明細
書においてＭｕｒＢと称されるスタフィロコッカス・ア
ウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断
学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なそのフラ
グメント、変種および誘導体、および前記したフラグメ
ントおよびアナログの変種および誘導体、およびそれら
を含む組成物が提供される。本発明の特に好ましい具体
例には、ＭｕｒＢ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコー
ドされるＭｕｒＢポリペプチドの変種がある。本発明の
好ましい具体例において、上記ＭｕｒＢポリペプチドの
製造方法がある。本発明のさらに別の態様によれば、例
えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用なかかるポリペ
プチドの阻害剤が提供される。
書においてＭｕｒＢと称されるスタフィロコッカス・ア
ウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断
学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なそのフラ
グメント、変種および誘導体、および前記したフラグメ
ントおよびアナログの変種および誘導体、およびそれら
を含む組成物が提供される。本発明の特に好ましい具体
例には、ＭｕｒＢ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコー
ドされるＭｕｒＢポリペプチドの変種がある。本発明の
好ましい具体例において、上記ＭｕｒＢポリペプチドの
製造方法がある。本発明のさらに別の態様によれば、例
えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用なかかるポリペ
プチドの阻害剤が提供される。
【００１０】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
ＭｕｒＢ発現の評価、疾病の治療、遺伝学的変異のアッ
セイ、ならびに細菌、特にスタフィロコッカス・アウレ
ウス細菌に対する免疫学的応答を生起するための生物へ
のＭｕｒＢポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与
のための、製品、組成物および方法が提供される。
ＭｕｒＢ発現の評価、疾病の治療、遺伝学的変異のアッ
セイ、ならびに細菌、特にスタフィロコッカス・アウレ
ウス細菌に対する免疫学的応答を生起するための生物へ
のＭｕｒＢポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与
のための、製品、組成物および方法が提供される。
【００１１】本発明のこのおよび他の態様の特定の好ま
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でＭｕｒＢポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明の特定の好ましい具
体例において、ＭｕｒＢポリペプチドに対する抗体が提
供される。本発明の他の具体例において、本発明ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの結合、あるいは相互作
用して、それらの活性を阻害または活性化する化合物の
同定方法が提供され、該方法は、化合物とポリペプチド
またはポリヌクレオチドとの間の結合あるいは他の相互
作用を可能にする条件下で、本発明ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触
させて、化合物との結合あるいは他の相互作用を評価し
（かかる結合または相互作用は、ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応
答して検出可能なシグナルを提供することのできる第２
の化合物に関連している）、次いで、化合物とポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用か
ら生じるシグナルの存在または不存在を検出することに
より、化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドに
結合あるいは相互作用して、それらの活性を活性化また
は阻害するかどうかを決定することを含む。本発明のさ
らにもう１つの態様によれば、ＭｕｒＢアゴニストおよ
びアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺細菌性
アゴニストおよびアンタゴニストが提供される。本発明
のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投
与するための、ＭｕｒＢポリヌクレオチドまたはＭｕｒ
Ｂポリペプチドを含む組成物が提供される。開示した本
発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、
以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の部分
を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でＭｕｒＢポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明の特定の好ましい具
体例において、ＭｕｒＢポリペプチドに対する抗体が提
供される。本発明の他の具体例において、本発明ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの結合、あるいは相互作
用して、それらの活性を阻害または活性化する化合物の
同定方法が提供され、該方法は、化合物とポリペプチド
またはポリヌクレオチドとの間の結合あるいは他の相互
作用を可能にする条件下で、本発明ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触
させて、化合物との結合あるいは他の相互作用を評価し
（かかる結合または相互作用は、ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応
答して検出可能なシグナルを提供することのできる第２
の化合物に関連している）、次いで、化合物とポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用か
ら生じるシグナルの存在または不存在を検出することに
より、化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドに
結合あるいは相互作用して、それらの活性を活性化また
は阻害するかどうかを決定することを含む。本発明のさ
らにもう１つの態様によれば、ＭｕｒＢアゴニストおよ
びアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺細菌性
アゴニストおよびアンタゴニストが提供される。本発明
のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投
与するための、ＭｕｒＢポリヌクレオチドまたはＭｕｒ
Ｂポリペプチドを含む組成物が提供される。開示した本
発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、
以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の部分
を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００１２】本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に
説明する、新規ＭｕｒＢポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。詳細には、本発明は、バチルス・ズブ
チリスのＭｕｒＢポリペプチドに対するアミノ酸配列相
同性により関連付けられる、スタフィロコッカス・アウ
レウスの新規ＭｕｒＢのポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。特に本発明は、それぞれ表１の配列番
号：１および配列番号：２に示すヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列を有するＭｕｒＢに関し、さらに寄託株
中のＤＮＡのＭｕｒＢヌクレオチド配列およびそれによ
りコードされるアミノ酸配列に関する。
説明する、新規ＭｕｒＢポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。詳細には、本発明は、バチルス・ズブ
チリスのＭｕｒＢポリペプチドに対するアミノ酸配列相
同性により関連付けられる、スタフィロコッカス・アウ
レウスの新規ＭｕｒＢのポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。特に本発明は、それぞれ表１の配列番
号：１および配列番号：２に示すヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列を有するＭｕｒＢに関し、さらに寄託株
中のＤＮＡのＭｕｒＢヌクレオチド配列およびそれによ
りコードされるアミノ酸配列に関する。
【００１３】 表１ ＭｕｒＢポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 （Ａ） スタフィロコッカス・アウレウスのＭｕｒＢポリヌクレオチド配列由来 の配列 [配列番号：1] 5'-1 TATAATTATA CTAATTCTAA TACTTTCTTT TCAATTTTCG CAAATGAATT 51 TTAAAATTGG TATAATACTA TATGATATTA AAGACATGAG AAAGGATGTA 101 CTGAGAAGTG ATAAATAAAG ACATCTATCA AGCTTTACAA CAACTTATCC 151 CAAATGAAAA AATTAAAGTT GATGAACCTT TAAAACGATA CACTTATACT 201 AAAACAGGTG GTAATGCCGA CTTTTATATT ACCCCTACTA AAAATGAAGA 251 AGTACAAGCA GTTGTTAAAT ATGCCTATCA AAATGAGATT CCTGTTACAT 301 ATTTAGGAAA TGGCTCAAAT ATTATTATCC GTGAAGGTGG TATTCGCGGC 351 ATTGTAATTA GTTTATTATC ACTAGATCAT ATCGATGTAT CTGATGATGC 401 GATAATAGCC GGTAGCGGCG CTGCAATTAT TGATGTCTCA CGTGTTGCTC 451 GTGATTACGC ACTTACTGGC CTTGAATTTG CATGTGGTAT TCCAGGTTCA 501 ATTGGTGGTG CAGTGTATAT GAATGCTGGC GCTTATGGTG GCGAAGTTAA 551 AGATTGTATA GACTATGCGC TTTGCGTAAA CGAACAAGGC TCGTTAATTA 601 AACTTACAAC AAAAGAATTA GAGTTAGATT ATCGTAATAG CATTATTCAA 651 AAAGAACACT TAGTTGTATT AGAAGCTGCA TTTACTTTAG CTCCTGGTAA 701 AATGACTGAA ATACAAGCTA AAATGGATGA TTTAACAGAA CGTAGAGAAT 751 CTAAACAACC TTTAGAGTAT CCTTCATGTG GTAGTGTATT CCAAAGACCG 801 CTTGGTCATT TTGCAGGTAA ATTGATACAA GATTCTAATT TGCAAGGTCA 851 CCGTATTGGC GGCGTTGAAG TTTCAACCAA ACACGCTGGT TTTATGGTAA 901 ATGTAGACAA TGGAACTGCT ACAGATTATG AAAACCTTAT TCATTATGTA 951 CAAAAGACCG TCAAAGAAAA ATTTGGCATT GAATTAAATC GTGAAGTTCG 1001 CATTATTGGT GAACATCCAA AGGAATCGTA AGTTAAGGAG CTTTGTCTAT 1051 GCCTAAAGTT TATGGTTCAT TAATCGATAC TGAAACACGC TGTCGCCATT 1101 ATTTTACCGA AGAAGATATT ATTGCTATTA AATTTAAATG TTGTAATAAA 1151 TACTATCCAT GCTATAAGTG CCATAATGAG TTTGAAAAGC ACGCCATTAA-3'
【００１４】 （Ｂ）この表中のポリヌクレオチド配列から推定されるＭｕｒＢポリペプチド配 列 [配列番号：2] NH2-1 MINKDIYQAL QQLIPNEKIK VDEPLKRYTY TKTGGNADFY ITPTKNEEVQ 51 AVVKYAYQNE IPVTYLGNGS NIIIREGGIR GIVISLLSLD HIDVSDDAII 101 AGSGAAIIDV SRVARDYALT GLEFACGIPG SIGGAVYMNA GAYGGEVKDC 151 IDYALCVNEQ GSLIKLTTKE LELDYRNSII QKEHLVVLEA AFTLAPGKMT 201 EIQAKMDDLT ERRESKQPLE YPSCGSVFQR PLGHFAGKLI QDSNLQGHRI 251 GGVEVSTKHA GFMVNVDNGT ATDYENLIHY VQKTVKEKFG IELNREVRII 301 GEHPKES-COOH
【００１５】 （Ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスのＭｕｒＢ ＯＲＦ配列を含むポリヌク レオチド配列［配列番号：３］ 5'-1 TGGCGAGGGT TCCTAGGCGG GGAGGGGGAG GCGCCAAAAG CCAACCCTTT 51 CCCCCGGGGT TGGCGGTTTC ATTATGGGGG GCCAGAAAAG TTTCCCGAAT 101 GGAAGCGTGC TTGCGGGGCA AAGCATTTAA GGGGGTTGTT CATTCAAGAG 151 CACCCCCGGG TTAAAAATTT AGCTTTCCGG TTGAAAGTGG GGGGATGGGA 201 GGCGATAACC ATTTAACCCG GGAAACCGTT GGACCCGGTT AACGCCAAGG 251 GGCCATTAAC CTTTAATGAA GGGAACAAAG GGGGGTCTCC CCCCGGGGGC 301 GCCCTTTTGG AAATGGGATA TCCCCGAAAG CCCATTAAAA TTAAAAAAAC 351 TATTGGGCGG AAACGATTCT TTTAAATTAT TAACGAGGCC CATTTTAGAT 401 TATTTTGGTA GTGGAGGAAA ATTGGAAGAG AATTAATTCC TTAGATGAAA 451 AACGCTTAAA TAATGTGGGG TTTATTGTTG GCTTCTAAAA TAAATTAGGA 501 AGTTTAGGTG GGGAAGTTTT ACAATTTTCA TGAATTAAAA CAACAGTGCG 551 TGCAAATATC ATTCAAGTGA TAACCCAAAC ATTTGGATCT TATCTTGCAC 601 TTGATAACTT CTATTCAACT ATGATGATAT TGTTTGCATT TTCATAACAA 651 AAAAGCACCA ANTATTGCAA CATAGCTTAA CAATTAGACA TNATGAGATG 701 CAAAAGCAAC AATACTTTGA AAAACTATGT AAAAAATACT TATAACGACA 751 ATAATGCCGT ATTTTATAAT TATACTAATT CTAATACTTT CTTTTCAATT 801 TTCGCAAATG AATTTTAAAA TTGGTATAAT ACTATATGAT ATTAAAGACA 851 TGAGAAAGGA TGTACTGAGA AGTGATAAAT AAAGACATCT ATCAAGCTTT 901 ACAACAACTT ATCCCAAATG AAAAAATTAA AGTTGATGAA CCTTTAAAAC 951 GATACACTTA TACTAAAACA GGTGGTAATG CCGACTTTTA TATTACCCCT 1001 ACTAAAAATG AAGAAGTACA AGCAGTTGTT AAATATGCCT ATCAAAATGA 1051 GATTCCTGTT ACATATTTAG GAAATGGCTC AAATATTATT ATCCGTGAAG 1101 GTGGTATTCG CGGCATTGTA ATTAGTTTAT TATCACTAGA TCATATCGAT 1151 GTATCTGATG ATGCGATAAT AGCCGGTAGC GGCGCTGCAA TTATTGATGT 1201 CTCACGTGTT GCTCGTGATT ACGCACTTAC TGGCCTTGAA TTTGCATGTG 1251 GTATTCCAGG TTCAATTGGT GGTGCAGTGT ATATGAATGC TGGCGCTTAT 1301 GGTGGCGAAG TTAAAGATTG TATAGACTAT GCGCTTTGCG TAAACGAACA 1351 AGGCTCGTTA ATTAAACTTA CAACAAAAGA ATTAGAGTTA GATTATCGTA 1401 ATAGCATTAT TCAAAAAGAA CACTTAGTTG TATTAGAAGC TGCATTTACT 1451 TTAGCTCCTG GG-3'
【００１６】 （Ｄ）この表中のポリヌクレオチドＯＲＦ配列から推定されるスタフィロコッカ ス・アウレウスのＭｕｒＢポリペプチド配列 NH2-1 VINKDIYQAL QQLIPNEKIK VDEPLKRYTY TKTGGNADFY ITPTKNEEVQ 51 AVVKYAYQNE IPVTYLGNGS NIIIREGGIR GIVISLLSLD HIDVSDDAII 101 AGSGAAIIDV SRVARDYALT GLEFACGIPG SIGGAVYMNA GAYGGEVKDC 151 IDYALCVNEQ GSLIKLTTKE LELDYRNSII QKEHLVVLEA AFTLAPG-COOH
【００１７】寄託物質 スタフィロコッカス・アウレウス WCUH29株を含有する
寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカードラ
イブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに
１９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１が付与された。寄託したことにより、寄託株をス
タフィロコッカス・アウレウス WCUH29株という。本明
細書においてスタフィロコッカス・アウレウス株の寄託
物を「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」という。寄託
株は全長のＭｕｒＢ遺伝子を含んでいる。寄託株中に含
まれるポリヌクレオチド配列ならびにそれによりコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列
に関する任意の記載に矛盾する事象において支配的であ
る。寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。寄託物を製造、使用または販売するためには
ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはこ
こでは賦与されていない。
寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカードラ
イブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに
１９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１が付与された。寄託したことにより、寄託株をス
タフィロコッカス・アウレウス WCUH29株という。本明
細書においてスタフィロコッカス・アウレウス株の寄託
物を「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」という。寄託
株は全長のＭｕｒＢ遺伝子を含んでいる。寄託株中に含
まれるポリヌクレオチド配列ならびにそれによりコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列
に関する任意の記載に矛盾する事象において支配的であ
る。寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。寄託物を製造、使用または販売するためには
ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはこ
こでは賦与されていない。
【００１８】ポリペプチド 本発明ポリペプチドは表１［配列番号：２または４］の
ポリペプチド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびに
ポリペプチドおよびフラグメント、詳細にはＭｕｒＢの
生物学的活性を有するものを包含し、さらに表１［配列
番号：２または４］のポリペプチドまたはその重要部分
に対して少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番
号：２または４］のポリペプチドに対して少なくとも８
０％の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメン
ト、より好ましくは表１［配列番号：２または４］のポ
リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性を有し
（より好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有
し）、さらにより好ましくは表１［配列番号：２または
４］のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性
を有する（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同
一性を有する）ポリペプチドおよびフラグメント、さら
に通常には少なくとも３０個、より好ましくは少なくと
も５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を
包含する。
ポリペプチド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびに
ポリペプチドおよびフラグメント、詳細にはＭｕｒＢの
生物学的活性を有するものを包含し、さらに表１［配列
番号：２または４］のポリペプチドまたはその重要部分
に対して少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番
号：２または４］のポリペプチドに対して少なくとも８
０％の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメン
ト、より好ましくは表１［配列番号：２または４］のポ
リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性を有し
（より好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有
し）、さらにより好ましくは表１［配列番号：２または
４］のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性
を有する（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同
一性を有する）ポリペプチドおよびフラグメント、さら
に通常には少なくとも３０個、より好ましくは少なくと
も５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を
包含する。
【００１９】また本発明は、式： X-(R1)m-(R2)-(R3)n-Y で示されるポリペプチドを包含する。式中、アミノ末端
においてＸは水素であり、カルボキシル末端においてＹ
は水素または金属であり、Ｒ1およびＲ3はアミノ酸残
基、ｍは１ないし１０００の間の整数またはゼロ、ｎは
１ないし１０００の間の整数またはゼロ、Ｒ2は本発明
アミノ酸配列、詳細には表１から選択されるアミノ酸配
列である。上式中、Ｒ2は、そのアミノ末端残基が左に
あってＲ1に結合し、そのカルボキシル末端残基が右に
あってＲ3に結合するように方向づけられる。ｍおよび
／またはｎが１よりも大きいいずれのＲ基により示され
るアミノ酸残基鎖も、ヘテロポリマーまたはホモポリマ
ーであってよく、ヘテロポリマーが好ましい。
においてＸは水素であり、カルボキシル末端においてＹ
は水素または金属であり、Ｒ1およびＲ3はアミノ酸残
基、ｍは１ないし１０００の間の整数またはゼロ、ｎは
１ないし１０００の間の整数またはゼロ、Ｒ2は本発明
アミノ酸配列、詳細には表１から選択されるアミノ酸配
列である。上式中、Ｒ2は、そのアミノ末端残基が左に
あってＲ1に結合し、そのカルボキシル末端残基が右に
あってＲ3に結合するように方向づけられる。ｍおよび
／またはｎが１よりも大きいいずれのＲ基により示され
るアミノ酸残基鎖も、ヘテロポリマーまたはホモポリマ
ーであってよく、ヘテロポリマーが好ましい。
【００２０】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。Ｍｕ
ｒＢポリペプチドについては、フラグメントは「独立し
て存在（free standing）」しているか、または一部分
もしくは領域を形成することにより、大型のポリペプチ
ド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域、すなわち大型の単一ポリペプチドとして含ま
れる。好ましいフラグメントは、表１［配列番号：２ま
たは４］のアミノ酸配列の一部分を有する末端切断され
たポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、そ
の例としてはアミノ末端を含む一連の残基を切断、また
はカルボキシル末端を含む一連の残基を切断したものが
ある。宿主、とりわけスタフィロコッカス・アウレウス
における、本発明のポリペプチドの分解形態もまた好ま
しい。また、構造的または機能的属性により特徴づけら
れたフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよび
アルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベ
ータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コ
イルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、
アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領
域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標
領域を含むフラグメントなども好ましい。ＭｕｒＢ活性
を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない活性を
減じられたフラグメントである生物学的に活性のあるフ
ラグメントも好ましい。動物、とりわけヒトにおいて抗
原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれる。個
体、特にヒトにおけるスタフィロコッカス・アウレウス
の生存に必須の機能、あるいは疾病を開始または維持す
る能力を付与する酵素の受容体またはドメインを含むフ
ラグメントが特に好ましい。本発明ポリペプチドのフラ
グメントである変種を、ペプチド合成による対応全長ポ
リペプチドの製造に使用してもよく、それゆえ、これら
の変種を全長のポリペプチド製造のための中間体として
