SK121798A3 - Native protein of a complement line, a fragment or variant of protein, dna sequence coding a protein, dna construct, a conjugate containing protein, pharmaceutical composition and use of protein - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka modifikovaných proteínov schopných vytvárať C3 konvertázy rezistentné voči regulačnému zníženiu aktivity (downregulácii), DNA sekvencii kódujúcich takéto proteíny a použitia takýchto proteínov ako terapeutické prostriedky najmä pri znižovaní hladín proteínov komplementovej dráhy a pri špecifickom nasmerovaní komplementového ataku do špecifického miesta (depozícia proteínu C3b) .

Doterajší stav techniky

Komplementový systém zohráva najdôležitejšiu úlohu v efektorových mechanizmoch imunitnej odpovede človeka a ďalších stavovcov, ako je fagocytóza, cytolýza a dozrievanie buniek, ktoré vedú k indukcii lokálnej zápalovej odpovede (Rother, K. E. & Till, G. 0. (editori), (1988) v knihe The Complement System, nakladateľstvo Springer, Berlin/Heidelberg, SRN). Tieto funkcie komplementového systému sú žiaduce tam, kde ide o elimináciu invazívnych patogénov, akými sú napríklad baktérie, ale nežiaduce tam, kde pôsobia proti tkanivám samotného hostiteľa (napríklad pri post-ischemickej reperfúznej traume, pozri Crawford, M. H. a ďalší, (1988) Circulation 78: strana 1449 až 1458) alebo tam, kde pôsobia proti cudziemu terapeutickému materiálu (napríklad pri hyperakútnom odvrhovaní cudzorodých štepov, pozri Forty, J., Hasan, R., Čary, N., White, D. J. & Wallwork, J., (1992) Transplant. Proc. 24: strana 488 až 489) . Uskutočnili sa pokusy potlačiť tieto nežiaduce účinky pomocou derivátov komplementových regulačných proteínov, ktorých normálnou funkciou je potláčanie aktivácie komplementu (pozri Kalli, K. R., Hsu, P. & Fearon, D. T., (1994) Springer

Semin. Immunopathol. 15: strana 417 až 431; Weisman, H. F. a ďalší, (1990) Science 249: strana 146 až 151) .

Komplementový systém obsahuje proteíny nachádzajúce sa tak na bunkovom povrchu (receptory a regulačné faktory) ako aj v telových tekutinách (t.j. v krvnej plazme a v ďalších extracelu-lárnych tekutinách). Kritickým krokom na vyvolanie odpovede je proteolytická konverzia proteínu C3 na fragmenty C3b a C3a. C3a pôsobí ako anafylatoxín, ktorý podobne ako C5a priťahuje do postihnutého miesta mastocyty. To má za následok miestne uvoľnenie histamínu, vazodilatáciu a ďalšie efektorové machanizmy zápalovej odpovede. Vzniknutý C3b má schopnosť viazať sa na povrchy v blízkosti svojho vzniku. Prostredníctvom naviazaného C3b je potom smerovaný atak cytologických komponentov komplementu (C5 - C9) .

Na povrch naviazaný C3b a produkty jeho degradácie sú tiež ligandami pre C3 receptory, ktoré sprostredkujú napríklad fagocytózu (pozri Rother, K. E. & Till, G. O. (editori), (1988) v knihe The Complement System, nakladateľstvo Springer, Berlin/Heidelberg, SRN). Existujú dve odlišné dráhy aktivácie komplementu. Obidve majú spoločné to, že vedú ku konverzii C3 na C3b a k následným odpovediam.

Klasická dráha aktivácie komplementu sa pri normálnych podmienkach zahajuje komplexmi antigénu s protilátkou. Dochádza k iniciácii enzýmovej kaskády, ktorá zahŕňa proteíny Clq, Clr, Cis, C2 a C4. Alternatívna dráha závisí od aktivačnej slučky, ktorá zahŕňa samotný C3 a nevyhnutné faktory B a D.

Výsledkom konverzie C3 na C3b (alebo C3i) je produkt, ktorý sa môže kombinovať s faktorom B, čím vzniká C3bB (alebo C3iB) . Z týchto komplexov ďalej pôsobením faktora D vzniká C3bBb, čo je C3 konvertáza schopná štiepiť ďalší C3 na C3b. To vedie k tvorbe ďalšieho C3bBb a následne k ďalšej konverzii C3. V určitých podmienkach je komplex C3bBb stabilizovaný asociáciou s pozitívnym regulátorom properdínom (P). Rýchlosť tejto pozitívnej spätnoväzbovej slučky je však v normálnych podmienkach následkom pôsobenia regulačných proteínov, menovite faktora H a faktora I, veími obmedzená.

Faktor H (a štruktúrne príbuzné s bunkou asociované molekuly) (i) odstraňuje B a Bb z C3b, a (ii) pôsobí ako kofaktor faktora I, ktorý štiepi C3b na iC3b, čím bráni akejkoľvek rekombinácii s faktorom B, ktorá by viedla k vzniku ďalších C3 konvertáz. K amplifikácii tvorby C3b dochádza v prítomnosti takých povrchov, akými sú napríklad mnohé bakteriálne steny, ktoré viažu vznikajúci C3b a bránia regulácii faktormi H a I. Vznikajúci C3b má schopnosť viazať sa aj na bunky endogénne. Endogénne bunkové povrchy bežne prichádzajúce do styku s komplementom sú preto navyše chránené na membrány viazanými regulátormi, akými sú napríklad MCP, DAF a CR1. Tieto regulačné faktory pôsobia podobným spôsobom ako faktor H.

Existuje niekoľko vzácnych prirodzene sa vyskytujúcich stavov, kedy nedochádza k normálnej regulácii C3 v telových tekutinách a kedy spontánna C3 konverzia nakoniec vedie k úplnému odčerpaniu C3 z cirkulácie. Medzi tieto prípady patria (i) genetická deficiencia faktora H alebo I (pozri Nicol, P. A. E. & Lachmann, P. J., (1973) J. Immunol. 24: strana 259 až 275), (ii) prítomnosť protilátok (nefritických faktorov), ktoré sa viažu k C3bBb a bránia disociácii (pozri Daha, M. R. & van Es, L. A., (1982) J. Immunol. 43: strana 33 až 38) a (iii) kontakt s proteínom prítomným v jede kobry nazývaným faktor z jedu kobry (CVF = cobra venom factor), ktorý sa spája s faktorom B a vytvára enzým s C3 konvertázovou aktivitou, ktorý neobsahuje C3b a nie je ovplyvňovaný faktormi H a I (pozri Pangburn, N. K. & Muller-Eberhard, H. J., (1984) Springer Semin. Immunopathol. 7: strana 163 až 192). Je zrejmé, že regulačné zníženie aktivity (down-regulácia) komplementu v neprítomnosti špecifickej aktivácie je veľmi dôležitá.

Existujú aj prípady, kedy síce dochádza k špecifickej aktivácii, avšak táto aktivácia je nežiaduca, pretože je namierená proti tkanivám samotného hostiteľa (napríklad tkanivám, ktoré boli poškodené ischémiou alebo chirurgickým zákrokom) alebo proti cudzím materiálom, ktoré sa použili na terapeutické účely (akými sú napríklad cudzorodé štepy, umelé orgány alebo dialyzačné membrány).

Aktivácia komplementu má za následok nežiaduci atak a následné poškodenie. V týchto prípadoch by bolo užitočné blokovať alebo inhibovať aktiváciu a odpoveď.

Doterajšie spôsoby riešenia problému ako zabrániť poškodeniu spôsobenému komplementom sa zameriavali na použitie proteínov, ktoré inhibujú aktiváciu komplementu (CR1, MCP, DAF, faktor H a faktor I) . Inhibítory komplementu akými sú faktor I, faktor H a rozpustné deriváty na membránu viazaných proteínov CR1, DAF, MCP potláčajú amplifikačnú slučku alternatívnej dráhy prebiehajúcej v telových tekutinách. Preto sa v modelových fyziologických situáciách testovalo, či sa tieto molekuly, a to najmä CR1, ktorý je, ako sa zdá, najúčinnejší, môžu použiť na zníženie poškodenia spôsobeného komplementom (pozri Kalli, K. R., Hsu, P. & Fearon, D. T., (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15: strana 417 až 431;

Weisman, H. F. a ďalší, (1990) Science 249: strana 146 až 151).

