KR20220105284A - 폐렴간균 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 화합물, 및 이들의 용도 - Google Patents

폐렴간균 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 화합물, 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐렴간균 VapBC 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 항균 화합물 또는 이의 용도에 관한 것이다.

Description

폐렴간균 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 화합물, 및 이들의 용도 {Antibacterial peptides and compounds targeting Toxin-antitoxin system of Klebsiella pneumoniae, and their use}
본 발명은 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)의 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 펩타이드 및 화합물에 관한 것이다.
폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)은 가장 중요한 기회감염 병원체 중 하나이다. 물, 고체 상 또는 잎 표면을 포함하여 환경에 널리 퍼져 있다. 폐렴간균(K. pneumoniae)은 상기도 (upper respiratory tract), 요로 및 혈류의 감염의 원인이 되며 폐렴을 유발한다. 현재 폐렴간균은 전 세계 사람들의 건강에 심각한 위협으로 간주된다. 이는 극도로 가소성인 게놈을 갖고 항생제 내성을 유발하는 경향이 크다. 특히, 카르바페넴에도 내성이 있는 약물-내성 폐렴간균이 세계적인 문제로 떠오르고 있다.
독소-항독소 (toxin-antitoxin, TA)의 전반적인 생물학적 기능 시스템은 매우 다양하다. TA 시스템에 대해 식별된 초기 역할은 플라스미드 유지였다. 얼마 지나지 않아 사후 사멸(postsegregational killing)과 같은 TA 시스템의 유사한 기능도 관찰되었다. 나아가 TA 시스템이 항생제 치료, 파지(phage) 감염, DNA 손상, 산화 스트레스, 및 고온과 같은 스트레스로 인해 프로그램된 세포 사멸을 매개하는 것으로 나타났다. 최근 TA 시스템이 지속성 세균(bacterial persister) 세포의 형성에 작용할 가능성이 있음이 밝혀졌다.
네 가지 주요 유형의 TA 시스템은 항독소가 독소를 억제하는 메커니즘과 항독소의 특성에 따라 분류된다. 타입 I 및 III TA 시스템에서의 항독소는 세포의 독소 수준을 조절하는 RNA 분자이다. RNA 항독소는 mRNA 독소의 번역을 억제하고 (타입 I) 직접 결합에 의해 단백질 독소의 활성을 억제한다 (타입 III). 그러나 타입 II 및 IV TA 시스템의 항독소는 단백질이다. 이러한 단백질 항독소는 단백질 독소에 직접 결합하여 독소의 활성을 억제하거나 (타입 II), 직접 결합하지 않고 예컨대 표적에 대한 반대 효과를 유발함으로써 독소의 독성 활성을 중화한다 (타입 IV). 타입 V 및 VI TA 시스템의 경우는 각각 다른 규제 원칙이 있는 단일 사례만 있다.
박테리아 타입 II TA 시스템은 두 가지 단백질, 즉 생물물리적으로 안정한 독소와 상대적으로 불안정한 항독소를 포함한다. 정상 상태에서는 독소와 항독소의 발현 수준이 잘 조화되고, 따라서 항독소가 독소의 해로운 영향을 상쇄하기 때문에 박테리아가 정상적으로 생존할 수 있다. 그러나 불안정한 항독소는 항생제 치료, 영양 부족 및 불리한 온도를 포함한 스트레스 조건에서 더 빨리 분해된다. 그러면 독소가 항독소로부터 자유롭게 해방되고 해방된 독소의 독성으로 인해 박테리아가 손상을 입는다.
타입 II TA 시스템은 비병원성 박테리아보다 병원성 박테리아에 더 광범위하게 분포되어 있다. 이는 TA 시스템이 박테리아 병원성과 밀접한 관련이 있음을 시사한다. 또한, TA 시스템은 어떠한 진핵 생물에서도 발견되지 않으므로 박테리아 병원체에 대한 유망한 약물 표적이다. 병원성 박테리아의 TA 시스템의 수십 가지 구조가 구조 및 기능 연구에서 해결되었다. 그러나 폐렴간균의 TA 시스템에 대한 구조적 정보는 아직 알려지지 않았다. 폐렴간균 TA 시스템을 미래의 약물 표적으로서 분자적으로 통찰하고 검증하려면 폐렴간균 TA 시스템의 구조를 탐구하는 것이 중요하다.
VapBC는 타입 II TA 시스템의 가장 큰 군 중 하나이다. 현재까지 VapBC TA 시스템에서 최소 11개의 복잡한 구조가 확인되었다: Neisseria gonorrheae FitAB, Shigella exneri VapBC; Rickettsia felis VapBC2; Caulobacter crescentus VapC1; Haemophilus inuenza VapC1; 및 Mycobacterium tuberculosis VapBC3, VapBC5, VapBC11, VapBC15, VapC26, 및 VapBC30. 이러한 VapBC 복합체들에서 VapB는 가변 DNA 결합 도메인과 가요성(flexible) 영역을 포함하며 구조적으로 매우 복잡한 반면, VapC는 보존된 경질(rigid) 도메인을 나타낸다.
VapC 독소는 리보뉴클레아제 (RNase) 활성에 중요한 필루스 수축 단백질 (PilT) N-말단 (PIN) 도메인을 포함한다. 이러한 PIN 도메인은 대략 130개의 아미노산 단백질로 구성되고 활성 부위에서 Mg2 +로 배위된 잔기의 엄격하게 보존된 음전하 acidic quartet을 포함한다. 반면에 동족 항독소 VapB는 N-말단에 리본-나선-나선 (RHH) DNA 결합 모티브로 폴딩되고, C-말단 나선을 통해 VapC의 활성 부위를 감싼다. VapB는 VapC의 촉매 부위를 입체적으로 차단하고 단단한 결합 억제제로 작용하기 때문에 VapB와 VapC 사이의 결합을 억제하는 분자는 유리 독소를 생성하고 방출할 수 있다. 결합 경쟁자로서 작용하여 다른 병원성 박테리아에서의 성장 정지 또는 궁극적 세포 사멸을 초래하는 이러한 억제 분자에 대한 앞선 연구가 있다. 독소의 인공적 활성화를 통한 항균 전략으로서 TA 시스템의 이용은 항생제 치료에 대한 잠재적 접근으로서 제안되고 있다. 일부 최근 연구에서 서열별 안티센스 펩타이드 핵산 올리고머 및 펩타이드 기반 억제제는 박테리아 세포 사멸을 초래함이 확인된 바 있다.
Kang, S.-M. et al., Nucleic Acids Res. 2017, 45, 8564-8580
본 발명의 목적은 폐렴간균 독소-항독소 시스템을 표적으로 하는 항균 펩타이드 또는 항균 화합물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 펩타이드 또는 화합물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 폐렴간균의 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 VapB 및 VapC의 결합을 억제하는 펩타이드이며, 폐렴간균의 독소-항독소 복합체 VapBC의 결합을 파괴 또는 억제하여 VapC 독소를 활성화하는 항균 펩타이드를 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 폐렴간균의 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 VapB 및 VapC의 결합을 억제하는 화합물이며, 저농도에서 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 인터페이스 포켓을 폐쇄하여 복합체 VapBC의 형성을 억제하는 화합물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 화합물을 포함하는 항균용 조성물, 의약외품, 또는 외용제를 제공한다.
본 발명의 항균 펩타이드는 폐렴간균의 독소-항독소 복합체 VapBC의 결합 인터페이스를 모방한 것으로서, 복합체 VapBC의 결합을 파괴하고 독소 VapC를 인공적으로 활성화시킴으로써 결과적으로 독소의 RNase 활성에 의해 폐렴간균의 사멸을 유도한다. 또한 본 발명의 소분자 화합물은 복합체 VapBC 내의 VapB와 VapC 간의 인터페이스 포켓을 폐쇄함으로써 복합체 VapBC의 결합을 억제하지만 독소 VapC의 RNase 활성에는 영향을 미치지 않는다. 따라서 본 발명의 항균 펩타이드 및 소분자 화합물은 이를 억제제로 이용하여 폐렴간균 제어에 대한 신규한 전략을 제공하는 항생 조성물로서 사용될 수 있다.
도 1은 성장 분석 및 CFU 측정을 나타낸다. 폐렴간균 VapBC TA 시스템의 검증에 사용된 박테리아는 E. coli이다. (a,b) 각 곡선은 그래프 내의 표에 나타낸 각 변수를 나타낸다. 데이터는 3회 반응에서 얻은 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. (a) 폐렴간균 VapBC TA 시스템의 성장 분석. (b) 상단 그래프: 0.2% 글루코오스(arabinose)로 처리된 플레이트의 CFU 측정. 하단 그래프: 0.2% 글루코오스(arabinose) 및 0.5 mM IPTG로 처리된 플레이트의 CFU 측정.
