KR19990087571A

KR19990087571A - 하향 조절 내성 c3 컨버타제

Info

Publication number: KR19990087571A
Application number: KR1019980707010A
Authority: KR
Inventors: 티모씨 찰스 패리스; 리처드 알렉산더 해리슨
Original assignee: 질리안 리틀; 이뮤트란 리미티드
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 1999-12-27
Also published as: AU2225797A; NO984073D0; PL328706A1; AR006150A1; SK121798A3; NZ331595A; US7002001B2; TR199801769T2; HUP9900789A3; US6268485B1; EP0885301A1; JP2000515001A; CN1214733A; IL125862A0; AU726187B2; US20020068059A1; CA2247615A1; CN1227359C; WO1997032981A1; NO984073L

Abstract

천연 보체 경로 단백질을 하향 조절 (down-regulation) 내성 C3 컨버타제를 형성할 수 있도록 변형시켰다. 바람직하게는 변형된 단백질은 변형된 사람 C3 단백질이다. 그러한 단백질을 코딩하는 DNA 서열도 DNA 제작물과 함께 제공되어 있다. 그러한 단백질 및 특이적 결합 부분, 예를 들면 항체를 포함하는 접합체도 기재되어 있으며, 상기 단백질 및(또는) 접합체의 치료 용도도 기재되어 있다.

Description

하향 조절 내성 Ｃ3 컨버타제

본 발명은 하향 조절 (down-regulation)에 내성이 있는 C3 컨버타제를 형성할 수 있는 신규 변형 단백질, 이러한 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 이러한 단백질의 치료제로서의 용도, 특히 보체 경로 (complement pathway) 단백질 또는 특정 위치에서 표적화 보체 공격 (C3b 침착)의 수준을 고갈시키는데 있어서의 용도에 관한 것이다.

보체계 (complement system)는 사람 및 다른 척추동물의 면역 반응에서 기능하며, 식세포작용, 세포용해, 국소 염증 반응을 유도하는 세포의 집중 (recruitment) 등의 작용인자 (effector) 기능에 있어서 중요하다[15]. 이러한 특성은 박테리아 등의 침입성 병원체를 일소하는데 바람직하지만, 숙주 조직 (예를 들면, 후허열 재관류 손상에서[3]) 또는 외부 치료 물질 (예를 들면, 이종이식편의 과민성 거부)에 대해 유도되어 작용하게 될 때는 바람직하지 않다. 이런 바람직하지 못한 특성을 없애기 위해, 본래 보체 활성화를 억제하는 기능을 갖는 보체 조절 단백질의 유도체를 개발하려는 시도가 있어왔다.

보체계는 세포 표면 단백질 (수용체 및 조절자 (regulator)) 및 유동상 (혈장 및 다른 세포외 환경)중의 단백질로 이루어진다. 반응이 일어나는데 있어서 결정적으로 중요한 단계는 C3를 단편 C3b 및 C3a로 단백질 가수분해를 통해 전환시키는 것이다. C3a는 일종의 아나필라톡신으로서, C5a와 마찬가지로 비만 세포를 공격 위치로 공격하여 히스타민의 국소적 분비, 혈관 확장 및 다른 염증성 효과를 불러일으킨다. 초기 C3b는 그의 생성 위치 주변에서 표면에 결합하는 능력이 있다. 그 다음 이 C3b는 세포용해성 보체 성분 (C5-C9)에 의한 공격에 집중한다.

표면에 결합된 C3b 및 이것의 분해 산물은 또한 C3 수용체의 리간드로서 기능하여 예를 들면, 식세포 작용을 매개한다[15]. C3를 C3b로 전환하고 후속 반응을 일으키는 보체 활성화 경로에는 두 가지 상이한 경로가 있다. 고전적 경로 (classical pathway)는 일반적으로 항원과 결합한 항체의 복합체에 의해 유도된 후, C1q, C1r, C1s, C2, C4 단백질을 수반하는 효소 단계를 촉발한다. 제2 경로 (alternative pathway)는 C3 자체를 수반하며 인자 B 및 D를 필요로하는 활성화 루프에 의존한다.

C3에서 C3b (또는 C3i)로 전환되면, 그 산물이 인자 B와 결합하여 C3bB (또는 C3iB)가 생긴다. 이를 복합체는 인자 D에 의해 활성화되어 C3bBb가 생성되며, 이는 C3 컨버타제로서, C3를 C3b로 더 많이 절단할 수 있어서, 결과적으로 더 많은 C3bBb이 생성되고 더 많은 C3 전환이 일어나게 된다. 특정 환경에서는, C3bBb 복합체가 양성 조절자 프로퍼딘 (P)과 결합하여 안정화된다. 그러나, 이런 양성-피드백 루프는 일반적으로 조절 단백질, 주로 인자 H 및 인자 I에 의해 느린 주기로 제한된다.

인자 H (및 구조적으로 연관된 세포 결합 분자)는 (i) C3b로부터 B 및 Bb를 대체하고, (ii) C3b를 iC3b로 절단하는 인자 I에 대한 보조 인자로 작용함으로써, 인자 B가 C3 컨버타제를 더 형성하지 못하도록 재조합을 방해한다. 이 경로가 격렬해지면 ("fired"), 초기 C3b와 결합하여 인자 H 및 I에 의한 그의 조절을 방해하는 많은 박테리아 세포벽 등의 표면이 존재할 때 C3b의 생성이 증폭된다. 초기 C3b는 또한 내인성 세포에 결합할 수도 있다. 따라서 정상적으로 보체에 노출된 내인성 세포 표면은 원래 인자 H와 유사한 방식으로 작용하는 MCP, DAF, CR1 등의 막 결합 조절자에 의해 추가로 보호된다.

정상적인 유동상(狀) 조절이 일어날 수 없어서 자발적인 C3 전환이 궁극적으로 순환계로부터 C3의 전반적인 고갈을 일으키는 몇몇 희귀한 자연발생 상태가 있는데, 그것은 (i) 인자 H 또는 I의 유전적 결함 [13], (ii) C3bBb와 결합하여 해리를 방해하는 항체의 존재 (신장염 인자) [4], (iii) 코브라 독액에 있는 코브라 독액 인자 (CVF)로 불리우는 단백질과의 접촉 (이 단백질은 인자 B와 결합하여 C3b를 포함하지 않는 C3 컨버타제 효소를 형성하며, 인자 H 및 I에 의해서는 영향을 받지 않음)[14] 등이다. 이들은 보체가 특이적으로 활성화되지 않을 때 보체의 하향 조절이 가지는 일반적인 생리학적 중요성을 예시한다.

또한, 특이적으로 활성화되더라도 이것이 불필요한 경우가 있는데, 구체적으로는 숙주의 조직 (예를 들면, 허혈 또는 수술로 손상된 조직) 또는 치료 목적으로 일부러 주입한 외래 물질 (이종이식편, 인공 장기, 투석막 등)에 관해 활성화되는 경우가 그것이다. 이런 보체 활성화는 결과적으로 불필요한 공격과 추가의 손상을 일으키게 되고, 이 경우에는 보체 활성화 및 반응을 차단 또는 억제하는 것이 유익할 것이다.

보체에 의해 매개되는 손상을 방지하기 위한 기존 시도들은 하향 조절 단백질 (CR1, MCP, DAF, 인자 H 및 I)을 사용하여 보체 활성화를 억제하는데 초점을 맞추고 있다. 인자 I, 인자 H 및 막결합 단백질인 CR1, DAF, MCP의 가용성 유도체들과 같은 보체 억제자는 제2 경로의 유동상 증폭 루프를 억제한다. 따라서, 이들 분자, 특히 CR1 (가장 강력한 것으로 추정됨)을 사용하여 생리학적 상황 모델에서 보체 매개 손상을 감소시키려는 시도가 있었다 [10,18].

인자 H는 내인성이며 혈장내에 고농도로 (0.3 - 0.5 mg/ml이 전형적임 [15]) 존재하기 때문에, 억제자의 양을 증가시켜서 유동상 반응을 약화시킨다고 하더라도, 이들의 성능이 약하기 때문에, 정제된 다량의 단백질이 생체내 투여되어야 한다 (예를 들면, 가용성 CR1은 5 mg/Kg(체중)의 과량으로 투여할 수 있음). 또한, 제2 경로는 인자 H의 영향을 이미 차단시킨 표면에 의해 활성화된다. 이는 다른 억제자의 활성을 반드시 동시에 감소시키지는 않는 반면, 동일한 인자들은 이들이 완벽하게 또는 보편적으로 효과적일 수는 없다는 것을 의미한다.

코브라 독액 인자 (CVF)는 안정한 C3 컨버타제를 생성하는 특성이 있으며, 이 안정한 C3 컨버타제는 동물 생체내 및 다른 시험관내 샘플 (예를 들면, 사람의 혈장)에서 보체를 고갈시키기 위해 실험용으로 사용할 수 있다. CVF는 강력하다 (예를 들면, 40 ㎍/kg가 생쥐의 보체 활성을 파괴할 수 있음[16]). 그러나, 사람에게 치료용으로 사용하기에는 적합하지 않은 단점들이 있다.

첫번째로, CVF는 코브라 독액 (공급원를 구하기 힘들고 다루기도 위험함)으로부터 얻어지며, 따라서 독액 신경독으로부터 주의해서 정제해 내야 한다. 또한 공급원을 구하는 것도 매우 어렵다. 이런 문제는 생체 외부 (ex vivo)에서 그 유전자를 클로닝하고 발현시킴으로써는 용이하게 극복할 수 없는데, 왜냐하면 뱀 내에서 일어나는 번역후 변형 (특이적 단백질가수분해 프로세싱)이 시험관내에서 재현하기 어렵거나 또는 불가능할 수 있기 때문이다. 또한, 이 프로세싱에 필요한 효소 및 소화 조건은 현재 밝혀지지 않았다. 두번째로, 이 단백질은 (사람에게 있어서는) 외래의 것이므로, 면역원성이 있다. 이는 수 주에 걸쳐 환자에게서 보체를 고갈시킬 필요가 있을 경우 (예를 들면 이종이식 수술이 가능하도록 하기 위해) 반복 치료 용도로 이 단백질을 사용하는데 걸림돌이 된다.

CVF가 사람 C3와 구조적, 기능적 상동성이 일부 있으나 [17], 양자에게는 중요한 차이점들도 있다 (예를 들면, 쇄 구조, 생합성 장소, 보체 조절자에 대한 무감각함, 안정한 C3 컨버타제의 형성 등). CVF는, 공지되어 이미 클로닝 및 서열분석되었고 전체 구조 및 기능에 있어서 CVF 보다 사람 C3에 더욱 밀접하게 닮은 코브라의 C3 동등물로부터 유래된 것이 아니다[8].

CVF는 호모 사피엔스의 진화상으로 거리가 먼 동물의 독액 특이적 산물이다. 따라서 이 단백질을 유전자 조작을 통해 사람에게 면역반응을 일으키지 않도록 사용될 수 있는 생성물로 변형하는 것은 실용 가능성이 없다.

본 발명자들은 생리적 조절을 우회하여 보체 활성화를 억제하는 대신 계를 과도활성화 (superactivation)시키는 다른 전략을 구상했다. 이는 두 가지로 응용할 수 있다. 첫째, 하나 이상의 구성요소가 소진되어 결국에는 이후의 임의의 도전 (이종이식편 등)에 대해서 국소적 반응을 일으킬 능력이 상실될 때까지, 보체를 생체내에서 활성화시키는데 사용할 수 있다. 둘째, 특정한 표적 (바이러스 또는 바이러스 감염 세포 등)에 대해 고의로 비조절 과도활성화를 집중시켜 보체 매개 파괴 반응에 대한 상기 표적의 민감도를 증가시킬 수 있다.

"보체 활성화의 조절자"라는 용어는 C3 컨버타제의 증폭을 억제하는 모든 단백질을 포괄하는 의미로 본원에 사용되며, 그 유전자가 RCA 유전자 위치에 놓인 단백질로 제한하는 것은 아니다. 그러나 프로퍼딘과 같은 "상향 조절자 (up-regulators)"를 포함하지는 않는다. "C3 전환"는 별도의 지시가 없는 한, C3가 C3b 및 C3a의 단백질 가수분해에 의해 전환되는 것으로 정의되며, "C3 컨버타제 (또는 간단히 컨버타제)"는 이 반응을 촉매하는 효소 (전형적으로는 둘 이상의 단백질 구성요소의 복합체, 예를 들면 C3bBb, C3iBb, CVFBb 또는 C4b2a 등)로 정의된다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 하향 조절 내성 C3 컨버타제를 형성할 수 있도록 변형된 천연 보체 경로 단백질을 제공한다.

"천연 (native)"이란 자연 발생됨을 의미하며, 즉 자연 상태에서 획득할 수 있음을 의미한다. 따라서, 이 정의는 상기 정의된 바와 같이 변형된 모든 자연 발생 보체 경로 단백질을 포괄한다. 종 특이 단백질로 제한되는 것은 아니다. 바꿔 말하면, 변형된 사람 단백질은 예를 들면, 다른 포유동물 종에서 하향 조절 내성 C3 컨버타제로 사용될 수 있을 것이다. 전형적으로는 동종으로부터 얻은 변형된 보체 경로 단백질이 사용될 것이다.

예를 들어 위치 지정 돌연변이 유발 등을 이용해서 C3 DNA 코딩 서열을 변형시키면, 양성 기능 특성 (C3 컨버타제에 의한 C3b로의 절단) 및 완전한 구조 (올바른 쇄 구조, 및 티오에스테르 결합 존재)는 유지하는 반면 보체 조절 단백질에 내성이 있는 C3 변이체를 얻을 수 있다. 본원에 기재된 발명은 천연 보체 단백질, 예를 들면 사람 C3의 유전자 조작된 형태 (이것의 C3b 단편은 생리적 보체 조절에 내성을 갖는 특성을 획득함)에 관한 것이다. 이런 내성으로 인해, 이들 분자들은 생리적 환경 (예를 들면 생체내)에서 C3에서 C3b로의 전환을 증폭시키는 해당 C3 컨버타제의 안정화된 형태를 발생시키고, 나중에는 분해 산물을 발생시킬 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인자 I의 절단에 내성이 있는 변형된 사람 C3 단백질을 제공한다.

이는 단백질 가수분해 위치에서 단백질의 잔기를 변형시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 태양은 Arg-1303, Arg-1320 또는 이 둘 모두가 다른 아미노산으로 치환되어 변형된 사람 C3 단백질에 관한 것이다. 다른 아미노산은 티로신, 시스틴, 트립토판, 글루타민, 글루타민산 또는 글리신일 수 있다. Arg-1303은 바람직하게는 글루탐산 또는 글리신 (덜 바람직하게는 글루타민)에 의해 치환된다. Arg-1320은 바람직하게는 글루타민으로 치환된다.

본 발명의 적합한 변형 단백질을 생산하는 다른 전략으로는 다음과 같은 것들이 있다.

(i) 인자 H 및 관련 단백질 (예를 들면, MCP, DAF, CR1)의 억제 작용에 대한 감수성 감소. 예를 들면, 사람 C3에서 잔기 767-776 및 1209-1271는 인자 H 결합에 관련되었고 [20, 24], 이들 단백질의 작용과도 관련된 이들 잔기 또는 다른 잔기 중 하나 이상이 치환되면 이들 조절 단백질 하나 이상의 결합이 감소할 수 있을 것이다.

(ii) C3bBb의 해리율 감소. 돌연변이를 일으켜 C3b 및 Bb 사이의 상호작용을 강화할 수 있다. 이로 인해 효소의 자연적 분해율이 감소할 뿐만 아니라 C3b로부터 Bb를 대체하는데 있어서 인자 H (및 관련 조절자)의 효능이 감소될 것이다.

이런 돌연변이는 자발적 분해 및 인자 H로 매개되는 C3bBb의 분해 모두의 속도를 감소시키는 것이 바람직하다. 인자 H의 부재시에도, 유동상 C3bBb 복합체의 반감기는 프로퍼딘의 존재시에 37 ℃에서 단지 10 분 정도이다 [6].

(iii) 사람 C3 잔기 752-761은 인자 B와 결합하는데 관여한다. 이것은 C3에서 잘 보존된 영역 (conserved region)이며, 밀접하게 관련된 서열이 C4에서 발견된다. C4가 인자 B 동족체 C2에 결합하기 때문에, 이 영역에 대한 C3 및 C4 간의 강력한 유사성 및 C3에서 이의 높은 보존율은 인자 B 결합 위치로서 C3 내에서 이것의 기능을 더욱 뒷받침한다. 따라서, 이 영역을 변화시키면 B 친화성 및 C3bBb의 안정성에 영향을 줄 수 있다.

(iv) 보체 활성화의 다른 조절자들, 예를 들면 CR1, DAF 및 MCP 등에 대한 내성도 또한 바람직할 것이다. 이들 조절자의 작용 방식은 모두 인자 H와 유사하며, 따라서 추가의 돌연변이 유발이 반드시 필요하지는 않을 것이다. 이와 유사하게, 몇몇 병원성 유기체는 인자 H와 구조 및 기능적으로 대개 상동인 이들 자신의 보체 활성화 억제자를 발현한다 (예를 들면, 백시니아 바이러스 분비 펩티드). 이들 분자는 면역반응으로부터 침입자를 보호하며, 이들 방어에 내성이 있는 표적화된 C3 컨버타제 효소와 함께 침입자를 공격할 수 있는 것이 유리할 것이다.

(v) 프로퍼딘에 의한 C3 컨버타제의 안정화를 증가시키는 돌연변이. 프로퍼딘의 활성은 C3bBb 복합체를 안정화시키는 것으로서, 자발적 해리 및 인자 H 의존적 해리를 지연시킨다. 이 안정화는 유동상에서는 효과적이지 않지만, 일단 적합한 활성화 표면에서 개시되면 이 프로세스를 증폭시키는데 있어서 매우 중요한 것으로 추정된다[5]. (친화성을 증가시킴으로써) 그 활성을 증가시키면 유동상에서의 균형을 파괴하게 되어 자발적 C3 전환을 촉진할 수 있다. 이는 특히 상기한 다른 변형과 조합되었을 때 특히 유용할 것이다.

(vi) C3bBb가 C5 컨버타제 활성을 갖지 못하도록 하는 돌연변이. 순환계에서 활성 C3를 고갈시키는데 사용될 경우, 유발될 수 있는 원치않는 부작용은 다량의 아나필락틴성 (anaphylactic) 펩티드가 생성되는 것이다. 이들 중 가장 강력한 것이 C5a이며, 이는 일부 C3 컨버타제 효소에 의해 C5로부터 절단된 것이다. 이 반응은 C3b의 또다른 분자를 위한 컨버타제의 친화성에 달려 있으며 [11], 또한 이런 상호작용을 제거하는 C3에 대한 돌연변이에 의해 억제될 수 있다.

(vii) C3 컨버타제의 활성의 개선. C3bBb C3 컨버타제 효소의 활성 위치는 Bb 부분에 있다. C3b 성분은 아마도 Bb가 활성 입체구조를 유지할 수 있도록 하는 기능 및(또는) Bb에 의해 활성화될 기질과 결합하여 배향시키는 기능을 하는 것으로 추정된다. 이는 밝혀지지는 않았으나, 어떠한 경우라도 C3의 돌연변이를 통해 컨버타제의 활성을 증진시킬 수 있는 여지가 있다.

(viii) 기능성 형태로 발현. 야생종 C3는 새로운 C3 컨버타제 복합체에 결합하기 전에 C3b로 전환되어야 한다. 생체내에서 사용되는 경우 C3b (또는 C3i)로의 전환이 필요하다는 것은 변형된 C3의 작용을 지연시킬 것이다. 따라서, 즉각적인 컨버타제 형성이 가능한 형태로 단백질을 투여하거나 또는 예비형성된 컨버타제 복합체를 투여하는 것이 바람직할 것이다. 그렇기 때문에 생체외에서 기능적으로 C3b와 유사한 반응물을 생성하는 것이 유리할 것이다. 이는 시험관내에서 달성할 수 있다 (예를 들면, 단백질 가수분해).

