KR102551038B1

KR102551038B1 - 폐렴구균 내인성 독소의 독성을 증가시키며, HigBA 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102551038B1
Application number: KR1020200187474A
Authority: KR
Inventors: 강성민; 이봉진; 김성룡; 김도희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2023-07-05
Also published as: KR20220095702A

Abstract

본 발명은 폐렴구균의 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 항균 펩타이드는 폐렴구균의 독소-항독소 복합체 형성을 억제하고, 그에 따라 분리된 독소의 RNA 분해 활성에 의해 폐렴구균의 성장 억제 및 사멸을 유도하므로, 항균용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐렴구균 내인성 독소의 독성을 증가시키며, HigBA 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 이의 용도{Antimicrobial peptides increasing toxicities of endogenous toxin and targeting HigBA toxin-antitoxin system of Streptococcus pneumoniae, and use thereof}

본 발명은 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae) 내인성 독소의 독성을 증가시키며, HigBA 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae)은 주로 호흡기 감염을 통해 질병을 일으키는 그람 양성균으로, 폐렴 구균으로 인한 질병에는 중이염, 부비동염, 수막염, 균혈증, 폐렴 등이 있다. 폐렴 구균에 의한 감염으로 2015년에 515,000명이 사망했으며, 그 중 335,000명이 5세 미만 유아에서 발생했다. 폐렴 구균에 감염된 환자는 주로 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporins), 마크로라이드(macrolides) 및 퀴놀론(quinolones)과 같은 항균제로 치료하는 것이 일반적이지만, 폐렴 구균에 대한 항균제 내성 균주가 증가함에 따라 새로운 치료제 개발이 필요하다.

박테리아는 일반적으로 독소-항독소 체계를 갖추고 있으며, 이는 유전자 조절, 성장, 생존 및 세포 자멸사 등과 같은 생리적 과정에서 중요한 역할을 한다. 정상적인 성장 환경에서는 독소와 그 동종의 항독소는 안정한 복합체를 형성하고 있으나, 스트레스 상태에서는 불안정한 항독소가 분해되면서 유리 독소가 방출된다. 방출된 독소는 숙주 세포의 RNA를 분해하거나, 토포이소머라제(topoisomerase) 또는 리보솜에 결합함으로써, DNA 복제, 단백질 합성 및 세포벽 합성 등을 억제하여 독성을 나타낸다.

독소-항독소 체계는 항독소가 독소의 독성을 억제하는 방법에 따라 6가지 종류(type I 내지 VI)로 분류된다. 타입 I 체계에서는 항독소가 독소 mRNA에 결합할 수 있는 안티센스(antisense) RNA로, 독소의 번역을 억제하고, 타입 II 체계에서는 단백질 형태의 열역학적으로 안정한 독소 및 불안정한 항독소가 서로 결합함으로써 비독성 단백질 복합체를 형성한다. 타입 III 체계에서는 RNA 형태의 항독소가 독소 단백질에 직접적으로 결합하여 비독성 RNA-단백질 복합체를 형성하며, 타입 IV 체계에서는 독소 및 항독소가 서로 결합하지 않고, 동일한 세포 표적에 대하여 경쟁적으로 작용한다. 타입 V 체계에서는 단백질 형태의 항독소가 독소 mRNA를 분해하고, 타입 VI 체계에서는 단백질 형태의 항독소가 독소 단백질을 세포 내 프로테아제에 전달하여 독소 단백질의 분해를 유도한다(Ki-Young Lee et al., Toxins, 8(10), 2016).

상기 독소-항독소 체계 중 타입 II 체계는 가장 흔한 타입으로 알려져 있다. 항독소는 세포 프로테아제에 의해 절단되며 독소보다 반감기가 낮기 때문에, 숙주는 독소의 독성을 중화시키기 위해 지속적인 항독소 공급에 의존한다. 폐렴 구균에서는 RelBEs, phd-doc, HicBA, HigBA 및 1개의 미확인 패밀리 등의 II 형 독소-항독소 체계가 알려져있다. 이들 독소-항독소 체계 중에서 HigBA 시스템은 HigB 독소 사이에서 제한된 서열 상동성을 공유하고 HigA 항독소는 상당한 구조적 가변성을 나타낸다. 독소 또는 항독소를 모방한 펩티드는 HigBA 복합체 형성을 방해할 수 있다.

독소-항독소 복합체의 형성을 인위적으로 억제할 수 있으면 독성을 갖는 독소가 중화되지 못하여 결국 세포가 사멸하기 때문에 독소-항독소 체계는 새로운 항균제 개발을 위한 매력적인 표적이 될 수 있다. 따라서, HigBA 복합체를 표적으로 하여 복합체 형성을 방해할 수 있는 독소 또는 항독소를 모방한 펩티드와 같은 폐렴 구균 치료제를 개발하기 위한 노력들이 이행되어 왔지만, 현재까지는 성공한 예가 없다.

이에, 본 발명자들은 폐렴 구균의 HigBA 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 폐렴 구균 치료제를 개발하기 위해 노력하던 중, 폐렴 구균의 HigB 유사 펩타이드를 고안하였고, 상기 펩타이드가 HigB 단백질의 RNA 분해 활성을 증가시키고, HigBA 단백질 복합체 형성을 억제하여 항균 활성을 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폐렴 구균 내인성 독소의 독성을 증가시키며, HigBA 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 폐렴구균의 독소-항독소 결합체인 HigBA 복합체의 형성을 억제하는 항균 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 외용제를 제공한다.

본 발명은 폐렴구균의 HigBA 독소-항독소 체계를 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 항균 펩타이드는 폐렴구균의 HigBA독소-항독소 복합체 형성을 억제하고, 그에 따라 분리된 독소의 RNA 분해 활성에 의해 폐렴구균의 성장 억제 및 사멸을 유도하므로, 항균용 조성물, 의약외품 또는 외용제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 폐렴구균(S. pneumoniae) HigBA 단백질 복합체의 비대칭적인 헤테로-테트라머(A), 헤테로-다이머(B) 및 HigA 항독소 단백질의 D 사슬(C) 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 폐렴구균의 HigBA 단백질 복합체 및 HigA 단백질의 분자량 확인을 위한 크기 배제 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 4가지 균주(Proteus vulgaris , Escherichia coli , Vibrio cholera, Streptococcus pneumoniae)의 HigBA 단백질 복합체 구조를 비교 분석한 도면이다.
도 4는 HigBA 프로모터 영역 내의 회문 구조를 가지는 4개의 DNA 이중체(Pal-I, Pal-II, Pal-III 및 Pal-IV)를 나타낸 도면이다.
도 5는 HigBA 복합체 단백질과 DNA 서열과의 결합 여부를 확인하기 위해 전기영동을 수행한 도면이다.
도 6은 HigBA 프로모터 영역에 속하지 않는 'A' 및 'B' 회문 구조 서열 및 대조군인 'X' 서열과 HigBA 복합체 단백질의 결합 여부를 확인한 도면이다.
도 7은 HigBA 복합체 단백질과 4개의 DNA 이중체(Pal-I, Pal-II, Pal-III 및 Pal-IV)의 결합 친화도를 측정하기 위해 등온 적정 열량 측정법(isothermal titration calorimetry, ITC)을 수행한 도면이다.
도 8은 0 내지 0.1mm 농도 구배의 Pal-III와 0.5mm 농도의 HigA¹⁹ ^-9가 혼합된 HSQC 스펙트럼을 겹쳐서 나타낸 도면이다.
도 9는 HigA 단백질(HigA¹⁹ ^- ⁹⁷)의 NMR 적정 그래프를 나타낸 도면이다.
도 10은 DNA와 HigBA 단백질 복합체의 상호 작용을 확인하기 위하여 in silico 분자 도킹을 통해 HigBA 단백질 복합체와 DNA의 구조를 나타낸 도면이다.
도 11은 V. cholerae, E. coli, P. vulgaris의 HigB 단백질 및 M. opportunistum의 ParE, P. horikoshii RelE, E. coli의 YeoB 단백질과 S. pneumoniae HigB 단백질의 구조적 유사성을 분석하기 위해 각 단백질의 구조를 나타낸 도면이다.
도 12는 HigA 항독소 단백질 및 HigB 독소 단백질의 결합 계면에서 친수성 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 나타낸 도면이다.
도 13은 HigA 항독소 단백질 및 HigB 독소 단백질의 결합 계면에서 소수성 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 나타낸 도면이다.
도 14는 HigB 독소 단백질은 농도 의존적 RNA 분해 활성을 나타내는 것을 확인한 도면이다.
도 15는 HigB 단백질의 RNA 분해 활성에 있어서, 아르기닌73 잔기, 페닐알라닌90 잔기, 아르기닌68 잔기 및 라이신92 잔기가 필수적임을 확인한 도면이다.
도 16은 R68, R73 및 F90 아미노산 잔기가 HigB 독성을 나타내는 활성 부위의 아미노산 잔기임을 확인한 도면이다.
도 17은 3종류의 모방 펩타이드는 다시 접힌 후 2차 구조를 회복하여, α-나선의 특성을 가지고 있음을 확인한 도이다.
도 18은 HigBA 단백질 복합체에 HigB 또는 HigA 단백질 모방 펩타이드들의 첨가 시, RNA 분해가 모두 증가하여 HigBA 단백질 복합체 형성 억제 효과를 나타냄을 확인한 도면이다.
도 19는 HigBA 단백질 복합체에 HigB 모방 펩타이드 첨가 시, HigBA 단백질 복합체 형성을 억제하는 효과가 있음을 확인한 도면이다.
도 20은 HigA α1 모방 펩타이드, HigA α2 모방 펩타이드 또는 HigB α2 모방 펩타이드는 폐렴 구균의 성장 억제 활성을 가짐을 확인한 도면이다.
도 21은 HigA α1 모방 펩타이드, HigA α2 모방 펩타이드 또는 HigB α2 모방 펩타이드는 폐렴 구균 사멸 효과가 있음을 확인한 도면이다.
도 22는 HigB α2 모방 펩타이드는 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae TIGR4) 세포질 막을 통과하여 폐렴구균을 사멸시킬 수 있음을 확인한 도면이다.
도 23은 HigB α2 모방 펩타이드는 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae D39) 세포질 막을 통과하여 폐렴구균을 사멸시킬 수 있음을 확인한 도면이다.
도 24는 HigB α2 모방 펩타이드를 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae D39)에 처리하였을 때, HigBA를 포함하지 않는 경우, 야생형 HigBA를 포함하는 경우, 돌연변이(R68A, R73A, F90A 및 K92A)가 일어난 HigBA를 포함하는 경우에 생존한 세포 및 사멸한 세포의 비율을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 HigB 독소 단백질의 α2 영역이 항독소 단백질 HigA와 결합하는 것을 억제한다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α1 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제한다.