도 2는 폐렴간균 VapBC (PDB ID: 7BY3)의 전체적인 구조 정보를 나타낸다. (a-c) 항독소 VapB의 서브유닛은 노란색으로 표시되고 독소 VapC의 서브유닛은 연보라색으로 표시된다. (a) VapC의 다이머화에 의해 형성된 분자간 인터페이스를 포함하는 VapBC 복합체의 헤테로테트라머 어셈블리. (b) VapB의 N-말단 DNA-결합 도메인의 다이머화에 의해 형성된 분자간 인터페이스를 포함하는 VapBC 복합체의 헤테로테트라머 어셈블리. (c) 2차 구조 아키텍처를 나타내는 VapBC 헤테로다이머의 개략도. (d) VapB의 N-말단 DNA-결합 도메인의 2차 구조 분석.
도 3은 폐렴간균 VapBC와 그의 동족체들의 구조 비교를 나타낸다. (a) 폐렴간균 VapC와 동족체들의 서열 정렬. 이러한 단백질들의 2차 구조 요소는 서열 정렬 위에 표시된다. 극도로 보존된 잔기는 노란색 및 빨간색으로 강조 표시된다. 그 중, 산성 활성 부위 잔기 및 남은 잔기는 각각 빨간색 및 파란색 삼각형으로 표시된다. (b) VapC (PDB ID: 7BY3)의 정전기적 표면 (좌). 양전하 및 음전하가 각각 파란색 및 빨간색으로 표시된다. VapC의 산성 활성 부위가 각 동족체의 구조에서 7개의 보존된 잔기의 위치를 나타내는 카툰 및 막대 표시로 확대되어 나타낸다 (우). (c) VapBC 복합체 비교 (PDB ID: 순서대로 7BY3, 6A7V, 5X3T, 5K8J, 및 6NKL). 각 VapBC 복합체는 VapC 구조에 기반한 동일한 방향으로 표시된다. VapC의 경우 도 3b에서와 동일한 색상이 사용된다.
도 4는 VapC의 활성 부위 및 RNase 활성을 나타낸다. (a) VapBC 복합체 구조의 두 가지 형태: 개방형 (좌)(PDB ID: 7BY2) 및 폐쇄형 (우)(PDB ID: 7BY3). (b) 두 가지 형태의 활성 부위가 VapC의 카툰 다이어그램과 함께 표시된다. 4개의 보존된 잔기를 막대 표시로 나타낸다. σ에서의 Mg2+ 부위 윤곽선의 2mFo-DFc 전자 밀도 맵 또한 표시된다 (PHENIX로 계산). 개방형의 VapC 활성 부위에서, 배위된 Mg2+는 잔기 D9, E43, 및 D90의 중간에 위치한다. 폐쇄형의 VapC 활성 부위에서, VapB의 R79는 Mg2+의 변위를 유발한다. 결과적으로 VapB의 R79는 Mg2+의 원래 위치를 채우고, Mg2+는 D9, D90, 및 D111의 중간으로 이동한다. (c) VapC, VapC 돌연변이체, 및 VapBC의 시험관내(In vitro) RNase 활성. 단백질을 EDTA로 처리하여 금속 이온을 제거한 후, 10 mM Mg2+를 단백질에 첨가하였다. 분석에서는 10 μM 단백질을 사용하였고, 일반 RNase 억제제 (40 유닛)을 사용하여 의도치 않은 오염을 방지하였다. 이들 단백질의 RNase 활성에 대한 동역학을 1시간 동안 기록하였다. 표시되는 데이터는 3회의 독립된 실험을 통해 얻어졌다.
도 5는 VapBC 복합체 (PDB ID: 7BY3)의 헤테로다이머 인터페이스 및 설계된 펩타이드를 사용한 복합체 파괴 효능을 나타낸다. (a)-(b) 상호작용 네트워크에 관여하는 잔기는 막대 표시로 나타낸다. 친수성 및 소수성 상호작용의 개략도가 표에 제공된다. (a) VapB α3 나선의 분자간 상호작용 네트워크. (b) VapC α1 나선의 분자간 상호작용 네트워크. (c)-(d) VapBC 복합체에 첨가된 펩타이드로 인한 RNase 활성. 펩타이드에 의해 생성된 활성은 VapC의 활성에 비례하여 플롯된다. 이러한 복합체 파괴 분석에서 100 μM 펩타이드를 10 μM 단백질에 첨가하고 복합체 파괴 효능을 평가하였다. 데이터는 3회의 독립된 실험 값의 평균±SD로 표시된다. (c) VapB α3 나선의 서열을 기반으로 설계된 펩타이드의 효능. (d) VapC α1 나선의 서열을 기반으로 설계된 펩타이드의 효능.
도 6은 유리 VapC에 대한 펩타이드의 영향을 나타낸다. 데이터는 3회 반응에서 얻은 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 본 발명의 설계된 펩타이드로 유리 VapC를 처리한 것이다.
도 7은 VapC (PDB ID: 7BY3) 상 표면 포켓 및 분자 도킹으로 표현되는 최종 화합물의 효능을 나타낸다. (a) VapB의 카툰을 포함한 VapC의 표면. 음으로 하전된 활성 부위 공동(cavity) 및 표면 틈새 인터페이스 포켓은 VapB의 α2-α3 루프를 통해 연결된다. VapC의 화합물-결합 부위는 인터페이스 포켓 밸리로 표시된 표면 틈새 인터페이스 포켓 상에 위치한다. (b) VapBC 복합체가 첨가되었을 때 화합물의 RNase 활성. 화합물에 의해 생성된 활성은 VapC의 활성에 비례하여 플로팅된다. VapBC 복합체 없는 화합물의 활성도 측정되었다. 본 복합체 파괴 분석에서 화합물 (1, 3.16 및 10 μM)을 10 μM 단백질에 첨가하고 복합체 파괴 효능을 평가하였다. 활성은 첫 시간 동안의 초기 속도를 기준으로 측정되었다. 데이터는 3회의 독립된 실험값의 평균±SD로 표시된다.
도 8은 유리 VapC에 대한 소분자의 영향을 나타낸다. 데이터는 3회 반응에서 얻은 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 본 발명의 소분자 화합물 1 및 화합물 2로 유리 VapC를 처리한 것이다.
도 9는 본 발명의 화합물 1 및 화합물 2의 억제 곡선을 나타낸다. 데이터는 3회 반응에서 얻은 평균값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다.
도 10은 자세한 상호 작용 네트워크를 포함하는 VapC 구조 (PDB ID: 7BY3)에서 화합물의 분자 도킹 결과를 나타낸다. 카툰 다이어그램에서 VapC의 리간드-결합 잔기는 막대로 나타내고 표지된다. 2D 리간드-VapC 상호작용 다이어그램은 LigPlot+를 사용하여 생성되었다. 화합물 1 및 2는 각각 녹색과 분홍색으로 표시된다. HB에 관여하는 잔기가 표시되고 HB는 파란색 점선으로 표시된다. 리간드와 비결합 접촉을 형성하는 잔기는 빨간색 스포크 원호로 표시된다. (a) 화합물 1에 대한 상호작용 데이터. (b) 화합물 2에 대한 상호작용 데이터.
도 11은 ITC 분석을 나타낸다. 각 실험에 참여하는 구성 요소와 결과 결합 매개 변수는 각 그래프에 기재된다.
본 발명은 폐렴간균의 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 VapB 및 VapC의 결합을 파괴 또는 억제하는 펩타이드를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "펩타이드"는 펩타이드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 포함하며, 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩타이드, 및 펩타이드를 의미한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 개별적인 단백질, 또는 단백질의 집합을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 분자를 의미한다. 아미노산은 알파-아미노산 및 베타-아미노산을 포함한다. 아미노산은 비천연 아미노산 또는 천연 아미노산일 수 있다. 예시적인 아미노산은 펩타이드에서 발견되는 20개의 일반적인 자연 발생 알파 아미노산의 D- 및 L-이성질체와 같은 천연 알파-아미노산, 비천연 알파-아미노산, 천연 베타-아미노산 (예를 들어, 베타-알라닌), 및 비천연 베타-아미노산을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 펩타이드의 구성에 사용되는 아미노산은 유기 합성에 의해 제조되거나, 다른 경로, 예컨대, 천연 공급원으로부터 단리 또는 분해에 의해 수득될 수 있다. 아미노산은 상업적으로 입수가능하거나 합성될 수 있다.
VapBC 복합체의 구조를 통해 독소 단백질 VapC 및 항독소 단백질 VapB 간의 결합에는 항독소 VapB의 α3 나선 및 독소 VapC의 α1 나선이 관여한다. 상기 펩타이드는 항독소 VapB의 α3 나선과 독소 VapC의 α1 나선의 결합을 파괴하거나 또는 억제하는 것일 수 있으며, 독소 단백질 VapC의 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 펩타이드는 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 치환 또는 결실된 아미노산도 사용 가능하다.