Faktor H je endogénne prítomný v krvnej plazme vo vysokých koncentráciách (typicky 0,3 až 0,5 mg/ml, pozri Rother, K. E. & Till, G. O. (editori), (1988) v knihe The Complement System, nakladateľstvo Springer, Berlin/Heidelberg, SRN), takže aj keď zvýšené hladiny inhibítorov tlmia reakciu v kvapalnej fáze, ich účinnosť je nízka a na efektívne zníženie reakcie by sa in vivo muselo podávať veľké množstvo týchto purifikovaných proteínov (napríklad možno viac než 5 mg rozpustného CR1 na 1 kg telesnej váhy). Alternatívna dráha je navyše aktivovaná povrchmi, kde sa efektu faktora H už zabraňuje. Pretože zároveň nedochádza k zníženiu aktivity ostatných inhibítorov, predpokladá sa, že tie isté faktory nie sú úplne alebo univerzálne účinné.

Faktor z jedu kobry (CVF) má schopnosť vytvárať stabilnú C3 konvertázu, ktorá sa môže u zvierat in vivo a v ďalších prípadoch in vitro (napríklad vo vzorkách ľudskej plazmy) experimentálne použiť na odčerpanie komplementu. CVF je veľmi účinný (napríklad 40 gg/kg môže zrušiť aktivitu komplementu u myši (pozri van den Beg, C. W., Aerts, P. C. & van Dijk, H., (1991) J. Immunol. Methods

136: strana 287 až 294). Existujú však nevýhody, kvôli ktorým je použitie CVF u Zudí nevhodné.

Po prvé, CVF sa získava z jedu kobry (ktorý je ťažko dostupný a práca s ktorým je nebezpečná) a musí sa teda starostlivo zbaviť neurotoxínov prítomných v tomto jede. Zabezpečiť dostatočné množstvo jedu je takisto velmi problematické. Tieto problémy nemožno prekonať pomocou klonovania a expresie príslušného génu ex vivo, pretože v kobre dochádza k post-translačným modifikáciám (ku špecifickému proteolytickému spracovaniu), in vitro uskutočnenie ktorých by bolo problematické či dokonca nemožné. Doteraz nie je známe, aké podmienky sú nutné na dané proteolytické štiepenie, a nie sú známe ani príslušné enzýmy. Po druhé, daný proteín je pre ľudský organizmus cudzí a teda imunogénny. Na dekomplementáciu pacienta by bolo nutné opakované terapeutické použitie CVF počas niekoľkých týždňov (čo by umožnilo napríklad prežitie cudzorodého štepu v organizme). To však z dôvodov uvedenej imunogenity nie je možné.

Hoci je CVF s ľudským C3 čiastočne štruktúrne a funkčne homológny (pozri Vogel, C. W., Smith, C. A. & Muller-Eberhard, H. J., (1984) J. Immunol. 133: strana 3235 až 3241), v oboch smeroch má aj veľké rozdiely (medzi obidvoma proteínmi sú odlišnosti v štruktúre reťazca, v lokalizácii biosyntézy, dalej v citlivosti na regulačné faktory komplementu a v tvorbe stabilnej C3 konvertázy). CVF nie je odvodený od kobrieho ekvivalentu C3, ktorý je známy (uskutočnilo sa už jeho klonovanie a sekvenovanie) a ktorý sa štruktúrne a funkčne viac podobá ľudskému C3· (pozri Fritzinger, D. C. a ďalší, (1992) J. Immunol. 149: strana 3554 až 3562).

CVF je špecifický produkt jedu zvierat, ktoré sú evolučné veľmi vzdialené homo sapiens. Preto genetické manipulácie, ktoré by zmenili daný proteín tak, aby sa stal pre človeka neimunogénnym, nie sú uskutočniteľné.

Vynález opisuje alternatívnu stratégiu, ktorá obchádza fyziologickú reguláciu a ktorá miesto inhibície aktivácie komplementu vyvoláva superaktiváciu tohto systému. Existujú dva spôsoby aplikácie tejto stratégie. Po prvé sa môže použiť in vivo, kedy sa vyvolá taká aktivácia komplementu, ktorá vedie k úplnému odčerpaniu jedeného alebo viacerých komponentov komplementovej kaskády, čím dôjde k strate schopnosti produkovať lokálne odpovede na následný podnet, ktorým môže byť napríklad cudzorodý štep. Po druhé, neregulovaná superaktivácia sa môže zámerne obmedziť na konkrétne cieľové miesto (napríklad na vírus alebo na vírusom infikované bunky), čím sa zvýši citlivosť tohto cieľového miesta na obranné reakcie sprostredkované komplementom.

Podstata vynálezu

Termínom regulátory aktivácie komplementu sa rozumejú všetky proteíny, ktorých účinok vedie k inhibícii amplifikácie konverzie C3, a neobmedzuje sa iba na proteíny, ktorých gény sú lokalizované na genetickom lokuse RCA. Nezahŕňa však aktivátory (upregulators), medzi ktoré patrí napríklad properdín. Ak sa neuvádza inak, C3 konverzia je definovaná ako proteolytická konverzia C3 na C3b a C3a. C3 konvertáza (alebo jednoducho konvertáza) je definovaná ako enzým (typicky komplex dvoch alebo viacerých proteínových komponentov, napríklad C3bBb, C3iBb, CVFBb alebo C4b2a), ktorý katalyzuje túto reakciu.

Vynález popisuje tvorbu natívneho proteínu komplementovej dráhy, ktorý je modifikovaný takým spôsobom, že je schopný vytvárať C3 konvertázu rezistentnú voči regulačnému zníženiu aktivity (downregulácii).

Výraz natívny znamená prirodzene sa vyskytujúci, t. j. dosiahnuteľný v prírode. Definícia teda zahŕňa akékoľvek prirodzene sa vyskytujúce proteíny komplementovej dráhy modifikované opísaným spôsobom. Nemusí pritom ísť iba o druhovo špecifické proteíny. Inými slovami, napríklad modifikovaný ľudský proteín by sa mohol použiť ako C3 konvertáza rezistentná voči regulačnému zníženiu aktivity (down-regulácii) u iných druhov cicavcov. Typicky sa však budú používať modifikované proteíny komplementovej dráhy z tých istých druhov.

Modifikácia DNA sekvencie kódujúcej C3, pričom sa použije napríklad miestne cielená mutagenéza, môže viesť k produkcii rôznych C3, ktoré sú rezistentné voči komplementovým regulačným proteínom. Zároveň si však uchovávajú pozitívne funkčné vlastnosti (štiepenie na C3b pomocou C3 konvertázy) a znaky štruktúrnej integrity (správna štruktúra reťazca, prítomnosť tioesterovej väzby). Tu opisovaný vynález sa týka geneticky modifikovaných foriem natívnych komplementových proteínov, napríklad ľudského C3, ktorého C3b fragment je rezistentný voči fyziologickej regulácii komplementu. Táto rezistencia vedie k tomu, že z týchto molekúl môžu vo fyziologických podmienkach (napríklad in vivo) vznikať stabilizované formy zodpovedajúcej C3 konvertázy, čím dochádza k amplifikácii konverzie C3 na C3b a na následné degradačné produkty.

Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa pripraví modifikovaný ľudský proteín C3, ktorý je rezistentný voči štiepeniu faktorom I.

Tento pozmenený proteín sa môže pripraviť modifikáciou zvyškov v proteolytickom mieste proteinu.

Obzvlášť výhodné je také uskutočnenie vynálezu, v ktorom sa ludský proteín C3 modifikuje tak, že sa v ňom zamení buď arginín v pozícii 1303, alebo arginín v pozícii 1320, alebo oba, za inú aminokyselinu. Aminokyselinami, za ktoré sa môže arginín zameniť, môžu byť tyrozín, cystín, tryptofán, glutamín, kyselina glutámová alebo glycín. Arginín v pozícii 1303 sa prednostne zamieňa za kyselinu glutámovú alebo glycín (menej za glutamín). Arginín v pozícii 1320 sa prednostne zamieňa za glutamín.