상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α2 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제한다.

상기 펩타이드는 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.

상기 펩타이드는 폐렴구균에 대한 항균 활성을 나타낸다.

상기 펩타이드는 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성될 수 있으며, 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성될 수 있고, 더욱 구체적으로는 고상 펩타이드 합성법으로 합성될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 하기와 같은 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied Biosystems 사의 제품)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다.

상기 DNA 서열은 이에 작동 가능하게 연결되어 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입한다. 그리고 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환한 다음, 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양한다. 그 다음, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 암호화된 실질적으로 순수한 펩타이드를 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 회수한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 등.

상기 펩타이드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 펩타이드는 본 발명의 펩타이드와 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.

상기 항균 펩타이드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항균 펩타이드를 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 0.001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.01 내지 10 mg/kg일 수 있으며, 하루에 1회 내지 수회 투여될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.

상기 의약외품은 폐렴구균의 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 HigB 독소 단백질의 α2 영역이 항독소 단백질 HigA와 결합하는 것을 억제하거나, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α1 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제하거나 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α2 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제할 수 있고, 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.

상기 외용제는 폐렴구균의 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 HigB 독소 단백질의 α2 영역이 항독소 단백질 HigA와 결합하는 것을 억제하거나, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α1 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제하거나 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α2 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제할 수 있고, 폐렴구균 독소의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 폐렴구균의 독소-항독소(HigBA) 단백질 복합체를 분리 및 정제한 후, X-선 회절(diffraction) 분석을 통해 구조를 결정하고, HigB 독소 단백질의 RNA 분해 활성 및 그에 따른 세포 독성에 필수적인 아미노산 잔기를 확인하였다(도 1 내지 7 참조).

또한, HigBA 단백질 복합체를 형성하는 HicB 및 HicA 단백질 간의 상호작용을 확인하고, 복합체 형성에 필수적인 HigB 단백질의 아미노산 잔기를 확인하였다(도 8 내지 도 13 참조).

아울러, HigA 단백질과 결합하는 HigB 단백질의 α2 영역을 모방하는 펩타이드, HigB 단백질과 결합하는 HigA 단백질의 α1 영역을 모방하는 펩타이드 및 HigB 단백질과 결합하는 HigA 단백질의 α2 영역을 모방하는 펩타이드를 제작하고, 상기 펩타이드들의 HigBA 단백질 복합체 형성 억제에 따라 분리된 HigB 독소 단백질 증가에 따른 RNA 분해 활성 증가 효과를 확인하였으며, 폐렴 구균 성장 억제 및 사멸 효과를 확인하였다(도 14, 도 18, 도 20 및 도 21 참조).

따라서, 상기 HigA 단백질과 결합하는 HigB 단백질의 α2 영역을 모방하는 펩타이드, HigB 단백질과 결합하는 HigA 단백질의 α1 영역을 모방하는 펩타이드 및 HigB 단백질과 결합하는 HigA 단백질의 α2 영역을 모방하는 펩타이드는 폐렴구균의 독소-항독소 복합체인 HigBA의 결합을 억제하여, 폐렴구균의 사멸을 유도하므로, 항균용 펩타이드, 항균용 조성물, 의약외품 또는 외용제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> HigBA 단백질 복합체 및 셀레노메티오닌 ( selenomethionine , SeMet) 표지된 HigBA 단백질 복합체의 분리 및 정제

<1-1> HigB 및 HigA 유전자의 클로닝 및 형질전환

먼저, 폐렴 구균(S. pneumoniae TIGR4)의 독소 단백질 HigB를 암호화하는 유전자 SP1143 및 항독소 단백질 HigA를 암호화하는 유전자 SP1143을 하기 표 1에 기재된 프라이머들을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭시켰다.

프라이머명 ^a	서열(5'→3') ^b	서열번호
HigB -F	GGAATTCCATATGATGCATAATATCTATTTTTA	7
HigB -R	CCGCTCGAGTTATTTTTCATTGTCTAAAC	8
HigA -F	GGAATTCCATATGATGAAAAATAATGCTATTGG	9
HigA -R	CCGCTCGAGTTAAACCTGCTCATGCTCTAATGGT	10

^aF는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 의미한다.

^b밑줄로 표시된 서열은 제한효소 부위를 의미한다.

상기 HigB 및 HigA 단백질을 암호화하는 유전자의 PCR 산물들을 제한효소인 Nde1 및 Xho1으로 이중 절단하고 동일한 효소로 절단한, 태그(tag)가 없는 pET28b 및 pET21a에 각각 연결하였고, 플라스미드를 제조하였다. 상기 제조된 각 플라스미드들을 대장균(Escherichia coli) Rosetta(DE3) pLysS 수용체 세포에 공-형질전환시켰다(co-transformed).

<1-2> HigBA 단백질 복합체의 발현 및 정제

상기 실시예 1-1에서 제작한 HigB 및 HigA 유전자를 포함하는 플라스미드들로 공-형질전환된 세포를 이용하여 HigBA 단백질 복합체를 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 상기 세포를 OD₆₀₀값이 0.8에 도달할 때까지 50㎍/㎖의 암피실린 및 30㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 LB(Lluria Bertani) 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다. 이후, 0.5 mM의 IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 단백질 과발현을 유도하고, 37℃에서 4시간 동안 더 배양하였다. 배양된 세포를 4℃에서 11,355×g로 원심분리하여 회수하였다. 수득된 세포를 5%(v/v) 글리세롤(glycerol)을 포함하는 버퍼 A(20 mM의 Tris-HCl(pH 7.9) 및 500 mM의 NaCl)에 현탁시키고 초음파를 이용하여 파쇄한 뒤, 파쇄된 세포는 다시 28,306×g에서 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 가용성 단백질을 포함하는 상기 상층액을 버퍼 A로 평형화된 Ni² ⁺ 친화 오픈 컬럼(Ni² ⁺ affinity open column, Bio-Rad)에 충진하고, 50 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 버퍼 A로 컬럼을 세척하였다. Ni²⁺ 컬럼에 결합한 단백질은 50 내지 700 mM의 이미다졸 농도구배를 이용하여 용출시켰고, 용출된 분획 내에 존재하는 HigBA 단백질 복합체를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하였다. 추가적인 정제를 위하여 HiTrap SP 컬럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 HigBA 단백질을 포함하는 버퍼를 50mm MES를 포함하는 버퍼 B(pH 6.0)로 교환하였고, 교환한 시료를 0 내지 1.5 m의 NaCl 농도 구배를 이용하여 용출시켰다. 그 후 마지막 정제 단계로, HiLoad 16/600 Superdex 200 prep-grade 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 HigBA 복합체를 포함하는 버퍼를 50mm MES 및 500mm NaCl을 포함하는 버퍼(pH 6.0)로 교환하였고, 교환한 시료를 아미콘 초원심분리 필터 유닛(Amicon Ultra centrifugal filter unit, Milipore)을 이용하여 10 mg/㎖의 농도로 농축하였다. 농축한 HigBA 단백질 복합체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다.