본 발명은 먼저 2.00 Å의 분해능에서 폐렴간균의 VapBC 복합체의 주요 결정 구조를 제공한다. 본 발명자들은 복합체 구조 분석을 통해, VapB의 R79가 배위된 Mg2 +를 인접 VapC의 D9, E43, 및 D90에서 VapC의 D9, D90, 및 D111로 이동시키고, VapC의 RNase 활성을 제거함을 확인하였다. 또한, 부위-유도 돌연변이 유발 및 시험관 내(in vitro) RNase 활성 실험에 의해 추가로 검증하였다. 본 발명자들은 VapBC 복합체의 결합 인터페이스를 모방한 펩타이드를 설계하고, 상기 펩타이드가 VapC 독소의 RNase 활성을 성공적으로 유발함으로써 VapBC 복합체를 파괴함을 확인하였다. 추가적으로, VapBC 복합체 구조 정보를 이용하여 총 400개의 소분자를 선별하였다. 또한, 2개의 최종 소분자 화합물이 저농도에서 VapBC 복합체의 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)의 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 VapB 및 VapC의 결합을 억제하는 신규한 화합물을 제공한다. 구체적으로, 상기 화합물은 폐렴간균의 독소 단백질 VapC의 표면에 위치하는 항독소 단백질 VapB 결합 인터페이스 포켓에 결합되어 독소-항독소 복합체 VapBC의 결합을 파괴 또는 억제할 수 있다.
본 발명자들은 VapB의 α2-α3 루프를 통해 VapC의 활성 부위가 아닌 틈새에 결합함으로써 VapBC 복합체를 파괴하도록 하는 신규 항균 화합물을 제조하고자 하였다.
이에 따른 본 발명의 항균 화합물은 하기 화합물 1 또는 2일 수 있다.
<화합물 1>
Figure pat00001
<화합물 2>
Figure pat00002
.
상기 펩타이드 화합물은 항균 활성, 특히 폐렴간균에 대해 항균 활성을 나타내는 것일 수 있다.
이에 따라 본 발명에 따른 항균 펩타이드 및 항균 화합물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 예컨대 세균, 바이러스, 효모 또는 진균에 의한 감염성 질환의 예방, 억제, 개선 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 기능성 식품 조성물, 식품 첨가제, 식품 보존제, 소독제, 살균 세정제 등의 용도로 사용될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
이에, 본 발명은 상기 항균 펩타이드 또는 항균 화합물을 포함하는 항균 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 폐렴간균에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 이에 따라 폐렴 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "폐렴(pneumonia)"은 세균, 바이러스 및 곰팡이 등의 미생물로 인한 감염으로 발생하는 폐의 염증을 의미하며, 기침, 염증 물질의 배출에 의한 가래, 숨쉬는 기능의 장애에 의한 호흡곤란 등의 폐의 정상적인 기능에 장애가 생기는 폐 증상, 구역, 구토, 설사 등의 소화기 증상 및 두통, 피로감, 근육통, 관절통 등의 신체 전반에 걸친 전신 질환이 발생하는 질환이다. 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료가 가능한 폐렴은 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 세균성 폐렴일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)에 의하여 발생하는 폐렴일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)"은, 그람 음성의 단간균을 의미하며, 편모, 포자는 없고 협막을 가지고 있는 미생물이다. 보통 한천에 잘 발달하는 통성염기성균으로 사람의 장관내, 구강 등에 상재하고 있으며, 급성 폐렴의 원인균이 되며, 기관지 폐렴, 요로감염증 등에서 분리되는 미생물이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 구사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 의약외품을 제공한다.
발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 펩타이드 또는 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 외용제를 제공한다.
상기 외용제는, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분 또는 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 항균용 약학 조성물, 의약외품, 항생제는 폐렴감균에 대해 항균 활성을 나타내는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
<실험 방법>
본 발명은 하기와 같은 실험 방법에 의해 수행될 수 있다.
1. VapB 및 VapC 유전자 클로닝 , 단백질 정제 및 돌연변이체 생성
VapBC 복합체의 구조 확인을 위해 폐렴간균 (균주 MGH78578) VapB (kpn_04185) 및 VapC (kpn _ 04186)를 코딩하는 유전자를 프라이머 VapB-F/VapB-R 및 VapC-F/VapC-R (표 1)을 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
Figure pat00003
제한 효소 Nde1 및 Xho1을 사용하여 모든 PCR 산물과 벡터를 이중 절단하였다. 그 후, 절단된 PCR 산물을 pET-21a (kpn _04185) 및 pET-28a (kpn _ 04186)에 연결하였다. VapC (kpn _ 04186)에 사용되는 pET-28a 벡터는 N-말단 태그 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH)를 갖는다. 복제된 플라스미드를 E. coli BL21 (DE3) 세포(Novagen)로 공동 형질 전환시켰다.
600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)가 0.6에 도달할 때까지 Luria broth (LB)를 사용하여 박테리아 세포를 37 ℃에서 성장시켰다. 그 다음 세포를 0.5 mM IPTG에 의해 유도시키고 37 ℃에서 4시간 동안 추가로 배양시켰다. 유도된 세포를 11,355g에서 원심분리시키고 20 mM Tris-HCl, pH7.9, 및 5% 글리세롤과 함께 500 mM NaCl이 포함된 버퍼 A에 현탁시켰다. 현탁된 세포를 초음파로 파쇄시키고(lysed) 28,306g에서 원심분리시켰다. 원심분리 후, 가용성 단백질을 포함하는 상층액을 미리 버퍼 A로 평형화한 Ni2 + 친화 오픈 컬럼(Bio-Rad)에 충진시켰다. 결합된 단백질은 100 mM 이미다졸이 포함된 버퍼 A로 세척되고 이미다졸 구배 (150-500 mM)로 용출되었다. 용출된 단백질을 20 mM HEPES, pH 7.5 및 100 mM NaCl이 포함된 버퍼로 희석시키고 NaCl 구배 (200-800 mM)를 사용하는 HiTrap Q HP 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 추가로 정제하였다. 상기 용출된 단백질을 HiLoad Superdex 200 prep-grade 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 20 mM HEPES, pH 7.5 및 400 mM NaCl을 포함하는 버퍼로 교환하고 Amicon Ultra 원심분리 필터 유닛 (Millipore)을 사용하여 20 mg/mL로 농축시켰다.
SeMet 표지된 VapBC 복합체의 정제를 위해 세포를 여분의 SeMet을 포함하는 Nutrient Mix (Molecular Dimensions)와 SeMet Medium Base에서 배양시킨 것을 제외하고는 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하였다.
VapC 돌연변이체를 생성하기 위해 D9A, E43A, D90A, 및 D111A에 대한 정방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머를 사용하였다 (표 1). 돌연변이체는 EZchange Site-Directed Mutagenesis Kit (Enzynomics)를 사용하여 생성되었다. PCR 산물은 N-말단 태그 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH)를 사용하여 pET-28a에 연결되었다. VapC 및 돌연변이된 VapC 단백질은 네이티브 VapBC 복합체의 단백질과 동일한 단계에 의해 제조되었다. 정제된 단백질의 순도는 모든 단계에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 검증되었다.
2. VapBC 복합체의 결정화, 데이터 수집 및 처리
VapBC 복합체를 결정화하기 위해 20 ℃에서 Wizard Classic crystallization screen series (Rigaku)를 이용하는 sitting drop vapor diffusion method를 사용하였다. 최종 결정화 조건은 0.1M 구연산 나트륨, pH 5.5 및 200 mM 황산 리튬이었다. 결정은 20% 글리세롤로 동결 보호(cryoprotection)되고 액체 질소에서 재냉각되었다. 자세한 정보가 하기 표 2 및 표 3에 제공된다.
데이터 수집 세부사항
회절 데이터는 대한민국 Pohang Light Source(PLS)의 빔라인 5C 및 11C에서 ADSC Quantum Q270r CCD 검출기를 사용하여 수집되었다. 모든 원형 데이터는 HKL2000을 사용하여 조정되고 처리되었다.
Data set SeMet Native
X-ray source 5C beamline of PLS,
Korea		 5C beamline of PLS, Korea
X-ray wavelength (Å) 0.9794 0.9795
Space group C2221 C2
Unit cell parameters
a, b, c (Å) 79.200, 110.323, 59.703 110.435, 79.019, 59.609
α, β, γ (°) 90.000, 90.000, 90.000 90.000, 89.985, 90.000
Resolution range (Å) 50.0-2.60 (2.64-2.60) 50.0-2.00 (2.04-2.00)
Molecules per ASU VapBC heterodimer 2 VapBC heterodimers
Observed reflections (>1σ) 110563 139747
Unique reflections 8245 31667
<I/σ(I)> 57.8 (5.02)e 48.3 (8.81)e
Completeness (%) 99.9 (100.0)e 96.8 (99.9)e
Multiplicitya 13.4 (10.8)e 4.4 (4.7)e
R pim (%)b 5.4 (63.2)e 3.7 (26.7)e
CC1/2, CC (0.912, 0.977)e (0.890, 0.971)e
a N obs/N unique
b Rmerge = Σ(I-<I>)/Σ<I>
e 괄호 안의 값은 가장 높은 해상도 쉘의 값이다.