(ix) 인자 B 결합에 필요한 펩티드 부위를 유지하면서 오직 인자 H 결합체에만 필요한 부위는 특이적으로 제거될 수 있는 새로운 절단 위치를 도입한 천연 단백질의 변형. 예를 들면, 변형된 C3의 C3b 유사 형태가 인자 B에는 여전히 결합하면서 인자 H 및 I에 의한 불활성화에 덜 민감한 형태로 더 절단될 수 있도록 절단 위치를 도입할 수 있다.

(x) 인자 B 및(또는) 인자 H와 C3b 상호작용에 영향을 줄 수 있는 다른 부위에서의 변형.

본 발명은 C3 전환을 촉진하여 C3를 고갈시키고 보체계를 무력화함으로써 전통적인 접근법을 뒤바꾸는데 근거해 있다. 본 발명을 추가로 응용하면, 특정 위치에서 C3 전환을 촉진함으로써 특정 표적을 공격하는 보체 의존적 작용인자 메커니즘을 집중시킬 수 있다.

따라서, 궁극적인 영향은 변형 단백질이 보체 활성화의 조절자를 함유하는 생리적 매질 (예를 들면 혈액)으로 투여될 때 C3 전환의 양을 증가시키는 것일 것이다. 이 활성은 곧 그 매질의 천연 C3를 고갈시키거나 또는 원하는 표적에서 C3 전환을 위치시킬 수 있다.

C3b 단편이 인자 I (실시예 1에 기재된 유도체)의 작용에 내성이 있는 C3 유사체가 인자 B에 결합하면 인자 B는 인자 D에 의해 절단되어 실질적으로 활성화된 형태로 해리될 것이다. 인자 I에 의한 불활성화의 부재시에, 변형된 C3b는 반복적으로 인자 B의 새로운 분자에 결합할 수 있어서 그의 불활성화를 촉진하게 될 것이다. 본 발명에 기재된 변형의 또다른 잠재적 응용은 인자 B 활성의 소비에 의한 제2 경로의 불활성화일 것이다. C2의 소비를 촉진하도록 C4를 변형시키는데 유사한 접근법을 사용하면 보체 활성화의 고전적 경로를 무력화할 수 있을 것이다.

본 발명은 보체 활성화 조절자가 존재함에도 불구하고 C3를 C3b로 절단된 C3bBb 효소와 유사한 방식으로 사용되는 다른 임의의 단백질 분해효소를 포괄한다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 이런 DNA 서열을 포함하는 DNA 제작물을 포괄한다.

"DNA 서열"이란 유전자 코돈의 동의성 (degeneracy)로 인해 소정의 아미노산 서열을 코딩하는 모든 다른 핵산 서열 또는 이 서열에 실질적으로 상동인 모든 핵산 서열을 포괄한다. 이들 서열은 따라서 본 발명의 범위에 포함된다.

"실질적으로 상동"인 핵산 서열도 본 발명의 범위에 포함된다. "실질적인 상동"이란 핵산 수준에서 또는 아미노산 수준에서 평가될 수 있다. 핵산 수준에서 실질적인 상동성을 가진 서열은 엄격한 조건 (stringent condition; 예를 들면, 약 0.9 M의 염 용액, 35 내지 65 ℃)에서 본 발명의 핵산 서열에 혼성화되는 것으로 간주될 수 있다. 아미노산 수준에서는 하나의 단백질이 다른 단백질과 상당수의 구성 아미노산에 있어서 상동성을 보인다면 실질적으로 상동인 것으로 간주될 수 있다. 아미노산의 적어도 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 심지어 99 % (선호도 증가 순서)까지도 상동일 수 있다.

상기 개시한 바와 같이, 본 발명의 단백질은 국소적 보체 활성화 효과를 얻는데 사용할 수 있다. 이를 확실하게 달성하는 방법은 단백질을 원하는 표적에 결합할 부분에 접합시키는 것이다. 따라서, 또다른 측면에서 본 발명은 특이적 결합 부분, 예를 들면 특이적 결합 단백질에 결합된 본 발명의 단백질을 포함하는 접합체를 제공한다. 그러한 단백질의 예는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 것이다.

본 발명의 단백질은 원하는 치료 효과를 유도해내기 위해 환자에게 투여하기 위한 용이다. 따라서 이를 위해 본 발명은 또한

(a) 치료에 사용하기 위한 본 발명의 단백질,

(b) 보체 경로 단백질의 양을 고갈시키는데, 특히 외래 물질에 대한 거부를 억제하는데 사용할 의약 제조에 있어서 본 발명의 단백질 또는 접합체의 용도,

(c) 본 발명의 하나 이상의 단백질 또는 접합체를 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 및(또는) 부형제와 함께 함유하는 제약 제제,

(d) 본 발명이 단백질을 포유동물에게, 바람직하게는 제약 제제의 형태로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에게서 보체 경로 단백질을 감소시키는 방법을 제공한다.

제약 제제는 1 용량 당 소정량의 활성 성분을 함유하는 단위 용량 형태로 제공될 수 있다. 그러한 1 단위는 최소량, 예를 들면 활성 성분 1 mg, 바람직하게는 2-3 mg을 함유할 수 있다. 이러한 단위 용량에 함유될 수 있는 최대치는 치료될 상태, 투여 경로, 환자의 나이, 체중, 상태 및 경제적 고려사항 등에 따라 달라질 것이다. 예를 들면 단위 용량 형태는 활성성분 10 mg 정도 또는 심지어 100 mg을 함유할 수 있다.

본 발명의 단백질은 생체내에 사용되어 보체계를 무력화시킬 수 있다. 이것이 필요한 상황은 다음과 같다.

(a) 이식물, 구체적으로는 이종이식편 (다른 종의 동물로부터 이식된 것), 특히 부정합 이종이식편 (discordant xenograft; 제공자와 수령자가 부정합한 관계인 경우)에 대한 보체 매개 파괴 또는 손상을 억제하기 위한 경우. 수령자는 수술 전에 보체가 고갈되어야 하며, 이식물이 적응되거나 또는 더 적합한 장기로 대체될 때까지 이 상태로 유지될 수 있어야 한다.

초기 치료는 이식 전에 수일 내에 행해질 수 있다. 추가의 보체 고갈은 거부 위기시에 필요할 수 있다. 이 치료는 C3a 및(또는) C5a의 생성으로부터 유발될 수 있는 일반적인 염증반응 (예를 들면, 혈관 확장)을 조절하기 위해 항히스타민제를 사용하여 수행할 수 있다.

보체 고갈은 또한 보체계를 활성화시키는 인공 장기 또는 조직 (예를 들면, 인공 신장 투석막)을 사용할 때 유익할 수 있다. 상기한 바와 같이, 단백질은 불활성화된 형태로, 기능적으로 C3b 유사 형태 또는 예비형성된 활성 C3 컨버타제 (C3bBb 등)로 제공될 수 있다. 이들은 활성 컨버타제가 순환하는 C3과 만날 수 있도록 하는 모든 경로 (예를 들면, 정맥내, 피하 등)로 투여될 수 있다.

또한 다르게는 예를 들면 활성 컨버타제를 함유하는 매트릭스를 통해 순환계에 배어들게 하는 생체외 처치가 가능하다. 이는 보체 고갈된 혈액 (또는 혈장)을 환자에게 반환하기 전에 아나필락틴성 펩티드 (C3a 및 C5a) 및 다른 저분자량 염증 매개자 (예를 들면, 히스타민 및 산화질소)를 제거할 수 있다는 이점이 있다.

(b) 주요 수술로부터 발생하는 보체 매개 손상을 억제하기 위한 경우. 환자는 상기한 바와 같이, 바람직하게는 수술 전에 (그러나 필요하다면 그 후에) 보체를 고갈시켜야 하며, 보체 의존적 면역 공격으로 인한 추가의 내부 손상 위험이 감소될 때까지 이 상태로 유지될 것이다.

(c) 비외과적 손상으로 발생한 보체 매개 손상을 감소시키 위한 경우. 이런 경우에는 보체 고갈이 초기 손상후 수행되어야 하지만, 제제 및 투여 방법은 달리 지시가 없는한 상기한 바와 유사할 것이다. 이는 특히 회복이 순환계에 의한 허혈 조직의 재관류와 관계된 경우 (예를 들면, 심근 허혈, 동창(凍瘡), 화상 등)에 유용할 수 있다.

(d) 항체-항원 상호작용으로 생겨난 보체 매개 손상을 최소화하기 위한 경우. 보체 매개 방어 반응은 사구체신염, 용혈성 빈혈, 무력성구마비, I형 당뇨병, 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증 등의 자기면역 질병에서는 특히 바람직하지 못하다. 질병의 심각한 상태시에 보체계를 무력화시키면 예를 들어 류마티스성 관절염에서 관절에 국소 투여함으로써, 상태를 호전시킬 수 있다.

(e) 특정 병원성 표적을 보체 매개 면역 메커니즘에 더욱 민감하게 만들기 위한 경우. 이런 접근법에서는, C3를 전반적으로 고갈시키는 과도활성 C3 컨버타제를 사용하는 것이 목적이 아니라 컨버타제를 사용하는 대신 원하는 표적에 C3 컨버타제를 국소적으로 집중시키는 것이 목적이다. 그 표적은 박테리아, 바이러스 또는 다른 기생충 등의 병원성 유기체 또는 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포 등과 같은 유해한 숙주 세포나 조직일 수 있다. 국소 투여 (예를 들면, 일반 순환계 내로 그의 분산을 늦추는 매질로 직접 주사) 또는 항체와 같은 표적화 부위와 결합시킴으로써 C3 컨버타제를 표적으로 집중시킬 수 있다. 따라서, 변형 단백질은 단백질의 화학적 가교결합을 통해, 또는 DNA 코딩 서열을 연결하고 융합 단백질을 발현 (그리고 정제하여) (예를 들면, IgG의 경우에, 중쇄 및 경쇄는 C3에 부착될 수 있거나 또는 두 쇄가 하나의 완전한 융합 폴리펩티드 내에 결합될 수 있음)시키거나, 또는 특이적 코딩 서열 (예를 들면 "루이신 지퍼"형 도메인)을 두 융합 파트너 (예를 들면, 변형된 C3 및 특이적 항체)의 DNA로 도입함으로써, 발현된 생성물은 서로 혼합되면 자가 결합을 통해 안정한 접합체를 형성한다. 융합 단백질은 그 다음 국소적으로 또는 일반 순환계로 투여될 수 있다.

리포솜 (리포솜 표면 또는 내부에 변형 단백질과 함께 표면상에 항체를 함유) 및(또는) 바이론 (예를 들면 이들의 표면에 단백질을 발현하도록 유전공학적으로 변형된 것)은 또한 항체 및 변형 단백질의 동시운반에 사용될 수 있다. 이 전략은 직접적으로, 질병의 임의의 진행 단계에서 단독 또는 다른 처치와 병행하여 사용될 수 있다. 종양을 외과적으로 제거한 후, 순환계에 남아있는 어떤 암 세포를 제거하는데 사용하기에 특히 적합할 수 있다. 항체 변형 단백질 접합체는 또한 병원성 조직을 제거하기 위해 생체외에서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 추출된 골수로부터 백혈구 (leukaemic cell)를 죽여서 남아있는 건강한 세포를 환자에게로 되돌려주기 위한 경우가 이에 해당한다.

또한 수령자의 MHC 형태와 조화되지 않는 림프구가 이식 전에 골수로부터 제거될 수 있을 것이다. 또한 변형 단백질은 항원에 연결될 수 있고, 이런 조합은 또한 생체내 또는 생체외에서 사용되어 (예를 들면 이식물 또는 자기 조직에 대한) 바람직하지 않은 반응성을 지닌 림프구를 공격할 수 있다.

동일한 기술을 사람의 변형 단백질 유도체 또는 다른 종에 맞게 제작된 유사한 유사체를 사용하여 다른 종을 치료하는데도 적용할 수 있다.

본 발명의 각 측면의 바람직한 특징은 각각에 대해 필요한 변경을 가한 서로 다른 측면이다.

이제부터는 다음의 실시예를 통해 본 발명을 설명할 것이다. 그러나 이 실시예가 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 실시예는 첨부된 도면을 통해 설명된다.

도 1은 PC3에 코딩된 사람 C3의 추정 단백질 서열을 보여준다 (표준 한 글자 아미노산 코드를 사용).

도 2는 PC3의 cDNA 서열을 도시한다 (센스 가닥 5'-3'에 대한 표준 한 글자 데옥시뉴클레오타이드 코드를 사용).

도 3은 본 발명의 변형 단백질의 시각 자료이다.

도 4는 Arg 1303 또는 Arg 1320를 치환한 사람 C3에 대한 각종 돌연변이의 인자 I 처리 절단에 미치는 영향을 보여준다.

N.B.

1. [35S]-생합성 표지 샘플

2. 정상 이온 세기에서 수행된 반응

3. 항-C3를 이용한 면역침전

4. 환원 상태에서의 SDS-PAGE

5. 자기방사능사진

도 5는 Arg 1303을 Gln 1303으로 돌연변이시킴으로써, 인자 I 및 H에 의한 불활성화에 대한 사람 C3의 내성이 향상됨을 보여준다.

도 6은 아미노산 잔기 752 - 754 및 758 - 760에서 돌연변이된 C3 컨버타제의 절단의 분석 결과를 보여준다.

이는 니트로셀룰로오즈로 전기영동시킨 후, 양의 항-사람 C3 항체로 탐침시키고, 양고추냉이 퍼록시다제 커플링 항-양 면역글로불린 항체 및 인핸스 케미루미네슨스 (Enhance ChemiLuminescence; 영국 아머샴(Amersham)사의 방법 및 검출 시약)로 현상시킨 후, X-선 필름으로 촬영한, 7.5 % 폴리아크릴아미드 SDS-PAGE 겔 (환원 상태)로부터 현상시킨 웨스턴 블롯 사진이다. 절단 반응 및 검출 절차는 도 3에서 보인 결과를 참조하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행했다.

중요 사항:

트랙 1-4 : 야생형 C3 (COS 세포에서 발현된 것)

트랙 5-8 : 돌연변이 C3 (잔기 752-754가 Gly-Ser-Gly로, 잔기 758-760이 Gly-Ser-Gly로 변한 것) (COS 세포에서 발현)

트랙 1,5 : 추가한 것 없음

트랙 2,6 : +CVFBb

트랙 3,7 : + 인자 H + I

트랙 4,8 : +CVFBb + 인자 H + I

화살표로 표시한 밴드는 다음과 같다.

A : C3 α-쇄

B : C3 α'-쇄

C : C3 β 쇄

D : C3 α'-쇄의 68 kDa 절단 생성물

E : IgG 중쇄

도 7은 야생형 및 돌연변이 C3 (C3i)의 존재하에 인자 D로 방사능표지 인자 B를 절단한 분석 결과를 보여준다.

SDS-PAGE 겔의 자기방사능사진을 보여준다. 모든 샘플에 인자D 및¹²⁵I-표지된 인자 B가 함유되었고, 3 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었다.

각 번호 트랙의 샘플에는 다음과 같은 내용물이 포함되었다.

1. 완충액 단독

2. 1/125 야생형 C3

3. 1/25 야생형 C3

4. 1/5 야생형 C3

5. 1/25 돌연변이 C3 (잔기 1427 Gln, 1431 Asp 및 1433 Gln)

6. 1/5 돌연변이 C3

7. 희석되지 않은 돌연변이 C3

화살표로 표시된 밴드는 다음과 같다.

A. 절단되지 않은¹²⁵I-표지된 인자 B (93 kDa)

B. 60 kDa 절단 생성물 ("Bb")

C. 33 kDa 절단 생성물 ("Ba")

도 8은 C3i 및 IgG 사이의 접합체 형성을 보여주는 SDS-PAGE 연구결과이다.

이는 비환원 상태에서 시행된 4 % 아크릴아미드 SDS-PAGE 겔 시행의 쿠마지에 (Coomasie) 염색 결과이다. 각 번호의 트랙에는 다음의 샘플이 함유되어 있다.

1. PDP-IgG

2. C3i

3. PDP-IgG + C3i 반응 혼합물

화살표로 표시된 밴드는 다음을 의미한다.

A : 아마도 C3i-IgG 접합체 (350 kDa)일 것이다.

B : C3i (200 kDa)

C : IgG (150 kDa)

도 9는 접합체가 양 적혈구에 대한 C3 컨버타제 활성을 표적으로 삼는다는 것을 보여준다.

이 그래프는 실험방법에 기재된 바와 같이, C3i-IgG 접합체, PDP-IgG 또는 C3i의 희석액으로 코딩한 후, 세척하고 프로퍼딘 및 인자 B 및 D를 이용해 C3 컨버타제의 생성후 마지막으로 CFD/EDTA 중의 NGPS로 용해 (lysis)시킨, 양 적혈구의 용해율을 보여준다. 단지 접합체만 용해를 일으키며, 이 용해는 용량에 따라 달라진다.

도 10 및 11은 DV-1AM 돌연변이 C3의 절단 특성을 보여준다 (실시예 12 내지 14 참조)

도 10과 관련하여, 발현된 야생형 (A) 및 DV-1AM 돌연변이 (B)를 함유하는 COS 세포 상층물은 1) -, 2) CVFBb, 3) 10 ㎍/ml 인자 I 및 50 ㎍/ml 인자 H, 또는 4) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I 및 50 ㎍/ml 인자 H로 처리하고, 면역침전시키고, SDS-PAGE로 분석하고 (표시한 각 레인에서), 실시예 4에 기재한 바와 같이 니트로셀룰로오즈로 전기블롯팅 (electroblotting)시켰다. 이 경우, 이 블롯은 C3의 C3dg 부위 및 그의 단편화 생성물과 반응하는 쥐 단일클론 항체, 클론-3 및 클론-9의 조합과 (Lachmann, P.J. 등, J. Immunol., 41: 503 (1980)), 양고추냉이 퍼록시다제-커플된 항 쥐 면역글로불린 (Sigma 제품)을 차례로 사용하여 현상한 후, ECL 시약 및 아머샴사가 제공하는 절차를 사용하여 검출했다.

도 11과 관련하여, 발현된 DV-1B 돌연변이 (A), 야생형 (B) 및 DV-6 돌연변이 (C) C3을 함유하는 COS 세포 상층물을 1) -, 2) 10 ㎍/ml 인자 I 및 50 ㎍/ml 인자 H, 3) CVFBb, 4) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I 및 2 ㎍/ml 인자 H, 5) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I 및 10 ㎍/ml 인자 H, 6) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I 및 50 ㎍/ml 인자 H로 처리하고 면역침전시키고, (표시한 각 레인에서) SDS-PAGE로 분석하고, 니트로셀룰로오즈 상으로 전기블롯팅하고, 다클론 양 항-C3 항체를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 검출했다.

도 12는 프레임 이동 돌연변이 (frame shift mutation)에 의해 생긴 C3 관련 생성물의 분석 결과를 보여준다. 이 생성물은 HDV-3X으로 명명된다. HDV-3X에 대한 결과를, HDV-3X처럼 돌연변이 T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N 및 K1036I을 포함하지만 HDV-3X와 달리 C-말단은 변형되지 않은 DV-3에 대한 결과와 비교했다.