Ďalšie stratégie produkcie vhodných modifikovaných proteínov zahŕňajú:

i) Zníženie citlivosti na inhibičné účinky faktora H a príbuzných proteínov (napríklad MCP, DAF, CR1). Napríklad v ludskom C3 sa v oblasti aminokyselinových zvyškov 767 až 776 a 1209 až 1271 nachádza väzbové miesto pre faktor H (pozri Botto, M., Fong, K. Y., So, A. K., Koch, C. & Walport, M. J., (1990) J. Exp. Med. 172:

strana 1011 až 1017; Lambris, J. D., Avila, D., Becherer, J. D. & Muller-Eberhard, H. J., (1988) J. Biol. Chem. 263: strana 2147 až 2150). Substitúcia jedného či viacerých týchto zvyškov alebo iných zvyškov, ktoré sú tiež spojené s funkciou týchto proteínov, by teda mohla viesť k redukcii väzby jedného alebo viacerých z týchto proteínov.

ii) Zníženie rýchlosti disociácie C3bBb. Môžu sa zaviesť také mutácie, ktoré by zosilnili interakciu medzi C3b a Bb. Zosilnenie tejto interakcie by viedlo tak k redukcii spontánneho rozkladu enzýmu, ako aj k zníženiu efektivity faktora H (a príbuzných regulačných faktorov) v odstraňovaní Bb od C3b.

Žiaduce sú také mutácie, ktoré znížia rýchlosť tak spontánneho, ako aj faktorom H sprostredkovaného rozkladu C3bBb. Dokonca aj v neprítomnosti faktora H má komplex C3bBb v kvapalnej fáze pri teplote 37° C a v prítomnosti properdínu polčas života iba približne 10 minút (pozri Farries, T. C., Lachmann, P. J. & Harrison, R. A., (1988) Biochem J. 253: strana 667 až 675).

iii) Aminokyselinové zvyšky 752 až 761 ľudského C3 sa podieľajú na väzbe faktora B. Ide o veľmi konzervovanú oblasť C3. V C4 sa našla sekvencia veľmi podobná tejto oblasti. Pretože C 4 viaže C2, čo je homológ faktora B, veľká podobnosť týchto oblastí medzi C3 a C4, spolu s vysokou konzervovanosťou v C3, môžu svedčiť o tom, že toto miesto v C3 je väzbovým miestom faktora H. Zmeny v tejto oblasti by teda mohli ovplyvňovať afinitu faktora B a stabilitu C3bBb.

iv) Žiaduca by bola aj rezistencia k ďalším regulátorom aktivácie komplementu, akými sú napríklad CR1, DAF a MCP. Všetky tieto regulátory pôsobia podobným mechanizmom ako faktor H, preto by ďalšia mutagenéza nemala byť nevyhnutná. Podobne aj niektoré patogénne organizmy exprimujú svoje vlastné inhibítory aktivácie komplementu, ktoré sú často štruktúrne i funkčne homológne s faktorom H (napríklad sekrečný peptid Vaccinia vírusu). Tieto molekuly chránia patogén proti imunitnej odpovedi. Bolo by výhodné atakovať ich špecificky nasmerovanou modifikovanou C3 konvertázou, ktorá by bola rezistentná voči tejto obrane.

v) Mutácie zvyšujúce stabilizáciu C3 konvertázy properdínom. Aktivita properdínu sa zakladá na tom, že stabilizuje komplex C3bBb a zabraňuje spontánnej a na faktore H závisiacej disociácii. Táto stabilizácia je však v kvapalnej fáze neúčinná. Zdá sa však, že je dôležitá pre amplifikáciu komplementovej kaskády, ktorá sa už spustila na vhodnom aktivačnom povrchu (pozri Ferries, T. C., Lachman, P. J. & Harrison, R. A., (1988) Biochenm. J. 252: strana 4 7 až 54) . Zvýšenie aktivity properdínu (zvýšením jeho afinity) by mohlo viesť k zmene rovnováhy v kvapalnej fáze a tak aj k iniciácii spontánnej C3 konverzie. Tento mechanizmus by bol obzvlášť výhodný v kombinácii s uvedenými modifikáciami.

vi) Mutácie zabraňujúce komplexu C3bBb získať C5 konvertázovú aktivitu. Pri odstraňovaní aktívneho C3 z cirkulácie môže byť nežiaducim vedlajším účinkom vznik veľkého množstva anafylaktických peptidov. Z nich je najúčinnejší peptid C5a, ktorý sa odštepuje z proteínu C5 niektorými C3 konvertázovými enzýmami. Táto reakcia pravdepodobne závisí od afinity konvertázy k ďalším molekulám C3b (pozri Kinoshita, T., Takata, Y., Kozono, H., Takeda J., Hong, K. S. & Inoue, K., (1988) J. Immunol. 141: strana 3895 až 3901) . Mutácia v proteíne C3 teda môže viesť k potlačeniu tejto interakcie.

vii) Zvýšená aktivita C3 konvertázy. Aktívne miesto C3bBb C3 konvertázy sa nachádza v časti Bb. Komponent C3b pravdepodobne prispieva k tomu, aby Bb časť zaujala správnu aktívnu konformáciu a/alebo k väzbe a orientácii substrátu pred jeho premenou pomocou Bb časti. Ktorý z týchto mechanizmov je správny, nie je zatial známe, avšak v oboch prípadoch existuje možnosť zvýšenia aktivity konvertázy mutáciou na strane proteínu C3.

viii) Expresia vo funkčnej forme. C3 prirodzene sa vyskytujúceho typu vyžaduje najskôr konverziu pomocou C3b a až potom je schopný kombinácie a tvorby nového C3 konvertázového komplexu. Pri použití in vi vo by požiadavka na konverziu na C3b (alebo C3i) spomaľovala aktivitu modifikovaného C3. Preto by bolo výhodné podávať proteín buď už vo forme, v ktorej je schopný okamžite vytvárať konvertázový komplex, alebo podávať už vopred vytvorený konvertázový komplex. Je preto výhodné vytvárať funkčné reagencie podobné C3b ex vivo. To isté sa môže dosiahnuť in vitro (napríklad pomocou proteolýzy).

ix) Modifikácia natívneho proteínu, ktorá slúži na zavedenie nových miest, v ktorých sa môže príslušný protein štiepiť. Modifikácia sa uskutoční tak, že oblasti peptidu, na ktoré sa viaže faktor B, ostanú zachované, ale oblasti, ktoré sú nutné na väzbu faktora H, sa špecificky odstránia. Miesta sa môžu napríklad zaviesť tak, aby sa modifikovaná forma C3 podobná C3b mohla ďalej štiepiť na formu, ktorá stále viaže faktor B, ale ktorá v menšej miere podlieha inaktivácii faktorom H a I.

x) Modifikácia v ďalších oblastiach, ktoré môžu ovplyvňovať interakciu proteínu C3b s faktorom B a/alebo s faktorom H. Vynález mení tradičný prístup tak, že zvyšuje konverziu C3 proteínu, ktorá vedie k odstráneniu C3 a teda k vyradeniu komplementového systému. Ďalšia aplikácia tohto vynálezu sa zakladá na možnosti zvyšovať C3 konverziu v určitom mieste a vytvárať tak na komplemente závislý efektorový mechanizmus na atakovanie špecifického cieľového miesta.

Konečným efektom teda bude zvýšenie C3 konverzie. Modifikovaný protein sa pridá do média (napríklad krvi), ktoré obsahuje regulátory aktivácie komplementu. To sa potom môže využiť buď na odstránenie natívneho C3 z média, alebo na obmedzenie C3 konverzie na určité cieľové miesto.

Analóg C3, ktorého C3b fragment je rezistentný voči pôsobeniu faktora I (napríklad derivát opisovaný v príklade 1), by viazal faktor B, ktorý by sa potom štiepil faktorom D a nakoniec by sa disocioval na inaktívnu formu. Ak by nedošlo k inaktivácii faktorom I, modifikovaný C3b by bol schopný opakovane sa viazať na nové molekuly faktora B a zvyšovať tak jeho inaktiváciu. Ďalšou možnou aplikáciou modifikácie opísanej v tomto vynáleze by teda bola inaktivácia alternatívnej dráhy odstránením aktivity faktora B. Analogický prístup by sa mohol použiť aj na modifikáciu C4, ktorá by viedla k zvýšenej spotrebe C2, čím by došlo k vyradeniu klasickej dráhy aktivácie komplementu.