개선 통계 결과
구조 계산 동안, PHENIX를 사용하여 모델을 자동으로 구축하고 Coot를 사용하여 모델을 수정하였다. REFMAC 및 PHENIX는 타당한 R work 및 R free 값을 얻기 위해 사용되었다. MolProbity는 전체적인 기하 구조를 검증하는데 사용되었다. PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, Schroedinger, LLC., Cam-bridge, MA, USA)을 사용하여 시각화하였다.
Data set SeMet Native
R work c (%) 26.8 24.4
R free d (%) 29.0 27.2
No. of atoms/RMS 1252/5.07 3192/2.72
RMSDf from ideal geometry
Bond distance (Å ) 0.008 0.005
Bond angle (°) 1.099 1.056
Ramachandran statistics
Most favored regions (%) 98.01 96.70
Additional allowed regions (%) 1.99 3.30
Residues in disallowed regions (%) 0.00 0.00
PDB ID 7BY2 7BY3
c R work = Σ hkl ||Fobs| - k|Fcalc||/Σ hkl |Fobs| (X-선 회절 데이터와 모델 사이의 일치하는 정도. 낮을수록 일치도가 높음.)
d R free는 개선 결과로부터 무작위로 추출된 5%의 데이터를 R work와 동일한 방법으로 계산하였다. (무작위로 선택된 데이터와 모델 사이의 일치하는 정도)
f REFMAC를 사용하여 평균 제곱근 편차 (Root-mean-square deviation, RMSD)를 계산했다. (결정된 모델의 구조가 통상적인 분자들이 지닌 결합 길이 및 각도와 부합하는 정도)
3. 성장 분석 및 콜로니 형성 단위( cfu ) 측정
VapC를 인코딩하는 유전자는 추가적으로 pBAD33으로 클로닝되었다. 클로닝된 플라스미드는 VapB를 인코딩하는 앞서 클로닝된 유전자를 포함하는 컴피턴트 E. coli BL21 (DE3) 세포로 형질전환되었다. 이 호환가능한 플라스미드 쌍 (pBAD33 및 pET-21a)을 M9 최소 배지 + 25 μg/mL 클로람페니콜 및 50 μg/mL 암피실린에서 37 ℃에서 밤새 배양시켰다. 밤새 성장시킨 배양물을 50배 희석하고 다음 5시간 동안 추가로 배양시켰다. 0.2의 OD600에서 0.2% 아라비노스를 첨가하였다. 성장 분석을 위해 0.5 mM IPTG를 1시간 후에 첨가하였다. cfu 측정을 위해 30분마다 세포 샘플을 수집하고 0.2% 글루코스(아라비노스) 및 0.5 mM IPTG가 있는 LB 배지 플레이트에 스트리킹하였다. 16시간 동안 배양하여 플레이트를 계수하였다.
4. 폐렴간균 VapBC 복합체 구조 확인
폐렴간균 VapBC TA 시스템을 실험적으로 검증하였다. VapC 발현은 세포 성장을 상당히 억제하고 콜로니 형성 단위 (cfu)를 감소시켰다. 그러나 억제된 세포 생존력은 VapB의 발현에 의해 거의 완전히 회복되었다(도 1). 폐렴간균 VapBC TA 시스템의 확인을 위해 사용된 박테리아는 E.coli였다.
VapBC의 구조를 해석하기 위해 셀레노메티오닌 (SeMet) 표지된 VapBC 복합체에 대한 단일 파장 변칙적 회절 (SAD) 데이터를 정제하여 [Protein Data Bank (PDB) ID: 7BY2] 위상 문제를 해결하는데 사용하였다. 그런 다음 SeMet 표지된 VapBC 복합체의 구조를 검색 모델로서 이용하는 분자 대체를 통해 네이티브 데이터를 정제하였다 (PDB ID: 7BY3).
native data로부터 폐렴간균 VapBC의 구조적 계산 결과, VapBC 복합체의 전체적인 형태를 얻었다. VapB 항독소는 DNA 결합 도메인을 포함하는 N-말단 부분과 VapC 독소의 활성 부위를 차단하는 독소 결합 영역을 포함하는 C-말단 부분으로 나뉜다. 흥미롭게도, SAD 데이터에서 VapBC의 위상 구조는 VapB의 C-말단이 분해된 불완전한 복합체 구조를 보여주었고, 따라서 VapC의 활성 부위는 VapB에 의해 억제되지 않았다.
상기 결정 구조에서, 결정 패킹으로부터 비롯된 두 가지 타입의 분자간 인터페이스를 확인하였다. 첫번째는 독소 다이머화-유도 헤테로테트라머(dimerization-driven heterotetramer)이다(도 2a). 이 경우, 인접한 독소 단량체에서 α-나선 사이의 상호작용이 주요 결합력이다. 다른 하나는 항독소의 DNA 결합 도메인에 의해 매개되는 항독소 다이머화-유도 헤테로테트라머이다(도 2b).
VapBC 헤테로다이머의 개략도는 헤테로다이머적 아키텍처를 구성하는 2차 구조적 요소의 공간 배열을 이해하는데 도움이 된다(도 2c). 네이티브 구조에서 VapB N-말단의 첫 번째 β-가닥은 전자 밀도가 낮기 때문에 맵에서 관찰되지 않았다. PSIPRED의 예측에 따르면, VapB는 N-말단에서 β1-α1-α2 순서로 RHH DNA 결합 도메인을 가질 것으로 예상된다(도 2d).
5. VapC 및 VapC 돌연변이체에 대한 시험관 내 ( In Vitro ) RNase 분석
VapC 및 VapC 돌연변이체의 RNase 활성은 RNase Alert Kit (Integrated DNA Technologies, Inc.)를 사용하여 확인되었다. 이 분석에서, 각 웰은 한 쪽 끝에 형광단이 있고 다른 쪽 끝에 소광제(quencher) 그룹이 포함된 50 pm의 합성 RNA를 포함한다. 준비된 RNA가 RNase에 의해 접촉되면 소광제가 분리된다. 그 다음, 1시간 반응 기간 동안 생성된 형광 (RFU)은 SPECTRAmax GEMINI XS 분광기 (Molecular Devices)를 사용하여 여기 및 방출 파장으로서 각각 490 및 520 nm에서 검출되었다. 이 분석을 위해서, 정제된 VapC 및 VapC 돌연변이체를 10 mM EDTA로 처리하여 금속 이온을 제거하고 10 mM Mg2 +를 포함하는 정제 버퍼로 교환하였다. 각 실험에서 VapC 및 VapC 돌연변이체의 농도는 모두 10 μM이었다. 오염을 방지하기 위해 40 유닛의 RiboLock (Thermo scientific)을 각 웰에 추가하였다. RiboLock은 원핵 RNase I 및 H를 억제하지 않는다. VapC는 구조상 RNase H와 유사하므로 RiboLock에 의해 영향을 받지 않는다. RNA의 최종 농도는 5 pM이었고 버퍼 구성 요소는 20 mM HEPES, pH 7.5, 및 400 mM NaCl이었다.
6. 폐렴간균 VapBC 복합체와 그의 동족체의 비교를 통한 구조 분석
폐렴간균 VapBC의 구조적 특성을 확인하기 위해 이의 구조적 동족체와 비교 분석을 수행하고 폐렴간균 VapBC 복합체의 구조를 확인하였다. 최신 정보를 반영하기 위해 2017년 이후 비교적 최근에 보고된 동족체와 비교하였다. 첫째, Clustal Omega 1.2.1 및 ESPript 3.0을 사용하여 VapC 독소의 아미노산 서열 정렬을 수행하였다. 이 정렬에서 결핵균(M. tuberculosis) VapC11 (PDB ID: 6A7V) 및 VapC26 (PDB ID: 5X3T), 카울로박터 크레센투스(C. crescentus) VapC1 (PDB ID : 5K8J), 및 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza) VapC1 (PDB ID : 6NKL)의 1차 서열들을 폐렴간균 VapC의 것과 비교하였다.