用いてもよい。本発明ポリヌクレオチドのフラグメント
である変種を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを
合成してもよい。
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。Ｍｕ
ｒＢポリペプチドについては、フラグメントは「独立し
て存在（free standing）」しているか、または一部分
もしくは領域を形成することにより、大型のポリペプチ
ド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域、すなわち大型の単一ポリペプチドとして含ま
れる。好ましいフラグメントは、表１［配列番号：２ま
たは４］のアミノ酸配列の一部分を有する末端切断され
たポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、そ
の例としてはアミノ末端を含む一連の残基を切断、また
はカルボキシル末端を含む一連の残基を切断したものが
ある。宿主、とりわけスタフィロコッカス・アウレウス
における、本発明のポリペプチドの分解形態もまた好ま
しい。また、構造的または機能的属性により特徴づけら
れたフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよび
アルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベ
ータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コ
イルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、
アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領
域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標
領域を含むフラグメントなども好ましい。ＭｕｒＢ活性
を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない活性を
減じられたフラグメントである生物学的に活性のあるフ
ラグメントも好ましい。動物、とりわけヒトにおいて抗
原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれる。個
体、特にヒトにおけるスタフィロコッカス・アウレウス
の生存に必須の機能、あるいは疾病を開始または維持す
る能力を付与する酵素の受容体またはドメインを含むフ
ラグメントが特に好ましい。本発明ポリペプチドのフラ
グメントである変種を、ペプチド合成による対応全長ポ
リペプチドの製造に使用してもよく、それゆえ、これら
の変種を全長のポリペプチド製造のための中間体として
用いてもよい。本発明ポリヌクレオチドのフラグメント
である変種を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを
合成してもよい。
【００２１】コドンＧＴＧによりコードされる最初のア
ミノ酸を配列番号：２においてメチオニンとして示す。
しかしながら、本発明の１の具体例において、本発明ポ
リペプチドのこの最初のアミノ酸はバリンである。
ミノ酸を配列番号：２においてメチオニンとして示す。
しかしながら、本発明の１の具体例において、本発明ポ
リペプチドのこの最初のアミノ酸はバリンである。
【００２２】アミノ酸を示す標準的な１文字および３文
字法のほかに、本発明の特定のポリペプチドを説明する
際にＸまたはＸａａを用いる。ＸおよびＸａａは、天然
に存在する２０種のアミノ酸のいずれかが、ポリペプチ
ド配列中のそのように記載された位置にあることを意味
する。
字法のほかに、本発明の特定のポリペプチドを説明する
際にＸまたはＸａａを用いる。ＸおよびＸａａは、天然
に存在する２０種のアミノ酸のいずれかが、ポリペプチ
ド配列中のそのように記載された位置にあることを意味
する。
【００２３】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するもの
であり、それには表１［配列番号：２または４］の推定
アミノ酸配列を有するＭｕｒＢポリペプチドをコードす
る全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレオ
チドおよびそれらの変種が包含される。本明細書に提供
される情報を用いて、例えば表１［配列番号：１または
３］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質スタ
フィロコッカス・アウレウス WCUH29細胞からの染色体
ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定する
ために用いるような標準的なクローニングおよびスクリ
ーニングを用いて、ＭｕｒＢポリペプチドをコードして
いる本発明ポリヌクレオチドを得て、次いで、全長のク
ローンを得てもよい。例えば、本発明ポリヌクレオチド
配列、例えば表１［配列番号：１または３］に示す配列
を得るために、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの
他の適切な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウ
ス WCUH29の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブ
ラリーを、部分的配列に由来する、好ましくは１７量体
またはそれ以上の長さの放射性標識化オリゴヌクレオチ
ドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤ
ＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別でき
る。元の配列から設計した配列決定プライマーを用いて
このように同定した個々のクローンを配列決定すること
により、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝
子配列を決定できる。このような配列決定は便宜的にプ
ラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用い
て実施する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fit
sch,F.F.およびSambrookら、MolecularCloning，A Labo
ratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている（Sc
reening By Hybridization 1.90およびSequencing Dena
tured Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。
本発明の典型例において、表１［配列番号：１または
３］に示すポリヌクレオチドが、スタフィロコッカス・
アウレウス WCUH29由来のＤＮＡライブラリー中に見い
だされた。
であり、それには表１［配列番号：２または４］の推定
アミノ酸配列を有するＭｕｒＢポリペプチドをコードす
る全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレオ
チドおよびそれらの変種が包含される。本明細書に提供
される情報を用いて、例えば表１［配列番号：１または
３］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質スタ
フィロコッカス・アウレウス WCUH29細胞からの染色体
ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定する
ために用いるような標準的なクローニングおよびスクリ
ーニングを用いて、ＭｕｒＢポリペプチドをコードして
いる本発明ポリヌクレオチドを得て、次いで、全長のク
ローンを得てもよい。例えば、本発明ポリヌクレオチド
配列、例えば表１［配列番号：１または３］に示す配列
を得るために、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの
他の適切な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウ
ス WCUH29の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブ
ラリーを、部分的配列に由来する、好ましくは１７量体
またはそれ以上の長さの放射性標識化オリゴヌクレオチ
ドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤ
ＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別でき
る。元の配列から設計した配列決定プライマーを用いて
このように同定した個々のクローンを配列決定すること
により、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝
子配列を決定できる。このような配列決定は便宜的にプ
ラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用い
て実施する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fit
sch,F.F.およびSambrookら、MolecularCloning，A Labo
ratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている（Sc
reening By Hybridization 1.90およびSequencing Dena
tured Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。
本発明の典型例において、表１［配列番号：１または
３］に示すポリヌクレオチドが、スタフィロコッカス・
アウレウス WCUH29由来のＤＮＡライブラリー中に見い
だされた。
【００２４】表１［配列番号：１または３］に示すＤＮ
Ａ配列は、表１［配列番号：２または４］に示すアミノ
酸残基数とほぼ同数のアミノ酸からなる蛋白をコードし
ている読み枠を含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該
分野でよく知られたアミノ酸の分子量を用いて算出でき
る。ヌクレオチド番号１０８からヌクレオチド番号１０
２９より開始する停止コドンまで間の配列番号：１のポ
リヌクレオチドは配列番号：２のポリペプチドをコード
する。本発明ＭｕｒＢ蛋白は、寄託株のＭｕｒＢをコー
ドしているＤＮＡの配列決定結果により示されるよう
に、ＭｕｒＢファミリーの他の蛋白に構造的に関連して
いる。
Ａ配列は、表１［配列番号：２または４］に示すアミノ
酸残基数とほぼ同数のアミノ酸からなる蛋白をコードし
ている読み枠を含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該
分野でよく知られたアミノ酸の分子量を用いて算出でき
る。ヌクレオチド番号１０８からヌクレオチド番号１０
２９より開始する停止コドンまで間の配列番号：１のポ
リヌクレオチドは配列番号：２のポリペプチドをコード
する。本発明ＭｕｒＢ蛋白は、寄託株のＭｕｒＢをコー
ドしているＤＮＡの配列決定結果により示されるよう
に、ＭｕｒＢファミリーの他の蛋白に構造的に関連して
いる。
【００２５】本発明は、表１［配列番号：１または３］
のコーディング配列に対して全長にわたり同一であるポ
リヌクレオチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコ
ーディング配列またはそれらのフラグメント、ならびに
その他のコーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリ
ペプチドのコーディング配列またはそのフラグメント、
例えばリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ
蛋白配列をコードする配列も本発明により提供される。
ポリヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、
終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化
する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転
写非翻訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コ
ーディング配列等の非コーディング５'および３'配列等
の非コーディング配列をも含有しうるが、これらに限定
するのではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促
すマーカー配列をコードすることもできる。本発明のあ
る好ましい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベク
ター（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒ
スチジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡ
タグ（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発
明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子
発現を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定す
るものではない。
のコーディング配列に対して全長にわたり同一であるポ
リヌクレオチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコ
ーディング配列またはそれらのフラグメント、ならびに
その他のコーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリ
ペプチドのコーディング配列またはそのフラグメント、
例えばリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ
蛋白配列をコードする配列も本発明により提供される。
ポリヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、
終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化
する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転
写非翻訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コ
ーディング配列等の非コーディング５'および３'配列等
の非コーディング配列をも含有しうるが、これらに限定
するのではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促
すマーカー配列をコードすることもできる。本発明のあ
る好ましい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベク
ター（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒ
スチジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡ
タグ（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発
明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子
発現を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定す
るものではない。
【００２６】本発明の好ましい具体例は、ＭｕｒＢポリ
ペプチドをコードいしている、表１の配列番号：１に示
すヌクレオチド１０８から１０２９のすぐ上流まで、ま
たはヌクレオチド１０２９までを含むポリヌクレオチド
である。
ペプチドをコードいしている、表１の配列番号：１に示
すヌクレオチド１０８から１０２９のすぐ上流まで、ま
たはヌクレオチド１０２９までを含むポリヌクレオチド
である。
【００２７】また本発明は、式： X-(R1)m-(R2)-(R3)n-Y で示されるポリヌクレオチドを包含する。式中、分子の
５’末端においてＸは水素であり、分子の３’末端にお
いてＹは水素または金属、Ｒ1およびＲ3は核酸残基、ｍ
は１ないし３０００の間の整数またはゼロ、ｎは１ない
し３０００の間の整数またはゼロ、Ｒ2は本発明の核酸
配列、詳細には表１から選択される核酸配列である。上
のポリヌクレオチドの式中、Ｒ2は、５’末端残基が左
にあってＲ1に結合し、３’末端残基が右にあってＲ3に
結合するように方向づけられる。ｍおよび／またはｎが
１よりも大きいいずれかのＲ基により示される核酸鎖は
ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってよく、ヘテ
ロポリマーが好ましい。好ましい具体例においてｍおよ
び／またはｎは１ないし１０００の間の整数である。
５’末端においてＸは水素であり、分子の３’末端にお
いてＹは水素または金属、Ｒ1およびＲ3は核酸残基、ｍ
は１ないし３０００の間の整数またはゼロ、ｎは１ない
し３０００の間の整数またはゼロ、Ｒ2は本発明の核酸
配列、詳細には表１から選択される核酸配列である。上
のポリヌクレオチドの式中、Ｒ2は、５’末端残基が左
にあってＲ1に結合し、３’末端残基が右にあってＲ3に
結合するように方向づけられる。ｍおよび／またはｎが
１よりも大きいいずれかのＲ基により示される核酸鎖は
ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってよく、ヘテ
ロポリマーが好ましい。好ましい具体例においてｍおよ
び／またはｎは１ないし１０００の間の整数である。
【００２８】本発明ポリヌクレオチドがスタフィロコッ
カス・アウレウス由来であるのが最も好ましいが、例え
ば、同じ分類学上の属の生物であっても好ましい。例え
ば、それらを同じ分類学上の科または目の生物から得て
もよい。
カス・アウレウス由来であるのが最も好ましいが、例え
ば、同じ分類学上の属の生物であっても好ましい。例え
ば、それらを同じ分類学上の科または目の生物から得て
もよい。
【００２９】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表
１［配列番号：２または４］に示すアミノ酸配列を有す
るスタフィロコッカス・アウレウスのＭｕｒＢのポリペ
プチドを包含する。該用語は、コーディング配列および
／または非コーディング配列を含んでいてもよいさらな
る領域を伴った、ポリペプチドをコードしている単一の
連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファ
ージまたは配列の挿入または配列の編集により分断され
たもの）を含むポリヌクレオチドを包含する。さらに本
発明は、表１［配列番号：２または４］の推定アミノ酸
配列を有するポリペプチドの変種をコードする上記ポリ
ヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌクレオチ
ドのフラグメントである変種を用いて本発明の全長ポリ
ヌクレオチドを合成してもよい。
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包
含し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表
１［配列番号：２または４］に示すアミノ酸配列を有す
るスタフィロコッカス・アウレウスのＭｕｒＢのポリペ
プチドを包含する。該用語は、コーディング配列および
／または非コーディング配列を含んでいてもよいさらな
る領域を伴った、ポリペプチドをコードしている単一の
連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファ
ージまたは配列の挿入または配列の編集により分断され
たもの）を含むポリヌクレオチドを包含する。さらに本
発明は、表１［配列番号：２または４］の推定アミノ酸
配列を有するポリペプチドの変種をコードする上記ポリ
ヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌクレオチ
ドのフラグメントである変種を用いて本発明の全長ポリ
ヌクレオチドを合成してもよい。
【００３０】さらに特に好ましい具体例は、表１［配列
番号：２または４］のＭｕｒＢポリペプチドのアミノ酸
配列を有するＭｕｒＢ変種をコードするポリヌクレオチ
ドであり、その中には、いくつか、少しの、５ないし１
０、１ないし５、１ないし３、２、１または０個のアミ
ノ酸残基を置換、欠損または付加を任意の組み合わせで
施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましい
ものは、ＭｕｒＢの特性および活性を変化させないサイ
レント置換、付加および欠損である。
番号：２または４］のＭｕｒＢポリペプチドのアミノ酸
配列を有するＭｕｒＢ変種をコードするポリヌクレオチ
ドであり、その中には、いくつか、少しの、５ないし１
０、１ないし５、１ないし３、２、１または０個のアミ
ノ酸残基を置換、欠損または付加を任意の組み合わせで
施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましい
ものは、ＭｕｒＢの特性および活性を変化させないサイ
レント置換、付加および欠損である。
【００３１】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号：２または４］に示すアミノ酸配列を有する
ＭｕｒＢポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドに対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同一
性があるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドである。あるい
はまた、寄託株のＭｕｒＢポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくと
も８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およ
びそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に
好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも
少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好まし
く、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。特に好ましい具体例は、表１［配列番号：１ま
たあ３］によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチドである。
［配列番号：２または４］に示すアミノ酸配列を有する
ＭｕｒＢポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドに対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同一
性があるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドである。あるい
はまた、寄託株のＭｕｒＢポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくと
も８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およ
びそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に
好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも
少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好まし
く、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。特に好ましい具体例は、表１［配列番号：１ま
たあ３］によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチドである。
【００３２】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／
ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶
液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６
５℃で０.１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するもので
ある。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知で
あり、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory
Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）、とりわけその第１１章に実例が示
されている。
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／
ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶
液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６
５℃で０.１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するもので
ある。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知で
あり、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory
Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）、とりわけその第１１章に実例が示
されている。
【００３３】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列
に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列
番号：１に示す上記ポリヌクレオチド配列またはそのフ
ラグメントの配列を有するプローブでスクリーニング
し、ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできる
ポリヌクレオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチド
をも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有
用なフラグメントには、例えば本明細書の別の箇所にお
いて説明するプローブおよびプライマー等がある。
ョン条件で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列
に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列
番号：１に示す上記ポリヌクレオチド配列またはそのフ
ラグメントの配列を有するプローブでスクリーニング
し、ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできる
ポリヌクレオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチド
をも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有