Vynález zahŕňa akékoľvek ďalšie proteázy, ktoré sa používajú analogickým spôsobom ako C3bBb, ktorá štiepi C3 na C3b aj v prítomnosti regulátorov aktivácie komplementu.

Vynález zahŕňa aj DNA sekvencie, ktoré kódujú proteín opisovaný vo vynáleze, rovnako ako aj DNA konštrukty obsahujúce tieto DNA sekvencie.

DNA sekvencie zahŕňajú všetky ďalšie sekvencie, ktoré vďaka degenerovanosti genetického kódu kódujú aj danú sekvenciu aminokyselín, alebo ktoré sú s touto sekvenciou značne homológne. V rámci tohto vynálezu sa opisujú aj tieto sekvencie.

V rámci tohto vynálezu sa uvádzajú aj sekvencie nukleových kyselín, ktoré sú značne homológne. Značná homológia sa môže stanoviť bud na úrovni nukleových kyselín, alebo na úrovni aminokyselín. Na úrovni nukleových kyselín sa za sekvencie s velkou homológiou môžu považovať také sekvencie, ktoré hybridizujú so sekvenciami tohto vynálezu v stringentných podmienkach (napríklad pri teplote 35 až 65° C v roztoku soli s koncentráciou 0,9 M). Na úrovni aminokyselín sa môžu proteínové sekvencie považovať za značne homológne s inými proteínovými sekvenciami vtedy, ak sa vyznačujú významnou aminokyselinovou homológiou. Aminokyselinové sekvencie môžu byť homológne z 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % alebo dokonca z 95 %, pričom výhodná je čo najväčšia homológia.

Ako sa už uviedlo, proteíny tohto vynálezu sa môžu použiť tak, aby sa mohli účinky aktivácie komplementu lokalizovať do určitého miesta. Môže sa to dosiahnuť pomocou konjugácie proteínu na funkčnú skupinu, ktorá sa bude viazať na požadované tkanivo.

Vynález ďalej opisuje konjugát obsahujúci proteín podlá vynálezu naviazaný na špecifickú väzbovú skupinu, napríklad na špecifický väzbový proteín. Príkladom takéhoto proteínu môže byť protilátka alebo jej antigén viažuci fragment.

Proteíny podía vynálezu sa budú liečenému subjektu podávať s cieľom vyvolať požadovaný terapeutický efekt. Vynález teda ďalej opisuje:

a) protein podľa vynálezu na použitie v liečbe,

b) použitie proteínu alebo konjugátu podľa vynálezu na výrobu lieku vhodného na znižovanie koncentrácií proteínov komplementovej dráhy a najmä na použitie pri prevencii odmietnutia cudzorodého materiálu,

c) farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu jeden alebo viacero proteínov alebo konjugátov podľa vynálezu spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo excipientami,

d) spôsob zníženia koncentrácie proteínov komplementovej dráhy v organizme cicavca, ktorý zahŕňa podanie proteínov podľa vynálezu tomuto cicavcovi, vo výhodnom uskutočnení vo forme farmaceutickej kompozície.

Farmaceutické kompozície sa môžu podávať vo forme jednotkových dávok, ktoré obsahujú určité množstvo účinnej zložky na dávku. Takáto jednotka môže napríklad obsahovať minimálne 1 mg účinnej zložky a výhodne 2 až 3 mg účinnej zložky. Horná hranica množstva účinnej zložky môže závisieť od mnohých faktorov, ako napríklad od druhu ochorenia, ktoré sa má liečiť, spôsobu administrácie, veku, hmotnosti a stavu pacienta, ako aj od ekonomických dôvodov. Môže sa uviesť, že jednotková dávka môže obsahovať až 10 mg účinnej zložky alebo dokonca aj až 100 mg účinnej zložky.

Proteíny podľa vynálezu sa môžu použiť in vivo proti zablokovaniu komplementovej kaskády. Môže to byť výhodné napríklad pri nasledovných okolnostiach:

a) pri prevencii komplementom spôsobeného zničenia alebo poškodenia transplantátu a to najmä xenotransplantátu (transplantátu z iného živočíšneho druhu) alebo nesúhlasného xenotransplantátu (xenotransplantátu, kde donor a akceptor nesú nesúhlasné determinanty, discordant xenograft), akceptorovi transplantátu sa v tomto prípade zablokuje komplement (dekomplementuj e sa) a v tomto stave sa udržiava až do chvíle, kedy sa.transplantát ujme alebo sa nahradí kompatibilnejším orgánom.

Počiatočné ošetrenie sa musí uskutočniť niekolko dní pred transplantáciou. V prípade krízy spôsobenej odmietnutím transplantátu môže byť potrebné uskutočnenie dodatočnej dekomplementácie. Liečba sa môže sprevádzať antihistaminikami, ktorými sa môžu kontrolovať prípadné celkové zápalové reakcie (napríklad vazodilatácia), ku ktorým môže dôjsť vďaka vzniku C3a a/alebo C5a.

Dekomplementácia môže byť výhodná aj pri použití umelých orgánov alebo tkanív (napríklad dialyzačné membrány v umelej obličke), ktoré aktivujú komplementový systém. Ako sa už skôr opísalo, proteín podlá vynálezu sa môže podať buď v neaktivovanej forme alebo vo forme funkčného proteínu podobného C3b alebo vo forme preformovanej aktívnej C3 konvertázy (podobnej C3bBb). Všetky tieto formy sa môžu podať ľubovoľným spôsobom, pri ktorom dôjde ku kontaktu aktívnej konvertázy s cirkulujúcim C3 (teda napríklad subkutánne, intravenózne, atď.).

Iným možným príkladom použitia je liečba ex vivo, napríklad prepúšťaním krvného obehu cez matricu, na ktorej je naviazaná aktívna konvertáza. Toto usporiadanie môže byť výhodné tým, že umožní odstrániť (napríklad dialýzou) anafylaktické peptidy (C3a a C5a) a ďalšie nízkomolekulárne mediátory zápalu (napríklad histamín alebo oxid dusný) ešte skôr než sa dekomplementovaná krv (alebo plazma) vráti do krvného obehu pacienta.

b) po vážnej operácii, pacient sa v takom prípade dekomplementuje opísaným spôsobom výhodne pred operáciou alebo, ak je to nutné, po operácii, a v tomto stave sa udržiava až do chvíle, kedy sa zníži riziko dodatočného vnútorného poranenia spôsobeného od komplementu závislou imunitnou reakciou.

c) na minimalizáciu kompíementom spôsobeného poškodenia po nechirurgickom poranení, v týchto prípadoch sa dekomplementácia uskutoční po zranení, ale farmaceutické kompozície a spôsoby ich apli14 kácie sú inak podobné tým, ktoré sa opísali vyššie. Obzvlášť výhodné to môže byť vtedy, ak je na uzdravenie nutná reperfúzia ischemického tkaniva krvným obehom (napríklad ischémia myokardu, omrzliny, popáleniny atď.).

d) na minimalizáciu komplementom spôsobeného poškodenia v dôsledku interakcií medzi protilátkou a antigénom, komplementom sprostredkovaná obranná reakcia je zvlášť nežiaduca pri autoimúnnych ochoreniach, ktoré môžu zahŕňať glomerulárnu nefritídu (zápal obličiek), hemolytickú anémiu, myasténiu gravis (ťažkú svalovú ochabnutosť) , diabetes prvého typu, reumatickú artritídu a roztrúsenú sklerózu. Zablokovanie komplementu počas krízy môže zmierniť a uľahčiť stav pacienta, napríklad pri lokálnej aplikácii na kĺb pri reumatickej artritíde.

e) na zvýšenie citlivosti určitého patogénu ku komplementom sprostredkovanej imunitnej odpovedi. Pri tomto prístupe sa nepoužije superaktívna C3 konvertáza, ktorá by všeobecne znížila koncentráciu C3, ale miesto toho sa aplikuje C3 konvertáza lokálne tak, aby sa zakoncentrovala konverzia C3 na tomto špecifickom cieli.