도 3은 폐렴간균 VapBC와 그의 동족체의 구조 비교를 나타낸다. 도 3a는 폐렴간균 VapC와 그의 동족체의 서열 정렬을 나타내는 것으로서, 7개의 고도로 보존된 잔기 (적색 및 청색 삼각형 표시)가 나타난다. 첫 번째, 세 번째, 네 번째, 및 여섯 번째 보존 잔기는 음전하를 띠고 산성 잔기, 예컨대 아스파르테이트 및 글루타메이트이며, 이는 독소의 활성 부위를 구성한다. 나머지 3개의 잔기 중에서 두 번째 트레오닌과 일곱 번째 페닐알라닌의 위치는 활성 부위의 위치와 밀접한 관련이 있으며, 이러한 잔기와 활성 부위 잔기 사이의 수소 결합 및 소수성 상호작용은 활성 부위의 구축 및 구조적 보전성(integrity)의 기반이 되고 그에 영향을 준다 (도 3b).
4개의 동족체와의 낮은 서열 유사성 (평균 13.7%)에도 불구하고 폐렴간균 VapC는 다른 VapC 단백질과 구조적 유사성을 공유한다. VapC 독소는 7개의 α-나선으로 구성된 5개의 평행한 β-가닥으로 구성된 표준 α/β/α 샌드위치 폴드를 채택한다. 또한 VapC 독소는 리보뉴클레아제 활성에 필수적인 PIN 도메인을 특징으로 한다. PIN 도메인 단백질의 보존된 산성 잔기는 2가 금속과 배위를 이루고 산-염기 반응을 기반으로 촉매 활성을 유발한다.
4개의 동족체는 폐렴간균 VapBC와도 비교되어 VapB 구조와 VapB 및 VapC 결합 패턴의 차이를 확인하였다 (도 3c). 비교 결과, VapC 구조는 유사한 폴딩을 가졌으나, VapC 독소와 그의 VapB 및 VapB DNA 결합 도메인의 결합 패턴은 상당히 달랐다. VapB의 C-말단 독소 결합 영역은 본질적으로 매우 유연해서, 구조적 폴딩 및 보전성(integrity)은 독소에 결합한 후에만 달성된다. 위와 같은 이유 때문에, 이러한 VapB 항독소와 VapC 독소 사이의 각 결합 영역에서 각 VapB의 α-나선 내용물과 루프 내용물은 큰 차이를 갖는 것으로 보인다. 또한 VapB에는 RHH 및 AbrB 타입 도메인을 포함하는 2개의 다른 DNA 결합 도메인이 있다. 흥미롭게도 VapB의 DNA 결합 도메인은 도메인 타입뿐만 아니라 동일한 도메인 타입 내에서도 다르며, 도메인의 방향은 힌지 영역의 곡선에 따라 상당히 다르다. 이것은 VapB 단백질의 구조적 가변성이 전사 조절 메커니즘의 다양성을 유발하고 자신의 프로모터 영역 인식의 특이성을 추가적으로 설명한다는 것을 강조한다.
7. VapC의 RNase 활성 및 VapB의 억제 매커니즘 확인
SAD 데이터로부터 얻은 구조는 VapB의 C-말단이 자연적으로 분해되기 때문에 활성 부위가 노출된 개방형이다 (도 4a). 반면에 네이티브 결정으로부터 얻은 네이티브 구조는 VapB의 독소 결합 영역이 완전히 보존된 활성 부위를 갖는 폐쇄형을 나타낸다 (도 4a). VapC의 타고난 특성에 따라, RNase 활성은 Mg2 +와 같은 2가 금속이 존재할 때만 나타난다.
폐렴간균 VapC는 단백질 용액에 Mg2+를 첨가한 경우에만 RNase 활성을 나타냈다. 활성 부위에서 VapB 간섭이 없는 개방형에서는 Mg2+가 VapC의 보존된 활성 부위 잔기 (D9, E43 및 D90)의 중간에 위치한다. 그러나 폐쇄형에서는 VapB가 독소의 활성 부위를 덮는다. VapB의 R79는 원래 Mg2+ 부위를 정확히 차단하고 Mg2+를 VapC의 잔기 D9, D90 및 D111의 중심으로 옮겨 활성 부위가 개방 상태에서 폐쇄 상태로 전환되도록 한다 (도 4b). 활성 부위의 이러한 억제 메커니즘은 새로운 TA 시스템 메커니즘이다. 활성 부위의 이러한 억제 메커니즘은 두 가지 상태의 결정 구조를 통해 처음으로 관찰된다.
이러한 결과의 중요성을 확대하기 위해, VapC의 활성 부위를 포함하는 각 잔기를 돌연변이시키고, 각 VapC 돌연변이체의 RNase 활성을 측정하였다 (도 4c). 1시간 동안의 동역학을 나타내며 VapC에 대한 비례 도표를 보여주는 그래프에서 활성에 가장 많이 기여한 잔기는 E43이었고 가장 적게 기여한 잔기는 D111이었다. 결론적으로, VapB의 R79가 Mg2+의 치환을 유발하기 때문에 VapC 활성 부위 억제는 RNase 활성에 대한 E43의 기여를 완전히 제거함으로써 달성된다. 그러나 돌연변이 실험에 따르면 VapC의 E43이 알라닌으로 돌연변이될 때 VapC는 여전히 RNase 활성의 약 40%를 갖는다. 이것은 VapC의 RNase 활성이 활성 부위를 구성하는 각 잔기의 기여뿐만 아니라 VapB에 의해 대체될 수 있는 Mg2 +의 위치에 의존함을 시사한다.
실시예 1. VapBC 결합 인터페이스 모방 펩타이드 설계
TA 복합체의 형성이 인공적으로 억제되면 TA 복합체에서 자유롭게 방출된 독소가 성장을 억제하거나 결국 박테리아의 죽음을 초래할 수 있다. 따라서 폐렴간균 VapBC 복합체를 파괴할 수 있는 펩타이드를 설계하기 위해, VapB 및 VapC를 단백질, 인터페이스, 구조 및 어셈블리 (PISA)의 분석 결과 및 단백질 상호 작용 계산기 (PIC) 서버를 기반으로 하여 분석하였다. 결과는 VapB의 α3 나선 (도 5a)과 VapC의 α1 나선 (도 5b)이 VapB와 VapC 간의 다이머화(dimerization) 상호 작용에서 가장 중요하다는 것을 보여주었다.
따라서, VapB의 α3 나선과 VapC의 α1 나선의 순서를 기반으로 몇 가지 펩타이드를 설계하였다(표 4).
Name Residues (N- to C-terminus) Mimicked
protein		 Mimicked
region		 서열번호
VapB71 -78 GMEYQRQL (71-78) VapB α3 1
VapB71 - 78,Y74A GMEAQRQL (71-78) VapB α3 2
VapB71 - 78,Q75A GMEYARQL (71-78) VapB α3 3
VapB71 - 78,Y74A,Q75A GMEAARQL (71-78) VapB α3 4
VapB71 -79 GMEYQRQLR (71-79) VapB α3 5
VapB71 -80 GMEYQRQLRK (71-80) VapB α3 6
VapC10 -17 TNILIDLF (10-17) VapC α1 7
VapC9 -17 DTNILIDLF (9-17) VapC α1 8
VapC10 -18 TNILIDLFS (10-18) VapC α1 9
VapC9 -18 DTNILIDLFS (9-18) VapC α1 10
상기 펩타이드는 구조 분석을 통해 설계되었으며 ANYGEN (http://www.anygen.com)에서 합성하였다.
실시예 2. VapBC 결합 인터페이스 모방 펩타이드에 의한 VapBC 복합체 파괴 분석
본 실시예에서는 실시예 1에서 합성된 펩타이드 (100 μM)를 VapBC 복합체 (10 μM)에 첨가하고 활성화된 VapC 독소의 RFU를 측정하였다. 그 외 실험 프로토콜은 VapC 및 VapC 돌연변이체의 RNase 활성 테스트(실험방법 5)와 동일하였다. VapBC 복합체에 본 발명의 펩타이드를 첨가하면 VapBC 복합체의 파괴에 의해 방출되는 유리 VapC에 의해 생성된 RNase 활성을 측정하여 펩타이드의 억제 효능을 추정할 수 있다.
2.1 VapB α3 나선 기반의 모방 펩타이드의 VapBC 복합체 파괴 효능 분석
VapBC 복합체 파괴 분석에서, VapB의 α3 나선은 G71-K80 (GMEYQRQLRK, 서열번호 6)으로 구성되지만, VapB71 -78 펩타이드는 G71-L78 (GMEYQRQL, 서열번호 1)로 구성되고, 이는 VapC의 3개의 활성 부위 잔기 (D9, E43, 및 D90)와 상호작용 하는 VapB의 R79를 제외시킨다. VapB의 Y74 및 Q75는 각각 VapC의 E43 및 D9와 상호작용 한다.