用なフラグメントには、例えば本明細書の別の箇所にお
いて説明するプローブおよびプライマー等がある。
【００３４】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ＭｕｒＢをコードするｃＤＮＡ全長およ
びゲノムクローンを単離するための、およびＭｕｒＢ遺
伝子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用することができる。このようなプ
ローブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこ
のようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なく
とも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプ
ローブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基またはそ
れ以下である。例えば、ＭｕｒＢ遺伝子のコーディング
領域は、表１（配列番号：１または３）に示すＤＮＡ配
列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成してスク
リーニングすることにより単離できる。次いで、本発明
の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌク
レオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの
ライブラリーのスクリーニングに用い、プローブがライ
ブラリーのいずれのメンバーにハイブリダイゼーション
するのかを決定する。
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ＭｕｒＢをコードするｃＤＮＡ全長およ
びゲノムクローンを単離するための、およびＭｕｒＢ遺
伝子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用することができる。このようなプ
ローブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこ
のようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なく
とも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプ
ローブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基またはそ
れ以下である。例えば、ＭｕｒＢ遺伝子のコーディング
領域は、表１（配列番号：１または３）に示すＤＮＡ配
列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成してスク
リーニングすることにより単離できる。次いで、本発明
の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌク
レオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの
ライブラリーのスクリーニングに用い、プローブがライ
ブラリーのいずれのメンバーにハイブリダイゼーション
するのかを決定する。
【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１または２または３
または４の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明
ポリヌクレオチドを本明細書記載の方法に使用してもよ
いが、好ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定し
たポリヌクレオチドの全体または一部が感染した組織に
転写されるかどうかを決定する。かかる配列が、病原体
が達成した感染段階および感染型の診断にも有用である
ことが理解される。
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１または２または３
または４の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明
ポリヌクレオチドを本明細書記載の方法に使用してもよ
いが、好ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定し
たポリヌクレオチドの全体または一部が感染した組織に
転写されるかどうかを決定する。かかる配列が、病原体
が達成した感染段階および感染型の診断にも有用である
ことが理解される。
【００３６】また本発明は、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。
【００３７】核酸塩基を示す標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／
Ｕのほかに、本発明のある種のポリヌクレオチドを説明
する場合にＮを用いる。Ｎは、隣接するヌクレオチド位
置と一緒になって作用する場合において、正確な読み枠
を読中で読まれる場合で、Ｎがそのような読み枠におい
て未成熟終止コドンを形成する効果を有する塩基でない
ことが好ましい場合を除き、４種のＤＮＡ塩基またはＲ
ＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列のその指
定位置にあることを意味する。要するに、本発明のポリ
ヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟蛋
白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリー
ダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する
成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１または
それ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプ
レプロ蛋白をコードしていてもよく、プロ配列は通常ポ
リペプチドの活性および成熟形態を生成するプロセッシ
ング段階で除去される。
Ｕのほかに、本発明のある種のポリヌクレオチドを説明
する場合にＮを用いる。Ｎは、隣接するヌクレオチド位
置と一緒になって作用する場合において、正確な読み枠
を読中で読まれる場合で、Ｎがそのような読み枠におい
て未成熟終止コドンを形成する効果を有する塩基でない
ことが好ましい場合を除き、４種のＤＮＡ塩基またはＲ
ＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列のその指
定位置にあることを意味する。要するに、本発明のポリ
ヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟蛋
白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリー
ダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する
成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１または
それ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプ
レプロ蛋白をコードしていてもよく、プロ配列は通常ポ
リペプチドの活性および成熟形態を生成するプロセッシ
ング段階で除去される。
【００３８】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。
【００３９】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。
【００４０】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。
【００４１】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
【００４２】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。
【００４３】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のＭ
ｕｒＢポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトにおけるＭｕｒＢの検出は、
疾患の診断のための診断法を提供する。ＭｕｒＢ遺伝子
を含む生物に感染した真核生物（本明細書において「個
体」とも称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトを種々の
方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸
は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、
筋肉、軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤ
ＮＡを直接検出に使用してもよく、あるいは分析の前に
ＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素
的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法
で用いることができる。増幅法を用いると、真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を、原
核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすること
ができる。対照配列の遺伝子型と比較した場合の増幅産
物の大きさの変化により、欠損および挿入を検出でき
る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ＭｕｒＢポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定
できる。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、
または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別
できる。変性剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
または直接的なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配列の
差を検出してもよい。例えばMeyersら、Science，230:1
242（1985）参照。また、特異的な位置での配列の変化
を、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよ
びＳ１保護または化学的切断法によって明らかにしても
よい。例えばCottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 85:4397-4401 （1985）参照。
ｕｒＢポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトにおけるＭｕｒＢの検出は、
疾患の診断のための診断法を提供する。ＭｕｒＢ遺伝子
を含む生物に感染した真核生物（本明細書において「個
体」とも称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトを種々の
方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸
は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、
筋肉、軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤ
ＮＡを直接検出に使用してもよく、あるいは分析の前に
ＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素
的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法
で用いることができる。増幅法を用いると、真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を、原
核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすること
ができる。対照配列の遺伝子型と比較した場合の増幅産
物の大きさの変化により、欠損および挿入を検出でき
る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ＭｕｒＢポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定
できる。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、
または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別
できる。変性剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
または直接的なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配列の
差を検出してもよい。例えばMeyersら、Science，230:1
242（1985）参照。また、特異的な位置での配列の変化
を、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよ
びＳ１保護または化学的切断法によって明らかにしても
よい。例えばCottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 85:4397-4401 （1985）参照。
【００４４】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、ＭｕｒＢをコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定お
よび分析するのに用いることができる。典型的なプライ
マーの例を下表２に示す。
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、ＭｕｒＢをコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定お
よび分析するのに用いることができる。典型的なプライ
マーの例を下表２に示す。
【００４５】表２ ＭｕｒＢポリヌクレオチドの増幅のためのプライマー 配列番号 プライマー配列 5 5'- GCCGACTTTTATATTACCCCTACT-3' 6 5'- ACAATCTTTAACTTCGCCACCATA-3'
【００４６】また本発明は、式： X-(R1)m-(R2)-(R3)n-Y で示されるプライマーを包含する。式中、分子の５’末
端においてＸは水素であり、分子の３’末端においてＹ
は水素または金属であり、Ｒ1およびＲ3は核酸残基、ｍ
は１ないし２０の間の整数またはゼロ、ｎは１ないし２
０の間の整数またはゼロ、Ｒ2は本発明のプライマー配
列、詳細には表２から選択されるプライ−配列である。
上のポリヌクレオチドの式中、Ｒ2は、５’末端残基が
左にあってＲ1に結合し、３’末端残基が右にあってＲ3
に結合するように方向づけられる。ｍおよび／またはｎ
が１よりも大きいいずれかのＲ基により示される核酸鎖
はヘテロポリマーまたはホモポリマーであってよく、表
１のポリヌクレオチドの領域に相捕的なヘテロポリマー
が好ましい。好ましい具体例においてｍおよび／または
ｎは１ないし１０の間の整数である。
端においてＸは水素であり、分子の３’末端においてＹ
は水素または金属であり、Ｒ1およびＲ3は核酸残基、ｍ
は１ないし２０の間の整数またはゼロ、ｎは１ないし２
０の間の整数またはゼロ、Ｒ2は本発明のプライマー配
列、詳細には表２から選択されるプライ−配列である。
上のポリヌクレオチドの式中、Ｒ2は、５’末端残基が
左にあってＲ1に結合し、３’末端残基が右にあってＲ3
に結合するように方向づけられる。ｍおよび／またはｎ
が１よりも大きいいずれかのＲ基により示される核酸鎖
はヘテロポリマーまたはホモポリマーであってよく、表
１のポリヌクレオチドの領域に相捕的なヘテロポリマー
が好ましい。好ましい具体例においてｍおよび／または
ｎは１ないし１０の間の整数である。
【００４７】本発明はまた、５'および／または３'末端
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。
【００４８】本発明はまた、疾病、好ましくは細菌感
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染の診断方法を提供し、該方法は、表１［配列番
号：１または３］の配列を有するポリヌクレオチドのの
発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出することを
特徴とする。ＭｕｒＢポリヌクレオチドの発現の増加ま
たは低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野
でよく知られたいずれかの方法、例えば増幅、ＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティン
グおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて測
定できる。
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染の診断方法を提供し、該方法は、表１［配列番
号：１または３］の配列を有するポリヌクレオチドのの
発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出することを
特徴とする。ＭｕｒＢポリヌクレオチドの発現の増加ま
たは低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野
でよく知られたいずれかの方法、例えば増幅、ＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティン
グおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて測
定できる。
【００４９】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、ＭｕｒＢ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診
断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のＭｕｒＢ蛋白のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。かかるアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。
て、ＭｕｒＢ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診
断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のＭｕｒＢ蛋白のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。かかるアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。
【００５０】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）； Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）； Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。
【００５１】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−ＭｕｒＢを有することにつ
いてスクリーニングされたヒトから、あるいは無処理の
ライブラリーから、ポリペプチドに対する結合活性を有
する抗体遺伝子を選別することもできる（McCafferty,
J.ら、Nature 348:552-554 （1990）； Marks, J.ら、B
iotechnology 10:779-783 （1992））。これらの抗体の
親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）に
より改善することもできる（Clackson, T.ら、Nature 3
52:624-628 （1991））。
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−ＭｕｒＢを有することにつ
いてスクリーニングされたヒトから、あるいは無処理の
ライブラリーから、ポリペプチドに対する結合活性を有
する抗体遺伝子を選別することもできる（McCafferty,
J.ら、Nature 348:552-554 （1990）； Marks, J.ら、B
iotechnology 10:779-783 （1992））。これらの抗体の
親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）に
より改善することもできる（Clackson, T.ら、Nature 3
52:624-628 （1991））。
【００５２】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上記抗体を用いてポリペプチド
を発現するクローンを単離または同定してもよく、上記
抗体を親和性クロマトグラフィーにより精製することが
できる。
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上記抗体を用いてポリペプチド
を発現するクローンを単離または同定してもよく、上記
抗体を親和性クロマトグラフィーにより精製することが
できる。
【００５３】従って、とりわけＭｕｒＢに対する抗体
を、感染、とりわけ細菌感染の治療に用いてもよい。
を、感染、とりわけ細菌感染の治療に用いてもよい。
【００５４】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。
【００５５】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。
【００５６】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。
【００５７】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。
イおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標
品、化学ライブラリー、および天然産物混合物中におけ
る小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガ
ンドであってもよく、構造上または機能上の模倣物であ
ってもよい。例えば、Coligan et al.,Current Protoco
ls in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。
【００５８】また本発明は、ＭｕｒＢポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または
阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、静菌性
および／または殺菌性化合物を同定するための、化合物
のスクリーニング方法をも提供する。該スクリーニング
方法は高処理量の方法である。例えば、アゴニストまた
はアンタゴニストをスクリーニングするために、Ｍｕｒ
Ｂポリペプチドを含む、合成反応混合物、膜、細胞表面
膜もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、また
はそれらのいずれかの調製物、およびこのようなポリペ
プチドの標識基質またはリガンドを、ＭｕｒＢアゴニス
トまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下ま
たは不在下でインキュベーションする。候補分子がＭｕ
ｒＢポリペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、
標識化リガンドの結合の低下またはこのような基質から
の生成物の産生の低下に反映される。結合しても影響を
及ぼさない分子、すなわちＭｕｒＢの効果を誘導しない
分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性があ
る。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高
める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成
速度またはレベルはリポーターシステムを用いることに
より強調できる。この点に関して有用なリポーターシス
テムには、生成物に転換される比色測定用標識化基質、
ＭｕｒＢポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変
化に反応するリポーター遺伝子、および当該分野で周知
の結合アッセイ等があるが、これらに限定するものでは
ない。
はポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または
阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、静菌性
および／または殺菌性化合物を同定するための、化合物
のスクリーニング方法をも提供する。該スクリーニング
方法は高処理量の方法である。例えば、アゴニストまた
はアンタゴニストをスクリーニングするために、Ｍｕｒ
Ｂポリペプチドを含む、合成反応混合物、膜、細胞表面
膜もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、また
はそれらのいずれかの調製物、およびこのようなポリペ
プチドの標識基質またはリガンドを、ＭｕｒＢアゴニス
トまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下ま
たは不在下でインキュベーションする。候補分子がＭｕ
ｒＢポリペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、
標識化リガンドの結合の低下またはこのような基質から
の生成物の産生の低下に反映される。結合しても影響を
及ぼさない分子、すなわちＭｕｒＢの効果を誘導しない
分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性があ
る。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高
める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成
速度またはレベルはリポーターシステムを用いることに
より強調できる。この点に関して有用なリポーターシス
テムには、生成物に転換される比色測定用標識化基質、
ＭｕｒＢポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変
化に反応するリポーター遺伝子、および当該分野で周知
の結合アッセイ等があるが、これらに限定するものでは
ない。
【００５９】ＭｕｒＢアンタゴニストのアッセイのもう
１つの例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適
した条件下で、ＭｕｒＢおよび潜在的アンタゴニスト
を、ＭｕｒＢ結合分子、組換えＭｕｒＢ結合分子、天然
基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模
倣物と混合する。例えば放射活性または比色測定用化合
物によりＭｕｒＢを標識し、結合分子に結合した、また
は生成物に変換されたＭｕｒＢ分子の数を正確に決定し