발현된 DV-3 (A) 및 HDV-3X 돌연변이 (B) C3을 함유하는 COS 세포 상층물을 1) -, 2) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I, 3) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I + 1 ㎍/ml 인자 H, 4) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I + 5 ㎍/ml 인자 H, 5) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I + 25 ㎍/ml 인자 H로 처리하고, 면역침전시키고, (표시한 각 레인에서) SDS-PAGE로 분석하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오즈 상으로 전기블롯팅했다. 이 경우, 이 블롯은 C3의 C3dg 부위 및 그의 단편화 생성물과 반응하는 쥐 단일클론 항체, 클론-3 및 클론-9의 조합과 (Lachmann, P.J. 등, J. Immunol., 41: 503 (1980)), 양고추냉이 퍼록시다제-커플된 항 쥐 면역글로불린 (Sigma 제품)을 차례로 사용하여 현상한 후, ECL 시약 및 아머샴사가 제공하는 절차를 사용하여 검출했다.

도 13은 발현된 E1Q2 (A), E1Q2QG3 (B) 및 E1Q2E3 (C) 돌연변이 C3을 함유하는 COS 세포 상층물을 1) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I, 2) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I + 50 ㎍/ml 인자 H, 3) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 I + 25 ㎍/ml sCR1로 37 ℃에서 2.5 시간 동안 처리하고, 면역침전시키고, (표시한 각 레인에서) SDS-PAGE로 분석하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오즈 상으로 전기블롯팅하는 실험에 관한 것이다. 이 경우, 이 블롯은 이 블롯은 실시예 12에 기재된 바와 같은 쥐 단일클론 항체, 클론-3 및 클론-9의 조합과 양고추냉이 퍼록시다제-커플된 항 쥐 면역글로불린 (Sigma 제품)을 차례로 사용하여 현상한 후, ECL 시약 및 아머샴사가 제공하는 절차를 사용하여 검출했다.

86 kDa 밴드 (화살표)는 위치 1 또는 2에서의 선행 절단이 없고 세번째 위치에서의 인자 I 매개 절단의 생성물이다.

도 14는 발현된 NC3 (A), FT-1 (B), FT-2 (C), FT-3 (D), FT-4 (E) 및 FT-5 (F) 돌연변이 C3을 함유하는 COS 세포 상층물을 1) -, 2) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 + 50 ㎍/ml 인자 H로 37 ℃에서 2.5 시간 동안 처리하고, 면역침전시키고, (표시한 각 레인에서) SDS-PAGE로 분석하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오즈 상으로 전기블롯팅하는 실험에 관한 것이다. 이 블롯은 실시예 12에 기재된 바와 같은 쥐 단일클론 항체, 클론-3 및 클론-9의 조합과 양고추냉이 퍼록시다제-커플된 항 쥐 면역글로불린 (Sigma 제품)을 차례로 사용하여 현상한 후, ECL 시약 및 아머샴사가 제공하는 절차를 사용하여 검출했다.

도 15는 발현된 NC3 (A), FR-1 (B), FR-2 (C), FR-3 (D), FR-4 (E) 및 FT-2 (F) 돌연변이 C3을 함유하는 COS 세포 상층물을 1) -, 2) CVFBb + 10 ㎍/ml 인자 + 50 ㎍/ml 인자 H로 37 ℃에서 2.5 시간 동안 처리하고, 면역침전시키고, (표시한 각 레인에서) SDS-PAGE로 분석하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오즈 상으로 전기블롯팅하는 실험에 관한 것이다. 이 블롯은 실시예 12에 기재된 바와 같은 쥐 단일클론 항체, 클론-3 및 클론-9의 조합과 양고추냉이 퍼록시다제-커플된 항 쥐 면역글로불린 (Sigma 제품)을 차례로 사용하여 현상한 후, ECL 시약 및 아머샴사가 제공하는 절차를 사용하여 검출했다.

관계를 용이하게 파악할 수 있도록, 하향 조절 내성 C3 컨버타제로 작용할 수 있는 특정 단백질 및 실시예 및 표와 청구항 사이의 관계를 하기 표에 보였다.

청구항	하향 조절 내성에 중요하다고 생각되는 (사람의 C3 컨버타제에 관한) 아미노산 서열의 부위	실시예	표
5-8	1303/1320	1-6, 11
9-11	758-780/752-754	7
12	1427, 1431, 1433	8	I
13-15	992-1005	12, 13	II
16-19	1152-1155	14	II
20-29	1546-1663	15, 17	III
30-34	954-955	16

다음의 표준 방법 및 정의는 모든 실시예에 적용할 수 있다.

언급된 모든 보체 구성성분은 다른 지시가 없는 한 사람에게서 유래한 것이며, 모든 단백질 및 이들로부터 유래된 단편에 대해서 표준 명명법을 사용한다 (예를 들면 참고문헌 [15]에 기재되어 있음). 또한 "C3i"란 용어는 손상되지 않은 티올에스테르 결합이 없지만 α 쇄 상에 C3a 폴리펩티드를 보유하는 모든 분자 형태를 의미한다.

사람 C3 cDNA 및 코딩 서열은 EMBL 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 사용된 번호체계 (참고문헌 [2]에서 유래)를 사용하여 도 2에 도시한 바와 같이 번호가 매겨진다. 나타낸 서열은 우리의 제작물 ('PC3')의 것이며, 이것은 참고문헌 [2]에 기록된 5' 비번역 영역의 처음 11개의 뉴클레오타이드를 결여하고 있어서, 제1 염기가 12번이다. 개시코돈으로 추정되는 것은 뉴클레오타이드 번호 61-63이고, β 쇄 아미노 말단 세린 잔기에 대한 코돈은 뉴클레오타이드 127-129이고, α 쇄의 아미노 말단 세린 잔기에 대한 코돈은 뉴클레오타이드 2074-2076이다.

단백질 서열은 도 1에 나타낸 전구체 서열에 따라 그 번호가 매겨지며, 이 서열은 부록 1의 DNA 서열을 추정 번역한 것이다 (아미노산 1-22는 생합성시 제거되는 신호 서열 (signal sequence)이며, 아미노산 668-671은 전구체가 알파 및 베타 쇄로 절단될 때 제거될 것으로 예상된다).

다음의 약자는 괄호 안의 의미를 갖는다. CVF (코브라 독액 인자), ELISA (효소 결합 면역 흡착 분석법), E. coli (Escherichia coli, 대장균), kb (킬로 베이스); HSV-1 (허피스 심플렉스 바이러스 1형), PBS (인산염 완충 염수), COS-1은 원숭이 신장 세포로부터 유래된 세포주이다. Af1II, DraI, DraIII, EcoRI, EcoRV, HindIII, NaeI, NheI, XbaI는 제한효소이다.

표준 방법

플라스미드 분리, 아가로오즈 겔 전기영동 및 DNA 라이게이션 등의 표준 분자생물학적 절차에 대한 방법은 참고문헌 [2]에서 찾을 수 있다. 이중 가닥 DNA는 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼스 (United States Biochemicals)사의 "시쿼네이즈 (Sequenase) 버전 2.0" 키트를 사용하여 서열 분석했다. 친화성 정제 다클론 양 항-사람 C3를 사용하여 예비코팅된 플라스틱 플레이트를 사용하여 여기에 배양 상층액 샘플을 첨가하는 ELISA 분석으로 C3 발현을 측정했다. 결합 C3는 알칼리성 포스파타제에 접합된 C3에 대한 단일클론 쥐 항체, 색유발 기질, p-니트로페놀 포스페이트로 검출했다.

보체 단백질 및 CVF의 정제 방법 및 분석에 사용된 친화성 정제된 항-C3 항체의 제조 방법은 참고문헌 [28]에 기재되어 있다. 동등한 반응물은 시그마 케미칼 캄파니 리미티드 (Sigma Chemical company LTD)로부터 구입할 수 있다.

C3 cDNA 코딩 서열

우리의 C3 cDNA 코딩 서열은 벡터 pGEM4 (Promega 제품)내에 보유된 무작위-프라밍된 (random-primed) 사람의 간 cDNA 라이브러리로부터 분리된 두 개의 세그먼트로부터 제작되었다. 사람 C3 코딩 서열내에 공지된 세그먼트에 상응하는 5 개의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 [γ-32P]ATP로 방사능 표지하여, 아가로오즈 플레이트로부터 라이브러리의 필터 운반을 탐침하는데 사용했다. 약 4 kb의 삽입체를 포함하는 두 개의 클론을 단리했다. 제한 효소 소화, 특이적 올리고뉴클레오타이드 탐침으로의 혼성화, 부분 서열 분석을 통해 이들 중 하나 ('A13')가 5.1 kb 메시지의 5'-말단을 포함하는데 반해, 다른 것 ('B44')은 3'-말단으로 연장되었다.

따라서 이들 삽입체들은 유일한 EcoRI 제한 효소 위치를 포함하는 대략 3 kb 정도가 포개졌다. A13의 불완전한 5' 구획은 EcoRI 및 NheI으로 자르고 EcoRI 및 XbaI으로 자른 B44로부터 단리된 완전한 세그멘트로 대체했다. 두 개의 조각을 저융점 아가로오즈로 겔 전기영동시켜 정제한 후, T4 리가아제로 라이게이션시켜서, C3 전구체 단백질 전체를 코딩하는 5.1 kb의 DNA를 포함하는 벡터 ('PGC3')를 생성했다.

C3 코딩 영역에 대한 링커 서열 5'에는 잠재적으로 오류 번역 개시 위치인 두 개의 ATG가 포함되었다. 따라서, 이들은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 약 50 bp의 링커/어댑터 DNA가 삭제된 올리고데옥시뉴클레오타이드 PL-ATC-3 (TAGGGAGACC GGAAGCTTGC CCTCTCCCTC TGTCCCTCTG T)를 사용하여, 빈틈많은 플라스미드 (gapped plasmid) 돌연변이유발 방법으로 제거했다. 5.1 kb의 C3 DNA 서열과 2.6 kb의 pGEM4 벡터 (Promega 제품) 서열이 포함된 7.7 kb의 상기 돌연변이된 벡터를 PC3으로 명명한다.

PGC3 플라스미드의 C3 코딩 영역을 완전히 서열 분석한 결과, 이미 공개되어 있던 사람 C3 ("S" 대립유전자) cDNA 서열 [2]과 단지 4 개의 차이만이 드러났다.

(i) C2481 → G 및 C2805 → T로의 변화는 코딩을 변화시키지 않는다.

(ii) T1001 → C는 이미 기재된 HAV 4-1-(루이신314 → 프롤린) 다형태 [20]를 코딩한다.

(iii) G2716 → A는 발린 886 → 이소루이신을 코딩하는데, Ile는 생쥐 및 쥐 C3의 이 위치에서는 발견되지만, 사람 C3에서는 이전에는 보고된 바 없었다.

우리의 서열에는 개시 및 종결 코돈, 신호 서열이 포함되기 때문에, 기능성 C3를 코딩한다.

COS-1 세포 (리포펙타민 및 pcDNA3 (Invitrogen 제품) 발현 벡터를 사용하여 형질감염된 것)의 배양 상층물 중에서 발현된 야생형 C3의 양이 ELISA를 통해 1.7 ㎍/ml이하로 검출되었다. pcDNA3 벡터 자체만으로 형질감염된 세포에 의해서는 C3를 전혀 검출할 수 없었다. 또한, 절단 반응 후 면역침전 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 분석한 결과,

(i) 1차 번역 생성물은 완전한 2 쇄 형태로 정확하게 프로세싱되었으며,

(ii) 이 생성물은 천연 C3와 마찬가지로 C3 컨버타제 (CVFBb)에 의해 C3b로 절단될 수 있었고,

(iii) 발현된 단백질은 천연 C3와 마찬가지로 인자 H + I에 의해서는 절단되지 않았으나, C3 컨버타제 효소에 의해 C3b으로 전환된 후에는 절단될 수 있게 되었음이 입증되었다. 이를 통해 우리의 출발 플라스미드가 기능성 C3로 번역될 수 있음이 확인되었다.

C3 코딩 서열의 제작 및 발현에 대한 다른 설명은 참고문헌 [25]를 참조한다.

<실시예 1>

인자 I에 의한 C3b 단편의 절단을 막기 위해, 인자 I 절단 위치 (아미노산 위치 1303 및 1320) 둘다에서 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 바뀐 C3의 생성

a) 돌연변이 유발

사용되는 돌연변이 유발성 올리고데옥시뉴클레오타이드는 QRI1 (CAACTGCCCAGCCAAAGCTCCAAGATCACC), QRI2 (GCCAGCCTCCTGCAATCAGAAGAGACCAAG), 및 AFL4149 (TAATAAATTCGACCTTAAGGTCACCATAAAAC)와 이에 상응하는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드 QRIln (GGTGATCTTGGAGCTTTGGCTGGGCAGTTG), QRI2n (CTTGGTCTCTTCTGATTGCAGGAGGCTGGC) 및 AFL4149n (GTTTTATGGTGACCTTAAGGTCGAATTTATTA)였다.

QRIl 및 QRIln은 C3 전구체 서열에서 인자 I의 절단 위치인 아미노산 잔기 1303에서 (cDNA 서열에서 G3968C3969를 AA로 바꿈으로써) 글루타민에 의한 아르기닌의 치환을 지정하며, QRI2 및 QRI2n은 인자 절단 위치인 아미노산 잔기 1320에서 (뉴클레오타이드 G4019가 A로 바뀌어) 동일한 치환을 수행한다.

AFL4149 및 AFL4149n은 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 (C4149를 T로 바꾸어) cDNA 서열에서 4149 위치에 제한 엔도뉴클레아제 AflII의 절단 위치를 도입한다. 이들 두 개의 프라이머를 마커로 사용하여, AflII에 의한 DNA 생성물의 절단을 근거로 성공적인 돌연변이 유발을 확인했다.

돌연변이 유발은 "빈틈많은 플라스미드" 방법을 사용하여 수행했다. 티미딘 대신에 우리딘이 풍부한 PGC3 ('UPGC3') 1회분을 0.25 ㎍/ml 우리딘의 존재하에 대장균 균주 CJ236를 증식시켜 제조했다. 이 플라스미드를 SmaI으로 소화시키고, 7.2 kb 생성물 ('US1')을 아가로오즈 겔로 정제하여 C3 서열로부터 나온 0.5 kb 단편 (잔기 1463-1947)을 제거했다. 빈틈많은 플라스미드 ('DN2')의 다른 성분은 PGC3을 DraIII과 NaeI로 소화시키고 5.1 kb 조각을 아가로오즈 겔 전기영동으로 2회 정제하여 제조했다. 200 ng DN2를 대략 500 ng US1과 50 ㎕ H₂O 중에서 혼합하고, 100 ℃로 가열하고, 50 ℃ 아래로 서서히 냉각시킨 후, 2XT7 완충액 (100 mM 트리스/HCl/pH 7.4/14 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 2mM 디티오트레이톨, 각각 1 mM의 ATP, dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 20 ㎕ 내지 25 ㎕과 각각 5'-인산화 돌연변이 유발성 프라이머 (한 반응에서는 QRI1, QRI2 및 AFL4149를 사용했고, 다른 반응에서는 QRIln, QRI2n 및 AFL4149n을 사용했음) 10 nmol을 첨가했다. 혼합물을 70 ℃까지 5 분 동안 재가열했고, 20 ℃까지 (30 내지 60 분에 걸쳐) 서서히 냉각시켰다. 0 ℃에서 10 유닛의 T7 DNA 중합효소와 80 유닛의 T4 DNA 리가아제를 첨가했다. 혼합물 (총 부피 50 ㎕)을 5 분 동안 0 ℃에서 우선 인큐베이션시킨 후, 실온에서 5 분 동안, 마지막으로 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 혼합물 1 ㎕씩을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 초수용성 (超受容性, supercompetent) XLl 대장균 (Stratagene 제품) 100 ㎕를 형질전환시켰다.

암피실린 내성 콜로니를 AFlII 절단에 대해 스크리닝하고, 성공적인 돌연변이체를 100 ml 배양액에서 증식시켜, 이로부터 플라스미드를 단리한 후 서열분석하여 (서열분석 프라이머 C3pa-3876, CTTCATGGTGTTCCAAGCCT, C3 cDNA의 뉴클레오타이드 3876-3895와 짝을 이룸) 인자 I 절단 위치에서 돌연변이를 확인했다.

"빈틈많은 플라스미드" 돌연변이 유발의 또다른 프로토콜은 참고문헌 [26, 27]을 참고한다.

b) 돌연변이 DNA를 진핵생물 발현 벡터로 옮김

돌연변이 플라스미드를 HindIII 및 NaeI으로 이중 소화시켜 C3 코딩 단편을 잘라냈다. DraI도 함께 사용하여 나머지 플라스미드를 무력화시켰다. C3 코딩 서열을 아가로오즈 겔로 정제했고, HindIII 및 EcoRV 효소로 선형화된 후 소의 장 포스포릴라제로 탈인산화시켜 놓은 pcDNA3 벡터 (Invitrogen 제품) 내로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 초수용성 XL1 대장균을 형질전환하고, 그 다음 이를 암피실린이 함유된 배양 플레이트에서 평판배양했다.

암피실린 내성 콜로니를 무작위 선별하여 (3 또는 4) 2 내지 3 ml 배양액에서 증식시키고, 플라스미드 DNA를 소규모 단리했다. 올바른 삽입체가 포함된 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI, HindIII 및 AflII로 플라스미드 DNA를 소화시켜 판별했다. 이에 해당하는 콜로니를 100 ml 배양액에서 배양하고, 표준 절차에 따라 플라스미드를 정제했다. 이들 돌연변이체는 본래 PCG3으로부터 제작되었기 때문에, 코딩 부위의 5'에 두 개의 ATG가 있다. 따라서, 이 부위 (및 C3 코딩 서열의 5' 3 kb)는 HindIII와 EcoRI으로 잘리며, PC3로부터 잘려나온 동일한 세그머트가 라이게이션되어 대체되었다. 이들 재제작된 벡터를 표준 절차를 통해 정제하고 COS 세포의 형질감염에 사용했다.

c) 야생형 및 돌연변이 C3의 발현

돌연변이 및 야생형 C3를 리포펙타민 (등록상표) (Gibco 제품)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 COS-1 세포로 형질감염시킨 플라스미드로부터 일시적으로 발현시켰다. 전형적으로는, 표준 6 웰 배양 플레이트의 한 웰 당 1-1.5 X 10⁵세포를 9 ㎕ 리포펙타민 시약을 사용하여 플라스미드 2 - 4 ㎍으로 형질감염시켰다. 상층물을 C3 분비에 관해 분석했고, 형질감염 3 내지 6일후 상층물 1 ml 당 전형적인 수율은 0.3 - 1.7 ㎍으로 얻어졌다.

결과

a) 돌연변이체의 생성

도입된 돌연변이 유발성 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열에 따라 명명한 다음의 돌연변이를 지금까지 단리했다.

(i) QRI1 및 QRI2 돌연변이 + AFL4149를 갖는 3 개의 돌연변이 : C3M-26, C3M-58 및 C3M-61

(ii) QRI1 및 QRI2를 갖지만 AFL4149는 없는 1 개의 돌연변이 : C3M-8

(iii) QRI2 및 AFL4149를 갖지만 QRI1은 없는 1 개의 돌연변이 : C3M-51 (실시예 3에 사용됨)

b) 기능상의 영향이 인자 I 절단 위치에서 특이적으로 도입된 돌연변이로 인한 것임을 입증

서열분석을 통해 각 돌연변이체의 돌연변이된 부위 주변에 178 -350개의 염기에서 다른 변이가 없음을 확인했다. 이런 절차에 의해 생성된 하나의 돌연변이체, C3M-51 (실시예 3 참조)의 서열을 돌연변이 유발에 사용된 전체 '갭' (2463-5067) 전반에 걸쳐 분석했고, 야생형 서열로부터 다른 변형은 전혀 발견되지 않았다.