그 결과는 도 5c에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1 내지 6의 VapB 모방 펩타이드는 모두 VapBC 복합체를 파괴하여 유리 VapC 독소를 증가시키는 효과를 나타내었다. 그 중 특히 Y74 및 Q75가 개별적으로 알라닌으로 변이되었을 때, VapB71 -78, Y74A 펩타이드 (서열번호 2)는 설계된 모든 펩타이드 중에서 가장 높은 효능을 나타냈다. Y74 및 Q75가 모두 알라닌으로 돌연변이된 VapB71-78, Y74A, Q75A 펩타이드(서열번호 4)는 개별 알라닌 돌연변이 VapB 펩타이드보다 낮은 효능을 나타냈는데, 이는 다수의 알라닌 치환으로 인해 α 나선의 구조적 보전성에 결함이 있기 때문일 수 있다.
2.2 VapC α1 나선 기반의 모방 펩타이드 효능 분석
VapBC 복합체 구조에서 VapC의 α1 나선은 T10-F17 (TNILIDLF, 서열번호 7)로 구성된다. D9 및 S18은 VapC의 α1 나선에 포함되어 있지 않지만, VapB와 상호 작용하는 D9 및 S18을 포함하여 서열번호 8 내지 10을 설계하였다.
그 결과는 도 5d에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1 내지 7의 VapC 모방 펩타이드는 모두 VapBC 복합체를 파괴하여 유리 VapC 독소를 증가시키는 효과를 나타내었다.
실시예 3. 유리 VapC의 활성능에 미치는 영향 분석
본 발명의 펩타이드는 VapB와 VapC의 결합 인터페이스를 모방하여 만들어지기 때문에 산술적으로 VapB와 VapC의 결합에 참여하는 잔기가 펩타이드에 더 많이 존재할수록 복합체 파괴 능력이 커져야 한다. 그러나, 펩타이드가 VapC의 활성 부위인 VapC의 핵산 결합 부위와 상호 작용하는 잔기를 포함하면 파괴 능력이 억제된다. 이에 본 실시예에서는 본 발명의 펩타이드가 유리 VapC의 활성능에 미치는 영향을 분석하였다.
유리 VapC를 VapB-모방 펩타이드로 처리했을 때, 측정된 전체 RNase 활성이 약간 증가했지만 패턴은 실시예 2.1에 따른 결과와 유사하였다(도 6). 특히 다중 알라닌 치환(Y74A 및 Q75A 모두)으로 인한 구조적 보전성의 결함은 VapC의 활성에 거의 영향을 미치지 않았다.
이로부터 서열번호 1 내지 6의 VapB 모방 펩타이드는 폐렴간균을 제어할 수 있는 효과를 나타냄이 확인되었다.
실시예 4. 구조 기반 약리단 생성 및 분자 도킹 연구
구조 기반 약물 설계는 구조 기반 약리단 (structure-based pharmacophore, SBP) 모델 및 분자 도킹 시뮬레이션으로 수행되어 주요 히트 화합물을 가상으로 스크리닝하였다. 단백질-리간드 복합체 구조에서 화학적 특징을 추출하는 SBP 모델링을 수행하여 VapBC 복합체 (PDB ID: 7BY3)의 결정 구조에 대한 SBP 모델을 생성하였다.
수용체-리간드 약리단 생성은 기본 매개변수를 갖는 Discovery Studio (DS) 2018 소프트웨어 (DASSAULT SYSTEMS, 2017)의 약리단 생성 도구에서 사용되었다. 4개의 중요한 화학적 특징 [2개의 수소 결합 (HB) 공여자, 1개의 HB 수용체, 및 1개의 소수성 상호작용]을 갖는 SBP 모델은 VapB α2-α3 루프 영역 (VapB의 W64, C67, 및 Y74)만을 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 대체 리간드로서 고려하여 설계되었다. 생성된 SBP 모델을 사용하여 총 ~610,000개의 화합물을 검색하고 필터링을 통해 ~16,000개의 화합물을 선택하였다.
그 후, 총 ~610,000개의 화합물을 나타내는 7155개의 다양한 세트 화합물 및 생성된 화합물로 분자 도킹 시뮬레이션을 수행하였다. VapC의 표적 결합 부위는 VapB의 공결정(cocrystal) 구조, 특히 반경이 14Å인 α2-α3 루프 영역에서 설정되었다. VapC의 3D 구조는 DS 2018에서 구현된 Prepare Protein tool에 의해 개선되고 양성자화 되었다. 도킹 시뮬레이션을 수행하기 위해서 CDOCKER이 DS 2018에서 사용되었다. CDOCKER는 강력한 리간드 유연성 알고리즘과 고온에서 임의 회전 및 그리드 기반 시뮬레이션 어닐링을 수행하는 개선 프로세스를 사용하는 CHARMm 기반 도킹 도구이다. 결과 히트 화합물이 점수에 의해 순위가 매겨졌으며, 이는 적합 값(fit value)과 음의 CDOCKER 상호작용 에너지 (반 데르 발스 및 정전기적 상호작용 포함)를 모두 고려한 것이다.
실시예 5. 인터페이스 포켓을 폐쇄하는 소분자 화합물의 VapBC 복합체 파괴 분석 및 화합물 선정
VapBC 복합체를 파괴하고 VapC 독소를 활성화하기 위해서, 처음에는 400개의 소분자가 약리단 모델 및 분자 도킹을 사용하는 가상 스크리닝에 의해 선정되었다. 이러한 가상 스크리닝에서 VapBC 복합체의 인터페이스 포켓을 폐쇄할 것으로 예상되는 소분자를 탐색하고 초기 후보를 선택하기 위한 기준으로 가상 적합성 점수(fitness score) 순서대로 상기 소분자를 나열하였다.
이들 화합물의 대부분은 평균 ~5.1 HB 수용체, ~2.2 HB 공여자, 및 6.8 회전가능 결합을 갖고, 300-500 Da의 MW 범위로 분포되어 있다. 상기 화합물 대부분에 대한 예측 A log P 값은 0.5-5의 범위이며, 평균값은 2.8이다. 각 화합물은 VapC의 활성 부위 공동(cavity)이 아니라 VapB의 α2-α3 루프를 통해 틈새에 결합하여 인터페이스 포켓을 연결함으로써 VapBC 복합체를 파괴하도록 설계되었다 (도 7a).
VapC를 활성화하는 펩타이드 설계에서와 유사한 분석 방법을 사용하여 VapBC 복합체의 파괴에 의해 방출된 유리 VapC에 의한 RNase 활성의 양에 따라 화합물의 억제 효과를 순위화하였다. 즉, VapBC 복합체 (10 μM)에 소분자를 첨가하고 VapC를 활성화하는 소분자의 효능을 테스트하였다. 다른 실험 프로토콜은 펩타이드에 의한 복합체 파괴 분석 (실시예 2 및 3)에 대해 설명된 것과 동일하였다.
3회 테스트를 통해 억제 효능 순위에 따라 총 400개의 화합물이 25개로 좁혀졌고, 이 25개의 소분자는 화합물 1 및 화합물 2로 명명된 가장 높은 효과를 갖는 2개의 화합물에 대해 추가 3회 테스트를 통해 더욱 좁혀졌다 (도 7b). 이 두 가지 최종 화합물은 VapC의 활성 부위가 아닌 VapC의 다른 영역과 VapB 사이의 결합 인터페이스에 결합하도록 설계되었기 때문에 유리 VapC에 첨가했을 때에도 VapC의 RNase 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 8).
이를 통해 최종적으로 선택된 두 화합물은 다음과 같다.
<화합물 1>
Figure pat00004
<화합물 2>
Figure pat00005
.
실시예 6. 화합물 1 및 2의 합성
<일반적인 사항>
실리카겔 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔 60, 230-400 mesh, Merck에서 수행되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 JEOL 400MHz에서 기록되었다. 화학적 이동은 Me4Si를 레퍼런스 표준으로 사용하여 ppm 단위로 보고된다. 질량 스펙트럼은 6460 triple quad LC-MS 기기에서 기록되었다.
합성식 1. 화합물 1 (N- 카르바모일 -3-(4-(4- 히드록시벤조일 )피페리딘-1-일)프로판아미드)의 합성
Figure pat00006
시약 및 조건: (a) Ac2O, reflux, 7h, 85%; (b) (i)SOCl2, 1,2-dichloroethane 65 ℃, 1h; (ii) anisole, AlCl3, reflux, 10h, 44%; (c) 1M HCl, reflux, 13h, 96%; (d) 48% HBr, AcOH, reflux, 48h, 73%; (e) methyl acrylate, CH2Cl2, rt, overnight, 36%; (f) urea, Ac2O, rt, 18 h, 90%.