<1-3> SeMet 표지된 HigBA 단백질 복합체의 발현 및 정제

단백질 결정 구조 분석에서의 위상차 해결을 위해 SeMet 표지된 HigBA 단백질 복합체를 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 제작한 세포를 배양할 때 여분의 필수 아미노산을 포함하는 M9 배지에서 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 SeMet 표지된 HigBA 단백질 복합체를 수득하였다.

<1-4> HigB 단백질의 분리 및 정제

상기 실시예 1-1에서 제작한 HigB 단백질을 암호화하는 유전자가 연결된 pBAD33 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) 세포에 형질전환시킨 후, 상기 세포를 0.2%(w/v)의 L-아라비노오스(L-arabinose) 처리 후 하루 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 HigB 단백질을 분리 및 정제하였다.

<1-5> HigB 돌연변이 단백질의 분리 및 정제

하기 표 2에 기재된 프라이머들 및 부위-특이적 돌연변이 유도 키트(EZchangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit, Enzynomics)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 PCR을 수행함으로써 HigB 단백질 중 아미노산 1개가 점 돌연변이된(D61A, E66A, R68A, R73A, F90A, K92A, D40A, M20A, F17A, L44A) 단백질을 수득하였다. HigB 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭시킨 PCR 산물 대신 상기 PCR 산물을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 돌연변이 HigB 단백질을 발현하는 세포를 제작하였다. 이후, 상기 실시예 1-4에 기재된 것과 동일한 방법으로 돌연변이 HigB 단백질을 분리 및 정제하였다.

프라이머명 ^a	서열(5'→3') ^b	서열번호
F17A -F	GGCAATGAGCCTGTTGCTGATTATATGCGAGAG	11
F17A -R	CTCTCGCATATAATCAGCAACAGGCTCATTGCC	12
M20A -F	CCTGTTTTTGATTATGCGCGAGAGCTTACCAGT	13
M20A -R	ACTGGTAAGCTCTCGCGCATAATCAAAAACAGG	14
D40A -F	CTTAATAAAATTAATGCTTATATTGAGTTGTTA	15
D40A -R	TAACAACTCAATATAAGCATTAATTTTATTAAG	16
L44A -F	AATGATTATATTGAGGCGTTAAGCCAACATGGA	17
L44A -R	TCCATGTTGGCTTAACGCCTCAATATAATCATT	18
D61A -F	TATATTAAGCATTTAGCTGCTGAAATTTGGGAG	19
D61A -R	CTCCCAAATTTCAGCAGCTAAATGCTTAATATA	20
E66A -F	GATGCTGAAATTTGGGCGCTGAGACCACTTAGA	21
E66A -R	TCTAAGTGGTCTCAGCGCCCAAATTTCAGCATC	22
R68A -F	GAAATTTGGGAGCTGGCACCACTTAGAGATAGA	23
R68A -R	TCTATCTCTAAGTGGTGCCAGCTCCCAAATTTC	24
R73A -F	AGACCACTTAGAGATGCAATTTTATTTGTTGCT	25
R73A -R	AGCAACAAATAAAATTGCATCTCTAAGTGGTCT	26
F90A -F	GTTTTACTGCATCATGCTATGAAAAGGACACAG	27
F90A -R	CTGTGTCCTTTTCATAGCATGATGCAGTAAAAC	28
K92A -F	CTGCATCATTTTATGGCAAGGACACAGAAAACA	29
K92A -R	TGTTTTCTGTGTCCTTGCCATAAAATGATGCAG	30

<1-6> HigA 단백질의 분리 및 정제

상기 실시예 1-1에서 제작한 HigA 단백질을 암호화하는 유전자가 연결된 pET-21a(+) 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) 세포에 형질전환시킨 후, 상기 세포를 0.5mm의 IPTG 처리 후 하루 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 HigA 단백질을 분리 및 정제하였다.

< 실시예 2> HigBA 단백질 복합체의 구조 분석

<2-1> 단백질의 결정화(crystallization)

상기 실시예 1에서 분리 및 정제한 HigBA 단백질 복합체 및 SeMet 표지된 HigBA 단백질 복합체의 결정 구조를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 50 mm MES (pH 6.0) 및 500 mm NaCl 용액에 11 mg/㎖ 농도로 포함된 각 단백질 복합체 용액 0.5㎕를 pH 6.2의 20%(w/v) PEG 1000, 0.1m의 potassium phosphate monobasic/sodium phosphate dibasic 및 0.2m의 NaCl을 포함하는 저장 용액(reservoir solution) 1㎕와 혼합하고, 크리스탈 스크리닝(Crystal Screening) 1, 2 및 인덱스(Index) 키트들(Hampton Research)을 이용하여 초기 결정 스크리닝을 수행하였다. 각 결정은 4℃에서 싯팅 드롭 증발법(sitting-drop vapor diffusion method)을 이용하여 성장시켰으며, 결정화 용액으로 0.1 M Tris(pH 8.5) 및 2.0 M 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)로 구성된 용액을 사용하였다. HigBA 단백질 복합체의 동결보호(cryoprotection)를 위하여 20% 글리세롤을 용액에 첨가하였다. 상기 결정은 데이터 모음 전에 액체 질소에서 즉시 동결하였다.

<2-2> X-선 회절 분석 데이터 모음

상기 실시예 2-1에서 수득한 결정을 이용하여 X-선 회절 분석(X-ray diffraction analysis)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 결정의 X-선 회절 분석 데이터는 포항 가속기 센터(대한민국)의 5C 및 7A 빔라인(beamline)에서 ADSC Quantum Q270r CCD 검출기를 이용하여 수집하였고, HKL2000 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각 결정의 데이터 모음을 하기 표 3에 나타냈다.

	SeMet 표지된 HigBA 결정	원형 HigBA 결정
X-ray source	5C beamline^a	7A beamline^a
X-ray wavelength^b (Å)	0.9794	0.9794
Space group^c	P2₁	P2₁
Unit cell parameters ^d
a, b, c (Å)	74.575, 67.038, 87.717	74.903, 73.403, 98.321
α, β, γ (°)	9.0., 94.223 90.0	90.0, 90.077, 90.0
Resolution range^e (Å)	50.0-2.80	50.0-2.30
Molecules per ASU^f	2 HigBA heterotetramers	2 HigBA heterotetramers
Observed reflections^g (>1σ)	235871	163245
Unique reflections^h	21414	45671
<I /σ(I)>ⁱ	24.8 (1.13)ⁿ	23.7 (1.61)ⁿ
Completeness^j (%)	99.9 (99.6)ⁿ	97.0 (100.0)ⁿ
Multiplicity^k	11.0 (9.0)ⁿ	3.6 (3.8)ⁿ
R_merge (%)^l	13.2 (139.8)ⁿ	10.3 (70.9)ⁿ
CC_1/2, CC^m	(0.651, 0.888)^e	(0.823, 0.950)ⁿ

^a포항 가속기 센터(대한민국)의 빔라인

^b사용된 X-선의 파장 길이

^c공간군: 결정의 단위 세포(unit cell)의 대칭성을 의미하며, 대칭요소들을 조합하면 군(group)을 형성하는데 총 230개의 공간군이 존재한다.

^d단위 세포 치수: 공간 격자(space lattice)를 구성하는 가장 해석이 용이한 최소 반복 단위인 단위 세포를 규정하는 값으로, 3개의 결정학상 축(crystallographic axes)으로 정의되며, 3방향 벡터(vector)들의 길이(a, b 및 c)와 이들이 서로 이루는 각(α, β 및 γ)을 의미한다.

^e수집된 데이터를 통해 얻을 수 있는 모델의 해상도의 한계

^f한 분자에 포함되는 비대칭 단위(asymmetric unit, ASU)

^gX-선 회절 분석 데이터의 총 반사 횟수

^hX-선 회절 분석 데이터 중 수집한 범위 내에 존재하는 반사 횟수

ⁱ각 쉘(shell)에서 얻은 반사 데이터의 강도(intensity, I)를 오류값으로 나눈 값으로, 높을수록 신뢰성 높은 결과임을 의미한다.

^j완성도: 특정 해상도에 존재하는 반사(reflection)의 총 수를 백분율로 나타낸 값으로, 높을수록 고해상도임을 의미한다.

^k다중도: 고유한 반사의 총 수(number of unique reflections)에 대한 실제 측정된 반사의 총 수(number of measured reflections)인 반복도(redundancy)와 동일한 의미이며, 대칭도가 높은 결정의 경우 고유한 반사의 총 수가 낮아 대칭도가 낮은 결정에 비하여 높은 다중도(반복도)를 나타낸다.

^lR_merge = Σ(I - <I>) / Σ<I>

R_merge: 대칭(symmetry)으로 연관된 측정 데이터 간의 일치하는 정도로, 낮을수록 신뢰성 높은 결과임을 의미하는 R_sym과 동일한 의미를 나타낸다.

^mCC(correlation coefficient): X-선 데이터 중 구조 결정에 사용된 데이터들의 정확도를 나타내는 척도로, 높을수록 정확도가 높음을 의미한다.