또한 모든 돌연변이체로부터 총 2922개의 염기를 대표적으로 서열분석한 결과 중합효소에 의해 매개된 오류로 인해 유발되었을 수 있는 단일점 돌연변이는 전혀 드러나지 않았다. 발현된 돌연변이는 모두 2-쇄 구조 및, 천연 C3의 특징인 C3 컨버타제에 의한 절단을 나타냈다. 요약하자면, 사용된 돌연변이는 이들이 완벽하게 재서열분석되지 않았지만 어떠한 원치 않는 변화도 포함하지 않았을 것이다.

<실시예 2>

한개의 인자 I 절단 위치 (아미노산 위치 1303)에서 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 바뀐 C3의 생성

단지 돌연변이 유발성 올리고데옥시뉴클레오타이드 AFL4149 + QRI1 또는 AFL4149n + QRIln (즉, QRI2 또는 QRI2n이 아님)을 돌연변이 유발에 사용한 것만 제외하면 실시예 1의 절차를 따랐다.

결과

a) 얻어진 돌연변이체

QRI1 및 AFL4149를 갖지만 QRI2는 없는 2개의 돌연변이체 C3M-I23, 27이 단리되었다. 돌연변이체 C3M-I23은 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현되었다.

이 단백질은 CVFBb에 의해 절단될 수 있었다. C3b 유사 생성물은 인자 I 및 H에 의한 1303 위치에서의 절단에 대해 (야생형과 비교했을 때) 상대적으로 내성이 있었으나, 위치 1320에서는 여전히 절단될 수 있었다. 이 C3b 유도체는 따라서 인자 I에 부분적으로 내성이 있다.

<실시예 3>

하나의 인자 I 절단 위치 (아미노산 위치 1320)에서 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 바뀐 C3의 생성

단지 돌연변이 유발성 올리고데옥시뉴클레오타이드 AFL4149 + QRI2 또는 AFL4149n + QRI2n (즉, QRI1 또는 QRIln이 아님)을 돌연변이 유발에 사용한 것만 제외하면 실시예 1의 절차를 따랐다. 또한, 실시예 1에 사용된 방법을 통해 QRI2 및 AFL4149를 갖지만 QRI1은 없는 돌연변이체 하나를 얻었다.

결과

a) 얻어진 돌연변이

QRI2 및 AFL4149를 갖지만 QRI1는 없는 3개의 돌연변이체 C3M-51, C3M-Q2, C3M-Q13이 단리되었다. 돌연변이 C3M-51은 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현되었다. 이 단백질은 CVFBb에 의해 절단될 수 있었다. C3b 유사 생성물은 인자 I 및 H에 의한 1320 위치에서의 절단에 대해 (야생형과 비교했을 때) 상대적으로 내성이 있었으나, 위치 1303에서는 여전히 절단될 수 있었다. 이 C3b 유도체는 따라서 인자 I에 부분적으로 내성이 있다.

<실시예 4>

돌연변이의 기능상 영향의 분석

형질감염된 COS 세포로부터 얻은 상층물 (100 - 400 ㎕)을 2 시간 동안 37 ℃에서 다음의 삽입체를 보유한 pcDNA3으로 형질감염된 COS 세포와 함께 인큐베이션시켰다.

1) 돌연변이되지 않은 C3 서열

2) 돌연변이체 C3M-I23 (Arg¹³⁰³→ Gln를 코딩)

3) 돌연변이체 C3M-26 (Arg¹³⁰³→ Gln, Arg¹³²⁰→ Gln를 코딩)

4) 돌연변이체 C3M-51 (Arg¹³²⁰→ Gln을 코딩)

형질감염하고 3일이 지난 후 채취한 배양 상층물 200 ㎕을 2 mM 페닐메탄술포닐 플루오라이드 (0 ℃, 15 분)로 예비처리한 후, 다음을 첨가하여 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.

A) 첨가 없음

B) 예비형성된 C3 컨버타제, CVFBb (10 mM MgCl₂를 함유하는 인산염 완충 염수 (PBS) 중에 CVF 6.6 ㎍, 인자 B 100 ㎍, 인자 D 1.4 ㎍을 함유하는 200 ㎕로부터 취한 10 ㎕, 15 분 동안 37 ℃에서 예비인큐베이션시킴)

C) 인자 H (5 ㎍) 및 인자 I (1 ㎍)

D) CVFBb + 인자 H 및 I

그 다음 친화성-정제된 양 항-사람 C3 면역글로불린 0.6 ㎍을 실온에서 첨가하고 1 시간 후 세척된 포르말린-고정 군 C 연쇄상구균 종 세포 (단백질 G) (Sigma 제품)의 5 % 현탁액 20 ㎕를 첨가하여 면역침전시켰다. 45 분 후 실온에서 입자들을 PBS, 5 mM NaN₃로 1 회 세척하고, 20 mM 트리스/HCl, 137 mM NaCl, 0.1 % (v/v) 트윈 20, pH 7.6으로 1 회 세척한 후, 1 % SDS/2 % 2-메르캅토에탄올 (90-100 ℃, 5 분)으로 용출했다. 이들 용출물을 SDS-PAGE로 분리했고, 니트로셀룰로오즈 상으로 전기블롯팅하고, 친화성-정제된 양 항-사람 C3 면역글로불린 및 양고추냉이 퍼록시다제-커플링된 당나귀 항-양 면역글로불린 (Sigma 제품)을 차례로 사용하여 탐침시켜 C3 밴드를 검출하고, 아머샴사가 제공하는 "인핸스트 케미루미네슨스"를 사용하여 검출했다. X-선 필름으로 2 분간 노출시킨 사진을 얻는다. 가시적인 C3-유래 밴드를 표지된 화살표로 나타내고, 개별 샘플 (1-4, A-D)은 기재된 것이다. (모든 샘플에 존재하는 약 50 kDa (46 및 68 kDa 밴드 사이)의 두드러진 밴드는 면역침전에 사용된 IgG의 중쇄이며, 양고추냉이 퍼록시다제-커플링된 당나귀 항-양 면역글로불린에 의해 검출된다.)

결과 (도 3 참조)

1. 모든 비처리 샘플 (1-A, 2-A, 3-A, 4-A)은 C3의 α 및 β 쇄에 대한 정확한 이동도의 밴드를 포함하며, 이는 모든 돌연변이가 발현되었고 번역후 정확하게 프로세싱되었음을 의미한다. 이들 샘플에서 43 또는 46 kDa 밴드의 존재는 배양 배지 내에서 몇몇 인자 H + 인자 I-유사 활성의 존재를 지시한다. 3일의 생합성 기간 동안 C3의 자발적 가수분해는 이 활성에 의해 절단된 C3i를 생성시킨다. 비돌연변이 C3에서 이것은 43 kDa 및 75 kDa를 생성시켰다 (75 kDa 밴드는 볼 수 없는데, 왜냐하면 (i) 75 kDa β 쇄에 의해 감춰져 있으며, (ii) 웨스턴 블롯을 현상하는데 사용된 항체는 C3 α 쇄의 이 부분을 향한 활성이 거의 없기 때문이며, 그의 존재는 나중에 이 영역에 특이적인 쥐 단일클론 항체 "클론-3"으로 재탐침시켜 확인했다). CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C) 없이 인자 H 및 I를 첨가하면 남아있는 C3를 절단하지 않았는데, 이것이 활성 C3 (손상되지 않은 티올에스테르)를 나타낸다는 것을 의미한다.

2. 비돌연변이 C3 (1)는 CVFBb에 의해 절단되며, C3b 생성물은 추가로 내인성 효소에 의해 1-B에서 또는 첨가된 인자 H 및 I에 의해 1-D에서 절단된다. 43 kDa 밴드는 Arg¹³²⁰에서 절단된 것을 의미하며, 68 kDa 밴드 (장시간 노출에서 가시화됨)는 Arg¹³⁰³에서의 절단을 지시한다.

3. 돌연변이 C3M-I23 (Arg¹³⁰³→ Gln)은 CVFBb에 의해 절단될 수 있으며, 그 생성물은 상대적으로 내인성 인자 H 및 I 유사 활성에 대해 내성이 있으며 (2-B), α' 쇄 (C3b) 상이한 양이 유지되지만, 초과의 인자 H 및 I가 첨가될 때 여전히 절단될 수 있었다 (2-D). 43 kDa 생성물은 Arg¹³²⁰에서 절단된 것을 가리키며 (α' 쇄의 다른 단편을 나타내는 71 kDa의 연한 밴드는 더 노출시켰을 때 관찰될 수 있었음) 68 kDa 밴드는 존재하지 않았는데, 이는 이 돌연변이가 돌연변이된 Gln¹³⁰³에서 절단에 내성이 있음을 보여준다.

4. 돌연변이체 C3M-26 (Arg¹³⁰³→ Gln, Arg¹³²⁰→ Gln)는 CVFBb에 의해 절단될 수 있었고, C3b-유사 생성물 (α')은 내인성 인자 H 및 I-유사 활성에 내성이 있었다 (3-B). 이것은 또한 비돌연변이 C3 (1) 및 다른 돌연변이 (2 및 4)와 비교할 때 추가의 인자 H 및 I (3-D)에 대한 내성이 매우 강했다. 돌연변이된 Gln¹³⁰³에서 일부 절단을 지시하는 소량의 46 kDa 생성물이 있었다 (수반되는 68 kDa 단편은 더 장시간 노출시 볼 수 있었다). Gln¹³²⁰에서의 절단에 상응하는 43 kDa는 거의 또는 전혀 검출할 수 없었다.

따라서, 위치 1303에서의 Arg → Gln 돌연변이는 인자 I에 의한 절단을 방해하는데 있어서 1320에서 보다 덜 효과적이다 (이 느린 나머지 절단은 돌연변이 C3M-I23 (Arg¹³⁰³→ Gln)에서 일어날 수도 있다). 그러나, 46 kDa 중간체는 비돌연변이 Arg¹³²⁰에서 추가 절단에 의해 43 kDa로 급속하게 프로세싱될 수 있다.

5. 돌연변이체 C3M-51 (Arg¹³²⁰→ Gln)은 CVFBb에 의해 절단될 수 있었고, 그 생성물은 내인성 인자 H 및 I-유사 활성에 의해 절단되었으며 (4-B), 추가의 인자 H 및 I (4-D)에 의해서 절단되었다. 46 kDa 생성물 (및 연한 68 kDa 밴드)는 Arg¹³⁰³에서 절단을 가리킨다. 그러나, 43 kDa 밴드의 부재는 돌연변이된 Gln¹³²⁰에서 절단되지 않음을 의미한다.

<실시예 5>

위치 1303에서 각종 아미노산 치환의 비교

1. 도입

상기한 실시예는 Arg¹³⁰³및 Arg¹³²⁰이 글루타민 잔기로 돌연변이된 것을 기재했다. 이 돌연변이는 둘다 인자 I에 의한 그 위치에서의 절단에 대해 내성을 부여했다. 그러나, Gln¹³⁰³에서의 절단은 작지만 검출할 수 있는 수준이었다. 따라서 이 위치에서 많은 다른 아미노산으로 치환하고 시험했다. 절단은 잔기 1303이 Arg > Tyr > [Cys 또는 Trp] > Gln > [Glu 또는 Gly]인 순으로 그 효능이 감소하면서 일어난다. 이 결과는 예측하지 못했던 것인데, 왜냐하면 (i) 모든 공지된 자연 발생 사람 인자 I-매개 절단이 아르기닌 잔기의 C-말단에서 일어나므로, 효소가 아르기닌을 필요로 한다는 것이 추론되었을 것이고, (ii) 다른 잔기에서 절단되었다면, 이들이 Arg과 정전기적으로 유사한, 즉 염기성 잔기 (Lys 또는 His)여야 한다고 예측할 수 있으므로 (예를 들면 트립신은 Arg, Lys 또는 His의 C-말단을 선택적으로 절단함), 티로신 치환의 절단을 예측할 수는 없었을 것이다.

따라서, 글리신 또는 글루탐산을 통한 Arg 1303의 치환이 인자 I에 의한 불활성화에 내성이 있는 C3 유도체를 만드는 목적에 적합하다.

2. 실험 방법

2.1 돌연변이 유발 : 사용된 동의성의 돌연변이 유발성 프라이머는 CAACTGCCCAGC(GT)(AG)(CG)AGCTCCAAGATCACC (괄호 안의 글자는 그 위치에서 염기의 혼합을 지시함)이었다. 돌연변이는 빈틈많은-플라스미드 방법 (선행 실시예에서 설명되어 있음)에 의해 또는 "메가프라이머법 (megaprimer method)" (V. Picard 등, Nuc. Acid. Res. 22: 2587-91 (1994))에 의해 제작되었으며, 여기서 상류 프라이머는 CACCAGGAACTGAATCTAGATGTCCCTC이고, 하류 프라이머는 GTTTTATGGTGACCTTAAGGTCGAATTTATTA였다. C3-코딩 DNA가 이미 돌연변이되어 아미노산 잔기 1320이 글루타민이고, AflII의 제한 위치가 (선행 실시예에서 기재된 바와 같이) 4149 위치에 도입된 주형을 사용하여 모든 돌연변이를 수행하고, DNA 서열분석을 통해 확인했다.

2.2 발현 : 돌연변이체는 선행 실시예에 기재된 바와 같은 [³⁵S]메티오닌으로 생합성 표지된 pcDNA3 벡터를 사용하여 무혈청 배지 중의 COS 세포에서 발현시켰다.

2.3 분석 : 상층물을 CVFBb (마그네슘 함유 완충액에서 인자 B 및 D와 CVF의 반응으로 생성) 및 인자 H 및 I로 처리한 후, (선행 실시예에서 기재한 바와 같이) 항-C3로 면역침전시키고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 환원 조건에서 수행하여 분리했다. 겔을 고정시키고 아머샴사의 "앰플리파이 (Amplify)" 시약으로 처리하고, 건조하고 자기방사능사진 필름에 노출시켜 도면에서 보인 바와 같은 결과를 얻었다.

3. 결과

1320 위치 (위치 2)에서의 절단없이 (이 위치는 글루타민으로 돌연변이됨), 1303 위치 (위치 1)에서 인자 I-매개 절단으로 46 및 68 kDa의 밴드가 생긴다. 절단은 Arg (R) > Tyr (Y) > Cys (C) 및 Trp (W) > Gln (Q) > Gly (G) 및 Glu (E)의 순서로 일어난다는 것을 알 수 있다. 야생형 (두 위치에 모두 아르기닌)은 두 위치에서 절단되어 43 (이 겔에서 가시화되기에는 너무 작음) 및 68 kDa 단편을 생성한다.

4. 도면

결과를 도 4에 나타냈다. 위치 1 (1303 위치) 및 위치 2 (1320 위치)에서의 잔기는 각 트랙 위에 표기했다.

<실시예 6>

Arg1303이 Gln으로 돌연변이된 후, 인자 I 및 H에 의한 불활성화에 대한 내성 증가의 증명

1. 도입

선행 실시예를 통해, Arg1303 또는 Arg1320이 글루타민으로 전환되면 그 위치에서 인자 I의 절단에 대해 내성을 갖게 된다는 것을 입증했다. 두 위치 모두에서의 돌연변이는 양쪽 위치에서 절단에 내성이 있는 분자로 만든다. 여기서, 우리는 Arg1303이 Gln으로 단독으로 일어난 (Arg1320에서의 변이 없이) 돌연변이가 야생형과 비교할 때 인자 I 및 H에 의한 기능 불활성화에 대해 상당한 내성을 유발한다는 것을 추가로 입증했다.

2. 방법

2.1 발현: Arg1303 → Gln 돌연변이의 제조는 선행 실시예에 기재된 바와 같다. 이는 CHO (중국 햄스터 난소 세포로부터 유래된 흔한 실험실용 세포주)내로 인산칼슘 방법으로 형질감염시키고, G418 ("Geneticin", Sigma 제품)에 대한 내성을 기준으로 안정한 형질전환체를 선별했다. 세포 배양 상층물을 모으고, 발현된 C3를 황산나트륨 침전 (10 - 20 % (w/v) 분획), 및 Q-세파로오즈 및 모노-Q-세파오로즈 상의 이온교환 크로마토그래피 (A W Dodds Methods Enzymol 223: 46 (1993))를 통해 부분적으로 정제했다.

2.2 분석 : 양의 적혈구를 SO16 단일클론 항체 (R. A. Harrison 및 P. J. Lachmann Handbook of Experimental Immunology, 제4판 39장 (1986))로 코팅하고, 5 % (v/v) 현탁액 4.4 ml를 대략 C2 10 ㎍ , C4 24 ㎍, C1 1 ㎍ (정제된 인체 성분)과 함께 CFD (R. A. Harrison 및 P. J. Lachmann, 위의 책) 중의 37 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 이 혼합물 0.8 ml를 반(半)정제 돌연변이 또는 야생형 C3 및 EDTA를 최종농도 12.5 mM으로 함유하는 0.25 ml와 함께 105 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 세포를 CFD에서 세척하고, 0.1 % (w/v) 겔라틴 (CFD-겔)을 함유하는 CFD 중에서 사용되었다. [¹²⁵I]-표지된 클론 4 단일클론 항-C3 항체를 이용한 방사능리간드 결합을 사용하여 야생형 또는 돌연변이 C3b의 유사한 양이 침착되었음을 확인했다.

분석을 위해, 세포의 5 % 현탁액 40 ㎕을 CFD-겔 250 ㎕로 희석시키고, 50 ㎕ 분액을 인자 I 및 H를 최종 농도 100, 10, 1, 0 ㎍/ml로 각각 함유하는 희석액을 함유하는 CFD-겔 50 ㎕과 함께 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 그 다음 CFD 0.9 ml를 첨가하고, 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, CFD를 1 ml씩 사용하여 2회 세척했다. 그 다음 세포를 100 ㎍/ml 인자 B, 100 ㎍/ml 프로퍼딘, 1 ㎍/ml 인자 D 및 0.3 mM NiCl₂를 함유하는 CFD-겔 100 ㎕에 재현탁시켰다. 37 ℃에서 10 분 후에, 10 mM EDTA 및 2 % (v/v) 정상 돼지쥐 (guinea-pig) 혈청을 함유하는 CFD 0.9 ml를 첨가했다. 37 ℃에서 30 분 동안 더 둔 후, 용해되지 않은 세포를 원심분리하여 펠렛화하고, 용해율을 412 nm에서 상층물의 흡광도를 측정함으로써 결정했다. 100 % 용해에 동등한 흡광도는 물 중에 용해된 세포 분액으로부터 결정되었으며, 이렇게 용해율 (%)을 계산했다.

이 분석은 침착된 C3b가 기능성 C3bBbP 컨버타제를 형성할 수 있는 능력을 측정하는 것이다. iC3b로의 전환은 컨버타제 생성 및 혈청/EDTA에서 후속 용해를 방해한다.

3. 결과

도면에 나타낸 결과는 야생형과 비교할 때 Arg1303 → Gln 돌연변이의 용혈 활성을 폐기하는데 10배 이상의 인자 I 및 H가 필요하다는 것을 지시한다. 따라서, 이 돌연변이는 C3b 생성물이 인자 H 및 I에 의한 불활성화에 내성을 갖는 C3의 유도체를 제조하는데 유리하다. 이 효과는 위치 1303에서의 절단에 대해 내성이 커진 것이 기인하거나 (Arg이 Gln으로 돌연변이 된 경우), 또는 위치 1303에서 절단이 우선 일어날 수 있는 경우 위치 1320에서 절단에 대해 내성이 더 커지는데 기인할 수 있다.

4. 도면

결과를 도 5에 나타낸다. X축은 인자 H 및 I의 농도를 가리킨다. Q1은 Arg1303 → Gln 돌연변이를 나타낸다. 용해율 (%)는 상기 방법에 기재된 바와 같이 측정한다.

토론

상기한 변형된 변이체와 관련하여 사람 C3의 필수적인 특징은 다음과 같다.