て、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。
１つの例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適
した条件下で、ＭｕｒＢおよび潜在的アンタゴニスト
を、ＭｕｒＢ結合分子、組換えＭｕｒＢ結合分子、天然
基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模
倣物と混合する。例えば放射活性または比色測定用化合
物によりＭｕｒＢを標識し、結合分子に結合した、また
は生成物に変換されたＭｕｒＢ分子の数を正確に決定し
て、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。
【００６０】潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペ
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、ＭｕｒＢにより誘導される活性
を誘導せず、それゆえＭｕｒＢを結合から排除すること
によりＭｕｒＢの作用を妨害する。潜在的アンタゴニス
トには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれ
を占領し、それにより細胞性結合分子への結合を防御し
て、正常の生物学的活性を防御する小型分子等がある。
小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、ペプ
チド様分子等があるが、これらに限定するものではな
い。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス分
子等がある（これらの分子についての記載に関してはOk
ano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucle
otides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（198
8）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、Ｍｕ
ｒＢ関連化合物およびＭｕｒＢ変種等がある。
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、ＭｕｒＢにより誘導される活性
を誘導せず、それゆえＭｕｒＢを結合から排除すること
によりＭｕｒＢの作用を妨害する。潜在的アンタゴニス
トには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれ
を占領し、それにより細胞性結合分子への結合を防御し
て、正常の生物学的活性を防御する小型分子等がある。
小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、ペプ
チド様分子等があるが、これらに限定するものではな
い。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス分
子等がある（これらの分子についての記載に関してはOk
ano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucle
otides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（198
8）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、Ｍｕ
ｒＢ関連化合物およびＭｕｒＢ変種等がある。
【００６１】本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。
【００６２】本発明は、感染の続発症に関与する病因お
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、ＭｕｒＢ蛋白により媒介される哺乳動物細胞への
侵入のブロック（Rosenshine et al.,Infect.Immunol.6
0:2211(1992)）；哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細
菌ＭｕｒＢ蛋白との間の、組織ダメージを媒介する細菌
付着のブロック；内在デバイスの移植または他の外科的
方法以外により開始される、感染における通常の病状の
進行のブロックに使用することができる。
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、ＭｕｒＢ蛋白により媒介される哺乳動物細胞への
侵入のブロック（Rosenshine et al.,Infect.Immunol.6
0:2211(1992)）；哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細
菌ＭｕｒＢ蛋白との間の、組織ダメージを媒介する細菌
付着のブロック；内在デバイスの移植または他の外科的
方法以外により開始される、感染における通常の病状の
進行のブロックに使用することができる。
【００６３】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、疾病の抑制および治療に用いてもよい。
を、例えば、疾病の抑制および治療に用いてもよい。
【００６４】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈelicobacter
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ｇｉｄＢ
ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニスト）、特に狭スペクトルの抗生
物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用であ
る。このような治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性
癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治療はま
た胃潰瘍および胃炎も治癒する。
pylori）（本明細書中、エッチ・ピロリともいう）菌
は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３
分の１以上の胃に感染している（国際癌研究機関（Inte
rnational Agency for Research on Cancer）（1994）S
chistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori
（International Agency for Research on Cancer，Lyo
n，France；http：／／www．uicc．ch／ecp／ecp2904．
htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近になっ
て、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を
認識し、その細菌をグループＩ（限定的）発癌物質と分
類した。本発明により提供されるスクリーニング法を用
いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物（ｇｉｄＢ
ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのアゴニ
ストおよびアンタゴニスト）、特に狭スペクトルの抗生
物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用であ
る。このような治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性
癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治療はま
た胃潰瘍および胃炎も治癒する。
【００６５】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス感染から個体を防御するための抗体および／ま
たはＴ細胞応答を生じさせるに十分なＭｕｒＢまたはそ
のフラグメントもしくは変種を個体に接種することを特
徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製を遅らせる
方法も提供される。本発明のさらにもう１つの態様は、
個体における免疫学的応答の誘導方法に関し、該方法
は、疾病が個体においてすでに確立されているか否かに
かかわらず、インビボでＭｕｒＢ、またはそのフラグメ
ントもしくは変種を発現させるためにＭｕｒＢまたはそ
のフラグメントもしくは変種の発現を指令する核酸ベク
ターをかかる個体に送達して、例えば、抗体および／ま
たはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞
または細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学的応答を誘
導して、該個体を疾病から防御する抗体を産生させるこ
とを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与する
方法としては、粒子上にコーディングすること等がある。
かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、また
はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス感染から個体を防御するための抗体および／ま
たはＴ細胞応答を生じさせるに十分なＭｕｒＢまたはそ
のフラグメントもしくは変種を個体に接種することを特
徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製を遅らせる
方法も提供される。本発明のさらにもう１つの態様は、
個体における免疫学的応答の誘導方法に関し、該方法
は、疾病が個体においてすでに確立されているか否かに
かかわらず、インビボでＭｕｒＢ、またはそのフラグメ
ントもしくは変種を発現させるためにＭｕｒＢまたはそ
のフラグメントもしくは変種の発現を指令する核酸ベク
ターをかかる個体に送達して、例えば、抗体および／ま
たはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞
または細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学的応答を誘
導して、該個体を疾病から防御する抗体を産生させるこ
とを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与する
方法としては、粒子上にコーディングすること等がある。
かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、また
はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。
【００６６】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、ＭｕｒＢまたはそれによりコードされている蛋
白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組
成物に関し、その組成物は組換えＭｕｒＢまたはそれに
よりコードされている蛋白を含み、ＭｕｒＢまたはそれ
によりコードされている蛋白に対する抗原をコードし発
現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または予防
的に用いてもよく、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞性免
疫の形態であってもよい。
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、ＭｕｒＢまたはそれによりコードされている蛋
白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組
成物に関し、その組成物は組換えＭｕｒＢまたはそれに
よりコードされている蛋白を含み、ＭｕｒＢまたはそれ
によりコードされている蛋白に対する抗原をコードし発
現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または予防
的に用いてもよく、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞性免
疫の形態であってもよい。
【００６７】ＭｕｒＢポリペプチドまたはそれらのフラ
グメントを、それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋
白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋
白を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合
させてもよい。好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、
抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ
（Hemophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベー
ターガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化
してそれらの産生および精製を促進する比較的大きな共
存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普
遍的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとし
て作用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミ
ノまたはカルボキシル末端のどちらかに結合できる。
グメントを、それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋
白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋
白を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合
させてもよい。好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、
抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ
（Hemophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベー
ターガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化
してそれらの産生および精製を促進する比較的大きな共
存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普
遍的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとし
て作用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミ
ノまたはカルボキシル末端のどちらかに結合できる。
【００６８】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。
【００６９】また、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウスに感染した動物モデルにおいて、かかる遺伝的
免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面蛋
白の不変領域をコードすることが示されている、説明し
たポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメン
トを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的また
は治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピトー
プを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動物、
とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロコッ
カス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発
のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功した動
物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体をう
まく調製することを可能にすると思われる。
ウレウスに感染した動物モデルにおいて、かかる遺伝的
免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面蛋
白の不変領域をコードすることが示されている、説明し
たポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメン
トを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的また
は治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピトー
プを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動物、
とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロコッ
カス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発
のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功した動
物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体をう
まく調製することを可能にすると思われる。
【００７０】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。
【００７１】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性無菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性無菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。本発明を特定のＭｕｒＢ蛋白に関し
て説明したが、本発明は天然に存在する蛋白および、実
質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失
または置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含す
ることが理解されよう。
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性無菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性無菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。本発明を特定のＭｕｒＢ蛋白に関し
て説明したが、本発明は天然に存在する蛋白および、実
質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失
または置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含す
ることが理解されよう。
【００７２】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。
【００７３】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の無菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の無菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。
【００７４】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御す
ることもできる。
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御す
ることもできる。
【００７５】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わ
るものとして、活性物質の使用を拡張することが可能で
ある。
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わ
るものとして、活性物質の使用を拡張することが可能で
ある。
【００７６】上述の治療に加え、一般的には本発明組成
物を創傷の治療薬として使用して、創傷組織に曝露した
マトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いでもよく、
歯科治療においては抗生物質による予防法に代えて、ま
たはそれと組み合わせて予防的に使用してもよい。
物を創傷の治療薬として使用して、創傷組織に曝露した
マトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いでもよく、
歯科治療においては抗生物質による予防法に代えて、ま
たはそれと組み合わせて予防的に使用してもよい。
【００７７】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。
【００７８】用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。
【００７９】「疾病」は、上気道感染（例えば、中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道
感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、
感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、分泌性下痢、脾
臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿
瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内
炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管
感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキ
シックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、
毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、
ならびに骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、
骨髄炎）のごとき疾病を包含する、細菌による感染によ
り引き起こされる疾病またはかかる細菌感染に関連した
疾病を意味する。
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道
感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、
感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、分泌性下痢、脾
臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿
瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内
炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管
感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキ
シックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、
毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、
ならびに骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、
骨髄炎）のごとき疾病を包含する、細菌による感染によ
り引き起こされる疾病またはかかる細菌感染に関連した
疾病を意味する。
【００８０】「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。
列により形質転換もしくはトランスフェクションされ
た、または形質転換またはトランスフェクションするこ
とのできる細胞である。
【００８１】当該分野にて周知であるように「同一性」
または「類似性」は、場合によっては、配列を比較して
測定されるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド
配列間または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配
列間の関係である。当該分野において、「同一性」とは
また、時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により
決定されるような２つのポリペプチドまたはポリヌクレ
オチド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」
および「類似性」は共に下記のものを包含する既知方法
（これらに限らない）により容易に算出できる（Comput
ational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフ
ォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、19
88年；Biocomputing：Informatics and Genome Project
s，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、1993年；Computer Analysis of Sequence Data，パ
ートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマ
ナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Ana
lysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデ
ミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Primer，
Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プ
レス、ニューヨーク、1991年；およびCarillo,H.,およ
びLipman,D.,SIAM J., Applied Math., 48:1073(198
8)）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験す
る２つの配列間で最も良く適合するように設計される。
同一性および類似性を測定する方法は、公に利用できる
コンピュータープログラムに集成されている。二つの配
列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュ
ータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387
（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.