CC_1/2: CC의 정확도를 증명하기 위한 척도로, 무작위로 선정된 절반의 데이터세트(dataset)를 이용하여 산출된다.

ⁿ괄호 안의 값은 가장 높은 해상도 쉘의 값이다.

<2-3> 단백질 구조 결정(determination) 및 구조 개선(refinement)

HigBA 단백질 복합체의 구조는 SeMet 표지된 결정을 이용한 단일 파장 변칙 분산(single-wavelength anomalous dispersion)에 의하여 2.80Å의 해상도로 분석하였고, HigBA 단백질 복합체의 최종 구조는 원형(native) HigBA 복합체의 2.30Å의 해상도 분산 회절 데이터로 SeMet 단백질 모델에 기반한 분자 치환법(molecular replacement)으로 결정되었다.

먼저, 피닉스(PHENIX)를 이용하여 모델을 형성하고, 쿠트(COOT) 프로그램을 이용하여 구조 개선의 초기 모델을 형성하였다. 전반적인 기하 구조는 몰프로비티(MolProbity)로 검증하였고, 개선된 구조는 파이몰(PyMOL)을 이용하여 시각화하였으며, 각 결정의 구조 개선 통계 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

	SeMet 표지된 HigBA 결정	원형 HigBA 결정
R_work ^a (%)	22.0	21.6
R_free ^b (%)	33.3	25.4
No. of atoms / average B factor^c (Å²)
Protein	6717/100.0	6810 / 60.0
RMSD^d from ideal geometry
Bond distance (Å)	0.028	0.006
Bond angle (°)	3.126	1.135
Ramachandran statistics^e
Most favoured regions (%)	87.30	95.60
Additional allowed regions (%)	10.21	4.40
Residues in Disallowed regions (%)	2.49	0.00
PDB accession code	6AF3	6AF4

^a실제 X-선 회절 데이터와 모델 사이의 일치하는 정도. 낮을수록 일치도가 높다. (R = Σ_hkl||F_obs| - k|F_calc|| / Σ_hkl|F_obs|)^b무작위로 선택된 데이터와 모델 사이의 일치하는 정도. 수득된 데이터 중 무작위로 선택된 5%의 데이터를 R_work와 동일한 식으로 계산하여 얻었다.

^c모델에 제시된 원자의 위치로부터 원자가 진동하여 움직이는 범위를 의미한다.

^d평균 제곱근 편차(Root mean square deviation): 결정된 모델의 구조가 통상적인 분자들이 지닌 결합 길이 및 각도와 부합하는 정도를 나타내며, 레프맥(REFMAC)을 사용하여 얻었다.

^e라마찬드란 분석: 폴리펩타이드의 주 사슬(main chain)의 공간 상 각도를 나타내는 분석으로, 입체 장애(steric repulsion)를 반영하여 사슬이 어느 각도로 존재하는 것이 모순이 없는지를 보여주며, 이에 따라 모델을 평가하는 지표로 활용된다.

<2-4> HigBA 단백질 복합체의 구조적 특성 확인

상기 실시예 2-2 및 2-3에서 얻은 데이터를 기반으로 하여, HigBA 단백질 복합체의 구조적 특성을 확인하고, 2Struc 서버를 이용하여 2차 구조 분석을 수행했으며, 다양한 단백질과의 분자량 비교(molecular weight comparison)를 통한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 HigBA 단백질 올리고머의 구조를 결정하였다.

X-선 회절 분석 데이터를 기반으로 분석한 결과, HigBA 단백질 복합체 결정 구조는 2개의 HigBA 단백질 복합체 헤테로-다이머(heterodimer)를 포함하며, 2개의 HigB 독소 단백질과 2개의 HigA 항독소 단백질이 비대칭적인 헤테로-테트라머(hetero-tetramer) 구조를 형성함을 확인하였다(도 1).

또한, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 다양한 참조 단백질의 분자량과 비교하여 HigBA 단백질 복합체 및 HigA 항독소 단백질의 분자량을 계산한 결과, HigBA 헤테로 테트라머 단백질 복합체의 분자량은 43kDa 및 75kDa 사이인 54.9kDa이고, HigA 호모다이머 항독소 단백질은 13.7kDa 및 29kDa 사이인 17.4kDa 임을 확인하였다(도 2).

또한, 2Struc 서버를 이용하여 2차 구조 분석을 수행한 결과, HigB 독소 단백질은 3개의 α-나선(α-helices), 1개의 3₁₀-나선(η) 및 5개의 β-가닥(β-strands)을 β1(4-7 잔기), α1(15-25 잔기), α2(29-48 잔기), η1(49-52 잔기), β2(57-61 잔기), β3(64-67 잔기), β4 (72-78 잔기), β5(84-91 잔기) 및 α3(99-115 잔기)의 순서로 포함한다. 또한, HigA 항독소 단백질은 5개의 α-나선 및 2개의 β-가닥을 β1(6-9 잔기), α1 (10-17 잔기), α2(20-42 잔기), α3(47-54 잔기), α4(58-66 잔기), α5(73-83 잔기) 및 β2(85-91 잔기)과 같은 순서로 포함한다.

<2-5> HigB 및 HigA 단백질의 구조적 특성 확인

상기 실시예 2-2 내지 2-4에서 얻은 데이터를 기반으로 하여, HigB 및 HigA 단백질의 구조적 특성을 확인하였다.

그 결과, HigB 독소 단백질의 β-가닥(β1-β5)은 역평행 베타 병풍 구조(antiparallel β-sheets)를 형성하고, HigB 및 HigA의 α1 및 α2 나선의 상호작용으로 인한 헤테로 다이머를 형성하며, HigA 항독소 단백질의 α3 및 α4 나선은 나선-회전-나선(helix-turn-helix, HTH) DNA-결합 모티프를 구성한다. 또한, HigB 및 HigA의 β1 가닥의 N-말단은 분자간(intermolecular) β-병풍 구조를 형성한다. 근접한 HigA 단백질들의 β-가닥의 C-말단은 다이머를 형성하기 위해 결합하기 때문에, 두 분자 간에 형성되는 β-병풍 구조는 HigA의 N 및 C 말단 모두를 형성함을 확인하였다(도 1).

< 실시예 3> HigBA 단백질 복합체 구조의 비교 분석

3가지 균주의 HigBA 복합체 단백질 구조(Proteus vulgaris: PDB code 4MCT, Escherichia coli: PDB 코드 5IFG 및 Vibrio cholera: PDB 코드 5JAA)와 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae )의 HigBA 단백질 복합체 구조(PDB 코드 6AF4)를 비교 분석하고, 아미노산 잔기를 정렬하여 각 균주의 HigB 및 HigA 단백질 간의 서열 유사도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 4가지 균주의 HigBA 단백질 복합체는 역평행 β 병풍 구조를 주된 기능 단위(functional unit)로 갖고, HigA는 나선-회전-나선(HTH) DNA-결합 모티프를 포함하는 특징을 공유하고 있음을 확인하였다. 각 HigBA 복합체는 헤테로 테트라머 구조를 형성하고, 이량체화는 HigB-(HigA2)-HigB를 통해서만 형성되었다. 그러나 각 균주 간의 HigBA 복합체 구조는 HigB 및 HigA 사이의 계면(interface)에서 HigA 이량체의 형태 및 HigA DNA-결합 모티프의 위치에서 유의한 차이를 보였다.

구체적으로, E. coli 및 폐렴 구균의 HigA는 동종의 HigB를 두 개의 나선으로 감싸는 구조를 가지고, V. cholera의 HigA는 하나의 α-나선과 하나의 β-가닥으로 동종의 HigB를 감싸는 구조를 가진다. 그러나 P. vulgaris의 HigA의 두 개의 나선은 동종 HigB의 두 나선과 경계 접합을 형성한다. HigA의 이량체화 도메인도 각 균주가 상이함을 확인하였다(표 5).

P. vulgaris와 E. coli에서는 하나의 나선이 이량체화에 관여하고 V. cholerae에서는 두 개의 나선이 압축되어 이량체화 도메인을 형성한다. 반면에, S. pneumoniae에서는 두 서브 유닛의 C 말단 사이에 역평행 β 병풍 구조가 형성된다. P. vulgaris HigA의 나선-회전-나선(HTH) 모티프는 N-말단에 위치하며 E. coli HigBA의 모티프는 C-말단에 위치한다. V. cholerae 및 S. pneumoniae의 HigA에서 HTH 모티프는 단백질 중간에 위치한다.

S. pneumoniae과 3가지 균주(P. vulgaris, E. coli 및 V. cholera)의 HigB 및 HigA 단백질 아미노산 서열의 상동성을 측정한 결과, 하기 표 6 및 표 7에 나타난 바와 같이 S. pneumoniae의 HigB 단백질은 다른 세 종류의 균주와 4 내지 14%의 아미노산 서열 상동성을 나타냈으며, HigA 단백질은 5 내지 12%의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 것을 확인하였다.