(i) 분자는 그것이 기능적으로 활성인 사람 인자 B에 결합할 수 있고, 그 다음 인자 B는 사람 인자 D에 의해 절단되어 사람 C3을 절단할 수 있는 효소를 형성할 수 있다는 점에서 기능적으로 C3b 유사 유도체를 갖는다.

(ii) 유도체의 아미노산 서열은 현재 그 서열이 공지된 어떤 다른 종의 C3 보다도 또는 현재 공지된 어떤 다른 단백질 서열보다도 사람에게서 얻은 C3에 더욱 상동이다. 야생형 단백질에는 존재하지만 변형된 유도체에는 반드시 존재하는 것은 아닌 C3의 구조적 특징으로는 다음과 같은 것들이 있다.

(a) 본 발명의 실시예에 사용된 사람 C3의 DNA 코딩 서열 및 번역된 단백질 서열은 도 2 및 1에 각각 주어져 있다. 이 단백질 서열은 공개된 서열 [2]와 단지 두 개의 아미노산 (상세한 사항은 실시예에 제공됨)만이 다르다. 대부분이 모집단으로 존재하지는 않더라도 더 많은 변이가 C3 기능과 양립할 수 있는 것으로 생각된다.

(b) 1차 번역 생성물은 신호 서열 (잔기 1-22)이 제거되면서 두 개의 디술파이드-결합 쇄, α (잔기 672-1663) 및 β (잔기 23-667)로 단백질 가수분해적으로 프로세싱된다.

(c) 성숙한 단백질은 잔기 Cys1010 및 Gln1013 사이에 티올에스테르 결합을 포함한다.

(d) C3 컨버타제는 C3를 절단하여 C3a (잔기 672-748)를 제거한다. 이 반응 후 티올에스테르 결합은 파괴된다.

(e) 인자 H의 존재하에, 인자 I는 잔기 Arg1303 및 Ser1304 사이 및 Arg1320 및 Ser1321 사이에서 C3b를 절단한다.

천연 C3 분자에 가해지는 변형

Gln에 의한 Arg1303의 치환

이 변형은 인자 I에 의한 C3b의 절단 위치 중 하나에서 일어난다. 그 영향은 이 위치에서 인자 I에 의한 절단 속도의 감소이다. 글루타민으로의 변화는, 인자 I의 세린 프로테아제 활성에 중요한 것으로 예측되는 아르기닌의 양전하를 없애면서 한편으로는 단백질 3차 구조에 대한 혼란을 최소화하도록 소수성 및 유사한 측쇄 크기를 유지하기 위해 선택되었다. 이런 가정을 뒷받침하는 증거는, 돌연변이가 2쇄 구조로의 프로세싱, 티올에스테르의 생성 또는 C3 컨버타제에 의한 C3의 절단을 방해하지 않았다는 것이다. Arg1303에서 다른 아미노산으로의 돌연변이는 실시예 5에서 입증된 바와 같이 유사한 또는 우수한 효과까지도 얻을 수 있다.

Ser1304 (절단 위치의 다른 한쪽) 또는 효소-기질 상호작용에 관련된 다른 잔기를 돌연변이시켜도 이런 절단을 감소시킬 수 있다.

Gln에 의한 Arg1320의 치환

이 변형은 인자 I에 의한 C3b의 절단의 다른 위치에서 일어난다. 그 효과는 이 위치에서 인자 I에 의한 절단 속도를 극적으로 감소시킨다 (사실상 일어나지 않음). 글루타민으로의 변화는 상기한 바와 동일한 기준으로 이루어졌으며, 이런 돌연변이는 또한 2쇄 구조로의 프로세싱, 티올에스테르의 형성, 또는 C3 컨버타제에 의한 C3의 절단을 방해하지 않았다. 또한, Ser1321 또는 효소-기질 상호작용에 관련된 다른 아미노산의 돌연변이와 마찬가지로 또다른 아미노산으로의 돌연변이도 동일한 효과를 얻을 수 있다.

두 돌연변이를 조합할 경우, Arg1303-Gln 및 Arg1320-Gln는 C3b가 불활성화되는 것을 막아서 활성 C3bBb 컨버타제의 부분을 형성하는 그의 능력을 유지한다. 두 절단 반응을 봉쇄하는 다른 돌연변이 (돌연변이의 조합을 포함)가 사용될 수 있다 (예를 들면 Arg1303 Glu 또는 Arg 1303 Gly는 Arg 1320 Gln과 조합하여 사용될 수 있다).

<실시예 7>

인자 H와 C3b/C3i의 상호작용을 감소시키는 각종 돌연변이

7.1 도입

다른 실험실들은 합성 펩티드의 영향 (Ganu, V.S. 및 Muller-Eberhard, H.J., 1985, Complement 2:27; Becherer, J.D. 등, 1992, Biochemistry 31:1787-1794) 또는 제한된 돌연변이유발 (Taniguchi-Sidle, A 및 Isenman, D.E., 1994, J. Immunol. 153:5285-5302)에 기초해서, C3 전사체 (도 1 참조)의 1차 서열에서 752-761의 잔기가 인자 H와의 상호작용에 관련될 수 있다는 것을 의미하는 증거를 발굴해냈다. 그러나, 다른 공개된 증거는 단지 잔기 767-776만이 인자 H와의 상호작용에 관련되어 있고, 반면에 잔기 752-761은 인자 B와의 상호작용에 중요하다고 제기한다 (Fishelson 1991, Mol. Immunol. 28:545-552). 우리는 이 영역의 더욱 확장된 돌연변이 유발이 인자 H에 대한 친화성을 감소시킬 수 있고 따라서 인자 H에 내성인 C3 유도체를 만들려는 목적에 바람직하리라고 추측했다. 또한 우리는 돌연변이될 중요한 잔기가 두드러진 산성 잔기 (아스파르트산 및 글루탐산)일 수 있고, 강한 상호작용을 매개하지 못할 중성 잔기로 이들을 변화시키는 것이 바람직하다고 생각했다. 이 실시예에서, 우리는 잔기 752-754를 Asp-Glu-Asp에서 Gly-Ser-Gly로 변화시키고, 이와 병행해서 잔기 758-760을 Glu-Glu-Asn에서 Gly-Ser-Gly로 변화시켰다. 나타난 생성물은 인자 H에 대한 민감도의 감소에 따라 절단 특성이 감소되었다. 이는 C3가 변형되면 인자 H의 결합 및 이에 따른 인자 H 및 I에 대한 민감도를 감소시킬 수 있다는 증거를 제공한다. 이런 변형은 생리 조건하에서 안정한 C3 컨버타제의 제조를 위해 바람직하다.

7.2 방법

돌연변이 유발, 발현 및 분석 방법은 선행 실시예에 기재되었다. 합성된 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드의 서열은 AGTAACCTGGGTTCGGGCATCATTGCAGGATCGGGCATCGTTTCC였다.

7.3 결과

절단 반응의 결과는 도 6에 나타냈다. 이들은 다음을 의미한다.

1. 야생형 C3에 CVFBb를 첨가하면, 형성된 C3b가 배양 상층물 중의 저농도의 인자 I 및 H에 민감하기 때문에 α 쇄가 제거된다 (트랙 2). 이 후속 인큐베이션 동안 생성된 C3i는 동일한 방식으로 iC3i으로 쪼개졌다. 외인성 인자 I 및 H (트랙 3 및 4)의 첨가는 각각 트랙 1 및 트랙 2와 다르지 않은데, 왜냐하면 배지 그 자체에 완전한 절단을 수행하기에 충분한 인자 H 및 I 활성을 함유하고 있기 때문이다.

2. 반대로, 돌연변이체 C3를 CVFBb (트랙 6)로 처리하면 α 쇄가 사라지지 않았다. C3b에 상응하는 α'이 일부 생성되지만 이것의 일부 또는 전부가 남아있으며, 이는 α 쇄의 존속이 단지 CVFBb의 절단이 실패한 결과만은 아니라는 것을 가리킨다. 트랙 2에 남아있는 절단되지 않은 α 쇄는, 만약 돌연변이체가 CVFBb에 부분적인 내성을 획득했다면 그의 일부가 잔존하는 천연 C3을 나타내는 것일 수도 있지만, 인자 H 및 I의 내인성 활성에 의해 절단되지 않았던 C3i를 나타내는 것일 수 있다. 고농도의 외인성 인자 H 및 I (트랙 7 및 8)를 첨가하면 α 및 α' 쇄를 고갈시키며, 이는 (i) 돌연변이체가 이들 인자에 대해 완벽한 내성이 있는 것은 아니며 (ii) 트랙 2에서 CVFBb에 의해 절단된 α 쇄는 천연 C3 (CVFBb에 의해서는 절단될 수 있지만 인자 H 및 I에 의해서는 절단되지 않음) 보다는 주로 C3i (인자 H 및 I에 의해서는 절단되지만 CVFBb에 의해서는 절단되지 않음)로부터 유래된다. 트랙 8에서도 인자 H 및 I에 대한 내성으로 인해 여전히 모든 α 쇄가 절단되는 것은 아니다.

따라서 잔기 752-754 및 잔기 758-760의 돌연변이는 C3 컨버타제에 의해 절단될 수 있는 C3 분자를 생성시키지만, 인자 H 및 I의 작용에 대해 부분적으로 내성이 있다. 이는 다른 공개 데이터를 볼 때, 아마도 돌연변이가 인자 H와 상호작용하는데 관련된 부위를 변형시켜서 인자 H에 대한 친화성을 감소시키기 때문일 것이다.

<실시예 8>

인자 B와 C3i의 상호작용을 변화시키도록 돌연변이될 수 있는 C3 내의 위치

8.1 도입

상기 실시예는 C3에 대한 돌연변이가 인자 H 및 I와 상호작용을 변화시킬 수 있다는 것을 입증했다. 인자 B와 상호작용하는 C3 내의 다른 위치를 발견하기 위해, 우리는 다른 종으로부터 얻은 C3 분자의 공지된 서열과, C4 및 다른 상동 단백질에 대해 입수할 수 있는 서열을 비교했다. 우리는 C3 및 C4 특이적 기능에 관련되었을 수 있는, 사람 C3의 잔기 1427-1433에 상응하는 부위를 판별해냈다. 이는 인자 B (또는 그의 동족체, C2, C4의 경우)와 상호작용을 포함할 수 있지만, 다른 잠재적인 기능으로 티올에스테르 형성, C3b (또는 C4b 형)으로 전환, 컨버타제 활성에서 기질 C3 및(또는) C5와의 상호작용 및 인자 I 및 그의 보조인자와의 상호작용 등이 있기 때문에, 반드시 그런 것은 아니다. 따라서, 선택된 잔기는 또다른 상동 단백질, 이 경우에는 사람의 C5에서 발견되는 (서열 배열을 기초로) 상응하는 잔기로 돌연변이되었다. 따라서, 잔기 1427은 Arg에서 Gln으로, 잔기 1431은 Lys에서 Asp으로, 잔기 1433은 Glu에서 Gln으로 바뀌었다. 생성된 돌연변이체는 C3 컨버타제 (CVFBb)에 의한 절단에 민감한 것으로 발견되었고, C3b 생성물은 인자 H 및 I에 의해 절단될 수 있었다. 그러나, 이 돌연변이체는 인자 B를 Bb 및 Ba로 전환을 돕지 않았으며, 이 전환은 인자 B가 C3i (또는 C3b)로 결합하는 것에 달려있다. 따라서, 우리는 이 부위에서의 돌연변이가 인자 B와의 상호작용을 감소시켰다는 증거를 획득했다. 이것이 과도활성 C3 컨버타제의 생성에 바람직하지 않은 반면, C3의 부위에 대한 다른 변형은 또한 인자 B와의 상호작용을 변화사키고, 이들 중 일부는 아마도 친화성을 증가시킬 수 있다는 징후를 제공한다. 결과적으로, 그러한 돌연변이는 또한 2분자 컨버타제 효소인 C3bBb (또는 C3iBb)의 안정성 및 활성을 증가시킬 수 있다.

8.2 방법

아래 표 I에 보인 배열은 이 부위가 돌연변이유발을 위한 후보로 우리가 생각했던 이유를 보여준다. 우리는 특정 잔기의 특성이 C3 및 C4에 잘 보존되어 있지만, 다른 단백질에서는 구별되게 다르다고 생각했다. 잔기 1427, 1431 및 1433은 이들의 대전된 성질이 단백질-단백질 상호작용에 관련된 군을 지시할 수 있기 때문에 선택했다. 이들은 매우 상이한 정전기적 성질을 보였기 때문에, 사람 C5에서 상응하는 잔기를, 유사한 국부적 구조를 나타낼 수 있는 일부 다른 보존된 잔기의 맥락 내에 변화시켰다.

C3 서열의 배열 및 사람 C3의 잔기 1427-1435 영역에 대한 관련 분자

단백질	종	잔기 (사람)
단백질	종	1427	1428	1429	1430	1431	1432	1433	1434	1435
C3	사람	R	Y	I	S	K	Y	E	L	D
	생쥐	R	Y	I	S	K	Y	E	M	N
	쥐	R	Y	I	S	K	Y	E	M	D
	돼지쥐	R	Y	I	S	K	Y	E	L	D
	토끼	R	Y	I	S	K	Y	E	L	N
	코브라	R	Y	I	S	K	F	E	I	D
	두꺼비	K	Y	I	S	K	Y	E	V	N
	송어	R	Y	I	E	K	F	E	M	D
C4	사람	R	Y	V	S	H	F	E	T	E
	생쥐	R	Y	V	S	H	F	E	T	D
Slp	생쥐	R	Y	V	S	H	F	E	T	D
C3/C4유사	먹장어	N	Y	I	V	Q	Y	E	I	R
	칠성장어	K	Y	I	S	N	Y	E	I	T
C5	사람	Q	L	F	T	D	L	Q	I	K
	생쥐	Q	L	L	T	D	L	Q	I	K
A2M	사람	P	T	V	K	M	L	E	R	S
	생쥐	P	S	V	K	R	L	Q	D	Q
	쥐	P	T	V	K	M	L	E	R	S
PZP	사람	P	T	V	K	M	L	E	R	S
뮤리노 글로불린	생쥐	P	T	V	K	K	L	E	R	L
A1M	쥐	P	S	V	K	K	L	Q	D	Q
A1M	햄스터	P	T	V	K	K	L	E	R	S
A1I3	쥐	P	T	V	K	K	L	E	R	L

돌연변이 유발 방법, 발현 방법, 및 C3 절단 반응의 분석 방법은 선행 실시예 (실시예 1-4)에 기재된 바와 같았다. 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드는 서열 TGGTGTTGACCAATACATCTCCGACTATCAGCTGGACAA로 합성했다.

인자 B의 전환에 대한 분석

발현된 생성물을 COS 세포 배지로부터 실시예 9에 기재된 바와 같이 클론-3-세파로오즈 칼럼으로 친화성 정제를 통해 정제했다. 이 방법은 티올에스테르 파괴 형태, C3i의 상당한 전환율을 유발했다. 야생형 C3는 동일한 절차를 통해 단리했다. 야생형 C3의 희석액 (1/5, 1/25, 1/125)을 SDS-PAGE 겔 (환원 조건)상에서 돌연변이체 C3와 함께 전기영동시키고, 이를 은 염색한 결과, 돌연변이체가 야생형의 1/25의 희석액 보다는 약간 작고 1/125 희석액 보다는 훨씬 큰 농도임을 지시했다. 동일한 희석액을 인자 B 전환에 대한 분석에 사용했다. 이들 C3 5 ㎕을 5 ㎍/ml 인자 D 및 대략 1.6 ㎍/ml¹²⁵I-표지 인자 B (약 1000 - 2000 dpm/㎕)를 함유하는 CFD-G 25 ㎕과 함께 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 샘플을 SDS-PAGE (환원 조건)과 건조된 겔의 자기방사능사진으로 분석했다. 결과를 도 7에 나타냈다.

8.3 결과

도 7에서 보는 바와 같이, 인자 B의 상이한 절단은 야생형 C3 (C3i)의 1/125 희석율에서도 나타난다. 반대로, 돌연변이 C3가 존재할 때는 희석되지 않고 야생형의 1/125 샘플 보다 농도가 높은 경우에도 절단은 별로 관찰되지 않았다.

따라서, 이 돌연변이체는 아마도 유력하게는 인자 B에 대한 그의 결합 친화성의 감소에 기인된 인자 B의 절단을 돕는 능력이 손상된 것으로 보인다. 따라서 이것은 C3i (또는 C3b)와 인자 B 사이의 상호작용 및 컨버타제 (C3iBb 또는 C3bBb)의 안정성도 조절하도록 돌연변이될 수 있는 C3의 부위이다.

<실시예 9>

발현된 돌연변이 C3 분자의 정제

9.1 도입

이 실시예는 돌연변이 C3 분자가 어떻게 형질감염된 진핵 세포의 배양 배지 등의 발현 배지로부터 단리될 수 있는지를 보여준다. C3 분자는 간단한 친화성 정제에 의해서도 기능 시험 및 실시예 10에 기재된 바와 같은 방법으로 항체를 접합시키기 위한 충분한 순도로 얻어진다. 항체로부터 용출이 내부 티올에스테르의 상당부분의 가수분해에 의해 수반되지만, C3i 생성물은 활성 C3 컨버타제의 생성 및 C3i-항체 접합체의 생성을 위한 여전히 안정한 전구체이다. 이런 접근은 또한 생체내 사용을 위해 필요한 제제의 일부로 유용할 수 있다.

9.2 방법

클론-3-세파로오즈 상의 친화성 정제

클론-3은 C3와 C3b 및 C3i를 비롯한 그의 유도체에 특이적인 쥐 단일클론 항체이다 (Lachmann, P. J. 등, 1980, J. Immunol. 41:503-515). C3에 대한 다른 단일클론 항체도 사용할 수 있으며, 몇몇 경우에는 소량의 사람 혈장에서 C3를 단리하는데 성공적으로 사용되어 (Dodds, A.W., 1993, Methods Enzymol. 223: 46-61), 생체외부에서 발현되는 분자의 단리에 적용할 수도 있을 것이다. IgG 분획을 브롬화시아노겐을 사용하는 세파오로즈 CL-4B로 커플링시켰다 (Harrison 및 Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 제4판, (편) Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg; Blackwell, Oxford에서 그 방법이 기재되어 있다). 배양 상층물을 이 수지 칼럼 (재순환)을 직접 통과시키거나 또는 우선 25 % (w/v) Na₂SO₄로 침전시켜 농축시키고 PBS, 5 mM NaN₃로 재용해 및 투석시켰다. 그 다음 칼럼을 (i) PBS, 5 mM NaN₃및 (ii) 1 M NaCl을 함유하는 PBS로 차례로 세척했다. 결합된 C3를 50 mM Na 붕산염 완충액, pH 10.5로 용출하고, 즉시 0.9 ml 분획을 0.1 ml 1 M 트리스/HCl pH 7과 합해서 즉각 중화시킨다. 그 다음 이 물질을 PBS, 5 mM NaN₃로 투석시킨다.

"His-Tag"를 갖는 C3의 제조

"His-Tag"는 니켈 이온을 갖는 칼럼에 대해 친화성을 보이는 일련의 히스티딘 잔기이다. 이 방법은 발현된 단백질을 단리하는데 보조적으로 사용되었다. 우리는 이것이 발현된 돌연변이 C3 분자를 단리하는데 유용할 수 있다고 생각했기 때문에, C3를 코딩하는 플라스미드가 카르복시 말단 (잔기 1663에 바로 인접한 카르복시-말단)에서 6 개의 히스티딘 잔기의 꼬리를 갖도록 삽입 돌연변이를 유발했다. His 꼬리표를 위한 위치는 초기 C3의 합성, 폴딩, 프로세싱 및 디술파이드 결합 생성에 대한 방해를 최소화하도록 선택했다. 잔기 1661은 서열에서 보다 앞선 잔기 (아마도 Cys 1537; Dolmer, K 및 Sottrup-Jensen, L., 1993, FEBS-Lett 315; 85-90)와의 디술파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기이며, 따라서 이 구조적 특징을 넘어서는 삽입은 신중해야 했다. 돌연변이는 실시예 1에 사용된 "빈틈많은-플라스미드" 방법을 통해, 서열 TGGGTGCCCCAACCATCATCATCATCATCATTGACCACACCCCC으로 합성된 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 도입했다.