Takýmto cieľom môže byť patogénny organizmus, ako je baktéria, vírus alebo iný parazit, alebo zhubná bunka alebo tkanivo hostiteľa, ako je napríklad nádorová bunka alebo bunka infikovaná vírusom. C3 konvertáza sa môže na cieľovú bunku nasmerovať buď lokálnou administráciou (napríklad priamou injekciou v médiu, ktoré zníži jej ďalšiu disperziu do obehu) alebo pomocou naviazania na cieľovo špecifickú skupinu, napríklad protilátku. Modifikovaný proteín sa tak môže naviazať na špecifický imunoglobulín buď chemickým postupom, alebo spojením kódujúcim sekvenciu DNA pre oba tieto proteíny a expresiou a purifikáciou fúznych proteínov (napríklad v prípade IgG sa môže buď lahký alebo ťažký reťazec naviazať na proteín C3 a potom spoločne exprimovať alebo sa môžu oba reťazce protilátky skombinovať na jeden úplný fúzny polypeptid). Ďalším spôsobom vhodným na naviazanie špecifickej skupiny na modifikovaný proteín C3 je vloženie špecifických kódujúcich sekven15 cií (napríklad sekvencií pre leucínové zipsy”) do DNA oboch fúznych partnerov (napríklad modifikovaného proteínu C3 a špecifickej protilátky) tak, aby sa po zmiešaní exprimované proteíny samé spojili a vytvorili stabilné konjugáty. Fúzny protein sa potom môže podávať lokálne alebo do celkového obehu.

Na transport proteínu podía vynálezu sa môžu použiť aj lipozómy, ktoré nesú na povrchu špecifickú protilátku a modifikovaný protein podľa vynálezu buď tiež na povrchu alebo vo vnútri lipozómu, a/alebo sa môžu použiť virióny navrhnuté napríklad tak, aby na svojom povrchu niesli vhodné proteíny. Táto stratégia sa môže použiť priamo a to tak samostatne ako aj v kombinácii s inou liečbou v ľubovoľnom štádiu ochorenia. Obzvlášť výhodná môže byť pri eliminácii všetkých zvyšných nádorových buniek po chirurgickom odstránení nádoru. Konjugáty modifikovaného proteínu podía vynálezu s protilátkou sa môžu použiť aj na elimináciu patogénnych tkanív ex vivo, napríklad na usmrtenie leukemických buniek v extrahovanej kostnej dreni a navrátenie zvyšnej drene do tela pacienta.

Prípadne sa môžu lymfocyty, ktoré nezodpovedajú typu MHC príjemcu, eliminovať z kostnej drene ešte pred transplantáciou. Upravený protein podľa vynálezu sa môže naviazať aj na antigén a takýto konjugát sa môže použiť na atak lymfocytov s nežiaducou reaktivitou a to bud v in vivo alebo v ex vivo podmienkach. Takýto postup sa môže použiť napríklad na elimináciu nežiaducich lymfocytov reagujúcich s transplantátom alebo s tkanivom hostiteľa.

Rovnaký spôsob sa môže použiť aj na liečbu iných druhov a to použitím buď derivátu ľudského modifikovaného proteínu podía vynálezu alebo podobného analógu pripraveného špeciálne pre daný druh.

Vynález sa opíše v nasledovných príkladoch, ktoré však vynález v žiadnom prípade neobmedzujú. Príklady sú ilustrované nasledovnými obrázkami.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: znázorňuje predpovedanú sekvenciu ľudského proteínu C3 kódovanú konštruktom PC3; na obrázku sa používa štandardný jednopísmenový aminokyselinový kód.

Obrázok 2: znázorňuje cDNA sekvenciu v konštrukte PC3; na obrázku sa používa štandardný jednopísmenový deoxynukleotidový kód pre sense-vlákno, sekvencia je zapísaná v smere 5'-3'.

Obrázok 3: vizualizácia modifikovaných proteínov podľa vynálezu.

Obrázok 4: znázorňuje účinok rôznych mutácií na ľudský proteín C3, pri ktorých sa zamenila aminokyselina Arg 1303 (miesto 1) alebo Arg 1320 (miesto 2), teda na miestach, kde dochádza k štiepeniu sprostredkovanému faktorom I.

1. vzorky sa označili biosynteticky sírou [^s].

2. reakcie sa uskutočňovali pri normálnej iónovej sile.

3. proteíny sa imunoprecipitovali protilátkou anti-C3.

4. uskutočnila sa SDS-PAGE použitím redukčných podmienok.

5. uskutočnila sa autorádiografia.

Obrázok 5: znázorňuje zvýšenú rezistenciu ľudského proteínu C3 s mutáciou Arg 1303 -> Gin 1303 voči inaktivácii faktormi I a H. Plné body platia pre prirodzene sa vyskytujúci proteín C3, prázdne štvorčeky pre mutovaný. Na zvislej osi sa uvádza percento lyzovaných buniek, na vodorovnej osi je množstvo faktora H/I v pg/ml.

Obrázok 6: znázorňuje analýzu štiepenia C3 konvertázy zmutovanej v amino kyselinových zvyškoch 752 až 754 a 758 až 760. Na obrázku je fotografia analýzy „Western blot vyvolaná po elektroforéze na 7,5 % polyakrylamidovom géli v prostredí SDS použitím redukčných podmienok, elektrotransfere na nitrocelulózovú membránu, inkubácii s ovčou protilátkou proti ľudskému proteínu C3 a vizualizácii chrenovou peroxidázou naviazanou na protilátku proti ovčím imunoglobulínom. Na vizualizáciu sa použila metóda Enhanced ChemiLuminiscence od firmy Amersham, Velká Británia a výsledok sa zachytil na rôntgenovom filme. Štiepna reakcia a detekcia sa opisujú v príklade 4 s odvolaním sa na výsledky z obrázku 3.

V jednotlivých stopách sa pustili nasledovné vzorky:

Stopy 1 až 4: prirodzene sa vyskytujúci protein C3 (exprimovaný v bunkách COS

Stopy 5 až 8: mutantný protein C3 (aminokyselinové zvyšky 752 až 754 sa zamenili na Gly-Ser-Gly a zvyšky 758 až 760 rovnako na Gly-Ser-Gly (protein sa exprimoval v bunkách COS)

Stopy 1,5: žiadny prídavok

Stopy 2,6: + CVFBB

Stopy 3,7: + faktory H a I

Stopy 4,8: + CVFBB + faktory H a I

Jednotlivé elektroforetické prúžky indikované šípkami sú:

A:	C3	reťazec	alfa
B:	C3	reťazec	alfa'
C:	C3	reťazec	beta

D: štiepny produkt C3 reťazca alfa' s veľkosťou 68 kDa

E: ťažký reťazec IgG

Obrázok 7: znázorňuje analýzu štiepenia rádioaktívne značeného faktora B faktorom D v prítomnosti prirodzene sa vyskytujúcej a mutantnej formy proteínu C3 (C3i).

Ide o fotografiu autorádiografického záznamu gélu z SDS-PAGE. Všetky vzorky obsahovali faktor D a faktor B značený ¹²⁵I. Vzorky sa inkubovali počas 3 hodín pri teplote 37’ C. V jednotlivých číslovaných stopách vzorky obsahovali:

1. samotný pufor

2. 1/125 prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3

3. 1/25 prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3

4. 1/5 prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3

5. 1/25 mutantného proteínu C3 (mutované zvyšky 1427 Gin, 1431 Asp a 1433 Gin)

6. 1/5 mutantného proteínu C3

7. neriedený mutantný proteín C3

Šípkami sú označené tieto elektroforetické prúžky:

A. Neštiepený faktor B značený ¹²⁵I (98 kDA)

B. produkt štiepenia s velkosťou 60 kDa (Bb)

C. produkt štiepenia s velkosťou 33 kDa (Ba)

Obrázok 8: znázorňuje SDS-PAGE elektroforézu dokazujúcu vznik konjugátu medzi C3i a IgG.

Ide o 4 % akrylamidový gél (SDS-PAGE) spustený použitím neredukujúcich podmienok po vyfarbení Comassie modrou. Číslované stopy obsahujú vzorky:

1. PDP-IgG

2. C3i

3. PDP-IgG + C3i reakčná zmes

Šípkami sú označené:

A. pravdepodobný konjugát C3i a IgG (350 kDa)

B. proteín C3i (200 kDa)

C. IgG (150 kDa)

Obrázok 9: demonštruje špecifické nasmerovanie aktivity konjugátu C3 konvertázy proti ovčím erytrocytom. Tento graf znázorňuje percento lyzovaných ovčích erytrocytov (os Y) po potiahnutí rôznymi riedeniami (os X) buď C3i-IgG konjugátu (štvorčeky) alebo PDP-IgG (krúžky) alebo C3i (kosoštvorčeky) , po ktorom nasledovalo premytie, vznik C3 konvertázy pomocou properdínu a faktorov B a D a nakoniec vyvolanie lýzy pomocou NGPS v CFD/EDTA, pozri opísané spôsoby. Iba konjugát indukuje lýzu buniek a táto lýza závisí od použitej dávky.