HigBA	HigBA 결합 계면	HigA 이량체화	HTH 도메인의 위치
*Proteus* *vulgaris*	나선에 의한 경계 접합	1개의 나선	α1-α2의 N-말단
*Escherichia* *coli*	2개의 나선이 감싸는 구조	1개의 나선	C-말단
*Vibrio* *cholera*	1개의 나선 및 1개의 가닥이 감싸는 구조	2개의 나선	α3-α4의 C-말단
*Streptococcus pneumoniae*	2개의 나선이 감싸는 구조	역평행 베타 병풍	α3-α4의 C-말단

단백질 이름	S. *pneumoniae* HigB 와 서열 상동성 ( % )
P. *vulgaris* *HigB*	14
E. *coli* *HigB*	4
*V. cholera* *HigB*	10

단백질 이름	S. *pneumoniae* HigA 와 서열 상동성 ( % )
P. *vulgaris* *HigA*	12
E. *coli* *HigA*	5
*V. cholera* *HigA*	-

< 실시예 4> HigBA 단백질 복합체의 DNA-결합 특성 분석

<4-1> HigBA 단백질 복합체의 회문 구조 DNA와의 결합 친화도 측정

HigA 및 HigBA의 오퍼레이터 영역이 HigBA 프로모터 내의 회문 구조를 가지는 서열(x a xx t (...) a xx aa 로 표시되는 서열)에 대한 결합 친화도를 전기영동 이동성 변화 분석(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)을 수행하여 DNA-결합 특성을 하기와 같이 분석하였다.

구체적으로, HigBA 프로모터 영역 내에서 회문 구조를 가지는 4개의 DNA 이중체를 선택하고 Pal-I, Pal-II, Pal-III 및 Pal-IV로 명명하였다(도 4). 대조군 실험은 DNA 'X'와 다른 두 개의 회문 서열 'A'와 'B'로 수행하였다. 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 8과 같다. 0.01mm의 DNA 이중체(Bioneer사)와 다양한 단백질 농도(HigA 이량체 및 HigBA 헤테로 테트라머가 0 내지 0.6mm의 농도)를 포함하는 반응 혼합물(10㎕)을 결합 버퍼(50mm MES, 500mm NaCl, pH 6.0)와 함께 0℃에서 30분 동안 배양하였다. 반응 혼합물을 0.5× TBE와 함께 0.5% 아가로오스 겔 상에서 20분 동안 전기영동 시키고 Printgraph 2M을 사용하여 시각화하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 첨가된 단백질의 양이 증가함에 따라 DNA-단백질 복합체의 밴드가 위쪽으로 이동하여 HigBA가 4개의 모든 DNA(Pal-I, Pal-II, Pal-III 및 Pal-IV)에 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 가장 HigBA는 4개의 DNA 중 Pal-III에 대해 가장 높은 결합 친화성을 보임을 확인하였다.

또한, HigBA의 업스트림 프로모터에 대한 결합 특이성을 모니터링하기 위해 HigBA 프로모터 영역에 속하지 않는 'A' 및 'B' 회문 구조 서열 및 대조군인 'X' t서열에 대해서도 EMSA 분석을 수행한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 밴드 이동이 일어나지 않음을 확인하였다. 상기 결과는 단백질과 DNA 사이에 복합체가 형성되지 않음을 의미한다.

프라이머명 ^a	서열(5'→3')	서열번호
Pal-I-F ^a	AGCATCTAGGAAACTAGGTGCT	31
Pal-I- R ^b	AGCACCTAGTTTCCTAGATGCT	32
Pal-II-F ^a	AACTTAAAAGTATTTACAAACAATAACTTTTAGGTT	33
Pal-II- R ^b	AACCTAAAAGTTATTGTTTGTAAATACTTTTAAGTT	34
Pal-III-F ^a	TATTTTAATAACTTAAAAGT	35
Pal-III- R ^b	ATAAAATTATTGAATTTTCA	36
Pal-IV-F ^a	TAGGTTATAATTGTTATTAGGAA	37
Pal-IV- R ^b	TTCCTAATAACAATTATAACCTA	38
'X'-F ^a	GATTTTTTTTGATTTTTTT	39
'X'- R ^b	AAAAAAATCAAAAAAAATC	40
'A'-F ^a	TATTTTAATAACTTAAAAGT	41
'A'- R ^b	ACTTTTAAGTTATTAAAATA	42
'B'-F ^a	TAATAGAATAATAAGTATCACTCCTTTA	43
'B'- R ^b	TAAAGGAGTGATACTTATTATTCTATTA	44

<4-2> HigBA 단백질 복합체의 결합 친화도 측정

HigBA 단백질 복합체의 결합 친화도를 측정하기 위하여 등온 적정 열량 측정법(isothermal titration calorimetry, ITC)을 수행하였다.

구체적으로, 25℃에서 iTC200 열량계(Malvern Instrument)에 단백질 및 상기 실시예 4-1에서 사용한 프로모터 dsDNA(Pal-I, PalII, PalIII 및 PalIV)를 HigA 및 HigBA 50mm MES, pH 6.0 및 100mm NaCl로 구성된 버퍼에 넣었다. 세포 내 단백질 용액(320㎕의 10㎛ 농도 HigA 다이머 및 HigBA 헤테로 테트라머)과 주입된 적정액으로 dsDNA 용액(600㎛)을 사용하였다. 데이터 수집을 위해 180초 간격으로 총 19회 주입하고, MicroCal Origin 소프트웨어를 사용하여 결합 친화도(K_d), 결합 엔탈피(ΔH), 결합 엔트로피(TΔS) 및 화학 양론(η)을 계산하고, 깁스에너지(ΔG)는 표준 방정식 ΔG=ΔH-TΔS로 계산하였다.

그 결과, 하기 표 9 및 도 7에 나타난 바와 같이, HigBA의 DNA 결합 반응은 흡열 반응 및 엔트로피 증가 반응이며, 결합 화학 양론(η)은 하나의 HigBA 헤테로 테트라머가 각 DNA 이중체에 결합함을 나타낸다. 단백질이 없는 버퍼를 사용한 대조군 및 DNA 'X', 회문 서열 'A' 및 'B'에서는 HigBA와 DNA가 결합하지 않기 때문에 열적 변화가 관찰되지 않음을 확인하였다.

DNA	결합 화학 양론 (η)	결합 친화도(K _d )	결합 엔탈피 ( ΔH )	결합 엔트로피 ( TΔS )	자유에너지 ( ΔG )
Pal-I	0.53±0.07	0.46±0.03	2.8±0.4	8.74	-5.94
Pal-II	0.49±0.06	0.70±0.08	3.6±0.3	7.37	-3.77
Pal-III	0.48±0.04	0.20±0.01	1.7±0.2	8.14	-6.44
Pal-IV	0.48±0.05	1.19±0.14	4.3±0.3	9.73	-5.43

<4-3> HigA의 DNA 결합 위치 결정

HigA 단백질의 DNA-결합 위치를 결정하기 위해 HigA와 가장 높은 친화도를 가지는 것으로 확인된 Pal-III DNA를 사용하여 NMR 분석 및 NMR 적정(NMR titration)을 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로, NMR 분석을 위해 HigBA 및 HigA¹⁹ ^-97은 ¹³C 및 ¹⁵N으로 균일하게 라벨링되고 20mm MES, pH 6.0, 50mm NaCl, 1mm EDTA, 0.1mm PMSF 및 10% D₂O에서 준비되었다. 모든 NMR 측정은 극저온 프로브(Bruker BioSpin)가 장착된 AVANCE 800MHz 분광기를 사용하여 35℃에서 수행되었다. 백본 핵에 대한 ¹H, ¹³C 및 ¹⁵N의 화학적 이동 할당은 2D ¹H-¹⁵N HSQC 및 일련의 삼중 공명 실험을 사용하여 HNCO, HN(CA)CO, HNCA, HN (CO)CA, HNCACB 및 HN(CO)CACB 스펙트럼을 얻었다. 데이터는 NMRPipe 및 nmrDraw 를 사용하여 처리되었으며 NMRviewJ를 사용하여 추가 분석하였다.

NMR 분석을 통한 전장 HigA 단백질의 스펙트럼의 해상도가 좋지 않아, NMR 적정은 19-97번째 아미노산으로 구성된 HigA 단백질(HigA^19-97)로 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4-1 및 4-2에서 HigBA 단백질 복합체와 결합 친화도가 가장 높은 것으로 확인된 Pal-III을 사용하여 HigA 단백질을 ¹⁵N으로 표지하고 ¹H-¹⁵N heteronuclear single quantum coherence spectroscopy(HSQC)로 NMR 적정 실험을 수행하였다. HigA 이량체의 농도는 0.5mm로 유지하고, Pal-III는 0에서 0.1mm의 농도 구배로 설정하였다. 화학적 이동 섭동(chemical shift perturbation, CSP)을 하기 수학식 1을 사용하여 계산 및 분석하였으며, ΔδN 및 ΔδH는 각각 아미드 질소와 양성자의 화학적 이동 섭동(CSP) 값을 나타낸다. 강도 비율은 마지막 스펙트럼의 피크 강도를 첫 번째 스펙트럼의 피크 강도로 나누어 계산하였다.