정확한 서열이 도입되었는지 여부는 DNA 서열분석을 통해 확인했다. 이 DNA 서열은 이제 발현 벡터로 이전시킬 수 있다. 진핵 세포를 형질감염시킨 후, 니켈 이온을 갖는 칼럼에 대한 친화성을 이용해서 또는 "His-Tag"에 대한 특이적 친화성을 갖는 어떤 다른 매트릭스를 이용해서 발현된 C3를 단리할 수 있을 것이다.

9.3 결과

CHO 세포에서 발현된 실시예 1 및 2에 기재된 것들을 포함해서 많은 돌연변이 C3가 클론-3-세파로오즈 상에서 정제되었다. 생성물은 인자 D에 의한 인자 B의 절단을 돕는 능력을 보유하고 있었다. 동일한 방법이 COS 세포에서 발현된, 실시예 B2에서 기재된 돌연변이체를 단리하는데도 사용되었다. SDS-PAGE 겔을 은 염색한 결과, 단리된 생성물은 100 % 순도는 아니지만 대개 50 % 이상의 순도를 나타냈다. 이는 10 % (v/v) 태 송아지 혈청 중의 10 ㎍/ml 이하의 C3 및 다른 세포내 단백질을 일반적으로 함유하는 출발 물질로부터 나온다. 또한 C3는 단리시에 분해되지 않았으며, 내인성 인자 H 및 I 활성은 제거되었던 것처럼 보였다.

"His-Tag"을 이용한 정제는 니켈 이온 함유 칼럼으로부터 보다 부드러운 용출 조건을 수반한다. 예를 들면, EDTA를 사용했다. 이런 방법을 C3에 적용하면 내부 티올에스테르 결합을 파괴하지 않고 단리할 수 있어야 한다.

<실시예 10>

항체로 C3i의 접합 및 특정 세포에 대해 C3 컨버타제 활성을 겨냥하기 위한 용도

10.1 도입

본 발명의 한 측면은, 돌연변이 C3 분자로부터 유도된 안정한 C3 컨버타제가 만약 특정 표적 위치에 위치된다면 그 표적의 보체 의존적 공격을 촉진하는 C3 전환율을 향상시킬 것이라는 것이다. 이 반응을 겨냥하기 위한 유리한 방법은 돌연변이 C3 분자를 C3i 또는 C3b 유도체로서, 원하는 표적에 특이적인 항체와 커플링시키는 것이다. 이 실시예에서, 우리는 그러한 접합체의 생성을 위한 실행 방법을 입증하며, 이 방법은 돌연변이 C3i 또는 C3b 분자에 적용할 수 있고 C3의 티올에스테르가 이 과정에서 파괴된다고 해도 발현계로부터 친화성-정제된 물질에 대해 사용될 수 있다. C3i를 양 적혈구에 특이적으로 결합하는 항체와 커플링시킴으로써, 우리는 또한 접합체가 C3i를 적혈구 표면에 고정시켜서, 컨버타제, C3iBbP가 형성될 수 있고, 이는 다른 보체 구성성분이 (C3 컨버타제의 새로운 형성을 방해하기 위해 EDTA 중에) 정상 돼지쥐 혈청의 형태로 공급될 경우 이들 세포의 용해 (lysis)를 촉발시키게 됨을 증명한다. 그러므로 항체와의 접합은 특정 세포 형태의 보체 의존적 공격을 촉발하기 위한 C3i 분자를 겨냥하는데 사용될 수 있다. 이 실시예는 시험관내에서 C3 컨버타제를 형성하는, 사람의 혈장에서 얻은 야생형 C3i를 사용한다. 생체내에서, 야생형 C3i 및 C3b는 인자 H 및 I에 의해 파괴된다. 따라서, 본 출원의 방법에 따라 제작되어 인자 H 및 I에 내성이 있으며 안정한 C3 컨버타제를 형성하는 돌연변이 C3는 생리학적 측면에서 유리할 것이다.

10.2 방법

(i) C3i-항체 접합체의 생성 및 정제

사용된 항체는 다클론 토끼 항-양 적혈구 항혈청에서 단리한 IgG 분획이었다. 1.1 mg을 접합 완충액 (pH 7.5, 20 mM KH₂PO₄, 60 mM Na₂HPO₄, 0.12 M NaCl) 중에서 75 nmol의 SPDP와 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. PDP-IgG는 슈퍼로오즈-6 칼럼 (Pharmacia 제품) (인산염 완충액 중에서, pH 7.4, 0.5 M NaCl을 함유) 상에서 겔-여과를 통해 정제했다. 샘플을 디티오트레이톨로 환원시켜서 IgG 분자당 커플링된 PDP 기가 4개인 것으로 평가되었다. C3i는 정제된 C3를 0.1 M 메틸아민 (pH 7.2, 37 ℃에서 2 시간)으로 처리하여 제조했다. 과량의 메틸아민은 겔-여과 후 접합 완충액으로 투석시켜 제거했다. C3i 18 nmol을 1.26 ml 접합 완충액 중의 PDP-IgG 1.7 nmol과 혼합하고, 실온에서 1일간, 4 ℃에서 1.5 일 인큐베이션시켰다. 도 8은 접합 반응 혼합물의 쿠마지에 블루 염색 SDS-PAGE 겔을 나타내며, PDP-IgG 또는 C3i에 존재하지 않는 대략 350 kDa의 생성을 보여준다. 이것은 0.5 M NaCl을 함유하는 인산염 완충액 (pH 7.4)으로 슈퍼로오즈-6 칼럼 상에서 겔-여과하고 PBS 내로 투석하여 부분적으로 정제했다. 이는 구형 분자량 표준으로 측정한 결과 분자량 300 - 400 kDa인 부피로 C3 보다 먼저 용출되었다. 접합체, 유리 항체 및 비커플링된 C3의 농도는 쿠마지에-염색 SDS-PAGE 겔 (비환원 조건)으로부터 추정했다. 2차원 SDS-PAGE (제1 축은 비환원 조건, 제2 축은 환원 조건) 결과, IgG 및 C3i 사이의 1 : 1 접합체와 일치하는 패턴이 나타났다.

(ii) C3-항체 접합체가 특정 세포에 대해 컨버타제 활성을 겨냥하는데 사용될 수 있음을 증명.

접합체의 희석액 20 ㎕ (0 (접합체 없음), 1/100, 1/50, 1/10)를 37 ℃에서 1 시간 동안 (CFD에서 예비세척된) 대략 1 % (v/v) 양 적혈구 100 ㎕과 인큐베이션시켰다. 동등한 양의 PDP-IgG (C3 없음) 및 C3 단독로도 동일하게 인큐베이션시켰다. 그 다음 세포를 CFD로 4회 세척하고, CFD-G 중에 100 ㎕로 재현탁시켰다. 이 현탁액 50 ㎕를 150 ㎕의 H₂O로 용해시킨 후, 10 mM EDTA 및 2 % (v/v) NGPS를 함유하는 800 ㎕의 CFD를 첨가했다. 접합체로 코팅한 세포의 다른 50 ㎕를 190 ㎍/ml 인자 B, 2 ㎍/ml 인자 D, 20 ㎍/ml 프로퍼딘 및 0.6 mM NiCl₂를 함유하는 CFD-G 50 ㎕과 함께 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 37 ℃에서 30 분 후, 세포를 원심분리하여 펠렛화하고 (2000 x g, 약 3분), 상층물의 흡광도를 412 nm에서 측정했다. H₂O로 처리한 샘플 (100% 용해율) 및 세포가 없는 완충액 블랭크를 사용하여 용해율 (%)을 도 9에 나타낸 바와 같이 계산했다. 접합체는 용량의존적인 세포용해를 유발한 반면, PDP-IgG 및 C3i 단독의 경우에는 임의의 그러한 처리가 없이 관찰된 어떠한 세포용해도 의미있을 정도로 일어나지 않았다.

10.3 결과의 요약

사용된 방법은 다음과 같은 이유로 C3i를 IgG에 커플링시키는데 성공적이었다.

1. 도 8에서 SDS-PAGE를 통해 보인 1 : 1 C3 : IgG에 대해 적당한 크기 (약 350 kDa)의 밴드 생성.

2. 이런 류가 IgG 및 C3i를 함유했다는 것을 지시하는 2차원 SDS-PAGE (제1 축은 비환원 조건, 제2 축은 환원 조건).

3. 겔 여과시 이런 류의 용출 특성이 약 350 kDa인 분자와 다시 일치함.

4. 접합체는 PDP-IgG 또는 C3i에 의해 나타나지 않는 용혈 활성을 보임 (도 9).

용혈 분석 (도 9)은 또한 다음과 같은 사항을 입증한다.

1. 특이적 항-양 적혈구 항체는 C3i를 표적 세포 (양 적혈구) 막에 위치시켜서 C3i가 (유리 C3i와 반대로) 세척되어 제거되지 않게 했다.

2. 접합체는 프로퍼딘 및 인자 B 및 D와의 반응에 의해 C3 컨버타제를 여전히 형성할 수 있다는 점에서 C3i의 활성을 보유하고 있다.

3. 이 컨버타제는 표적의 보체-의존적 공격을 촉발시킬 수 있으며, 이 경우에 적혈구를 세포용해시킬 수 있는 용해 경로 (C5-9)를 활성화시킨다.

다른 실험실들로부터 얻은 추가의 데이터는 코브라 독액 인자가 항체와 커플링될 수 있으며, 이들 접합체는 특정 세포형에 대한 보체 활성화를 겨냥시킬 수 있다는 것을 보여준다 (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Ther., 1 : 191-224; Muller, B. 및 Muller-Rucholtz, W., 1987, Leuk. Res. 11: 461-468; Parker, C.J., White, V.F. 및 Falk, R. J., 1986, Complement 3 : 223-235; Petrella, E. C. 등, 1987, J. Immunol. Methods 104:159-172). 이들 데이터는 안정한 C3 컨버타제를 형성할 수 있도록 변형된 C3는 코브라 독액 인자와 마찬가지로 본 발명에서 개략된 보체 매개 반응을 겨냥할 수 있음을 뒷받침한다.

<실시예 11>

돌연변이 C3 분자가 정상 사람 혈청에서 인자 B 전환을 유도함을 증명.

11.1 도입

본원에 기재된 본 발명의 주요 목적은 생물 유체로부터 보체 활성을 소비시켜 고갈시키는 것이다. 본 발명은 인자 H 및 I의 하향 조절에 내성이 있는 C3 분자의 제조 방법을 기재한다. 이 상태에서, C3 분자는 인자 B와 결합하여 활성 C3 컨버타제를 생성할 것이다. 이들 컨버타제의 활성은 실시예 6에서 사용된 용혈 분석으로 증명된다. 그러한 컨버타제는 따라서 C3을 소모할 것이다. 컨버타제가 불안정하다면, 이것은 많은 C3 전환이 없이도 해리될 것이다. 그러나 이는 새로운 인자 B의 결합 및 Bb 및 Ba로의 전환을 가능하게 할 것이다. 따라서, 돌연변이 C3는 인자 B의 소비를 촉진하여, 궁극적으로 제2 경로를 무력화시키고, 고전 경로 자극을 증폭시킬 수 없게 될 것이다. 안정한 C3 컨버타제가 형성된다면, 인자 B의 전환은 감소될 것이지만, C3의 소비는 증가될 것이다. 따라서, 두가지 상황 모두 바람직할 수 있다. 이 실시예에서 우리는 컨버타제의 안정성을 변화시키기 위한 변형은 가하지 않고 인자 I에 대해 내성을 갖도록 변형된 돌연변이 C3 분자가 사람 혈청내에서 인자 B의 전환을 촉진한다는 것을 증명한다. 야생형 C3는 반대로 거의 전환을 유발하지 못하는데, 이는 아마도 야생형 C3i가 인자 H 및 I에 의해 급속하게 분해되기 때문일 것이다.

11.2 방법

돌연변이체는 다음과 같이 제조된다.

Q1R2 Arg1303이 Gln으로 변화 (실시예 2)

Q1Q2 Arg1303이 Gln으로, Arg1320이 Gln으로 변화 (실시예 1)

E1Q2 Arg1303이 Glu으로, Arg1320이 Gln으로 변화 (실시예 5)

이들 돌연변이는 모두 CHO 세포에서 발현된 후, Na₂SO₄로 침전시키고, 클론-3-세파로오즈로 실시예 B3에 기재된 바와 같이 친화성 정제를 통해 정제했다. 야생형 C3 (R1R2)는 유사하게 단리되었다. SDS-PAGE를 은-염색함으로서, Q1의 농도는 야생형의 1/5 및 1/25 사이였고, Q1Q2의 농도는 야생형의 약 1/5였으며, E1Q2의 농도는 야생형의 1/25 및 1/125 사이였다. 모든 제제는 아마도 대부분의 티올에스테르-파괴 분자를 함유하고 있었을 것이다 (C3i).

이들 C3 제제 10 ㎕을 1 mM MgCl₂및 대략 300 ng¹²⁵I-표지 인자 B (대략 2-300,000 dpm)을 함유하는 PBS 중의 20 % (v/v) 정상 사람 혈청 용액 10 ㎕과 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 5 ㎕를 SDS-PAGE (환원 조건)로 분석했다. 건조된 겔을 자기방사능사진 필름에 노출시킨 결과, 손상되지 않은 인자 B 및 그의 절단 생성물에 상응하는 밴드의 위치가 나타났다. 그 다음 이 밴드를 잘라내어 계수하여 절단 정도를 정확하게 결정했다. 완충액 자체만으로 얻은 값을 기본값으로 뺐다 (기본 절단 및 방사능리간드 제제에 존재하는 분해 생성물 및 다른 불순물 등을 포괄).

11.3 결과

결과적인 인자 B의 절단 정도는 아래와 같았다.

1/25 야생형 1.49 %

1/5 야생형 2.74 %

Q1R2 6.19 %

Q1Q2 7.41 %

E1Q2 6.42 %

따라서, 인자 I 내성 돌연변이체는 모두 동등한 양의 야생형 C3 (C3i) 보다 더 큰 수준의 인자 B 절단을 유발한다. 용량이 더 크고 인큐베이션을 더 장시간 수행할수록 제2 경로가 완전히 무력화될 것이다.

상기 실시예에 사용된 약자는 다음과 같은 의미를 갖는다.

CFD (보체 고정 희석제; Harrison 및 Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 제4판 (편) Weir, Herzenberg, Blackwell 및 Herzenberg, Blackwell, Oxford), CFD-G (0.1 % (w/v) 겔라틴 함유 CFD), PBS (인산염 완충 염수), NGPS (정상 돼지쥐 혈청), SDS-PAGE (SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동), SPDP (N-숙신이미딜-3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트)

<실시예 12>

잔기 992-1000의 돌연변이

1. 도입

다른 연구결과는 인자 H과 상호작용하는데 관련되어 있을 수 있는 사람 C3b의 여러 잔기를 제시하는 합성 펩티드의 영향에 기초한 증거를 획득했다 (Ganu, V.S. 및 Muller-Eberhard, H. J., 1985, Complement 2 : 27; Becherer, J. D. 등, 1992, Biochemistry 31:1787-1794; Fishelson, Z., 1991, Molecular Immunology 28: 545-552; Lambris, J.D., Ganu, V.S., Hirani, S. 및 Muller-Eberhard, H. J., 1988, J. Biol. Chem. 263; 12147-12150). 우리는 C3-특이적 기능에 관련된 잔기들을 예측하는데 다른 접근방법의 서열 비교를 사용했다. 위치 지정 돌연변이를 수행하여 이들 후보 대부분이 인자 H에 대한 기능적 민감도에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 지시했다. 그러나, 몇몇 돌연변이는 인자 H에 대한 민감도를 감소시켰다. 이들 돌연변이는 인자 H와 상호작용하거나 또는 그의 결합을 조절하는 것으로 이전에는 밝혀지지 않았던 분자의 부분에 가해졌다. 따라서, 이런 한정된 잔기의 돌연변이 유발을 사용하여 생리적 환경에서 인자 H에 의한 억제에 대해 부분적으로 또는 완전히 내성인 C3의 돌연변이 유도체를 제조할 수 있으며, 인자 H에 의한 불활성화에 유사하게 내성인 복합체 C3 컨버타제 효소 (C3bBb 등)를 형성할 것이다.

인자 H는 CR1, MCP 및 DAF를 비롯한 다른 보체 억제 단백질에 구조적으로 상동이다. 이런 분명한 진화적 관련성 및 결합에 있어서의 상호 경쟁을 고려할 때, 이들은 인자 H에 구조상 유사한 방식으로 C3b와 상호작용할 것이다 (Farries 등, 1990, Complement Inflamm. 7:30-41). 인자 H에 대한 민감도를 조절하는 상기한 돌연변이는 이들 다른 단백질과 상호작용을 조절하는데, 특히 이들의 보체 하향 조절 활성을 모면하려는 목적을 위해 사용할 수 있다. 이들은 또한 인자 B (및 C4b에 결합하는데 관여하는 C2내의 상동 도메인)에서 SCR 도메인과 상호작용을 변형시키는데도 적용될 수 있다. C4 및 C5의 상응하는 부위에 대한 돌연변이도 또한 C1r 및 C1s (C4), C4b 결합 단백질 (C4b), 및 C6 및 C7 (C5b) 내의 SCR 도메인과 상호작용을 변형하는데 유용할 수 있다.

2. 방법.

2.1 C3-특이적 기능에 관련된 잔기의 검색

공공 데이터베이스를 통해 입수할 수 있는 서열을 갖는 모든 상동 단백질과 사람 C3의 배열로부터 예측했다. 상동 단백질로는, 생쥐, 쥐, 돼지쥐, 토끼, 코브라, 두꺼비, 닭 및 송어의 기능적으로 동등한 분자, 사람 및 생쥐 C4, 사람 및 생쥐 C5, 칠성장어 및 먹장어의 C3-유사 단백질, 코브라 독액 인자 (CVF), 사람의 α-2-마크로글로불린 및 이의 동족체 등이 있다. 상이한 C3들 사이에 보존되어 있지만, 관심이 있는 C3 특이적 기능을 결여한 동족체 (주로 C5 및 CVF)에서는 구별되게 다른 서열을 검색했다. 이들 중 일부는 C5 또는 CVF에서 상응하는 잔기를 코딩하도록 돌연변이시키고, COS 세포에서 발현시키고, 분비된 생성물을 CVFBb 및 인자 H 및 I의 존재시 절단을 대해서 시험했다. 모든 방법은 표준 방법 및 실시예 1에 기재된 바와 같다. 결과를 표 II에 요약했다.