Obrázky 10 a 11: ukazujú štiepne vlastnosti mutantnej formy C3 nazvanej DV-1AM (vid príklady 12 až 14) .

Na obrázku 10 sa supernatanty COS buniek obsahujúce exprimovanú prirodzene sa vyskytujúcu formu C3 (A) a mutantnú formu DV-1AM (B) ošetrili 1) ničím; 2) prídavkom CVFBb; 3) prídavkom 10 pg/ml faktora I a 50 μg/ml faktora H; alebo 4) CVFb plus 10 pg/ml faktora I a 50 pg/ml faktora H, potom sa imunoprecipitovali a analyzovali pomocou SDS-PAGE a elektroblotovali na nitrocelulózovú membránu, pozri príklad 4. V tomto prípade sa blot vyvolal použitím kombinácie potkaních monoklonálnych protilátok, klonu 3 a klonu 9, reagujúcich s C3dg oblasťou proteinu C3 a s produktami jej fragmentácie (pozri Lachmann, P. J. a ďalší, J. Immunol. (1980) 41: strana 503) . Potom nasledovala detekcia konjugátom chrenovej peroxidázy s protilátkou proti potkaním imunoglobulínom (Sigma) a vizualizácia pomocou ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Na obrázku 11 sa supernatanty z buniek COS obsahujúce exprimovaný mutantný proteín DV-1B (A) , prirodzene sa vyskytujúcu formu proteinu C3 (B) a mutantný proteín DV-6 (C) ošetrili v jednotlivých stopách nasledovným spôsobom: 1) ničím; 2) prídavkom 10 pg/ml faktora I a 50 pg/ml faktora H; 3) CVFb; 4) CVFb s prídavkom 10 pg/ml faktora I a 2 μg/ml faktora H; 5) CVFb s prídavkom 10 pg/ml faktora I a 10 μg/ml faktora H; alebo 6) CVFb s prídavkom 10 pg/ml faktora I a 50 pg/ml faktora H, potom sa imunoprecipitovali a analyzovali pomocou SDS-PAGE a elektroblotovali na nitrocelulózovú membránu, pozri príklad 4. V tomto prípade sa blot vyvolal použitím polyklonálnej ovčej anti-C3 protilátky.

Obrázok 12: znázorňuje analýzu proteínu príbuzného C3, ktorý vzniká transláciou z mutantného génu s posunom čítacieho rámca. Tento produkt sa označuje ako HDV-3X. Výsledky proteínu HDV-3X sa porovnávajú s výsledkami pre proteín DV-3, ktorý rovnako ako proteín HDV-3X obsahuje mutácie T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N a K1036I, ale na rozdiel od proteínu HDV-3X nemá upravený C-koniec.

Supernatanty z buniek COS obsahujúce exprimovaný proteín DV-3 (A) a mutantný proteín HDV-3X (B) sa v jednotlivých stopách ošetrili nasledovným spôsobom: 1) ničím; 2) prídavkom CVFb a 10 gg/ml faktora I; 3) prídavkom CVFb a 10 ng/ml faktora I s 1 μς/πιΐ faktora H; 4) prídavkom CVFb a 10 gg/ml faktora I s 5 μg/ml faktora H; 5) prídavkom CVFb a 10 μg/ml faktora I s 25 μg/ml faktora H; potom sa imunoprecipitovali a analyzovali pomocou SDS-PAGE a elektroblotovali na nitrocelulózovú membránu, pozri príklad 4. V tomto prípade sa blot vyvolal použitím kombinácie potkaních monoklonálnych protilátok, klonu 3 a klonu 9, reagujúcich s C3dg oblasťou proteínu C3 a s produktami jej fragmentácie (pozri Lachmann, P. J. a ďalší, (1980) J. Immunol. 41: strana 503). Potom nasledovala detekcia konjugátom chrenovej peroxidázy s protilátkou proti potkaním imunoglobulínom (Sigma) a vizualizácia pomocou ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Obrázok 13 poukazuje na experiment, v ktorom sa supernatanty z buniek COS obsahujúce exprimované mutantné formy proteínu C3 E1Q2 (A), E1Q2QG3 (B) a E1Q2E3 (C) ošetrili inkubáciou pri teplote 37° C počas 2,5 hodiny v jednotlivých stopách nasledovnými prídavkami: 1) CVFBB s 10 μg/ml faktora I; 2) CVFBB s 10 μg/ml faktora I a 50 μg/ml faktora H; 3) CVFBB s 10 μg/ml faktora I a 25 μg/ml sCRl; potom sa imunoprecipitovali a analyzovali pomocou SDS-PAGE a elektroblotovali na nitrocelulózovú membránu, pozri príklad 4. V tomto prípade sa blot vyvolal použitím kombinácie potkaních monoklonálnych protilátok, klonu 3 a klonu 9 (pozri príklad 12), reagu21 júcich s C3dg oblasťou proteínu C3 a s produktami jej fragmentácie (pozri Lachmann, P. J. a ďalší, (1980) J. Immunol. 41: strana 503). Potom nasledovala detekcia konjugátom chrenovej peroxidázy s protilátkou proti potkaním imunoglobulínom (Sigma) a vizualizácia pomocou ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Elektroforetický prúžok s veľkosťou 86 kDa (označený šípkou) je produktom štiepenia sprostredkovaného faktorom I na treťom štiepnom mieste, pričom nedošlo k predošlému štiepeniu v štiepnych miestach 1 alebo 2.

Obrázok 14 poukazuje na experiment, v ktorom sa supernatanty z buniek COS obsahujúce exprimované mutantné formy proteínu C3 a to NC3 (A), FT-1 (B), FT2 (C), FT-3 (D), FT-4 (E) a FT-5 (F) v jednotlivých stopách ošetrili inkubáciou pri teplote 37° C počas 2,75 hodiny nasledovnými prídavkami 1) bez prídavku; 2) CVFBb s 10 μg/ml faktora I a 50 μg/ml faktora H; potom sa imunoprecipitovali a analyzovali pomocou SDS-PAGE a elektroblotovali na nitrocelulózovú membránu, pozri príklad 4. V tomto prípade sa blot vyvolal použitím kombinácie potkaních monoklonálnych protilátok, klonu 3 a klonu 9 (pozri príklad 12) , reagujúcich s C3dg oblasťou proteínu C3 a s produktami jej fragmentácie (pozri Lachmann, P. J. a ďalší, (1980) J. Immunol. 41: strana 503). Potom nasledovala detekcia konjugátom chrenovej peroxidázy s protilátkou proti potkaním imunoglobulínom (Sigma) a vizualizácia pomocou ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Obrázok 15 poukazuje na experiment, v ktorom sa supernatanty z buniek COS obsahujúce exprimované mutantné formy proteínu C3 a to NC3 (A), FR-1 (B), FR-2 (C), FR-3 (D), FR-4 (E) a FT-2 (F) v jednotlivých stopách ošetrili inkubáciou pri teplote 37° C počas 2,5 hodiny nasledovnými prídavkami: 1) bez prídavku; 2) CVFBB s 10 μg/ml faktora I a 50 μg/ml faktora H; potom sa imunoprecipitovali a analyzovali pomocou SDS-PAGE a elektroblotovali na nitrocelulózovú membránu, pozri príklad 4. V tomto prípade sa blot vyvolal použitím kombinácie potkaních monoklonálnych protilátok, klonu 3 a klonu 9 (pozri príklad 12), reagujúcich s C3dg oblasťou proteínu C3 a s produktami jej fragmentácie (pozri Lachmann, P. J. a ďalší, (1980) J. Immunol. 41: strana 503). Potom nasledovala detekcia konjugátom chrenovej peroxidázy s protilátkou proti potkaním imunoglobulínom (Sigma) a vizualizácia pomocou ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Kvôli prehľadnosti sa uvádza tabuľka, v ktorej sa uvádzajú vzťahy medzi nárokmi vzťahujúcimi sa na určitý modifikovaný proteín, ktorý sa môže použiť ako C3 konvertáza odolná voči regulačnému zníženiu aktivity a medzi príkladmi a tabuľkami opisujúcimi tento proteín.