ら、J.Molec.Biol.215：403-410（1990）））を包含す
るが、これらに限定されるものではない。BLAST Xプロ
グラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公に利用できる
（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH
Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J.Mol.
Biol. 215:403-410 (1990)）。一例として、配列番号：
１の対照ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも
９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドを挙げると、そのポリヌクレオチド配列が
配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列のヌクレオチド
１００個ごとに５個までのヌクレオチドの変化を含みう
ることを除き、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配
列は対照配列と同一である。言い換えると、対照酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列
を有するポリペプチドを得るためには、対照配列中の５
％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドと
置換されていてもよく、あるいは対照配列中の全ヌクレ
オチドのうち５％までの数のヌクレオチドが対照配列に
挿入されたものであってもよい。対照配列のこれらの変
異は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置
に存在していてもよく、あるいはそれらの末端位置の間
のいずれかの位置に存在していてもく、対照配列のヌク
レオチドに散在していてもよく、あるいは対照配列内の
１個またはそれ以上の一連の群となっていてもよい。同
様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列に対して少なく
とも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプチド配列
が配列番号：２の対照アミノ酸配列のアミノ酸１００個
ごとに５個までのアミノ酸の変化を含みうることを除
き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対照配列と同一
である。言い換えると、対照アミノ酸配列に対して少な
くとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを得るためには、対照配列中のアミノ酸の５％まで
が欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、ある
いは対照配列中の全アミノ酸のうち５％までの数のアミ
ノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。対
照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のア
ミノまたはカルボキシ末端位置に存在してもよく、ある
いはそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよ
く、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配
列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよ
い。
または「類似性」は、場合によっては、配列を比較して
測定されるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド
配列間または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配
列間の関係である。当該分野において、「同一性」とは
また、時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により
決定されるような２つのポリペプチドまたはポリヌクレ
オチド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」
および「類似性」は共に下記のものを包含する既知方法
（これらに限らない）により容易に算出できる（Comput
ational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフ
ォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、19
88年；Biocomputing：Informatics and Genome Project
s，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、1993年；Computer Analysis of Sequence Data，パ
ートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマ
ナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Ana
lysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデ
ミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Primer，
Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プ
レス、ニューヨーク、1991年；およびCarillo,H.,およ
びLipman,D.,SIAM J., Applied Math., 48:1073(198
8)）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験す
る２つの配列間で最も良く適合するように設計される。
同一性および類似性を測定する方法は、公に利用できる
コンピュータープログラムに集成されている。二つの配
列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュ
ータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387
（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.
ら、J.Molec.Biol.215：403-410（1990）））を包含す
るが、これらに限定されるものではない。BLAST Xプロ
グラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公に利用できる
（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH
Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J.Mol.
Biol. 215:403-410 (1990)）。一例として、配列番号：
１の対照ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも
９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドを挙げると、そのポリヌクレオチド配列が
配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列のヌクレオチド
１００個ごとに５個までのヌクレオチドの変化を含みう
ることを除き、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配
列は対照配列と同一である。言い換えると、対照酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列
を有するポリペプチドを得るためには、対照配列中の５
％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドと
置換されていてもよく、あるいは対照配列中の全ヌクレ
オチドのうち５％までの数のヌクレオチドが対照配列に
挿入されたものであってもよい。対照配列のこれらの変
異は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置
に存在していてもよく、あるいはそれらの末端位置の間
のいずれかの位置に存在していてもく、対照配列のヌク
レオチドに散在していてもよく、あるいは対照配列内の
１個またはそれ以上の一連の群となっていてもよい。同
様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列に対して少なく
とも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプチド配列
が配列番号：２の対照アミノ酸配列のアミノ酸１００個
ごとに５個までのアミノ酸の変化を含みうることを除
き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対照配列と同一
である。言い換えると、対照アミノ酸配列に対して少な
くとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを得るためには、対照配列中のアミノ酸の５％まで
が欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、ある
いは対照配列中の全アミノ酸のうち５％までの数のアミ
ノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。対
照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のア
ミノまたはカルボキシ末端位置に存在してもよく、ある
いはそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよ
く、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配
列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよ
い。
【００８２】「単離」とは、「人の手によって」天然の
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。
【００８３】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、
これらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌ
クレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡと
ＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域
における鎖は同一の分子または異なる分子由来のもので
よい。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の
全てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの
分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書の用
語ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用
な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの
修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌ
クレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリ
ヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細
胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよ
びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチ
ド」は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）
と称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、
これらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌ
クレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡと
ＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域
における鎖は同一の分子または異なる分子由来のもので
よい。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の
全てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの
分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書の用
語ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用
な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの
修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌ
クレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリ
ヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細
胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよ
びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチ
ド」は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）
と称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。
【００８４】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペ
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Prote
in Synthesis：Posttranslational Modifications and
Aging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Prote
in Synthesis：Posttranslational Modifications and
Aging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。
【００８５】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成および当業者に知られた他の組み換
え法により製造できる。
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成および当業者に知られた他の組み換
え法により製造できる。
【００８６】
【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のスタフィロコッカス・
アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーか
ら得た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤ
ＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンからの配
列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮＡ配列を
構築した場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１
および２によりライブラリーを製造できる。全細胞ＤＮ
Ａは、スタフィロコッカス・アウレウス WCUH29から、
標準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサ
イズ分画する。
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のスタフィロコッカス・
アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーか
ら得た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤ
ＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンからの配
列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮＡ配列を
構築した場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１
および２によりライブラリーを製造できる。全細胞ＤＮ
Ａは、スタフィロコッカス・アウレウス WCUH29から、
標準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサ
イズ分画する。
【００８７】方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を
感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を
感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。
【００８８】方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒｓ
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを標準
法により増幅する。
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを標準
法により増幅する。
【００８９】実施例２ ＭｕｒＢの特徴づけ ｍｕｒＢ遺伝子発現の特徴づけ インビボでの遺伝子発現 最近、感染中の全体的な遺伝子発現を調べる新たなアプ
ローチがいくつか記載されている（Chuang, S. et al.,
(1993); Mahan, M. J. et al., Science 259:686-688
(1993); Hensel, M., et al., Science 269:400-403 (1
995)）。これらの新たな方法は、いままでのところ、グ
ラム陰性病原体について示されているが、グラム陽性病
原体の感染については示されていない。その理由はおそ