2.2 돌연변이 DV-1AM의 제작 및 분석

이 돌연변이체는 문헌 (V. Picard 등, 1994, Nuc. Acid. Res. 22:2587-2591)에 기재된 바와 같이 "메가프라이머 방법"을 사용하여 다른 돌연변이체와 동일한 방법으로 제조했다. 돌연변이 유발성 프라이머의 서열은 돌연변이 E992S, D993A, D996S, A997Q, E998S, R999G를 코딩하는 CCAGATGACAAGTGCTGCCGTCAGCCAGTCAGGGCTGAAGCACC였다. 상류 프라이머의 서열은 TGTCATCGTGCCGCTAAAGA (데옥시뉴클레오타이드 2754-2773에 상응)이었고, 하류 프라이머의 서열은 GTTTTATGGTGACCTTAAGGTCGAATTTATTA (데옥시뉴클레오타이드 4130 - 4165에 상보적, 4149 위치에서 제한 효소 Afl II를 위한 절단 위치 도입)이었다. 위치 4149에서 Afl II를 위해 도입된 위치와 함께 C3의 코딩 서열을 포함한 벡터로 돌연변이된 DNA 단편을, Afl II 및 EcoRI (위치 2997에서 자름)으로 둘을 자르고 원하는 생성물을 정제하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 라이게이션시켰다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아 콜로니로부터 단리하고, 틀림없는 돌연변이를 DNA 서열 분석을 통해 판별했다. 이 때, DNA 서열은 돌연변이 L1000M을 코딩하도록 추가적으로 돌연변이되었다는 것이 발견되었다. 생성된 발현 벡터로 COS 세포를 형질감염시키고, 분비된 발현 생성물을 상기한 바와 같이 절단 반응에 대해 분석했다.

3. 돌연변이 DV-1AM의 성질

DV-1AM 돌연변이를 갖는 발현 생성물의 분석 결과를 도 10에 보였다. 주목해야할 사항은 다음과 같다.

(i) 웨스턴 블롯은, 전구체, α, α', 77 및 68 kDa 단편을 검출하고, β, 43 또는 46 kDa 단편은 검출하지 못하는 C3의 C3dg 부위에 대한 단일클론 항체로 현상시킨다.

(ii) DV-1AM 생성물 (레인 B1-4)의 모든 밴드는 동등한 야생형 밴드 (레인 A1-4)의 약간 아래에 나타난다. 이동도의 변동은 가해진 돌연변이의 결과이다.

(iii) CVFBb를 이용한 야생형 C3의 절단으로, C3b로부터 약간의 α' 쇄가 생기고 내인성 인자 H 및 I 활성에 의한 C3b에서 iC3b로의 절단으로부터 더 많은 68 kDa가 생겼다 (레인 A3). 외인성 H 및 I를 추가하여 C3b에서 iC3b로의 전환을 완료했다 (레인 A4). 반대로, CVFBb에 의한 DV-1AM 생성물의 절단은 더 많은 양의 α' 쇄 및 단지 소량의 68 kDa 단편을 생성시켰다 (레인 B3). 외인성 H 및 I의 첨가로, 이 C3b를 iC3b로 전환했다 (레인 B4). 따라서, 외래에서 첨가된 H 및 I의 고농도에 의한 절단에 대한 민감도에 의해 나타나는 바와 같이 내성은 완전하지는 않지만, 돌연변이 C3b는 내인성 H 및 I에 대해 야생형 보다 더욱 내성이 크다.

4. 결론

DV-1AM 돌연변이는 인자 I에 의한 인자 H 의존적 절단에 대한 내성을 유발한다. 변형된 잔기가 인자 I에 의한 절단 위치와 (1차 구조에서) 멀기 때문에, 손상되는 것이 인자 H와의 상호작용일 것이라고는 하지만, 그 메커니즘은 확실한 것은 아니다. 이 경우에, 돌연변이는 또한 (i) C3b (또는 C3i)에 대한 결합에 있어서 인자 B와의 경쟁 및 (ii) C3bBb 및 C3bBbP 컨버타제의 가속화된 해리 등 인자 H의 다른 억제 활성에 대한 내성을 부여할 것이다. DV-1AM 돌연변이는 인자 H에 대한 친화성을 유지하는데 직접 또는 간접적으로 관련된 잔기를 변형시켰다. 동일한 잔기의 많은 다른 돌연변이는 아마도 유사한 효과를 가질 것이며, 단지 일부 변형된 잔기뿐만 아니라 1차 구조의 이 세그멘트 내의 다른 잔기의 돌연변이도 그러한 효과를 달성할 수 있을 것이다.

<실시예 13>

잔기 1001-1005의 돌연변이

1. 도입

상기 실시예에 기재된 바와 같이, 잔기 1001, 1002 및 1005도 C3-특이적 기능에 필수적일 수 있는 후보로서 판명되었다. 돌연변이를 통해 이들 잔기의 변형이 인자 H에 대한 내성을 부여하는데 사용될 수 있다는 것을 확인한다.

2. 방법

2.1 돌연변이 DV-1B의 제작 및 분석

돌연변이 유발성 프라이머의 서열이 돌연변이 K1001N, H1002I 및 V1005H를 코딩하는 AACGGCTGAACATATTAATTCATACCCCCTCGGGC이었다는 것을 제외하면, 사용된 방법은 선행 실시예에 대해 기재한 바와 같았다. 단리된 플라스미드 DNA를 서열분석하여 정확한 돌연변이가 도입되었는지를 확인했다. 아무런 다른 돌연변이도 검출되지 않았다.

3. 돌연변이 DV-1B의 특성

DV-1B 돌연변이를 갖는 발현 생성물의 분석을 도 11에 도시한다. 주목해야 할 사항은 다음과 같다.

(i) 웨스턴 블롯은, 전구체, α, α', β, 43 및 46 kDa 단편을 강력하게 검출하고, 77 및 68 kDa 단편은 단지 약하게만 검출하는 C3에 대한 다클론 항체로 현상시킨다. 주목해야 할 것은 α 및 α' 쇄는 이동하지 않아 100 % 효율로 검출되지 않으며, 이들 밴드의 강도는 예상치보다 낮고 존재하는 실질적인 양에 대한 적절치 못한 지표이다.

(ii) CVFBb를 이용한 야생형 C3의 절단으로, C3b로부터 약간의 α' 쇄가 생기지만, 이들 대부분은 내인성 인자 H 및 I 활성에 의한 C3b에서 iC3b로의 절단으로부터 손실된다 (레인 B3). 이는 대부분 43 kDa 단편으로 나타나며, 46 kDa 중간체도 소량 볼 수 있다. 외인성 H (레인 B4) 2 ㎍/ml를 인자 I와 함께 첨가하면 눈에 띄는 추가의 절단이 유발되며, 외인성 H (레인 B5, B6) 10 - 50 ㎍/ml은 C3b를 완전히 절단된 (α' 또는 46 kDa 밴드 없음) iC3b로의 전환을 완료했다. CVFBb에 의한 DV-1B 생성물의 절단으로, 소량의 α' 쇄가 생성되었다 (레인 A3, 존재하는 C3의 총량은 너무 작고, α 및 α' 밴드는 매우 연하다). 중요하게는 외인성 H 및 I의 부재시에 생성되는 43 kDa 쇄의 양은 야생형에서보다 작고, 46 kDa 중간체 단편은 상대적으로 더 크게 나타났는데, 이는 절단이 덜 효과적이었음을 의미한다. 외인성 H 및 I (레인 A4-6)를 첨가하여 이 C3b에서 iC3b로의 전환을 완료시키지만, 46 kDa이 여전히 분명한 경우 43 kDa 생성물은 H 50 ㎍/ml까지는 용량에 의존해서 증가하는 것으로 나타난다 (레인 A6). 따라서, 외래에서 첨가된 H 및 I의 고농도에 의한 절단에 대한 민감도에 의해 나타나는 바와 같이 내성은 완전하지는 않지만, 돌연변이 C3b는 내인성 및 외인성 H 및 I에 대해 야생형 보다 내성이 강하다.

4. 결론

DV-1B 돌연변이는 인자 I에 의한 인자 H-의존적 절단에 대해 내성을 유발한다. 변형된 잔기가 인자 I에 의한 절단 위치로부터 (1차 구조에서) 떨어져 있고 그효과가 첨가된 인자 H의 용량에 의존했기 때문에, 인자 H와 상호작용이 메커니즘은 확실하지 않다. 이 경우에, 돌연변이는 또한 (i) C3b (또는 C3i)에 대한 결합에 있어서 인자 B와의 경쟁 및 (ii) C3bBb 및 C3bBbP 컨버타제의 가속화된 해리 등 인자 H의 다른 억제 활성에 대한 내성을 부여할 것이다. DV-1B 돌연변이는 인자 H에 대한 친화성을 유지하는데 직접 또는 간접적으로 관련된 잔기를 변형시켰다. 동일한 잔기의 많은 다른 돌연변이는 아마도 유사한 효과를 가질 것이며, 단지 일부 변형된 잔기뿐만 아니라 1차 구조의 이 세그멘트 내의 다른 잔기의 돌연변이도 그러한 효과를 달성할 수 있을 것이다.

<실시예 14>

잔기 1152-1155의 돌연변이

1. 도입

상기 실시예에 기재된 바와 같이, 잔기 1152, 1153 및 1155도 C3-특이적 기능에 필수적일 수 있다. 돌연변이를 통해 이들 잔기의 변형이 인자 H에 대한 내성을 부여하는데 사용될 수 있다는 것을 확인한다.

2. 방법

2.1 돌연변이 DV-6의 제작 및 분석

돌연변이 유발성 프라이머의 서열이 돌연변이 Q1152R, E1153K 및 K1155F를 코딩하는 ATCTCGCTGCGCAAGGCTTTCGATATTTGCGAG이었다는 것을 제외하면, 사용된 방법은 선행 실시예에 대해 기재한 바와 같았다. 단리된 플라스미드 DNA를 서열분석하여 정확한 돌연변이가 도입되었는지를 확인했다. 아무런 다른 돌연변이도 검출되지 않았다.

3. 돌연변이 DV-6의 특성

DV-6 돌연변이를 갖는 발현 생성물의 분석을 도 11에 도시한다. 주목해야 할 사항은 다음과 같다.

(i) 상기 실시예에 기재한 바와 같이, 웨스턴 블롯은, 전구체, α, α', β, 43 및 46 kDa 단편을 강력하게 검출하고, 77 및 68 kDa 단편은 단지 약하게만 검출하는 C3에 대한 다클론 항체로 현상시킨다. 주목해야 할 것은 α 및 α' 쇄는 이동하지 않아 100 % 효율로 검출되지 않으며, 이들 밴드의 강도는 예상치보다 낮고 존재하는 실질적인 양에 대한 적절치 못한 지표이다.

(ii) CVFBb를 이용한 야생형 C3의 절단으로, C3b로부터 소량의 α' 쇄가 생기지만, 이들 대부분은 내인성 인자 H 및 I 활성에 의한 C3b에서 iC3b로의 절단으로부터 손실된다 (레인 B3). 이는 대부분 43 kDa 단편으로 나타나며, 46 kDa 중간체도 소량 볼 수 있다. 외인성 H (레인 B4) 2 ㎍/ml를 인자 I와 함께 첨가하면 눈에 띄는 추가의 절단이 유발되며, 외인성 H (레인 B5, B6) 10 - 50 ㎍/ml은 C3b를 완전히 절단된 (α' 또는 46 kDa 밴드 없음) iC3b로의 전환을 완료했다. CVFBb에 의한 DV-6 생성물의 절단으로, 소량의 α' 쇄가 생성되었다 (레인 C). 중요하게는 외인성 H 및 I의 부재시에 생성되는 43 kDa 쇄의 양은 야생형에서보다 작고, 46 kDa 중간체의 양은 상대적으로 더 큰데, 이는 절단이 덜 효과적이었음을 의미한다. 외인성 H 및 I (레인 C4-6)를 첨가하여 이 C3b에서 iC3b로의 전환을 완료시킨다. 그러나, 야생형의 경우 46 kDa 중간체는 10 ㎍/ml H에 의해 제거되어 완전한 절단을 지시하는 반면 (레인 B5), 이런 류는 이 H 농도에서 돌연변이는 여전히 남아있으며 (레인 C5), 완벽한 절단은 단지 50 ㎍/ml H이 사용되었을 경우에만 나타났다. 따라서, 외래에서 첨가된 H 및 I의 고농도에 의한 절단에 대한 민감도에 의해 나타나는 바와 같이 내성은 완전하지는 않지만, 돌연변이 C3b는 내인성 및 외인성 H 및 I에 대해 야생형 보다 내성이 강하다.

4. 결론

DV-6 돌연변이는 인자 I에 의한 인자 H-의존적 절단에 대해 내성을 유발한다. 변형된 잔기가 인자 I에 의한 절단 위치로부터 (1차 구조에서) 떨어져 있고 그 효과가 첨가된 인자 H의 용량에 의존했기 때문에 손상되는 것이 인자 H의 상호작용이라고는 하지만, 그 인자 H와 상호작용이 메커니즘은 확실하지 않다. 이 경우에, 돌연변이는 또한 (i) C3b (또는 C3i)에 대한 결합에 있어서 인자 B와의 경쟁 및 (ii) C3bBb 및 C3bBbP 컨버타제의 가속화된 해리 등 인자 H의 다른 억제 활성에 대한 내성을 부여할 것이다. DV-6 돌연변이는 인자 H에 대한 친화성을 유지하는데 직접 또는 간접적으로 관련된 잔기를 변형시켰다. 동일한 잔기의 많은 다른 돌연변이는 아마도 유사한 효과를 가질 것이며, 단지 일부 변형된 잔기뿐만 아니라 1차 구조의 이 세그멘트 내의 다른 잔기의 돌연변이도 그러한 효과를 달성할 수 있을 것이다.

인자 H에 대한 민감도에 있어서 돌연변이의 영향 요약

돌연변이	아미노산 변화	인자 H에 의한 인자 H 의존적 절단의 억제
CV-2	E776K	-
CV-1	P963K, P964A, A965R, D966K	-
DV-1AM	E992S, D993A, D996S, A997Q, E998S, R999G, L1000M	++
DV-1B	K1001N, H1002I, V1005H	+
DV-3	T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N, K1036I	-
DV-4	V1070K, K1071G, R1072G, A1073S, P1074A	-
CV-5	R1134Q	-
DV-6	Q1152R, E1153K, K1155F	+
DV-7N	D1174N	-
DV-9	D1216G, K1217E, N1218D, R1219H	-
CV-4	R1260N, G1264E	-
RY-1	R1427Q, K1431D, E1433Q	-
-, 억제가 전혀 검출되지 않음, + 약간의 억제, ++ 더 큰 억제 효과

<실시예 15>

잔기 1546 - 1663의 변이

1. 도입

상기 실시예 12 - 14와 달리, 잔기 1546 - 1663의 변형은 C3 및 관련 단백질 사이의 서열 비교에 대한 고려를 근거로 하지 않았다. 대신에 상기한 변형은 우연히 얻어졌고, C-말단 잔기의 번역에서 프레임 이동을 유발하는 의도하지 않은 뉴클레오타이드 결실의 결과였다. 생성된 생성물은 인자 I에 의한 인자 H 의존적 절단에 대해 상당한 내성을 나타냈다. 따라서, 고의로 유발한 이와 유사한 변형은 인자 H 및(또는) 인자 I의 조절 작용에 대해 내성을 부여하는데 유용할 수 있다.

2. 방법

NC3과 동등하지만 아미노산 변화 T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N 및 K1036I로 번역되는 추가의 돌연변이 3151G, 3152G, 3154A, 3156C, 3159C, 3163A, 3165T, 3167T, 3168T를 보유하는 벡터를 제한 효소 Pvu I (벡터 서열을 자름) 및 BsrG I (뉴클레오타이드 4962에서 자름)로 자르고, 아가로오즈 겔 전기영동으로 6.1 kb 밴드를 단리했다. NC3에 동등하지만 C-말단에 아미노산 HHHHHH의 삽입을 코딩하는 뉴클레오타이드 5049 뒤에 CATCATCATCATCATCAT의 삽입을 보유한 또다른 벡터를 Pvu I 및 BsrG I로 위와 유사하게 자르고, 4.4 kb 단편을 단리했다. 이들 두 개의 DNA 단편을 함께 라이게이션시키고, 완전한 플라스미드를 단리했다. DNA 서열분석을 통해 하나의 뉴클레오타이드 (A4696 또는 A4697)가 손실된 것을 밝혀냈다. 예상된 결과는 아미노산 1546-1663이 프레임 내에 번역될 수 없다는 것이다. 대신, 종결 코돈에 도달할 때까지 정상 프레임으로부터 판독된 48 잔기가 존재할 것이다.

생성물 "HDV-3X"는 COS 세포에서 발현시키고, 선행 실시예에 기재된 바와 같이 시험했다.

3. 돌연변이 HDV-3X의 특성

HDV-3X 변형을 포함하는 발현된 생성물을 분석한 결과를 도 12에 나타냈다. 주목해야 할 사항은 다음과 같다.

(ii) HDV-3X을 추가의 C-말단 변형만 없는 동등한 생성물인 DV-3과 비교했다. HDV-3X는 더 작은 α을 보이지만, C-말단에서의 절두 (truncation)와 일치하는 정상 크기의 68 kDa 및 77 kDa 생성물을 나타낸다.

(iii) CVFBb를 이용한 DV-3 C3의 절단으로, C3b로부터 약간의 α' 쇄 및 내인성 인자 H 및 I 활성에 의한 C3b에서 iC3b로의 절단으로부터 생기는 더 많은 68 kDa가 생겼다 (레인 A2). 외인성 H 및 I를 추가하여 C3b에서 iC3b (레인 A3-5)로의 전환을 완료했다. 전환은 단지 1 ㎍/ml 인자 H만으로 가시적으로는 완벽하다 (레인 A3). 반대로, CVFBb에 의한 HDV-3X 생성물의 절단은 더 많은 양의 α' 쇄 및 단지 소량의 68 kDa 단편을 생성시켰다 (레인 B2). 외인성 H의 첨가는 C3b를 iC3b로 전환시키는데 효과가 없다 (레인 B3-5). 68 kDa 및 77 kDa 생성물의 단지 약간의 생성이 H 25 ㎍/ml로도 검출될 수 있다 (레인 A5). 따라서, 내인성 H 및 I에 대해 HDV-3X C3b는 야생형 보다 더 내성이 강하다. 다량의 인자 H에 의해 내성이 부분적으로 극복된다는 사실은 인자 H에 대한 친화성이 크게 감소할 수 있음을 의미한다.

4. 결론

HDV-3X 변형은 인자 I에 의한 인자 H 의존적 절단에 대한 내성을 유발한다. 변형된 잔기가 인자 I에 의한 절단 위치와 (1차 구조에서) 멀기 때문에, 손상되는 것이 인자 H와의 상호작용일 것이라고는 하지만, 그 메커니즘은 확실한 것은 아니다. 이 경우에, 돌연변이는 또한 (i) C3b (또는 C3i)에 대한 결합에 있어서 인자 B와의 경쟁 및 (ii) C3bBb 및 C3bBbP 컨버타제의 가속화된 해리 등 인자 H의 다른 억제 활성에 대한 내성을 부여할 것이다. HDV-3X 돌연변이는 인자 H에 대한 친화성을 유지하는데 직접 또는 간접적으로 관련된 잔기를 변형시켰다. 동일한 잔기의 많은 다른 결실 또는 돌연변이는 아마도 유사한 효과를 가질 것이며, 단지 일부 잔기의 결실 또는 돌연변이도 그러한 효과를 달성할 수 있을 것이다.

HDV-3X 변형은 고의로 유발된 것이 아니었다. 그러나 이를 만들고 관련된 변형을 위해 선택된 방법은 선행 실시예에서 기재한 그러한 방법들을 비롯하여 위치 지정 돌연변이 유발의 특정 방법일 것이다.