<수학식 1>

Δδ_avg=[(0.2×△δ² _N+△δ² _H/2]^1/2

그 결과, 0 내지 0.1mm 농도 구배의 Pal-III와 0.5mm 농도의 HigA¹⁹ ^-9가 혼합된 HSQC 스펙트럼을 겹쳐서 나타내었다(도 8). 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, HigA의 ¹H-¹⁵N HSQC 피크는 감소된 강도와 함께 유의한 화학적 이동 변화를 나타내지 않았다. HigA의 ¹H-¹⁵N HSQC 교차 피크의 강도 감소 및 소멸은 Pal-III DNA와의 복합체 형성에 의한 HigA¹⁹ ^-27의 증가된 가로 이완률(transverse relaxation rate) 때문인 것으로 추측된다. 또한, S34, T69, Q72 및 A88은 다른 아미노산 잔기와 비교하여 상대적으로 뚜렷한 화학적 이동 변화와 큰 강도 감소를 나타냈다. α3, α4 및 α5 나선 및 이들의 연결 루프에서 ¹H-¹⁵N HSQC 교차 피크 강도 감소가 가장 크게 나타났다. α3 및 α4 나선은 DNA 결합과 밀접한 관련이 있는 나선-회전-나선(HTH) 모티프를 형성하고, α5와 연결 루프는 HTH 모티프에 가까움을 확인하였다.

<4-4> DNA와 HigBA 단백질 복합체의 결합 패턴 확인

상기 실시예 4-3의 결과에 기반하여, DNA와 HigBA 단백질 복합체의 결합 패턴을 하기와 같이 확인하였다.

구체적으로, DNA와 HigBA 단백질 복합체의 상호 작용을 확인하기 위한 in silico 분자 도킹은 높은 모호성-기반 단백질-단백질 DOCKing 알고리즘(HADDOCK)을 사용하여 수행하였다. 20-염기쌍 프로모터 DNA는 3D-DART 서버를 사용하여 모델링하였고, S57, T69 및 Q72 아미노산 잔기는 NMR 적정 결과에 따라 '활성 잔기'로 정의하였고, Pal-III-F의 A2, C12, T13 및 T14 아미노산 잔기, Pal-III-R의 T7, T8, A9 및 C19 아미노산 잔기, HigA의 Q47, R63 및 T75 아미노산 잔기는 단백질과 DNA간의 나선-회전-나선(HTH) 인식을 위한 계면을 생성하기 위해 추가로 지정되었다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 나선-회전-나선(HTH) 모티프를 구성하는 HigA의 α3 및 α4 나선은 DNA의 주요 홈(groove)에 결합하고, 정전기적으로 생성된 계면에서 α3 나선은 음전하를 나타내고 α4 나선은 양전하를 나타내는 것을 확인하였다.

< 실시예 5> 상동체로부터 HigB의 활성 부위 추론

HigB 단백질의 활성 부위 잔기를 다른 균주의 HigB 단백질 및 유사한 패밀리 균주의 단백질와 구조를 비교하여 추론하였다.

구체적으로, V. cholerae, E. coli, P. vulgaris의 HigB 단백질 및 M.opportunistum의 ParE, P. horikoshii RelE, E. coli의 YeoB 단백질과 S. pneumoniae HigB 단백질의 구조적 유사성을 Dali 서버를 이용하여 분석하고, 활성 부위 잔기를 정렬하였다.

그 결과, 도 11 및 표 10에 나타난 바와 같이, 구조적 정렬에 따라 RNA 분해 활성을 가지는 S. pneumoniae HigB의 활성 잔기는 D61, E66, R68, R73, F90 및 K92일 수 있다. 다른 균주의 HigB와 비교하여 S. pneumoniae HigB의 활성 부위 잔기는 β5와 α3 사이에 존재하는 유연한 루프에 의해 입체적으로 방해되는 것을 확인하였다.

또한, 하기 표 11에 나타난 바와 같이, 유사한 계열의 RNA 분해 활성을 가지는 균주의 단백질의 전체 구조를 비교한 결과, 낮은 서열 동일성에도 불구하고 상당한 구조적 유사성을 보이는 것을 확인하였다.

단백질 이름	출처	PDB 코드	Z-값	RMSD (Å)	정렬된 Cα 의 개수	서열 상동성 (%)
HigB	V. cholerae	5JAA	6.8	3.6	87	10
HigB	E. coli	5IFG	6.9	2.9	83	4
HigB	P. vulgaris	4MCT	6.4	2.7	77	14

단백질 이름	출처	PDB 코드	Z-값	RMSD (Å)	정렬된 Cα의 개수	서열 상동성 (%)
ParE	M. opportunistum	5CEG	9.8	2.4	86	3
RelE	P. horikoshii	1WMI	9.8	1.8	80	11
YoeB	E. coli	2A6R	9.8	2.0	79	16

< 실시예 6> HigBA 단백질 복합체의 분자 간 상호작용 확인

HigBA 단백질 복합체에서 HigB 독소 단백질과 HigA 항독소 단백질 간의 분자간 상호작용을 확인하였다. HigB 및 HigA α1 및 α2 나선은 친수성 및 소수성 상호작용을 통하여 결합 계면(interface)을 형성하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 계면에서 친수성 상호 작용에 관여하는 HigB의 잔기는 R21, R32, N39, D40, E43 및 H48이며, 이들은 HigA의 W10, R14, E16, E22, S26, R29 및 S34와 상호 작용한다. 또한, HigB의 D40은 HigA의 S26 및 R29와 가장 가까운 상호 작용을 하는 것을 확인하였다.

또한, 도 13에 나타난 바와 같이, 계면에서 소수성 상호 작용에 관여하는 HigB의 잔기는 F17, M20, L35, Y41, I42 및 L44이며, 이들은 HigA의 W10, V13, L17, F18, V30 및 M33와 상호작용한다. 또한, HigB의 F17, M20 및 L44는 여러 잔기와 소수성 상호 작용을 하는 것을 확인하였다.

< 실시예 7> HigB 및 돌연변이의 RNA 분해 활성 확인

<7-1> 폐렴구균 HigB 독소 단백질 및 HigBA 복합체 단백질의 RNA 분해 활성 확인

폐렴구균 HigB 독소 단백질 및 HigBA 복합체 단백질의 RNA 분해 활성을 확인하였다.

구체적으로, 각 단백질의 RNA 분해 활성은 키트(RNase Alert Kit, IDT)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 기질로 사용한 합성 RNA는 양 말단에 각각 형광단(fluorophore)과 소광자(quencher)가 붙어있어, RNA가 분해되면 형광단 및 소광제가 분리되어 490nm에서 여기(excitation) 후 520nm에서 형광이 방출된다. 상기 실시예 1-4에서 정제한 HigB 단백질 및 상기 실시예 1-2에서 정제한 HigBA 복합체 단백질 1μM 또는 2μM와 RNase A 3×10^-5 단위를 Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl로 구성된 용액에 오염을 방지하기 위해 RNase 억제제(40 units, RiboLock^TM, Thermo Scientific)를 첨가하여 준비한 후, 상기 합성 RNA와 각각 혼합하고, 방출되는 형광을 분광형광계(SPECTRAmax GEMINI XS spectrofluorometer)로 시간에 따라 측정하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, HigB 독소 단백질은 농도 의존적 RNA 분해 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 반해, HigBA 복합체 단백질 및 단백질이 포함되지 않고 RNA 기질만을 포함한 대조군은 RNA 분해 활성을 나타내지 않았다. 상기 결과는 HigB 독소 단백질이 HigBA 단백질 복합체를 형성하지 않을 경우 RNA 분해 활성을 나타냄을 제시한다.

<7-2> 폐렴구균 HigB 독소 단백질 돌연변이의 RNA 분해 활성 확인

활성 부위 아미노산 잔기 및 HigA 항독소 단백질과 상호작용하는 주된 잔기의 돌연변이에 따른 효과를 확인하기 위하여, 점 돌연변이가 일어난 폐렴구균 HigB 독소 단백질에서 RNA 분해 활성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-5에서 제작한 활성 부위 아미노산 잔기의 돌연변이인 D61A, E66A, R68A, R73A, F90A, K92A와 HigA 항독소 단백질과 상호작용하는 주된 잔기의 돌연변이인 D40A, M20A, F17A, L44A의 각각 10개의 점 돌연변이가 일어난 HigB 독소 단백질을 하기 표 10에 기재된 프라이머를 이용하여 증폭하고, 에서 RNA 분해 활성을 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 73번째 아미노산인 아르기닌(Ariginine)이 알라닌으로 치환된 돌연변이(R73A)에서 RNA 분해 활성이 야생형 HigB 단백질에 비해 약 70% 감소한 것을 확인하였다. 또한, 90번째 아미노산인 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 돌연변이(F90A) 및 68번째 아미노산인 아르기닌이 알라닌으로 치환된 돌연변이(R68A)에서도 RNA 분해 활성의 유의한 감소를 확인하였고, 92번째 아미노산인 라이신이 알라닌으로 치환된 돌연변이(K92A)에서도 상대적으로 감소한 RNA 분해 활성을 확인하였다. 상기 결과는 HigB 단백질의 RNA 분해 활성에 있어서, 아르기닌73 잔기, 페닐알라닌90 잔기, 아르기닌68 잔기 및 라이신92 잔기가 필수적임을 제시한다.