Tabuľka A

Oblasť (číslovanie sa vzťahuje na ľudskú C3 konvertázu) sekvencie aminokyselín o ktorej sa predpokladá, že je dôležitá na rezistenciu voči regulačnému zníženiu aktivity (down-regulácii)

Nároky	Oblasť	Príklad	Tabuľka
5 až 8	1303/1320	1 až 6, 11
9 až 11	758 až	7
	780/752 až
	754
12	1427, 1431,	8	I
	1433
13 až 15	992 až 1005	12, 13	II
16 až 19	1152 až 1155	14	II
20 až 29	1546 až 1663	15, 17	III
30 až 34	954 až 955	16

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledovné štandardné postupy a definície sa môžu použiť vo všetkých príkladoch:

Ak sa neuvádza inak, všetky uvedené súčasti komplementu sú ľudského pôvodu a pre všetky proteíny a ich odvodené fragmenty sa používa štandardná terminológia (t. j. ako v Rother, K. E., Till, G. 0. (editori), (1988) v knihe The Complement System, nakladateľstvo Springer, Berlin/Heidelberg, SRN). Okrem toho výraz C3i” sa vzťahuje na všetky molekulárne formy C3, v ktorých nie je intaktná tioesterová väzba, ale ktoré si uchovávajú polypeptid C3a v alfa reťazci.

Ľudská C3 cDNA a kódujúca sekvencia sa číslujú tak, ako sa uvádza na obrázku 2, pričom sa používa číslovanie použité v nukleotidovej databáze EMBL (pozri de Bruijn, M. H. & Fey, G. H., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: strana 708 až 712). Uvedená sekvencia je aj sekvenciou nášho konštruktu ('PC3'), v ktorej chýba prvých 11 nukleotidov z 5' neprekladanej oblasti tak, ako sa uvádza v literárnom odkaze (pozri de Bruijn, M. H. & Fey, G. H., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: strana 708 až 712), a preto je prvá báza označená číslom 12. Predpokladaný iniciačný kodón obsahuje nukleotidy s číslom 61 až 63, kodón pre koncový serínový aminokyselinový zvyšok v beta reťazci pozostáva z nukleotidov 127 až 129 a kodón pre koncový aminokyselinový serínový zvyšok v alfa reťazci sú nukleotidy 2074 až 2076.

Číslovanie v sekvencii proteínu sa uskutočňuje podľa sekvencie prekurzoru tak, ako sa uvádza na obrázku 1, pričom je odvodeným prekladom (transláciou) sekvencie DNA v dodatku 1. Predpokladá sa, že aminokyseliny 1 až 22 obsahujú signálnu sekvenciu, ktorá sa odstraňuje počas biosyntézy. Ďalej sa predpokladá, že aminokyseliny 668 až 671 sa odstránia v okamihu, kedy sa prekurzor štiepi na alfa a beta reťazec.

Nasledovné skratky majú uvedené významy:

CVF faktor kobrieho jedu,

ELI SA enzymoimunologické adsorpčné testy,

E. coli	Escherichia coli,
kb	kilobáza,
HSV-1	herpes simplex vírus prvého typu,
PBS	pufrovaný fyziologický roztok
COS-1	bunková línia odvodená z opičích obličkových buniek.

Nasledovné skratky platia pre rôzne reštrikčné endonukleázy: AflII, Dral, DralII, EcoRI, EcoRV, HindlII, Nael, NheI, Xbal.

Štandardné spôsoby

Metódy používané v štandardných molekulárno biologických postupoch, ako sú izolácie plazmidov, elektroforézy na agarózovom géli a ligácia DNA sa dajú nájsť napríklad v Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory

Manual 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Dvojvláknová DNA sa sekvenovala pomocou súpravy Sequenase, verzia 2.0 dodávaného firmou United States Biochemicals. Expresia proteínu C3 sa merala pomocou ELISA testov, pri ktorých sa používali plastové doštičky, ktoré boli potiahnuté afinitne čistenou polyklonálnou ovčou protilátkou proti ludskému proteínu C3. Na tieto potähované doštičky sa nanášali vzorky supernatantu z kultúry. Naviazaný proteín C3 sa deteguje monoklonálnymi potkaními protilátkami proti proteínu C3 konjugovanými s alkalickou fosfatázou, pričom sa použije chromogénny substrát p-nitrofenylfosfát. Testy sa kalibrujú pomocou purifikovaného ludského plazmatického proteínu C3.

Metódy používané na purifikáciu proteínov komplementu a CVF a na prípravu afinitne čistených anti C3 protilátok použitých na analýzu sa dajú nájsť napríklad v Harrison, R. A. & Lachmann, P. J., (1986) Handbook of Experimental Immunology, Weir, Herzenberg & Blackwell (editori), 4. vydanie, Oxford. Rovnocenné reagencie sa môžu získať aj nákupom od spoločnosti Sigma.

Sekvencie cDNA kódujúce proteín C3

Sekvencie kódujúce proteín C3 cDNA sa skonštruovali z dvoch segmentov izolovaných z cDNA knižnice z ľudských pečeňových buniek, ktorá sa získala pomocou náhodných primerov.. Táto knižnica sa nachádza vo vektore pGEM4 (Promega). Päť oligonukleotidov zodpovedajúcim známym segmentom v ľudskej sekvencii kódujúcej proteín C3 sa rádioaktívne označilo pomocou T4 polynukleotidkinázy a (y- 32p) TYTp _a použilo sa ako hybridizačná sonda s knižnicami prenesenými z agarózových platní. Izolovali sa dva klony obsahujúce inzerty s veľkosťou približne 4 kb. Štiepením reštrikčnými endonukleázami, hybridizáciou so špecifickými polynukleotidovými sondami a čiastočnou sekvenčnou analýzou sa dokázalo, že jeden z týchto klonov (A13) obsahoval 5'-koniec fragmentu mRNA s veľkosťou 5,1 kb, zatial čo druhý (B44) dosahoval až k jej 3'-koncu.

Tieto inzerty sa teda prekrývajú v oblasti približne 3 kb, ktorá zahŕňa špecifické štiepne miesto pre EcoRI reštrikčný enzým. Nekompletná 5' časť A13 sa môže odštiepiť EcoRI a NheI a nahradiť kompletnou časťou izolovanou z B44, pričom sa použije štiepenie EcoRI a Xbal. Oba kusy sa prečistili gélovou elektroforézou na agarózovom géli s nízkou teplotou topenia (low-melting point agarose). Potom sa spojili ligáciou pomocou T4 DNA ligázy a tak sa vytvoril vektor (PGC3) obsahujúci 5,1 kb dlhý fragment DNA, ktorá kóduje celý proteínový prekurzor C3.

Sekvencia linkera na 5'-konci C3 kódujúcej oblasti obsahuje dva ATG kodóny, ktoré sú možnými chybnými miestami pre iniciáciu translácie. Preto sa tieto kodóny z plazmidu odstránili spôsobom gapped” mutagenéza plazmidu, ako sa opisuje v príklade 1, pričom sa použije oligonukleotid PL-ATC-3 (taggg agacc, ggaag cttgc, cctct, ccctc, tgtcc ctcgt). Tým sa vynechalo približne 50 báz z linkerovej-adaptorovej DNA bez toho, aby sa tým zmenila sekvencia kódujúca C3. Takto premenený vektor s veľkosťou 7,7 kb, ktorý obsahuje sekvenciu cDNA s veľkosťou 5,1 kb kódujúcou proteín C3 a sekvenciu s veľkosťou 2,6 kb patriacu vektoru pGEM4 (Promega), sa ďalej označuje ako PC3.

C3 kódujúca oblasť v plazmide PGC3 je kompletne sekvenovaná a vyznačuje sa iba štyrmi zmenami v porovnaní s už skôr publikovanou ludskou cDNA sekvenciou pre proteín C3 (S alela, pozri de Bruijn, M. H. & Fey, G. H., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: strana 708 až 712):

(i) zmeny C2481 za G a C2805 za T nemení kódovaný proteín, (ii) zmena T1001 za C kóduje skôr opísanú polymorfnú formu HAV 4-1-(leucín 314 -> prolín) (20), a (iii) G2716 za A kóduje zámenu valínu 886 za izoleucín, čo sa dovtedy v ľudskom C3 nedokázalo, hoci íle sa v tejto pozícii našiel v potkaňom a myšom C3.