<실시예 16>

잔기 954 및 955 위치에서 인자 I 매개 절단을 억제하는 이 위치의 변형

1. 도입

P1 잔기 (1303 및 1320)에서의 이전의 돌연변이는 첫번째 두 위치에서 인자 I에 의한 절단에 대해 내성을 제공한다 (실시예 1-6). 이 두 위치에서 절단의 억제가 C3dg로부터 C3c의 방출에 관여하는 제3 위치에서의 절단도 억제하게 될 것이라는 것은 알려지지 않았다. 정상적으로는 보조인자인 CR1 (가용성 형태로 조작된 막결합 수용체, sCR1)에 의존하는 제3 절단은 상대적으로 느리고, iC3b (또는 iC3i) (즉, 위치 1 및 2에서의 절단 후) 상에서 이전에 관찰되었고, C3i 또는 C3b 상에서는 관찰되지 않았다. 이를 시험하기 위해, 위치 1 및 2에서의 절단에 대해 내성이 매우 강한 E1Q2 돌연변이체 (실시예 11에 기재됨)를 사용했다. 이 돌연변이가 위치 3에서의 절단에 아직 민감하다면, 생물 유체내에서 분자의 분해를 억제하기 위해 이 위치를 돌연변이시키는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 954-955 결합에서 절단이 독점적으로 일어나는지 여부에 대해서 (Davis, A. E. 3d. Harrison, R. A. & Lachmann, P.J., 1984, J. Immunol., 132: 1960-6) 또는 959-960 등의 다른 위치에서도 절단이 일어나는지 여부에 대해 (Harrison, R. A. 등, 1996 Molecular Immunology 33, Suppl. 1, 59, abstract 235; Ekdahl, K.N., Nilsson, U.R. & Nilsson, B., 1990, J. Immunol. 144: 4269-74) 문헌마다 혼동스런 결과가 보고되어 있다. 처음에 우리는 잔기 954를 아르기닌에서 글루탐산으로 돌연변이시켰다 (E1Q2E3). 왜냐하면 (i) 상기 문헌에서 이것은 절단 위치 중 하나의 P1잔기인 것으로 나타나 있었으며, (ii) 위치 1에서의 실시예 5로부터 글루탐산으로의 돌연변이가 다른 치환보다 절단에 대한 더 큰 내성을 부여한다는 것 때문이다. 또한 사람 C3의 아르기닌 및 글루탐산 대신에, C3의 다른 포유동물 종 (생쥐, 쥐, 돼지쥐, 토끼)은 954 및 955에 동등한 잔기로서 글루타민 및 글리신을 가진다 (예를 들면, Mavroidis, M. Sunyer, J. O. & Lambris, J. D., 1995, J. Immunol. 154: 2164-2174). 이들 데이터는 다른 종들의 이 위치 (954-955)에서는 절단이 잘 일어나지 않으며, 959-960 등의 다른 위치가 더 중요할 수 있음을 제기한다 (Harrison, R. A. 등, 1996, Molecular Immunology 33, Suppl. 1, 59, abstract 235). Arg954에서 Gln으로 및 Glu955에서 Gly로의 동등한 돌연변이는 따라서 사람에게 가해져서 E1Q2QG3 돌연변이를 만들었다.

2. 방법

E1Q2E3 돌연변이를 위한 돌연변이 유발성 프라이머의 서열은 돌연변이 R954E를 코딩하는 GAACGCCTGGGCGAAGAAGGAGTGCG이고, E1Q2QG3 돌연변이를 위한 돌연변이 유발성 프라이머의 서열은 돌연변이 R954Q, E995G를 코딩하는 AACGCCTGGGCCAAGGAGGAGTGCGAA를 사용하는 것만 제외하면 돌연변이 제작에 사용되는 방법은 선행 실시예에 기재된 바와 같다. 생성물은 E1Q2을 코딩하는 돌연변이 (실시예 5 및 11에 기재한 바와 같은 E1303, Q1320)를 포함하는 제작물로 라이게이션시켰다. 단리된 플라스미드 DNA를 서열 분석하여 정확한 돌연변이가 도입되었다는 것을 확인했다. 어떠한 다른 돌연변이도 검출되지 않았다. 생성된 발현 벡터로 COS 세포를 형질감염시키고, 분비된 발현 생성물을 상기한 바와 같이 절단 반응에 대해 분석했다.

3. E1Q2, E1Q2E3 및 E1Q2G3 돌연변이의 인자 I-매개 절단

발현된 생성물의 분석은 도 13에 도시되어 있다. 주목해야 할 사항은 다음과 같다.

(i) 웨스턴 블롯은, 전구체, α, α', 77 및 68 kDa 단편을 검출하고, β, 43 또는 46 kDa 단편은 검출하지 못하는 C3의 C3dg 부위에 대한 단일클론 항체로 현상시킨다. 또한 위치 1 또는 2에서의 절단이 일어나지 않고 위치 3에서 절단된 86 kDa 생성물이 검출될 것이다.

(ii) 도면은 86 kDa 생성물이 sCR1 (레인 A3)의 존재하에 E1Q2의 인자 I-매개 절단에 의해 사실상 생성되며, 인자 H가 보조인자일 경우에는 생성되지 않는다 (레인 A3)는 것을 보여준다.

(iii) 86 kDa 생성물은 sCR1 (C3 및 B3)가 존재할 때도 E1Q2E3 (C) 또는 E1Q2QG3 (B) 돌연변이 중 하나로 생성되지 않는다.

4. 결론

(i) 위치 3에서의 인자 I-매개 절단이 위치 1 및 2의 절단이 차단되었을 경우에도 여전히 일어날 수 있다. 따라서, 위치 3에서의 절단을 추가적으로 차단하는 것이 그렇지 않고 위치 1 및 2에서에서만 내성이 있는 모든 돌연변이 생성물이 생리적 환경에서 사용될 때 분해되는 것을 막는데 바람직하다.

(ii) 위치 3에서의 절단은 잔기 954를 Glu로 돌연변이시키고, 954 및 955를 Gln 및 Gly로 돌연변이시켜서 차단할 수 있다. 그러나, 잔기 954 및(또는) 955의 다른 돌연변이는 위치 3에서 절단에 내성을 부여할 수 있다.

(iii) 나타난 돌연변이는 제3 위치 절단의 다른 추정 위치 (예를 들면, 959 - 960)에서 절단되지 못하도록 했다. 이는 954 - 955가 유일하게 중요한 절단 위치거나 또는 다른 절단은 954 - 955에서의 사전 절단을 필요로하거나 또는 이들 잔기가 다른 메커니즘 (예를 들면, 입체배열의 뒤틀림)에 의해 다른 위치에서의 절단을 방해한다는 것을 의미할 것이다. 어떤 경우에나, 954 및(또는) 955의 돌연변이는 C3b 또는 C3i-유사 생성물의 분해를 억제하는데 유효한 수단이다.

<실시예 17>

인자 I에 의한 절단을 억제하는, C3의 C-말단 부위에서의 돌연변이

1. 도입

실시예 15는 잔기 1546 - 1663의 돌연변이 또는 결실은 인자 I에 의한 절단에 대해 내성을 부여한다는 증거를 제공했다. 본 실시예는 이런 내성을 부여하는 소규모 돌연변이체 뿐만 아니라 내성을 부여하지 않는 각종 돌연변이를 제공한다.

2. 방법

돌연변이 유발성 프라이머가 지시된 돌연변이를 코딩하는 표 3의 서열을 갖는다는 것을 제외하면 선행 실시예에 대해 기재한 바와 같은 돌연변이 제작 방법을 사용했다. 단리된 플라스미드 DNA의 서열분석을 통해 정확한 돌연변이가 도입되었음을 확인했다. 아무런 다른 돌연변이가 검출되지 않았다. 생성된 발현 벡터로 COS 세포를 형질감염시켰고, 분비된 발현 생성물을 상기한 바와 같이 절단 반응에 대해 분석했다.

3. 인자 I에 의한 절단에 대한 각종 돌연변이의 내성

이들 돌연변이에 대해 인자 I 및 H를 사용하여 수행한 절단 분석 결과를 도 14 및 15에 나타냈다. 주목해야 할 사항은, 웨스턴 블롯을 전구체, α, α', 77 및 68 kDa 단편은 검출하지만 β, 43 또는 46 kDa 단편을 검출하지 않는, C3의 C3dg 부위에 대한 단일클론 항체로 현상시킨다는 것이다.

도 14는 야생형 (NC3, A), FT-3(D), FT-4(E) 및 FT-5(F) 생성물은 인자 I에 의해 절단됨을 보여주는데, 이는 77 kDa 및(또는) 68 kDa 밴드가 나타나고 α 쇄가 사라짐을 통해 확인된다. 반대로 FT-1 및 FT-2가 절단되지 않는다.

도 15는 야생형 (NC3,A), FR-1(B), FR-2(C), FR-3(D) 및 FR-4(E) 생성물이 절단되고 반면에 FT-2 생성물(F)은 절단되지 않음을 보여준다.

4. 결론

(i) FT-2의 작은 절두 (truncation)도 인자 I에 의한 절단에 대해 내성을 제공하기 충분하다. 그러한 내성은 따라서, 잔기 1636 - 1663의 일부 또는 전부의 결실을 통해 달성될 수 있다. 이 결론은 잔기 1636 - 1663의 결실과 잔기 1591 - 1635의 추가 결실/변형을 갖는 FT-1에 의해 보여지는 내성에 의해 뒷받침된다.

(ii) 잔기 1636 - 1663이 인자 I-매개 절단에 대해 필요하기 때문에, 이들 잔기의 많은 다른 변형이 내성을 유발할 수 있다.

(iii) 이들 잔기의 모든 변형이 내성을 부여할 수 있는 것은 아니다. 효과없는 변형으로는 FT-5, FR-1, FR-2, FR-3 및 FR-4에 의해 정의된 것과 1636 - 1663 이외의 잔기를 변형시키는 FT-3 및 FT-4에 의해 정의된 변형이 있다.

(iv) 이들 데이터는 절단에 필요한 1636 - 1663 내의 잔기가 FT-5, FR-1, FR-2, FR-3 또는 FR-4에 의해 변형되지 않은 것들임을 암시한다. 따라서, 잔기 1649 - 1660 중의 일부는 결정적으로 중요할 수 있다.

실시예 17에서 사용된 돌연변이

돌연변이	돌연변이 유발성 프라이머의 서열	치환되는 서열	잔기	치환하는 서열
FT-1		REA	1591 - 1593	TN 종결
FT-2		E	1636	종결
FT-3		LSSDFWGE	1607 - 1614	KEALQI
FT-4		IIGKD	1621 - 1625	RYIYPLDSL
FT-5		C	1661	S
FR-1		EEDE	1633 - 1636	RDTT
FR-2		QDEENQKG	1638 - 1645	SS
FR-3		QDEENQKG	1638 - 1645	RSTRQRAA
FR-4		D	1648	AFLAN

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〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인:

(A) 수신인: 이뮤트란 리미티드

(B) 거리: 더글러스 하우스, 18 트럼핑톤 로드

(C) 도시: 캠브리지

(D) 주: 캠브리지

(E) 국가: 영국

(F) 우편번호: 씨비2 2에이에이치

(A) 수신인: 패리스, 티모씨, 찰스

(B) 거리: 엠알씨 센터, 힐스 로드

(C) 도시: 캠브리지

(D) 주: 캠브리지

(E) 국가: 영국

(F) 우편번호: 씨비2 2큐에이치

(A) 수신인: 해리슨, 리처드 알렉산더

(B) 거리: 엠알씨 센터, 힐스 로드

(C) 도시: 캠브리지

(D) 주: 캠브리지

(E) 국가: 영국

(F) 우편번호: 씨비2 2큐에이치

(ii) 발명의 명칭: 변형 단백질

(iii) 서열수: 23

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 41 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 32 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 32 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 32 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 45 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 39 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 13에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 44 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 14에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 44 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 15에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 16에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 32 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 17에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 35 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 18에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 19에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 20에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 21에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 14 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 22에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 1663 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 23에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 5067 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 설명:

Claims

하향 조절 내성 C3 컨버타제를 형성할 수 있도록 변형된 천연 보체 경로 단백질.
제1항에 있어서, 변형된 사람 단백질인 단백질.
제1 또는 2항에 있어서, 천연 단백질보다 인자 I에 의한 절단에 더 내성이 강한 단백질.
제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 C3 단백질인 단백질.
제4항에 있어서, 상기 단백질이 Arg-1303, Arg-1320 또는 이들 양자가 다른 아미노산에 의해 변형된 것인 단백질.
제5항에 있어서, 상기 Arg-1303, Arg-1320 또는 이들 양자가 글루타민, 티로신, 시스틴, 트립토판, 글루탐산 또는 글리신에 의해 치환된 단백질.
제6항에 있어서, 상기 Arg-1320이 글루타민에 의해 치환된 단백질.
제6 또는 7항에 있어서, Arg-1303이 글루탐산, 글리신 또는 글루타민에 의해 치환된 단백질.
제1 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 사람 C3에 비해 인자 H 및(또는) 인자 I에 대한 감수성이 작고, 천연 사람 C3의 아미노산 잔기 752 - 754 및(또는) 잔기 758 - 780에 해당하는 부위에서 천연 사람 C3과 비교할 때 하나 이상의 아미노산이 변화한 단백질.
제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변화가 산성 아미노산 잔기에서 중성 아미노산 잔기로의 변화인 단백질.
제9 또는 10항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 변화가 Asp-Glu-Asp에서 Gly-Ser-Gly로의 변화인 단백질.
제1 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 사람 C3과 비교할 때, 천연 사람 C3의 잔기 1427, 1431 및(또는) 1433에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산이 변화한 단백질.
제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, C3b 및 C3i 산물 또는 이들의 유도된 C3 컨버타제가 인자 H의 보체 억제 활성에 내성을 지니도록, 사람 C3의 아미노산 잔기 992 - 1005 (EDAVDAERLKHLIV)에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질.
제13항에 있어서, 사람 C3의 아미노산 잔기 992 (E), 993 (D), 996 (D), 997 (A), 998 (E), 999 (R), 1000 (L), 1001 (K), 1002 (H), 1005 (V)에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질.
제14항에 있어서, E992S, D993A, D996S, A997Q, E998S, R999G, L1000M, K1001N, H1002I, V1005H 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질.
제1 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, C3b 및 C3i 산물 또는 이들의 유도된 C3 컨버타제가 인자 H의 보체 억제 활성에 내성을 지니도록, 사람 C3의 아미노산 잔기 1152 - 1155 (QEAK)에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질.
제16항에 있어서, C3 중 아미노산 잔기 1152 (Q), 1153 (E), 1155 (K)에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질.
제17항에 있어서, Q1152R, E1153K, K1155F 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질.
제13 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, CR1, MCP 및(또는) DAF의 보체 억제 활성에 내성이 있는 단백질.
제1 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 사람 C3에 비해 인자 H 및(또는) 인자 I에 대한 감수성이 작고, 천연 사람 C3의 아미노산 잔기 1546 - 1663에 대해 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환 또는 삽입된 단백질.
제20항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 1546 - 1663에 대해 하나 이상의 아미노산이 결실된 단백질.
제20 또는 21항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 1546 - 1663에 해당하는 모든 아미노산이 결실된 단백질.
제20항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 잔기 1546 - 1663에 해당하는 부위에서 천연 사람 C3과 하나 이상의 아미노산이 다른 단백질.
제23항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 1546 - 1663에 해당하는 부위에 있는 아미노산이 상기 천연 사람 C3을 코딩하는 DNA에서 프레임 이동 돌연변이 (frame-shift mutation)로 인해 생길 수 있는 것인 단백질.
제20 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 사람 C3에 비해 인자 H 및(또는) 인자 I에 대한 감수성이 작고, 천연 사람 C3의 아미노산 1636 - 1663에 대해 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환 또는 삽입된 단백질.
제25항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 1636 - 1663에 대해 하나 이상의 아미노산이 결실된 단백질.
제25 또는 26항에 있어서, 천연 C3의 아미노산 1636 - 1663에 해당하는 모든 아미노산이 결실된 단백질.
제25항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 잔기 1636 - 1663에 해당하는 부위에서 천연 사람 C3과 하나 이상의 아미노산이 다른 단백질.
제25항에 있어서, 천연 사람 C3에 비해 인자 H 및(또는) I에 대한 감수성이 작고, 천연 사람 C3의 아미노산 1649 - 1660에 대해 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환 또는 삽입된 단백질.
제1 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 사람 C3의 아미노산 잔기 954 및(또는) 955에 대해 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환 또는 삽입되고, 이 위치에서 보조인자 의존적 (예를 들면, CR1 또는 인자 H) 인자 I-매개 절단에 대한 감수성이 감소된 단백질.
제30항에 있어서, 사람 C3의 잔기 954에 해당하는 위치의 아미노산 잔기가 사람 C3의 잔기 954와 상이하고, 이 위치에서 보조인자 의존적 (예를 들면, CR1 또는 인자 H) 인자 I-매개 절단에 대한 감수성이 감소된 단백질.
제31항에 있어서, 상기 아미노산이 글루타민이고, 이 위치에서 보조인자 의존적 (CR1 또는 인자 H) 인자 I-매개 절단에 대한 감수성이 감소된 단백질.
제30항에 있어서, 사람 C3의 잔기 954 및 955에 해당하는 위치의 아미노산이 각각 글루탐산 및 글리신이고, 이 위치에서 보조인자 의존적 (예를 들면, CR1 또는 인자 H) 인자 I-매개 절단에 대한 감수성이 감소된 단백질.
제30항에 있어서, 사람 C3의 잔기 955에 해당하는 위치의 아미노산 잔기가 사람 C3의 잔기 955와 상이하고, 이 위치에서 보조인자 의존적 (예를 들면, CR1 또는 인자 H) 인자 I-매개 절단에 대한 감수성이 감소된 단백질.
C3 컨버타제 활성이 있고 인자 H, 인자 I, CR1, MCP 및(또는) DAF의 보체 억제 활성에 대한 내성도 있는, 제1 내지 34항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 단편 또는 변형체.
제1 내지 34항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 또는 제35항에 기재된 단편 또는 변형체를 코딩하는 DNA 서열.
제36항에 정의된 DNA 서열을 포함하는 DNA 제작물 (예를 들면, 벡터).
치료에 사용하기 위한 제1 내지 34항 중 어느 한 항에서 정의된 단백질 또는 제35항에 기재된 단편 또는 변형체.
특이적 결합 부분에 연결된, 제1 내지 34항 중 어느 한 항에 정의된 단백질 또는 제35항에 기재된 단편 또는 변형체를 포함하는 접합체.
제39항에 있어서, 상기 특이적 결합 부분이 특이적 결합 단백질인 접합체.
제40항에 있어서, 상기 특이적 결합 단백질이 항체 또는 항체의 항원 결합 단편인 접합체.
제1 내지 34항 중 어느 한 항에 정의된 단백질 또는 제35항에 정의된 단편 또는 변형체 또는 제39 내지 41항 중 어느 한 항에 정의된 접합체의 보체 경로 단백질의 양을 고갈시키는데 사용하기 위한 의약 제조에 있어서의 용도.
제42항에 있어서, 상기 의약이 외래 물질의 거부를 억제하는데 사용하기 위한 것인 용도.
제42항에 있어서, 상기 의약이 특정 위치에서 내인성 보체 단백질 전환 및 침착을 국소화 및(또는) 증폭시키는데 사용하기 위한 것인 용도.
제1 내지 34항 중 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 단백질 하나 이상, 또는 제35항에 정의된 단편 또는 변형체, 또는 제39 내지 41항 중 어느 한 항에 정의된 접합체를 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 제약 제제.
제45항에 있어서, 보체 경로 단백질의 양을 고갈시키는데 사용하기 위한 제약 제제.
제45항에 있어서, 외래 물질 거부를 억제하는데 사용하기 위한 제약 제제.
제45항에 있어서, 특정 위치에서 보체 단백질 전환 및 침착을 국소화 및(또는) 증폭시키는데 사용하기 위한 제약 제제.
제1 내지 34항 중 어느 한 항에 정의된 단백질, 또는 제35항에 정의된 단편 또는 변형체, 또는 제39 내지 41항 중 어느 한 항에 정의된 접합체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에게서 보체 경로 단백질을 감소시키는 방법.
제49항에 있어서, 제45항에 정의된 제약 제제를 사용하여 투여하는 방법.