らく、全体的なトランスポン突然変異およびこれらの生
物に置けるこれらの方法に必要な適当なベクターの開発
がずっと遅れており、Chuang, S. et al., J. Bacterio
l.175:2026-2036 (1993)に記載された方法の場合、哺乳
動物ＲＮＡ不含の適当量の細菌ＲＮＡを感染組織から単
離することが困難で、十分に高い比活性にまで細菌ＲＮ
Ａを標識できない。本発明は、哺乳動物宿主の感染の異
なる段階における病原体中の遺伝子発現を調べるための
方法を用いる。本発明方法の使用は、感染中に転写され
る細菌遺伝子の同定、抗細菌療法において有用な阻害剤
の同定を可能にする。かかる遺伝子転写の特異的阻害
剤、あるいは生じたｍＲＮＡのその後の転写の特異的阻
害剤、あるいは対応する発現蛋白の機能に対する特異的
阻害剤は、抗細菌療法において有用であろう。
ローチがいくつか記載されている（Chuang, S. et al.,
(1993); Mahan, M. J. et al., Science 259:686-688
(1993); Hensel, M., et al., Science 269:400-403 (1
995)）。これらの新たな方法は、いままでのところ、グ
ラム陰性病原体について示されているが、グラム陽性病
原体の感染については示されていない。その理由はおそ
らく、全体的なトランスポン突然変異およびこれらの生
物に置けるこれらの方法に必要な適当なベクターの開発
がずっと遅れており、Chuang, S. et al., J. Bacterio
l.175:2026-2036 (1993)に記載された方法の場合、哺乳
動物ＲＮＡ不含の適当量の細菌ＲＮＡを感染組織から単
離することが困難で、十分に高い比活性にまで細菌ＲＮ
Ａを標識できない。本発明は、哺乳動物宿主の感染の異
なる段階における病原体中の遺伝子発現を調べるための
方法を用いる。本発明方法の使用は、感染中に転写され
る細菌遺伝子の同定、抗細菌療法において有用な阻害剤
の同定を可能にする。かかる遺伝子転写の特異的阻害
剤、あるいは生じたｍＲＮＡのその後の転写の特異的阻
害剤、あるいは対応する発現蛋白の機能に対する特異的
阻害剤は、抗細菌療法において有用であろう。
【００９０】感染中の、スタフィロコッカス・アウレウ
スＷＣＵＨ２９由来の遺伝子の発現の調査 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に感染し
た４日目のマウス鼠蹊部または感染７日目のマウス腎臓
由来の壊死脂肪組織を、カオトロピック剤およびＲＮＡ
ａｓｅ阻害剤の存在下で効果的に破砕し処理して動物Ｒ
ＮＡおよび細菌ＲＮＡの混合物を得る。組織を液体窒素
中で即座に凍結し、凍結したまま組織試料を処理するこ
とにより、細菌ｍＲＮＡ集団の変化を最小にする。得ら
れた全ＲＮＡはＤＮＡおよび蛋白不含である（ＲＮＡａ
ｓｅおよびＤＮＡａｓｅも不含）。長い転写物を伴った
高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕および処理の最適
条件は、得られたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、なら
びに構成的かつ低コピー数でスタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９中で発現されることが知られている
細菌遺伝子用のＯＲＦ特異的プライマーによる。この実
施例ＩＩのパートｂの態様は、公表されているプロトコ
ール（Cheung, et al., Anal. Biochem (1994) 222:511
-514）の修飾である。
スＷＣＵＨ２９由来の遺伝子の発現の調査 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に感染し
た４日目のマウス鼠蹊部または感染７日目のマウス腎臓
由来の壊死脂肪組織を、カオトロピック剤およびＲＮＡ
ａｓｅ阻害剤の存在下で効果的に破砕し処理して動物Ｒ
ＮＡおよび細菌ＲＮＡの混合物を得る。組織を液体窒素
中で即座に凍結し、凍結したまま組織試料を処理するこ
とにより、細菌ｍＲＮＡ集団の変化を最小にする。得ら
れた全ＲＮＡはＤＮＡおよび蛋白不含である（ＲＮＡａ
ｓｅおよびＤＮＡａｓｅも不含）。長い転写物を伴った
高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕および処理の最適
条件は、得られたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、なら
びに構成的かつ低コピー数でスタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９中で発現されることが知られている
細菌遺伝子用のＯＲＦ特異的プライマーによる。この実
施例ＩＩのパートｂの態様は、公表されているプロトコ
ール（Cheung, et al., Anal. Biochem (1994) 222:511
-514）の修飾である。
【００９１】ａ）感染のマウス動物モデルからのスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染組織の単離 ｉ）感染のネズミ大腿部感染傷害モデルからのスタフィ
ロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染組織の単離。
体積１０ｍｌの滅菌栄養培地（No.2 Oxoid）に、寒天培
養プレートから単離した個々のスタフィロコッカス・ア
ウレウスＷＣＵＨ２９のコロニーを撒く。３７℃で１６
〜２０時間培養物を好気的にインキュベーション（静置
培養）する。このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９ブロス培養物（ブロス中に約１０8ｃｆｕ／ｍ
ｌとなるよう希釈）０．５ｍｌを右前足の大腿部（鼠蹊
部）に皮下注射することにより４週齢のマウス（メス、
１８〜２２ｇ、ＭＦ１株）をそれぞれ感染させる。感染
後２４時間は、マウスを定期的にモニターすべきであ
り、その後、研究終了まで毎日モニターすべきである。
全身感染の徴候、すなわち、昏睡、逆立った毛、群れか
らの離脱を示す動物を詳細にモニターすべきであり、徴
候が瀕死状態に至る場合には動物を即座に除去すべきで
ある。傷害進展を示す外部から目で見てわかる徴候は感
染２４〜４８時間後に現れるであろう。動物の腹部の試
験により、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輪郭が示される
であろう。局所的な傷害は右の下大腿部にとどまるはず
であるが、場合によっては左の下大腿部および上に広が
って胸部に至るかもしれない。場合によっては、膿瘍が
皮膚層から破裂してくるかもしれない。このような場
合、感染動物を即座に除去し、可能ならば組織をサンプ
リングする。動物を除去しないと、膿瘍を覆っている壊
死皮膚組織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれな
い。感染から約９６時間後に、二酸化炭素による窒息を
用いて動物を殺す。死亡と組織処理／保存との間の時間
を最短にするために、グループにおいてではなく、個々
にマウスを殺すべきである。死亡したマウスを仰向けに
置き、７０％アルコールで毛を横向けに拭く。左下大腿
部から腹部へと、はさみを用いる最初の皮膚の切開を行
い、次いで、胸部を切る。腹部から右の下大腿部への切
開により切開を完了する。腹膜を貫通しないように注意
すべきである。鉗子で皮膚を固定し、含むから皮膚を静
かに引っ張る。腹膜を覆っているが通常には筋肉シート
を完全には貫通していない、露出した膿瘍を切除する
が、内蔵を傷つけないように注意する。液体窒素中での
迅速凍結の前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織
を切片化する必要があるかもしれない。切片化によりプ
ラスチック製収集バイアル中での保存が容易となる。
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染組織の単離 ｉ）感染のネズミ大腿部感染傷害モデルからのスタフィ
ロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染組織の単離。
体積１０ｍｌの滅菌栄養培地（No.2 Oxoid）に、寒天培
養プレートから単離した個々のスタフィロコッカス・ア
ウレウスＷＣＵＨ２９のコロニーを撒く。３７℃で１６
〜２０時間培養物を好気的にインキュベーション（静置
培養）する。このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９ブロス培養物（ブロス中に約１０8ｃｆｕ／ｍ
ｌとなるよう希釈）０．５ｍｌを右前足の大腿部（鼠蹊
部）に皮下注射することにより４週齢のマウス（メス、
１８〜２２ｇ、ＭＦ１株）をそれぞれ感染させる。感染
後２４時間は、マウスを定期的にモニターすべきであ
り、その後、研究終了まで毎日モニターすべきである。
全身感染の徴候、すなわち、昏睡、逆立った毛、群れか
らの離脱を示す動物を詳細にモニターすべきであり、徴
候が瀕死状態に至る場合には動物を即座に除去すべきで
ある。傷害進展を示す外部から目で見てわかる徴候は感
染２４〜４８時間後に現れるであろう。動物の腹部の試
験により、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輪郭が示される
であろう。局所的な傷害は右の下大腿部にとどまるはず
であるが、場合によっては左の下大腿部および上に広が
って胸部に至るかもしれない。場合によっては、膿瘍が
皮膚層から破裂してくるかもしれない。このような場
合、感染動物を即座に除去し、可能ならば組織をサンプ
リングする。動物を除去しないと、膿瘍を覆っている壊
死皮膚組織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれな
い。感染から約９６時間後に、二酸化炭素による窒息を
用いて動物を殺す。死亡と組織処理／保存との間の時間
を最短にするために、グループにおいてではなく、個々
にマウスを殺すべきである。死亡したマウスを仰向けに
置き、７０％アルコールで毛を横向けに拭く。左下大腿
部から腹部へと、はさみを用いる最初の皮膚の切開を行
い、次いで、胸部を切る。腹部から右の下大腿部への切
開により切開を完了する。腹膜を貫通しないように注意
すべきである。鉗子で皮膚を固定し、含むから皮膚を静
かに引っ張る。腹膜を覆っているが通常には筋肉シート
を完全には貫通していない、露出した膿瘍を切除する
が、内蔵を傷つけないように注意する。液体窒素中での
迅速凍結の前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織
を切片化する必要があるかもしれない。切片化によりプ
ラスチック製収集バイアル中での保存が容易となる。
【００９２】ｉｉ）血液原性腎盂腎炎のネズミのモデル
からのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感
染組織の単離 エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の一晩培養を、５ｍｌの
トリプリン消化ソイブロス（ＴＳＢ）中で開始し、振盪
しながら３７℃で増殖させる。次いで、滅菌金酸塩緩衝
化セイライン（ＰＢＳ）で培養物をを２回洗浄し、希釈
してＡ６００＝０．３とする。ツベルクリン用シリンジ
に装着した３０ｇの注射針を用いて尾の静脈に接種する
ことにより、オスのＣＤ−１マウス（体重１８〜２０
ｇ）をこの懸濁液０．２ｍｌで感染させる。このやり方
で各マウスは４ｘ１０7個の細菌を与えられる。疾病の
徴候についてマウスを毎日モニターし、通常には、４８
時間以内に昏睡状態、逆立った毛、不活発さの徴候が見
られ、実験終了前に瀕死と思われる動物を安楽死させ
る。感染７日後、二酸化炭素過剰摂取によりすべての動
物を安楽死させる。動物を仰向けに置き、エタノールで
拭き、次いで、ＲＮＡＺａｐで拭く。器具も同様に拭
く。腹腔を開き、腎臓を無菌的に取り、４片に切り、凍
結バイアルに入れ、即座に液体窒素で凍結する。
からのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感
染組織の単離 エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の一晩培養を、５ｍｌの
トリプリン消化ソイブロス（ＴＳＢ）中で開始し、振盪
しながら３７℃で増殖させる。次いで、滅菌金酸塩緩衝
化セイライン（ＰＢＳ）で培養物をを２回洗浄し、希釈
してＡ６００＝０．３とする。ツベルクリン用シリンジ
に装着した３０ｇの注射針を用いて尾の静脈に接種する
ことにより、オスのＣＤ−１マウス（体重１８〜２０
ｇ）をこの懸濁液０．２ｍｌで感染させる。このやり方
で各マウスは４ｘ１０7個の細菌を与えられる。疾病の
徴候についてマウスを毎日モニターし、通常には、４８
時間以内に昏睡状態、逆立った毛、不活発さの徴候が見
られ、実験終了前に瀕死と思われる動物を安楽死させ
る。感染７日後、二酸化炭素過剰摂取によりすべての動
物を安楽死させる。動物を仰向けに置き、エタノールで
拭き、次いで、ＲＮＡＺａｐで拭く。器具も同様に拭
く。腹腔を開き、腎臓を無菌的に取り、４片に切り、凍
結バイアルに入れ、即座に液体窒素で凍結する。
【００９３】ｂ）感染組織試料からのスタフィロコッカ
ス・アウレウスＷＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を、凍結組
織の即時処理のために液体窒素貯蔵庫から取り出す。微
生物安全キャビネット中で試料を一度に破砕するが８片
までとする。組織試料中の細菌を破砕するために、５０
〜１００ｍｇの組織をシリカ／セラミックマトリックス
（BIO101）の入ったFastRNAチューブに移す。即座に１
ｍｌの抽出試薬（FastRNA試薬，BIO101）を添加して試
料対試薬の体積比を約１対２０とする。往復震盪機（Fa
stPrep FP120,BIO101）を５．５ないし６にセットし、
２０〜１２０秒振盪する。粗ＲＮＡ調合物をクロロホル
ム／イソアミルアルコールで抽出し、ＤＰＥＣ処理／イ
ソプロパノール沈殿溶液（BIO101）で沈殿させる。必要
ならばＲＮＡ調合物をこのイソプロパノール溶液中、−
８０℃で保存する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００
ｇ、１０分）、７５％エタノール（ＤＰＥＣ処理水中ｖ
／ｖ）で洗浄し、５〜１０分風乾し、ついで０．１ｍｌ
のＤＰＥＣ処理水に再懸濁する。２ｋｂまでの長さの細
菌性転写物をＲＴ−ＰＣＲにより検出する能力により単
離ＲＮＡの品質を評価する（下のセクションに説明する
ように）。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すため
に、ＲＮＡ試料を逆転写し、構成的に発現される遺伝子
の存在を、TaqManプローブの存在下で定量的ＰＣＲを用
いることにより検出する（以下に説明するように）。
ス・アウレウスＷＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の感染組織試料を、凍結組
織の即時処理のために液体窒素貯蔵庫から取り出す。微
生物安全キャビネット中で試料を一度に破砕するが８片
までとする。組織試料中の細菌を破砕するために、５０
〜１００ｍｇの組織をシリカ／セラミックマトリックス
（BIO101）の入ったFastRNAチューブに移す。即座に１
ｍｌの抽出試薬（FastRNA試薬，BIO101）を添加して試
料対試薬の体積比を約１対２０とする。往復震盪機（Fa
stPrep FP120,BIO101）を５．５ないし６にセットし、
２０〜１２０秒振盪する。粗ＲＮＡ調合物をクロロホル
ム／イソアミルアルコールで抽出し、ＤＰＥＣ処理／イ
ソプロパノール沈殿溶液（BIO101）で沈殿させる。必要
ならばＲＮＡ調合物をこのイソプロパノール溶液中、−
８０℃で保存する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００
ｇ、１０分）、７５％エタノール（ＤＰＥＣ処理水中ｖ
／ｖ）で洗浄し、５〜１０分風乾し、ついで０．１ｍｌ
のＤＰＥＣ処理水に再懸濁する。２ｋｂまでの長さの細
菌性転写物をＲＴ−ＰＣＲにより検出する能力により単
離ＲＮＡの品質を評価する（下のセクションに説明する
ように）。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すため
に、ＲＮＡ試料を逆転写し、構成的に発現される遺伝子
の存在を、TaqManプローブの存在下で定量的ＰＣＲを用
いることにより検出する（以下に説明するように）。
【００９４】ｃ）スタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積５７マイクロリットルとしたバッファー中１０
ユニットのＲＮＡａｓｅ不含ＤＮＡａｓｅＩ（GeneHunt
er）を用い、３７℃で３０分処理することにより５０マ
イクログラムのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去する。フェ
ノール：クロロホルム抽出によりＤＮＡａｓｅを不活性
化する。ＲＮＡを５マイクロリットルの３Ｍ ＮａＯＡ
ｃおよび２００マイクロリットルの１００％ ＥｔＯＨ
で沈殿させ、１２０００ｇで１０分間の遠心分離により
ペレット化する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００
ｇ、１０分）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ処理水中ｖ
／ｖ）で洗浄し、５〜１０分風乾し、１０〜２０マイク
ロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。清浄化した
ＲＮＡ試料を１：１０００希釈後、ＯＤ２６０によりＲ
ＮＡ収量を定量する。必要ならばＲＮＡを−８０℃で保
存し、１週間以内に逆転写する。
ＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積５７マイクロリットルとしたバッファー中１０
ユニットのＲＮＡａｓｅ不含ＤＮＡａｓｅＩ（GeneHunt
er）を用い、３７℃で３０分処理することにより５０マ
イクログラムのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去する。フェ
ノール：クロロホルム抽出によりＤＮＡａｓｅを不活性
化する。ＲＮＡを５マイクロリットルの３Ｍ ＮａＯＡ
ｃおよび２００マイクロリットルの１００％ ＥｔＯＨ
で沈殿させ、１２０００ｇで１０分間の遠心分離により
ペレット化する。ＲＮＡをペレット化し（１２０００
ｇ、１０分）、７５％エタノール（ＤＥＰＣ処理水中ｖ
／ｖ）で洗浄し、５〜１０分風乾し、１０〜２０マイク
ロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。清浄化した
ＲＮＡ試料を１：１０００希釈後、ＯＤ２６０によりＲ
ＮＡ収量を定量する。必要ならばＲＮＡを−８０℃で保
存し、１週間以内に逆転写する。
【００９５】ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料１０マイクロリットルを、First Strand cDNA合成
キット用のSuperScript Preamplification System（Gib