<7-3> HigB 단백질의 RNA 분해 활성에 영향을 미치는 잔기 확인

in vivo 독성 중화 실험을 통하여 4가지의 돌연변이(R73A, F90A, R68A 및 K92A)에서 HigB 단백질의 RNA 분해 활성에 영향을 미치는 것임을 하기와 같이 검증하였다.

구체적으로, HigB 돌연변이(R68A, R73A, F90A 및 K92A)를 코딩하는 유전자를 상기 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭하고, pBAD33 플라스미드 벡터에 클로닝하고, HigA 단백질은 상기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭하고, pET-21a(+) 플라스미드 벡터에 클로닝하였다. 각 플라스미드 쌍을 BL21(DE3) 세포에 공-형질전환시켰다(co-transformed). 37℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 배양물을 25㎍/㎖의 클로람페니콜 및 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 20㎖의 M9 배지에서 100배 희석하였다. 그 후 박테리아를 유도제인 L-아라비노스(0.2% w/v) 또는 0.5 mm IPTG로 보충된 LB 배지 플레이트에 도말하고, 세포 성장을 측정하기 전에 배양 접시를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, R68, R73 및 F90의 HigA 및 HigB 돌연변이에 의해 HigB의 독성이 나타나지 않았다. K92A 돌연변이는 야생형 HigB 단백질에 비해 약간 약한 독성을 보였는데, 이는 HigB의 독성이 다른 잔기(R68, R73 및 F90)의 돌연변이에 비해 K92의 돌연변이에 의해 강하게 영향을 받지 않았음을 보여주는 결과이다. 상기 결과는 HigB 독소 단백질이 세포 독성을 가지고 있으며, R68, R73 및 F90 아미노산 잔기가 HigB 독성을 나타내는 활성 부위의 아미노산 잔기임을 제시한다.

< 실시예 8> HigB 독소 단백질 및 HigA 항독소 단백질의 모방 펩타이드 제작

<8-1> HigB 독소 단백질 및 HigA 항독소 단백질의 모방 펩타이드 제작

HigB 단백질의 α1 나선을 모방한 펩타이드(서열번호 1), HigA 단백질의 α1 나선을 모방한 펩타이드(서열번호 2) 및 HigB 단백질의 α2 나선을 모방한 펩타이드(서열번호 3)의 HigB와 HigA 사이의 결합 계면 영역을 모방한 세 가지 펩타이드를 디자인하고, 애니젠(ANYGEN, http://www.anygen.com)에 의뢰하여 제작하였다(표 12). 펩타이드 제작 시, 단백질 가수분해를 방지하기 위하여 헬릭스 구조를 모방하는 것이 유리하고, 선택성 감소 및 자가 응집(self-aggregation)을 방지하기 위한 최적 길이의 펩타이드를 제작하는 것이 중요하므로, 이를 고려하여 펩타이드를 제작하였다.

펩타이드명	서열	펩타이드 길이(aa)	서열번호
HigB α2-모방 펩타이드	SRIKLNKINDYIELL (31-45)^a	15	1
HigA α1-모방 펩타이드	SNWKDVRAELF (8-18)^a	11	2
HigA α2-모방 펩타이드	EEILESDMRVAIMSELIE (21-38)^a	18	3

^a괄호 안의 숫자는 전체 HigB 또는 HigA 단백질의 아미노산 서열 중 해당 서열의 아미노산 순서를 나타내는 번호이다.

<8-2> HigB 독소 단백질 및 HigA 항독소 단백질 모방 펩타이드의 원평광 이 색성(circular dichroism, CD) 확인

상기 실시예 8-1에서 제작한 HigB 독소 단백질 및 HigA 항독소 단백질 모방 펩타이드의 CD 분광 분석을 수행하여 각 펩타이드의 헬리시티(helicity)를 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 8-1에서 제작한 펩타이드 I 내지 III를 각각 25 μM 농도로 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl로 구성된 용액에 용해하고, 20℃에서 1 mm의 광 경로(light path)를 갖는 셀(cell)을 이용하여 분광편광계(Chirascan Plus spectropolarimeter, Applied Photophysics, Ltd.)로 CD 분광 분석을 수행하였다. CD 스캔은 260에서 190nm까지 1 nm의 밴드 폭으로 측정하였고, 스캔 속도는 100nm/분이었다. 각 펩타이드의 헬리시티는 평균 잔기 타원율(mean residue ellipticity, [θ]₂₂₂)에 기초하여 정량적으로 측정하였다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 펩타이드 I, II, III는 다시 접힌 후 2차 구조를 회복하여, α-나선의 특성을 가지고 있음을 확인하였다.

< 실시예 9> HigB 독소 단백질 및 HigA 항독소 단백질 모방 펩타이드의 HigBA 단백질 복합체 형성 억제 효과 확인

<9-1> 모방 펩타이드에 의한 RNA 분해 활성 측정

상기 실시예 8-1에서 제작한 HigB 및 HigA 단백질 모방 펩타이드의 HigBA 단백질 복합체 형성 억제 효과를 확인하기 위하여, HigBA 단백질 복합체에 HigB 또는 HigA 단백질 모방 펩타이드를 첨가한 후, RNA 분해 활성을 측정하였다. HigBA 복합체 형성이 모방 펩타이드에 의해 억제되고 HigB 독소 단백질이 방출되면 형광 표지된 RNA 기질은 HigB에 의해 절단된 기질의 양에 비례하여 형광을 방출하므로 형광을 측정하면 RNA 분해 활성을 측정할 수 있다.

구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 정제한 HigBA 단백질 복합체를 최종 농도 2 μM로 20 mM Tris(pH 7.5) 및 150 mM NaCl로 구성된 용액에 준비하고, 상기 표 10의 서열번호 1 내지 3의 펩타이드를 동일한 용매에 최종 농도 10 μM로 하여 HigBA 단백질 복합체와 각각 혼합한 후, RNA 분해 효소 오염을 방지하기 위해 40 unit의 RiboLockTM(Thermo Scientific) RNase 억제제를 첨가하여 37℃에서 30분간 배양하였다. 이후, 상기 실시예 7-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 RNA 분해 활성을 측정하였다.

그 결과, HigBA 단백질 복합체에 HigB 또는 HigA 단백질 모방 펩타이드들의 첨가 시, RNA 분해가 모두 증가하였으며, 그 중 HigB 모방 펩타이드의 RNA 분해 활성은 HigB의 80%를 나타내 효과가 가장 크게 나타났다(도 18). 이는 상기 HigB 또는 HigA 단백질 모방 펩타이드들의 첨가로 HigBA 단백질 복합체 형성이 경쟁적으로 저해됨으로써, 분리된 HigB 단백질이 늘어남에 따라 RNA 분해 정도가 증가한 결과로 해석되며, HigB 모방 펩타이드의 HigBA 단백질 복합체 형성 억제 효과가 가장 우수함을 제시한다.

<9-2> 크로마토그래피에 의한 모방 펩타이드의 HigBA 단백질 복합체 형성 억제 효과 확인

Superdex 75 10/300 prepacked 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 사용하여 HigB 모방 펩타이드가 추가된 HigBA, HigA, HigB 및 HigBA의 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 280nm에서의 흡수는 용출 부피의 함수로 표시되며, 주입된 단백질의 부피는 100㎕이고, HigB 모방 펩타이드의 농도는 200μm, HigA, HigB 및 HigBA 단백질은 1mm의 농도로 첨가되었다.

그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, HigBA 단백질 복합체에 HigB 모방 펩타이드 첨가 시, HigBA 단백질 복합체 형성을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

< 실시예 10> 모방 펩타이드의 항균 활성 확인

<10-1> 모방 펩타이드의 폐렴 구균 성장 억제 활성 확인

그람 양성균인 폐렴 구균(S. pneumoniae TIGR4)에 대한 모방 펩타이드의 항균 활성을 세포 성장 분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, 세포 성장 분석을 위해, S. pneumoniae TIGR4는 중간 지수 단계(OD₆₀₀=0.5)까지 5% CO₂를 포함하는 공기에서 Todd Hewitt Broth(THB)에서 4℃에서 교반없이 10시간 동안 배양하고, 새로운 배지에 접종하였다. 그 후 37℃에서 10시간 동안 배양하고 성장을 1시간 간격으로 모니터링했다. 평균의 표준 오차 및 평균 OD₆₀₀ 값을 MicroCal Origin 소프트웨어에 의해 표시했다.