1-아세틸-4-피페리딘 카르복실산:
무수 아세트산 (Ac2O) (150mL, 1.36 mol, 4.53 eq) 중의 4-피페리딘 카르복실산 (38.75g, 0.3mol, 1eq) 용액을 7시간 동안 reflux시키고 주위(ambient) 온도에서 밤새 교반하였다. 이어서 혼합물을 rotary evaporator를 통해 농축하고, 디에틸 에테르 (Et2O)에서 분쇄하고(triturated), 디이소프로필 에테르 (DIPE) 및 메탄올 (MeOH)로부터 재결정화하였다(recrystalized). 유리 필터로 여과하여 생성물 (85%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.89 (s, 1H), 4.48 - 4.32 (m, 1H), 3.80 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 3.26 - 3.08 (m, 1H), 2.95 - 2.78 (m, 1H), 2.64 - 2.47 (m, 1H), 2.11 (s, 3H), 1.98 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 1.82 - 1.57 (m, 2H);
13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 178.10, 169.47, 60.71, 45.67, 40.97, 40.55, 28.34, 27.77, 21.27.
N-아세틸-4-(4- 메톡시벤조일 )피페리딘:
1,2-디클로로에탄 (10mL) 중의 SOCl2 (2.97g, 25mmol, 1 eq)의 용액을 1-아세틸-4-피페리딘 카르복실산 (4.28g, 25mmol, 1 eq)의 용액에 적가하고 40 ℃로 예열하였다. 이 혼합물의 온도를 65 ℃로 증가시키고 1시간 동안 교반하고 주위 온도로 공냉(air-cool)시켰다. 생성된 산 클로라이드를 아니솔 (2.70 g, 25 mmol, 1 eq)과 반응시켰다. 무수 알루미늄 트리클로라이드 (AlCl3) (6.66 g, 50 mmol, 2 eq)를 서서히 첨가하고 반응 혼합물을 10시간 동안 reflux시키고 주위 온도에서 밤새 교반한 후 혼합물을 얼음물에 부었다. 디클로로메탄 (DCM) 및 염수로 추출한 다음 MgSO4로 건조하고 rotary evaporaton시켜 생성물 (44%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.94 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.48 (m, 4H), 3.05 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 1.98 - 1.58 (m, 4H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 200.16, 168.93, 163.62, 130.57, 128.59, 113.96, 55.53, 45.86, 42.84, 41.09, 28.76, 28.55, 21.51.
4-(4- 메톡시벤조일 ) 피페리디늄 클로라이드:
N-아세틸-4-(4-메톡시벤조일)피페리딘 (2.09 g, 8 mmol, 1 eq)을 1M aq. HCl (90 mmol, 90 eq)에 용해시키고 13시간 동안 reflux시키고 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 에탄올 (EtOH)로 rotary evaporation에 의해 농축하여 원하는 아민을 HCl 염 형태 (96%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 8.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.79 (t, J = 10.9 Hz, 1H), 3.49 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 3.23 (t, J = 12.8 Hz, 2H), 2.11 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.93 (q, J = 12.8 Hz, 2H).
4-(4-히드록시) 벤조일피페리딘:
48% HBr (aq) (16mL) 및 아세트산 (16mL) 중의 4-(4-메톡시)벤조일피페리딘 하이드로클로라이드 (3.0g, 11.7mmol) 용액을 48시간 동안 환류에서 가열하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발 건조시켜 포화 NaHCO3 (aq.)에 현탁된 회백색 고체를 얻었다. 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 건조하여 생성물 (73%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.68 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.00 (m, 1H), 1.69-1.79 (m, 4H), 1.77-1.52 (m, 4H).
Mass spectrum : Found 206 [M+H]+, C12H15NO2 requires 205
3-(4-(4- 히드록시벤조일 )피페리딘-1-일)프로판산:
DCM (15ml) 중 4-(4-히드록시)벤조일피페리딘 (2.0g, 9.7mmol), 메틸아크릴레이트 (1.0g, 19.4mmol, 1.2 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 감압 하에서 증발시킨 후, 상응하는 메틸 에스테르를 얻고 5% NaOH 용액으로 30분 동안 40 ℃에서 가열하여 가수분해 하였다. 반응의 마지막에 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 HCl로 중화시켰다. 생성된 침전물을 여과, 건조하고 추가 정제없이 사용하였다 (36%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 12.27 (br, 1H), 9.68 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.47-2.24 (m, 6H), 1.77-1.52 (m, 4H).
Mass spectrum : Found 278 [M+H]+, C15H19NO4 requires 277
N- 카르바모일 -3-(4-(4- 히드록시벤조일 )피페리딘-1-일) 프로판아미드:
3-(4-(4-히드록시벤조일)피페리딘-1-일)프로판산 (2.0g, 7.2mmol)을 아세트산 무수물 5mL 중 우레아 (0.4g, 7.9mmol, 1.1 eq)로 처리하였다. 반응 혼합물을 90 ℃로 30분 동안 가열하였다. 5분 후 백색 침전물이 형성되었다. 그 다음 8 mL의 물을 첨가하고 추가로 5분 동안 계속 교반하였다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후, 침전물을 여과하고 밤새 고진공에서 건조하여 생성물 (90%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.38 (s, 1H), 9.68 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.35 (s, 2H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.47-2.24 (m, 6H), 1.77-1.52 (m, 4H).
Mass spectrum : Found 320 [M+H]+, C16H21N3O4 requires 319
합성식 2. 화합물 2 (1-((2-에틸-6- 메틸 -3-옥소-3,4- 디히드로 -2H- 벤 조[b][1,4]옥사진-7-일)술포닐)-N-(4-플루오로페닐)피페리딘-3-카르복스아미드)의 합성
Figure pat00007
시약 및 조건: (a) Ethyl 2-bromobutyrate, DBU, NMP, microwave, 180 ℃, 5 min, 76%; (b) HSO3Cl, 0 ℃, 1 h, 66%; (c) ethyl piperidine-3-carboxylate, TEA, MC, rt, 2 h, 94%; (d) LiOH, THF, rt, ON, 92%; (e) BOP Reagent, 4-fluoroanilne, DMIPA, THF, rt, 18 h, 20%.
2-에틸-6- 메틸 -2H- 벤조[b][1,4]옥사진 -3(4H)-온:
증류 NMP (2 mL) 중의 에틸 2-브로모 뷰티레이트 (97.5 mg, 0.50 mmol), 2-아미노-4-메틸페놀 (73.9 mg, 0.60 mmol) 및 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운덱-7-엔 (DBU, 83.7 mg, 0.55 mmol)의 혼합물을 10 mL 공정 바이알에 채우고 격막이 있는 캡으로 밀봉하였다. 로드된 바이알을 마이크로파 반응기의 캐비티에 넣고 고정 모드에서 180 ℃에서 3분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL)로 희석하고 염수 (3 x 5 mL)로 세척하였다. 조합된 유기층을 MgSO4로 건조시키고 감압 하에 응축시켰다. 잔류물을 용리액(eluent)으로서 EtOAc-헥산을 사용하는 실리카겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물 (76%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.87 (br s, 1H), 7.00-6.85 (m, 3H), 4.68 (q, J=6.8 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.59 (m, 2H), 0.89 (m, 3H).
Mass spectrum : Found 192 [M+H]+, C11H13NO2 requires 191
2-에틸-6- 메틸 -3-옥소-3,4- 디히드로 -2H- 벤조[b][1,4]옥사진 -7-술포닐 클로라이드:
2-에틸-6-메틸-2H-벤조[b][1,4]옥사진-3(4H)-온 (2.5g, 13.4mmol)을 20분에 걸쳐 여러 배치로 설포로클로라이드산 (10mL)에 0 ℃에서 첨가하고, 다이 반응 혼합물을 1시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 조심스럽게 얼음 (100g)에 붓고 생성된 혼합물을 디클로로메탄 (100mL)으로 추출하였다. 유기층을 건조 (황산나트륨)하고 농축하여 생성물 (66%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.87 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 4.68 (q, J=6.8 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.59 (m, 2H), 0.89 (m, 3H).
Mass spectrum : Found 290 [M+H]+, C11H12ClNO4S requires 289
에틸 1-((2-에틸-6- 메틸 -3-옥소-3,4- 디히드로 -2H- 벤조[b][1,4]옥사진 -7-일)술포닐)피페리딘-3-카르복실레이트:
메틸렌 클로라이드 (10.0 mL) 중의 2-에틸-6-메틸-3-옥소-3,4-디히드로-2H-벤조[b][1,4]옥사진-7-술포닐 클로라이드 (1.83g, 6.36 mmol), 에틸 피페리딘-3-카복실레이트 (1.00 g, 6.36 mmol) 및 트리에틸아민 (2.66 mL, 19.1 mmol)을 r.t.에서 2시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 물로 급냉(quenched)시킨 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 1N HCl 용액, 물, 포화 소듐 바이카보네이트 용액, 물 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 그 후 추출물을 황산나트륨 (무수)으로 건조시켰다. 여과 후, 여액을 농축하여 생성물 (94%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.87 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 4.70 (q, J=6.8 Hz, 1H), 4.21 (m, 2H), 3.50 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.09-1.98 (m, 4H), 1.53 (m, 2H), 1.21 (m, 3H), 0.89 (m, 3H).