co BRL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScripItI逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料１０マイクロリットルを、First Strand cDNA合成
キット用のSuperScript Preamplification System（Gib
co BRL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScripItI逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。
【００９６】ｅ）感染組織由来の細菌ＲＮＡの品質を調
べるためのＰＣＲの使用 ペニシリン結合蛋白２（ＰＢＰ２）のごとき細菌細胞中
では低コピー数と考えられる長い転写物を上記のごとく
ランダムプライマーを用いて逆転写し、ついで、抽出お
よび精製中に得られたｍＲＮＡの品質を増幅された長さ
により確認するためにＯＲＦ特異的プライマーを用いる
ＰＣＲにより増幅する。下記成分（最終濃度）を添加す
ることにより氷上で０．２ｍｌのチューブにおいて最終
体積５０マイクロリットルのＰＣＲ反応物をセットアッ
プする：AmpliTaq PCRバッファーII（１Ｘ）、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ順方向
プライマー、０．５μＭ逆方向プライマー、および２マ
イクロリットルの逆転写されたＲＮＡ。PE GeneAmp PCR
System 9600においてＰＣＲ反応を行った：９４℃で２
分、次いで９４℃で３０秒、４２℃で３０秒そして７２
℃で３０秒を３５サイクル、その後７２℃で７分の最終
伸長を行う。
べるためのＰＣＲの使用 ペニシリン結合蛋白２（ＰＢＰ２）のごとき細菌細胞中
では低コピー数と考えられる長い転写物を上記のごとく
ランダムプライマーを用いて逆転写し、ついで、抽出お
よび精製中に得られたｍＲＮＡの品質を増幅された長さ
により確認するためにＯＲＦ特異的プライマーを用いる
ＰＣＲにより増幅する。下記成分（最終濃度）を添加す
ることにより氷上で０．２ｍｌのチューブにおいて最終
体積５０マイクロリットルのＰＣＲ反応物をセットアッ
プする：AmpliTaq PCRバッファーII（１Ｘ）、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ順方向
プライマー、０．５μＭ逆方向プライマー、および２マ
イクロリットルの逆転写されたＲＮＡ。PE GeneAmp PCR
System 9600においてＰＣＲ反応を行った：９４℃で２
分、次いで９４℃で３０秒、４２℃で３０秒そして７２
℃で３０秒を３５サイクル、その後７２℃で７分の最終
伸長を行う。
【００９７】ｆ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用 ０．５マイクロＭの各ＯＲＦ特異的順方向および逆方向
プライマーを用いて、上記のごとくＰＣＲ反応系をセッ
トアップする。２０マイクロリットルの部分試料中のＰ
ＣＲ生成物を１ないし１．５％ １ｘＴＢＥゲルでまた
は１０％ １ｘ ＴＢＥアクリルアミドゲルで電気泳動す
ることにより分離する。臭化エチジウムでゲルを染色す
ることによりＰＣＲ生成物を可視化する。１００ｂｐの
ＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Technologies）との比
較によりサイズを評価する。別法として、ＰＣＲ生成物
が標識ＰＣＲプライマーを用いることにより慣用的に標
識される場合には（例えば、５’末端を色素で標識する
場合）、ＰＣＲ生成物の適当な部分試料をポリアクリル
アミド配列決定用ゲルに流し、その存在および量を適当
なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin Elmer
により提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いたABI
PrismTM 377 Sequencer）を用いて検出する。ＲＴ／Ｐ
ＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応物、非転写スタフィロ
コッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９ゲノム配列からＰＣ
Ｒ生成物を生じるように設計された１６Ｓ ｒＲＮＡプ
ライマーもしくはＤＮＡ特異的プライマーペアーを含ん
でいてもよい。プライマーペアーの効率を試験するため
に、それらをスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ
２９全ＤＮＡを用いるＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣ
Ｒ反応をセットアップし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイ
クログラムのＤＮＡを用いて上記のごとく３５サイクル
のＰＣＲ反応を行う。ＤＮＡ ＰＣＲまたはＰＴ／ＰＣ
Ｒのいずれにおいても予想サイズの生成物を生じないプ
ライマーペアーはＰＣＲ反応できず、そのようなものと
しては不均一である。ＤＮＡ ＰＣＲで正しいサイズの
生成物を生じるものは２つのクラスに分類される：１．
インビボで転写されない遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲ
において生成物を生じる再現性がないもの；および２．
インビボで転写される遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲに
おいて正しいサイズの生成物を再現性をもって生じ、＋
ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシグナル（生じた
場合には）よりも強力なシグナルを生じるもの。
ＰＣＲの使用 ０．５マイクロＭの各ＯＲＦ特異的順方向および逆方向
プライマーを用いて、上記のごとくＰＣＲ反応系をセッ
トアップする。２０マイクロリットルの部分試料中のＰ
ＣＲ生成物を１ないし１．５％ １ｘＴＢＥゲルでまた
は１０％ １ｘ ＴＢＥアクリルアミドゲルで電気泳動す
ることにより分離する。臭化エチジウムでゲルを染色す
ることによりＰＣＲ生成物を可視化する。１００ｂｐの
ＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life Technologies）との比
較によりサイズを評価する。別法として、ＰＣＲ生成物
が標識ＰＣＲプライマーを用いることにより慣用的に標
識される場合には（例えば、５’末端を色素で標識する
場合）、ＰＣＲ生成物の適当な部分試料をポリアクリル
アミド配列決定用ゲルに流し、その存在および量を適当
なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin Elmer
により提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いたABI
PrismTM 377 Sequencer）を用いて検出する。ＲＴ／Ｐ
ＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応物、非転写スタフィロ
コッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９ゲノム配列からＰＣ
Ｒ生成物を生じるように設計された１６Ｓ ｒＲＮＡプ
ライマーもしくはＤＮＡ特異的プライマーペアーを含ん
でいてもよい。プライマーペアーの効率を試験するため
に、それらをスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ
２９全ＤＮＡを用いるＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣ
Ｒ反応をセットアップし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイ
クログラムのＤＮＡを用いて上記のごとく３５サイクル
のＰＣＲ反応を行う。ＤＮＡ ＰＣＲまたはＰＴ／ＰＣ
Ｒのいずれにおいても予想サイズの生成物を生じないプ
ライマーペアーはＰＣＲ反応できず、そのようなものと
しては不均一である。ＤＮＡ ＰＣＲで正しいサイズの
生成物を生じるものは２つのクラスに分類される：１．
インビボで転写されない遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲ
において生成物を生じる再現性がないもの；および２．
インビボで転写される遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲに
おいて正しいサイズの生成物を再現性をもって生じ、＋
ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシグナル（生じた
場合には）よりも強力なシグナルを生じるもの。
【００９８】ｇ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を決定するため
のＰＣＲおよび蛍光発生プローブの使用 ５’および３’末端をそれぞれレポーターおよびクエン
チャー蛍光色素（ＦＱプローブ）で標識したオリゴヌク
レオチドプローブ（２つのＰＣＲプライマー間にアニー
ルする）の存在下でのPE Applied Biosystems 7700 Seq
uence Detection Systemにおける標的配列の増幅により
配列特異的検出を行う。プローブがプライマー間に結合
する場合、特異的生成物のみが検出されるであろう。Ｐ
ＣＲ増幅が進行するにつれ、Ｔａｑポリメラーゼの５’
ヌクレアーゼ活性により、まず、レポーター色素がプロ
ーブから開裂される。レポーター色素がクエンチャー色
素から物理的に分離された場合に発生するシグナルを、
装備されたＣＣＤカメラを用いてシグナルを測定するこ
とにより検出する。発生した各シグナルは開裂された１
のプローブに等しく、それは１の標的鎖の増幅に対応す
る。提供された説明書に従ってPE Applied Biosystem T
aqMan PCR Core Reagent Kitを用いてＰＣＲ反応をセッ
トアップして、各反応系が５マイクロリットルの１０Ｘ
ＰＣＲバッファーII、７マイクロリットルの２５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５マイクロリットルの３００ｎＭ順方向プ
ライマー、５マイクロリットルの逆方向プライマー、５
マイクロリットルの特異的ＦＱプローブ、各１マイクロ
リットルの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１
０ｍＭ ｄＧＴＰおよぶい２０ｍＭ ｄＵＴＰ、１３．２
５マイクロリットルの蒸留水、０．５マイクロリットル
のAmpErase UNG、および０．２５マイクロリットルのAm
pliTaq ＤＮＡポリメラーゼを含み、全体積が４５マイ
クロリットルとなるようにする。下記温度サイクリング
で増幅を進行させる：５０℃に２分保持、９５℃に１０
分保持、９５℃に１５秒そして６０℃に１分を４０サイ
クル、その後試料を回収するまで２５℃に保持。検出を
リアルタイムで行う。反応終了時にデータを集める。こ
れらの分析に基づいて、スタフィロコッカス・アウレウ
スｍｕｒＢ遺伝子がインビボで転写されたことが見いだ
された。
のＰＣＲおよび蛍光発生プローブの使用 ５’および３’末端をそれぞれレポーターおよびクエン
チャー蛍光色素（ＦＱプローブ）で標識したオリゴヌク
レオチドプローブ（２つのＰＣＲプライマー間にアニー
ルする）の存在下でのPE Applied Biosystems 7700 Seq
uence Detection Systemにおける標的配列の増幅により
配列特異的検出を行う。プローブがプライマー間に結合
する場合、特異的生成物のみが検出されるであろう。Ｐ
ＣＲ増幅が進行するにつれ、Ｔａｑポリメラーゼの５’
ヌクレアーゼ活性により、まず、レポーター色素がプロ
ーブから開裂される。レポーター色素がクエンチャー色
素から物理的に分離された場合に発生するシグナルを、
装備されたＣＣＤカメラを用いてシグナルを測定するこ
とにより検出する。発生した各シグナルは開裂された１
のプローブに等しく、それは１の標的鎖の増幅に対応す
る。提供された説明書に従ってPE Applied Biosystem T
aqMan PCR Core Reagent Kitを用いてＰＣＲ反応をセッ
トアップして、各反応系が５マイクロリットルの１０Ｘ
ＰＣＲバッファーII、７マイクロリットルの２５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５マイクロリットルの３００ｎＭ順方向プ
ライマー、５マイクロリットルの逆方向プライマー、５
マイクロリットルの特異的ＦＱプローブ、各１マイクロ
リットルの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１
０ｍＭ ｄＧＴＰおよぶい２０ｍＭ ｄＵＴＰ、１３．２
５マイクロリットルの蒸留水、０．５マイクロリットル
のAmpErase UNG、および０．２５マイクロリットルのAm
pliTaq ＤＮＡポリメラーゼを含み、全体積が４５マイ
クロリットルとなるようにする。下記温度サイクリング
で増幅を進行させる：５０℃に２分保持、９５℃に１０
分保持、９５℃に１５秒そして６０℃に１分を４０サイ
クル、その後試料を回収するまで２５℃に保持。検出を
リアルタイムで行う。反応終了時にデータを集める。こ
れらの分析に基づいて、スタフィロコッカス・アウレウ
スｍｕｒＢ遺伝子がインビボで転写されたことが見いだ
された。
【００９９】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：Wallis, Nicola G. Fedon, Jason C. Palmer, Leslie M. Shilling, Lisa K. （ｉｉ）発明の名称：新規ＭｕｒＢ （ｉｉｉ）配列の数：６ （ｖｉ）連絡先： （Ａ）宛て名：Dechert Price & Phoads （Ｂ）通り名：4000 Bell Atlantic Tower, 1717 Arch
Stre （Ｃ）都市名：Philadelphia （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：19103 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）Windows用FastSEQバージョン２．０用 （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Dickinson, Todd Q （Ｂ）登録番号：28354 （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ１００７６ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２２５２ （Ｂ）ファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：
Stre （Ｃ）都市名：Philadelphia （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：19103 （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）Windows用FastSEQバージョン２．０用 （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Dickinson, Todd Q （Ｂ）登録番号：28354 （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ１００７６ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２２５２ （Ｂ）ファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：
【０１００】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２００塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： TATAATTATA CTAATTCTAA TACTTTCTTT TCAATTTTCG CAAATGAATT TTAAAATTGG 60 TATAATACTA TATGATATTA AAGACATGAG AAAGGATGTA CTGAGAAGTG ATAAATAAAG 120 ACATCTATCA AGCTTTACAA CAACTTATCC CAAATGAAAA AATTAAAGTT GATGAACCTT 180 TAAAACGATA CACTTATACT AAAACAGGTG GTAATGCCGA CTTTTATATT ACCCCTACTA 240 AAAATGAAGA AGTACAAGCA GTTGTTAAAT ATGCCTATCA AAATGAGATT CCTGTTACAT 300 ATTTAGGAAA TGGCTCAAAT ATTATTATCC GTGAAGGTGG TATTCGCGGC ATTGTAATTA 360 GTTTATTATC ACTAGATCAT ATCGATGTAT CTGATGATGC GATAATAGCC GGTAGCGGCG 420 CTGCAATTAT TGATGTCTCA CGTGTTGCTC GTGATTACGC ACTTACTGGC CTTGAATTTG 480 CATGTGGTAT TCCAGGTTCA ATTGGTGGTG CAGTGTATAT GAATGCTGGC GCTTATGGTG 540 GCGAAGTTAA AGATTGTATA GACTATGCGC TTTGCGTAAA CGAACAAGGC TCGTTAATTA 600 AACTTACAAC AAAAGAATTA GAGTTAGATT ATCGTAATAG CATTATTCAA AAAGAACACT 660 TAGTTGTATT AGAAGCTGCA TTTACTTTAG CTCCTGGTAA AATGACTGAA ATACAAGCTA 720 AAATGGATGA TTTAACAGAA CGTAGAGAAT CTAAACAACC TTTAGAGTAT CCTTCATGTG 780 GTAGTGTATT CCAAAGACCG CTTGGTCATT TTGCAGGTAA ATTGATACAA GATTCTAATT 840 TGCAAGGTCA CCGTATTGGC GGCGTTGAAG TTTCAACCAA ACACGCTGGT TTTATGGTAA 900 ATGTAGACAA TGGAACTGCT ACAGATTATG AAAACCTTAT TCATTATGTA CAAAAGACCG 960 TCAAAGAAAA ATTTGGCATT GAATTAAATC GTGAAGTTCG CATTATTGGT GAACATCCAA 1020 AGGAATCGTA AGTTAAGGAG CTTTGTCTAT GCCTAAAGTT TATGGTTCAT TAATCGATAC 1080 TGAAACACGC TGTCGCCATT ATTTTACCGA AGAAGATATT ATTGCTATTA AATTTAAATG 1140 TTGTAATAAA TACTATCCAT GCTATAAGTG CCATAATGAG TTTGAAAAGC ACGCCATTAA 1200