그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, HigA α1 모방 펩타이드, HigA α2 모방 펩타이드 또는 HigB α2 모방 펩타이드는 6.3 μm 농도에서 세포 성장이 억제되는 것으로 나타났고, HigB α2 모방 펩타이드가 폐렴 구균의 성장을 가장 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

<10-2> HigB 모방 펩타이드의 폐렴 구균 사멸 확인(1)

HigB 독소 단백질의 α2 나선 모방 펩타이드가 폐렴 구균을 사멸시키는지 여부를 세포 생존능 분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae TIGR4) 세포를 상기 실시예 10-1에서 제작한 다양한 농도(6.3μM, 3.1μM, 1.6μM 및 0.8μM)의 HigB 독소 단백질의 α2 나선 모방 펩타이드와 함께 THB(MB cell)를 포함하는 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 1시간 후 및 10시간 후에 박테리아 세포를 수확하고 살아 있는 세포를 염색하는 녹색 형광 단백질인 SYTO9 및 사멸한 세포를 염색하는 적색 형광 단백질인 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)를 포함하는 LIVE/DEAD BacLight 키트(Thermo Fisher Scientific)로 염색을 수행하였다. 양성 대조군로서 새로운 폐렴 구균 세포를 준비하고, 세척 전 70% 이소프로필알코올에 세포를 15분 동안 배양하여 음성 대조군을 준비하였다. 염색을 위해 세포를 실온에서 5μm SYTO9 및 30μm 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)와 함께 배양하고 15분 동안 빛을 차단하였다. 세포는 LSRFortessa 유세포 분석기(BD Bioscience)로 분석되었고 데이터는 FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 시각화하였다.

그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 펩타이드가 없는 대조군에서는 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae TIGR4)의 22.1%가 프로피디움 아이오다이드에 투과성을 보인데 반해, 6.3μM 농도의 모방 펩타이드와 함께 10시간 배양한 폐렴 구균 세포에서는 PI-투과성 세포가 76.6%로 증가하였다. 상기 결과는 사멸한 세포를 염색하는 PI의 적색 형광을 발현하는 세포가 증가한 것으로, 모방 펩타이드가 폐렴 구균을 사멸하는 효과가 있음을 제시한다.

<10-3> HigB 모방 펩타이드의 폐렴 구균 사멸 확인(2)

HigB 독소 단백질의 α2 나선 모방 펩타이드를 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae TIGR4) 및 폐렴 구균(S. pneumoniae D39)과 10시간 동안 배양하여 상기 실시예 10-2에 개시된 방법으로 동일하게 처리한 후, 공초점 현미경을 사용하여 형광을 관찰하였다.

구체적으로, 폐렴 구균 세포는 OD₆₀₀가 0.4 내지 0.6이 될 때까지 THB에서 배양하고, DifcoTM Mueller Hinton Broth(BD Bioscience)로 희석하여 10% 세포 현탁액을 수득하였다. 수득한 세포 현탁액을 플루오레세인과 결합된 1μm HigB 독소 단백질의 α2 나선 모방 펩타이드 샘플과 30분 동안 배양한 후, 세포 표면에 결합된 펩타이드를 제거하기 위해 소 췌장(Sigma Life Sciences)에서 1mg/㎖ 트립신을 첨가하여 급속 냉각시켰다. 30분 후, 세포를 PBS로 세척한 다음 Leica TCS SP8(Leica Microsystems) 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다.

또한, 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae D39) 세포를 6.3μM의 HigB 독소 단백질의 α2 나선 모방 펩타이드 및 상기 실시예 1-2에서 제작한 HigBA 복합체 단백질, 상기 실시예 1- 함께 상기 실시예 10-1에 개시한 방법과 동일하게 처리하여

그 결과, 도 22및 도 23에 나타난 바와 같이, 모방 펩타이드는 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae TIGR4) 세포 및 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae D39) 세포 내에 위치하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 표면 결합 펩타이드와 세포 외 펩타이드는 트립신에 의해 분해되었기 때문에, 형광 이미지는 모방 펩타이드를 나타내며, 모방 펩타이드가 폐렴 구균의 세포질 막을 통과하여 폐렴 구균 사멸에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다.

또한, 도 24에 나타난 바와 같이, 10시간 후 활성 부위 돌연변이 HigBA를 포함하는 S. pneumoniae D39는 야생형 HigBA를 포함하는 S. pneumoniae D39보다 사멸한 세포의 비율이 더 낮았고, HigBA를 함유하지 않은 S. pneumoniae D39는 모방 펩타이드의 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 R68, R73, F90 및 K92 아미노산 잔기가 HigBA 복합체 단백질 형성에 필수적인 잔기임을 제시한다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Antimicrobial peptides increasing toxicities of endogenous toxin and targeting HigBA toxin-antitoxin system of Streptococcus pneumoniae, and use thereof <130> 2020P-09-012 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HigB alpha2 mimicking peptide <400> 1 Ser Arg Ile Lys Leu Asn Lys Ile Asn Asp Tyr Ile Glu Leu Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HigA alpha1 mimicking peptide <400> 2 Ser Asn Trp Lys Asp Val Arg Ala Glu Leu Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HigA alpha2 mimicking peptide <400> 3 Glu Glu Ile Leu Glu Ser Asp Met Arg Val Ala Ile Met Ser Glu Leu 1 5 10 15 Ile Glu <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HigB alpha2 <400> 4 Ser Arg Ile Lys Leu Asn Lys Ile Asn Asp Tyr Ile Glu Leu Leu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HigA alpha1 <400> 5 Ser Asn Trp Lys Asp Val Arg Ala Glu Leu Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HigA alpha2 <400> 6 Glu Glu Ile Leu Glu Ser Asp Met Arg Val Ala Ile Met Ser Glu Leu 1 5 10 15 Ile Glu <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HigB F <400> 7 ggaattccat atgatgcata atatctattt tta 33 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HigB R <400> 8 ccgctcgagt tatttttcat tgtctaaac 29 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HigA F <400> 9 ggaattccat atgatgaaaa ataatgctat tgg 33 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HigA R <400> 10 ccgctcgagt taaacctgct catgctctaa tggt 34 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F17A F <400> 11 ggcaatgagc ctgttgctga ttatatgcga gag 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F17A R <400> 12 ctctcgcata taatcagcaa caggctcatt gcc 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M20A F <400> 13 cctgtttttg attatgcgcg agagcttacc agt 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M20A R <400> 14 actggtaagc tctcgcgcat aatcaaaaac agg 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D40A F <400> 15 cttaataaaa ttaatgctta tattgagttg tta 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D40A R <400> 16 taacaactca atataagcat taattttatt aag 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L44A F <400> 17 aatgattata ttgaggcgtt aagccaacat gga 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L44A R <400> 18 tccatgttgg cttaacgcct caatataatc att 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D61A F <400> 19 tatattaagc atttagctgc tgaaatttgg gag 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D61A R <400> 20 ctcccaaatt tcagcagcta aatgcttaat ata 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E66A F <400> 21 gatgctgaaa tttgggcgct gagaccactt aga 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E66A R <400> 22 tctaagtggt ctcagcgccc aaatttcagc atc 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R68A F <400> 23 gaaatttggg agctggcacc acttagagat aga 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R68A R <400> 24 tctatctcta agtggtgcca gctcccaaat ttc 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R73A F <400> 25 agaccactta gagatgcaat tttatttgtt gct 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R73A R <400> 26 agcaacaaat aaaattgcat ctctaagtgg tct 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F90A F <400> 27 gttttactgc atcatgctat gaaaaggaca cag 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F90A R <400> 28 ctgtgtcctt ttcatagcat gatgcagtaa aac 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K92A F <400> 29 ctgcatcatt ttatggcaag gacacagaaa aca 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K92A R <400> 30 tgttttctgt gtccttgcca taaaatgatg cag 33 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal I F <400> 31 agcatctagg aaactaggtg ct 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal I R <400> 32 agcacctagt ttcctagatg ct 22 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal II F <400> 33 aacttaaaag tatttacaaa caataacttt taggtt 36 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal II R <400> 34 aacctaaaag ttattgtttg taaatacttt taagtt 36 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal III F <400> 35 tattttaata acttaaaagt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal III R <400> 36 ataaaattat tgaattttca 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pal IV F <400> 37 taggttataa ttgttattag gaa 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA 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Claims

서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되며, 폐렴구균의 독소-항독소 결합체인 HigBA 복합체의 형성을 억제하는 항균 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 HigB 독소 단백질의 α2 영역이 항독소 단백질 HigA와 결합하는 것을 억제하는, 항균 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α1 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제하는, 항균 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 HigA 항독소 단백질의 α2 영역이 독소 단백질 HigB와 결합하는 것을 억제하는, 항균 펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하고 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항균 활성을 나타내는 것인, 항균용 조성물.
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하고 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항균 활성을 나타내는 것인, 항균용 의약외품.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하고 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항균 활성을 나타내는 것인, 항균용 외용제.