Mass spectrum : Found 411 [M+H]+, C19H26N2O6S requires 410
1-((2-에틸-6- 메틸 -3-옥소-3,4- 디히드로 -2H- 벤조[b][1,4]옥사진 -7-일)술포닐)피페리딘-3-카르복실산:
1M 수산화 리튬 수용액 (3.5 mL)을 테트라 하이드로푸란 (10 mL) 중의 에틸 1-((2-에틸-6-메틸-3-옥소-3,4-디하이드로-2H-벤조[b][1,4]옥사진-7-일)설포닐)피페리딘-3-카복실레이트 (0.56 g, 1.46 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 물로 희석하고 용액을 pH 1로 산성화시켰다. 용액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 결합된 유기층을 80% 포화 염수로 세척, 건조 (황산 마그네슘), 여과 및 증발시켜 생성물 (92%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.63 (br, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 4.70 (q, J=6.8 Hz, 1H), 3.50 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.09-1.98 (m, 4H), 1.53 (m, 2H), 0.89 (m, 3H).
Mass spectrum : Found 383 [M+H]+, C17H22N2O6S requires 382
1-((2-에틸-6- 메틸 -3-옥소-3,4- 디히드로 -2H- 벤조[b][1,4]옥사진 -7-일)술포닐)-N-(4-플루오로페닐)피페리딘-3-카르복스아미드:
THF (1 mL) 중의 1-((2-에틸-6-메틸-3-옥소-3,4-디히드로-2H-벤조[b][1,4]옥사진-7-일)술포닐)피페리딘-3-카르복실산 (0.15g, 0.39mmol), 4-플루오로아닐린 (0.065g 0.59mmol, 1.5eq), bop 시약 (259mg, 0.59 mmol, 1.5 eq) 및 디에틸이소프로필아민 (0.14 mL, 0.78 mmol, 2 eq)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 5% NaHCO3 (3 mL)에 붓고 이후 2시간 동안 교반하였다. 수층을 따라 내고 유성 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물 (20%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.05 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.14 (m, 2H), 4.70 (q, J=6.8 Hz, 1H), 3.50 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.09-1.98 (m, 4H), 1.53 (m, 2H), 0.89 (m, 3H).
Mass spectrum : Found 476 [M+H]+, C23H26FN3O5S requires 475
실시예 7. 화합물 1 및 화합물 2의 효능 분석
상기 두 화합물은 앞서 사용된 펩타이드 농도 (100 μM, 실시예 2)의 100분의 1인 1μM에서 더 높은 효능을 나타냈다. 따라서 화합물 1 및 화합물 2는 VapBC 복합체를 파괴하는데 매우 효율적이다. 화합물 1 및 2는 각각 0.42 및 0.40 μM의 IC50 값을 나타냈다 (도 9).
또한, 화합물 1 및 화합물 2의 분자 도킹 시뮬레이션 결과가 각각 도 10a 및 도 10b에 제공된다. 화합물 1의 카르보닐기는 강한 HB를 형성함으로써 K50의 측쇄 상의 양전하를 띠는 아미노 기와 상호작용 하였다. 잔기 E43, S18, 및 A48은 또한 수소와 탄소-수소 결합 상호작용을 형성하였다. 잔기 Y51, I14 및 V46은 π-알킬 및 알킬 상호작용을 형성하였다. 화합물 1의 HB와 유사하게 화합물 2의 설포닐 기도 또한 K50의 측쇄에서 양으로 하전된 아미노 기와 강한 HB를 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 잔기 T10, N11, G47, 및 A48은 탄소-수소 결합과 아미드-π적층 상호작용을 형성하였다. 잔기 I14 및 V46은 각각 π-알킬 및 알킬 상호작용의 형성에 관여하였다. F17 및 Y51은 화합물의 플로오로벤젠 고리와 π-π 적층 상호작용을 형성하였다.
이로부터, 화합물 1 및 2는 세균 TA 시스템을 제어하는 소분자로서, 약물 내성 폐렴간균을 제어할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 결합 친화도에 기반한 경쟁 억제제 및 자동 조절의 가능성 분석
본 발명을 통해 선택한 펩타이드와 소분자를 추가로 검증하기 위해 VapC와 VapB, 펩타이드, 및 소분자의 결합 친화도를 등온 적정 열량 측정법 (ITC)으로 측정하였다 (도 11).
ITC는 MicroCal200 (GE Healthcare)을 사용하여 수행되었다. 단백질과 DNA의 농도는 각각 280 nm와 260 nm에서 NanoDrop (Thermo)을 사용하여 결정되었다. 펩타이드 및 소분자의 저장 용액은 적절한 농도로 준비되었다. 적정은 25℃에서 수행되었다. 데이터는 배경을 빼서 계산하고 MicroCal200을 사용하여 제공된 원본 기반 소프트웨어를 사용하여 단일 부위 결합 모델에 피팅시켰다. 그 결과를 도 11 및 표 5에 나타내었다.
Figure pat00008
VapB는 VapC와 가장 강하게 결합되었으며 (K d = 3 nM) 펩타이드 및 소분자는 나노 몰 범위로 VapC와의 친화도를 나타냈다 (펩타이드의 경우 K d = 110-170 nM, 소분자의 경우 K d = 22-35 nM) (도 11). 이와 같은 친화도의 확인은 펩타이드가 VapB 결합 영역에 대한 경쟁 억제제로서 성공적으로 합리적 설계되었으며, 소분자의 제안된 도킹 모델을 신뢰할 수 있음을 확인시켜준다.
VapC에 대한 펩타이드 VapB71 -78, VapB71 - 18,Y74A, 및 VapB71 - 78,Q75A의 친화도는 각각 110 nM, 170 nM, 및 150 nM이었다. Y74 및 Q75의 돌연변이에 의해 VapC와의 상호작용 일부가 사라지고 VapC와의 친화도가 감소하였다. 그러나, VapB의 Y74 및 Q75는 VapC의 활성 부위와 상호작용한다. 따라서 VapB71 - 78,Y74A 및 VapB71 - 78,Q75A는 VapC와의 결합 친화도가 감소했음에도 불구하고, VapC 활성 억제의 감소로 인해 VapB71-78보다 높은 활성을 나타낸다.
타입 II TA 시스템에서 항독소와 독소 단백질은 전사 자동 조절에 중요한 역할을 한다. 전사 조절의 분자 메커니즘을 조사하기 위해 프로모터 영역에서 28-bp DNA 서열을 VapB와 VapBC로 적정하였다. DNA에 대한 VapBC의 친화력 (K d = 1.26 μM)은 DNA에 대한 VapB의 친화력 (K d = 5.38 μM)보다 5배 더 높았다. 이는 VapB가 자체 프로모터에 직접 결합하여 자동 조절에서 주요 리프레서 역할을 하는 반면에, VapC는 VapB와 복합체를 형성하여 VapB와 오퍼레이터 부위 사이의 상호작용을 강화하는 코어프레서로서 역할을 함을 나타낸다.
결론
본 발명의 VapBC 복합체의 구조는 폐렴간균에서 처음으로 보고되는 TA 복합체 구조이다. Mg2 +를 대체하는 VapB의 R79에 의한 VapC 독소 억제 매커니즘은 활성 부위의 개방 및 폐쇄 형태의 두 가지 결정 구조를 통해 밝혀졌다. 이는 박테리아 TA 시스템 분야에서 처음으로 확인된 신규한 발명이다. VapBC 결합 인터페이스를 모방한 펩타이드의 합리적인 설계를 통해 VapBC 복합체를 파괴할 수 있고 독소의 인공적 활성화를 항균 전략으로서 폐렴간균에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 심지어 저농도에서 VapBC 복합체의 형성을 효과적으로 억제하는 소분자 화합물을 제공함으로써, 억제제를 이용한 변형을 통한 약물 내성 폐렴간균의 제어를 가능하게 할 수 있다.
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Claims (12)

  1. 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)의 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 VapB 및 VapC의 결합을 억제하는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 항독소 VapB의 α3 나선과 독소 VapC의 α1 나선의 결합을 억제하는 것인, 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 폐렴간균에 대해 항균 활성을 나타내는 것인, 펩타이드.
  5. 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)의 독소-항독소 복합체 VapBC 내의 VapB 및 VapC의 결합을 억제하는 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물 1 또는 2인, 화합물:
    <화합물 1>
    Figure pat00009

    <화합물 2>
    Figure pat00010
    .
  7. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 폐렴간균에 대해 항균 활성을 나타내는 것인, 화합물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 항균 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 폐렴간균에 대해 항균 활성을 나타내는 것인, 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 폐렴의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 항균 의약외품.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 항균 외용제.
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