【０１０１】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Ile Asn Lys Asp Ile Tyr Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ile Pro Asn 1 5 10 15 Glu Lys Ile Lys Val Asp Glu Pro Leu Lys Arg Tyr Thr Tyr Thr Lys 20 25 30 Thr Gly Gly Asn Ala Asp Phe Tyr Ile Thr Pro Thr Lys Asn Glu Glu 35 40 45 Val Gln Ala Val Val Lys Tyr Ala Tyr Gln Asn Glu Ile Pro Val Thr 50 55 60 Tyr Leu Gly Asn Gly Ser Asn Ile Ile Ile Arg Glu Gly Gly Ile Arg 65 70 75 80 Gly Ile Val Ile Ser Leu Leu Ser Leu Asp His Ile Asp Val Ser Asp 85 90 95 Asp Ala Ile Ile Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ile Ile Asp Val Ser Arg 100 105 110 Val Ala Arg Asp Tyr Ala Leu Thr Gly Leu Glu Phe Ala Cys Gly Ile 115 120 125 Pro Gly Ser Ile Gly Gly Ala Val Tyr Met Asn Ala Gly Ala Tyr Gly 130 135 140 Gly Glu Val Lys Asp Cys Ile Asp Tyr Ala Leu Cys Val Asn Glu Gln 145 150 155 160 Gly Ser Leu Ile Lys Leu Thr Thr Lys Glu Leu Glu Leu Asp Tyr Arg 165 170 175 Asn Ser Ile Ile Gln Lys Glu His Leu Val Val Leu Glu Ala Ala Phe 180 185 190 Thr Leu Ala Pro Gly Lys Met Thr Glu Ile Gln Ala Lys Met Asp Asp 195 200 205 Leu Thr Glu Arg Arg Glu Ser Lys Gln Pro Leu Glu Tyr Pro Ser Cys 210 215 220 Gly Ser Val Phe Gln Arg Pro Leu Gly His Phe Ala Gly Lys Leu Ile 225 230 235 240 Gln Asp Ser Asn Leu Gln Gly His Arg Ile Gly Gly Val Glu Val Ser 245 250 255 Thr Lys His Ala Gly Phe Met Val Asn Val Asp Asn Gly Thr Ala Thr 260 265 270 Asp Tyr Glu Asn Leu Ile His Tyr Val Gln Lys Thr Val Lys Glu Lys 275 280 285 Phe Gly Ile Glu Leu Asn Arg Glu Val Arg Ile Ile Gly Glu His Pro 290 295 300 Lys Glu Ser 305
【０１０２】（２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４６２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： TGGCGAGGGT TCCTAGGCGG GGAGGGGGAG GCGCCAAAAG CCAACCCTTT CCCCCGGGGT 60 TGGCGGTTTC ATTATGGGGG GCCAGAAAAG TTTCCCGAAT GGAAGCGTGC TTGCGGGGCA 120 AAGCATTTAA GGGGGTTGTT CATTCAAGAG CACCCCCGGG TTAAAAATTT AGCTTTCCGG 180 TTGAAAGTGG GGGGATGGGA GGCGATAACC ATTTAACCCG GGAAACCGTT GGACCCGGTT 240 AACGCCAAGG GGCCATTAAC CTTTAATGAA GGGAACAAAG GGGGGTCTCC CCCCGGGGGC 300 GCCCTTTTGG AAATGGGATA TCCCCGAAAG CCCATTAAAA TTAAAAAAAC TATTGGGCGG 360 AAACGATTCT TTTAAATTAT TAACGAGGCC CATTTTAGAT TATTTTGGTA GTGGAGGAAA 420 ATTGGAAGAG AATTAATTCC TTAGATGAAA AACGCTTAAA TAATGTGGGG TTTATTGTTG 480 GCTTCTAAAA TAAATTAGGA AGTTTAGGTG GGGAAGTTTT ACAATTTTCA TGAATTAAAA 540 CAACAGTGCG TGCAAATATC ATTCAAGTGA TAACCCAAAC ATTTGGATCT TATCTTGCAC 600 TTGATAACTT CTATTCAACT ATGATGATAT TGTTTGCATT TTCATAACAA AAAAGCACCA 660 ANTATTGCAA CATAGCTTAA CAATTAGACA TNATGAGATG CAAAAGCAAC AATACTTTGA 720 AAAACTATGT AAAAAATACT TATAACGACA ATAATGCCGT ATTTTATAAT TATACTAATT 780 CTAATACTTT CTTTTCAATT TTCGCAAATG AATTTTAAAA TTGGTATAAT ACTATATGAT 840 ATTAAAGACA TGAGAAAGGA TGTACTGAGA AGTGATAAAT AAAGACATCT ATCAAGCTTT 900 ACAACAACTT ATCCCAAATG AAAAAATTAA AGTTGATGAA CCTTTAAAAC GATACACTTA 960 TACTAAAACA GGTGGTAATG CCGACTTTTA TATTACCCCT ACTAAAAATG AAGAAGTACA 1020 AGCAGTTGTT AAATATGCCT ATCAAAATGA GATTCCTGTT ACATATTTAG GAAATGGCTC 1080 AAATATTATT ATCCGTGAAG GTGGTATTCG CGGCATTGTA ATTAGTTTAT TATCACTAGA 1140 TCATATCGAT GTATCTGATG ATGCGATAAT AGCCGGTAGC GGCGCTGCAA TTATTGATGT 1200 CTCACGTGTT GCTCGTGATT ACGCACTTAC TGGCCTTGAA TTTGCATGTG GTATTCCAGG 1260 TTCAATTGGT GGTGCAGTGT ATATGAATGC TGGCGCTTAT GGTGGCGAAG TTAAAGATTG 1320 TATAGACTAT GCGCTTTGCG TAAACGAACA AGGCTCGTTA ATTAAACTTA CAACAAAAGA 1380 ATTAGAGTTA GATTATCGTA ATAGCATTAT TCAAAAAGAA CACTTAGTTG TATTAGAAGC 1440 TGCATTTACT TTAGCTCCTG GG 1462
【０１０３】（２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： Val Ile Asn Lys Asp Ile Tyr Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ile Pro Asn 1 5 10 15 Glu Lys Ile Lys Val Asp Glu Pro Leu Lys Arg Tyr Thr Tyr Thr Lys 20 25 30 Thr Gly Gly Asn Ala Asp Phe Tyr Ile Thr Pro Thr Lys Asn Glu Glu 35 40 45 Val Gln Ala Val Val Lys Tyr Ala Tyr Gln Asn Glu Ile Pro Val Thr 50 55 60 Tyr Leu Gly Asn Gly Ser Asn Ile Ile Ile Arg Glu Gly Gly Ile Arg 65 70 75 80 Gly Ile Val Ile Ser Leu Leu Ser Leu Asp His Ile Asp Val Ser Asp 85 90 95 Asp Ala Ile Ile Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ile Ile Asp Val Ser Arg 100 105 110 Val Ala Arg Asp Tyr Ala Leu Thr Gly Leu Glu Phe Ala Cys Gly Ile 115 120 125 Pro Gly Ser Ile Gly Gly Ala Val Tyr Met Asn Ala Gly Ala Tyr Gly 130 135 140 Gly Glu Val Lys Asp Cys Ile Asp Tyr Ala Leu Cys Val Asn Glu Gln 145 150 155 160 Gly Ser Leu Ile Lys Leu Thr Thr Lys Glu Leu Glu Leu Asp Tyr Arg 165 170 175 Asn Ser Ile Ile Gln Lys Glu His Leu Val Val Leu Glu Ala Ala Phe 180 185 190 Thr Leu Ala Pro Gly 195
【０１０４】（２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： GCCGACTTTT ATATTACCCC TACT 24
【０１０５】（２）配列番号：６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： ACAATCTTTA ACTTCGCCAC CATA 24
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/085 39/085 39/395 Ｄ 39/395 Ｎ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 14/31 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェイソン・クレイグ・フェドン アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ス トラフォード、フェアフィールド・レイン 106番、アパートメント２ (72)発明者 レスリー・マリー・パーマー アメリカ合衆国19407ペンシルベニア州オ ーデュボン、イーグルビル・ロード2820番 (72)発明者 リサ・キャスリーン・シリング アメリカ合衆国18940ペンシルベニア州ニ ュータウン、イースト・パーク・ロード６ 番
Claims (24)
- 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドコードしているポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単
離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 寄託株のスタフィロコッカス・アウレウ
ス中に含まれるＭｕｒＢ遺伝子により発現されるのと同
じ成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
オチドを含む単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチドを含む単離ポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項１のポリヌクレオチドに対して相
捕的な単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ
である請求項１のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号：１に示す核酸配列を含む請求
項１のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 配列番号１に示すヌクレオチド１０８か
らヌクレオチド番号１０２９より開始する停止コドンま
でを含む請求項１のポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードしている請求項１のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項９】 請求項１のポリヌクレオチドを含むベク
ター。 - 【請求項１０】 請求項９のベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項１１】 請求項１０の宿主細胞から上記ＤＮＡ
によりコードされているポリペプチドを発現させること
を含む、ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１２】 ＭｕｒＢポリペプチドまたはフラグメ
ントの製造方法であって、該ポリペプチドまたはフラグ
メントの生成に十分な条件下で請求項１０の宿主を培養
することを含む方法。 - 【請求項１３】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド。 - 【請求項１４】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
むポリペプチド。 - 【請求項１５】 請求項１４のポリペプチドに対する抗
体。 - 【請求項１６】 請求項１４のポリペプチドの活性また
は発現を阻害するアンタゴニスト。 - 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１４のポリペプ
チドを個体に投与することを含む、ＭｕｒＢポリペプチ
ドを必要とする個体の治療方法。 - 【請求項１８】 治療上有効量の請求項１４のアンタゴ
ニストを個体に投与することを含む、ＭｕｒＢポリペプ
チドの阻害を必要とする個体の治療方法。 - 【請求項１９】 個体における請求項１４のポリペプチ
ドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であっ
て、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
すること、および／または（ｂ）個体由来の試料中の該
ポリペプチドの存在または量について分析することを含
む方法。 - 【請求項２０】 請求項１４のポリペプチドと相互作用
して、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方
法であって、 化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条
件下で、ポリペプチドとスクリーニングすべき化合物と
を接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作
用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出
可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したもので
ある）、 次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じ
るシグナルの存在または不存在を検出することにより、
化合物がポリペプチドと相互作用して、その活性を活性
化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。 - 【請求項２１】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、抗体および／またはＴ細胞を生じさ
せて動物を疾病から防御するに十分な請求項１４のＭｕ
ｒＢポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種
を哺乳動物に接種することを含む方法。 - 【請求項２２】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法であって、ＭｕｒＢポリペプチドまたはそのフ
ラグメントもしくは変種をインビボで発現させて、抗体
および／またはＴ細胞を生じさせる免疫学的応答を誘導
して該動物を疾病から防御するするために、請求項１４
のＭｕｒＢポリペプチドまたはそのフラグメントもしく
は変種の発現を指令する核酸ベクターを送達することを
含む方法。 - 【請求項２３】 配列番号：４のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドを
含む単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２４】 配列番号：３のポリヌクレオチド配列
に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
オチドを含む単離ポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5694297P | 1997-08-25 | 1997-08-25 | |
| US08/975,215 US6225098B1 (en) | 1997-08-25 | 1997-11-20 | UDP-N-acetylenolpyruvyglucosamine reductase |
| US08/975215 | 1997-11-20 | ||
| US60/056942 | 1997-11-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11235178A true JPH11235178A (ja) | 1999-08-31 |
Family
ID=26735875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10280413A Withdrawn JPH11235178A (ja) | 1997-08-25 | 1998-08-25 | 新規ＭｕｒＢ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6225098B1 (ja) |
| EP (1) | EP0899335A3 (ja) |
| JP (1) | JPH11235178A (ja) |
| CA (1) | CA2241430A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009523120A (ja) * | 2005-12-09 | 2009-06-18 | アールエックス３ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 抗生物質の相乗効果の同定法と応用法 |
Families Citing this family (3)
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