Sekvencie podlá vynálezu obsahujú iniciačné a terminačné (stop) kodóny, ako aj celú signálnu sekvenciu a môžu teda kódovať funkčný proteín C3.

Pomocou ELISA testov sa detegovali hladiny koncentrácií nad 1,7 μg/ml. Tieto hodnoty sa dosiahli expresiou prirodzene sa vyskytujúceho typu C3 v supernatantoch kultúr COS-1 buniek. Na transfekciu týchto buniek sa použil lipofektamín a expresný vektor pcDNA3 (Invitrogen). Nedetegovatelné hladiny proteínu C3 sa zistili u buniek, v ktorých sa uskutočnila transfekcia iba samotným vektorom pcDNA3. Analýzou produktov expresie pomocou štiepnych reakcií s následnou imunoprecipitáciou, SDS polyakrylamidovou elektroforézou a imunoblotom sa dalej dokázalo, že:

(i) primárny produkt translácie sa bezchybne premenil na matúrovanú dvojreťazcovú formu, (ii) tento produkt sa môže, rovnako ako natívny proteín C3, štiepiť na C3b pomocou C3 konvertázy (CVFbB), a (iii) exprimovaný proteín sa rovnako ako natívny proteín C3 nedal štiepiť pomocou faktora H a faktora I, ale dal sa štiepiť po konverzii na C3b pomocou enzýmu konvertázy. Toto všetko potvrdzuje skutočnosť, že náš východiskový plazmid sa môže preložiť do funkčného proteínu C3.

Ďalší opis konštrukcie a sekvencie kódujúcej protein C3 sa dá nájsť v publikácii Taniguchi-Sidle, A. & Isenman, D. E., (1992) J.

Biol. Chem. 267: strana 635 až 643.

Príklad 1

Príprava proteínu C3 s arginínovými aminokyselinovými zvyškami v oboch štiepnych miestach pre faktor I (aminokyselinové zvyšky v pozíciách 1303 a 1320) zamenenými za glutamínové zvyšky, čím sa zabránilo štiepeniu C3b fragmentu faktorom I

a) Mutagenéza

Použili sa nasledovné mutagénne oligonukleotidy:

QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc) ,

QRI2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag) ,

AFL4149 (taataaattcgacctaaggtcaccataaa a c) a ďalej aj zodpovedajúce anti-sense oligonukleotidy,

ORIla (ggtgatcttggaagctttggctgggcagttg) ,

QR2a (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) a

AFL4149a (gttttatggtgacctttaaggtcgaatttatta) .

Oligonukleotidy QRI1 a QRIln špecifikujú zámenu arginínu za glutamín v mieste štiepenia faktorom I, a to u aminokyseli-nového zvyšku 1303 v sekvencii prekurzoru proteínu C3 (deje sa to zámenou nukleotidov v cDNA sekvencii, a to u G3968 a C3969 vo oboch prípadoch za A) . Podobne je to aj u QRI2 a QRI2n, ktoré ovplyvňujú rovnakú zámenu v štiepnom mieste faktora, a to u aminokyselinového zvyšku 1320 (zmenou v nukleotidovej sekvnecii G4019 za A).

AFL4149 a AFL4149a zavádzajú štiepne miesto pre reštrikčnú endonukleázu AflII v pozícii 4149 v cDNA sekvencií (zámenou C4149 za T) bez zámeny kódovanej aminokyselinovéj sekvencie. Tieto dva primery sa použili ako markery, ktoré umožnili identifikáciu toho, že mutagenéza prebehla úspešne, a to práve na základe štiepenia DNA produktu reštrikčným enzýmom AflII.

Mutagenéza sa uskutočnila spôsobom gapped plazmid mutagenéza. Dávka PGC3 (UPGC3), obohatená uridínom na mieste tymidínu, sa vypestovala v E. coli kmeňa CJ236 v prítomnosti 0,25 pg/ml uridínu. Tento plazmid sa štiepil enzýmom Smal a produkt štiepenia s veľkosťou 7,2 kb (US1) sa prečistil na agarózovej elektroforéze, čím sa odstránil 0,5 kb dlhý fragment pochádzajúci z C3 sekvencie (aminokyselinové zvyšky 1463 až 1947). Ďalšia súčasť gapped plazmidu (DN2) sa pripravila štiepením PGC3 reštrikčnými enzýmami DralII a Nael. Časť s veľkosťou 5,1 kb sa purifikovala pomocou dvojnásobného čistenia na agarózovej elektroforéze. 200 ng DN2 sa zmiešalo s 500 ng US1 v 50 μΐ vody, zohrialo sa na teplotu 100° C a pomaly ochladilo pod teplotu 50° C. Potom sa pridalo 20 až 25 μΐ 2XT7 pufra (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 14 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 2 mM ditiotrei-tolu a 1 mM koncentrácie každého z nasledovných nukleotidov: ATP, dATP, dCTP, dTTP a dGTP. Ďalej sa pridalo ešte 10 nM každého z 5'-fosforylovaných mutagénnych primerov (v jednej reakcii sa použili QRI, QRI2 a AFL4149, v druhej reakcii sa použili QRIla, QRl2a a AFL4149a).

Zmes sa znovu zohriala na teplotu 70° C počas 5 minút a pomaly ochladila (počas 30 až 60 minút) na teplotu 20° C. Pri teplote 0° C sa pridalo 10 jednotiek T7 DNA polymerázy a 80 jednotiek T4 DNA ligázy. Zmes (celkový objem bol 50 μΐ) sa najskôr inkubovala počas 5 minút pri teplote 0° C a potom pri teplote miestnosti tiež počas 5 minút a nakoniec pri teplote 37° C počas 3 hodín. 1 μΐ z každej zmesi sa použil na transformáciu 100 μΐ superkompetentných buniek XL1 E. coli (Stratagene). Transformácia sa uskutočnila podía inštrukcií výrobcu.

Voči ampicilínu rezistentné kolónie sa podrobili štiepeniu reštrikčným enzýmom AflII a požadované mutantné formy enzýmov sa namnožili v kultúrach s objemom 100 ml, z ktorých sa potom izolovali a sekvenovali plazmidy. Sekvenácia sa uskutočňovala pomocou sekvenačného primera C3pa3876 (cttca tggtg ttcca agcct), ktorý zodpovedal nukleotidom 3876 až 3895 v cDNA pre proteín C3. Uskutočňovaná sekvenácia by mala charkterizovať mutácie v štiepnych miestach pre faktor I.

Ďalšie možné uskutočnenie gapped plazmid mutagenézy sa opisuje napríklad v publikáciách Hofer, B & Kuhlein, B., (1993) Methods Enzymol. 217: strana 173 až 189; Morinaga, Y, Franceschini, T., Inouye, S. & Inouye, M., (1984) Bio-Technology 2: strana 636 až 639.

b) Prenos mutantnéj DNA do eukaryotického expresného vektora.

Fragmenty kódujúce C3 sa z mutantov vybrali pomocou dvojnásobného štiepenia reštrikčnými enzýmami HindlII a Nael. Ďalej sa použil enzým Dral, ktorým sa rozštiepila zvyšná časť plazmidu tak, aby sa vyradila z ďalšieho použitia.

Sekvencia kódujúca proteín C3 sa prečistila pomocou elektroforézy na agarózovom géli a ligovala sa do plazmidu pcDNA3 (Invitrogen), ktorý sa linearizoval použitím enzýmov HindlII a EcoRV a defosforyloval pomocou fosforylázy izolovanej z teľacích čriev. Ligačná zmes sa použila na transformáciu superkompetetných buniek kmeňa XL1 E. coli. Tieto bunky sa potom pestovali na kultivačných platniach obsahujúcich ampicilín.

Tri alebo štyri náhodne vybrané k ampicilínu rezistentné kolónie sa potom preniesli a pestovali v 2 až 3 ml kultúrach, ktoré slúžili na izoláciu plazmidovej DNA v malom množstve. Plazmidy obsahujúce správny inzert sa identifikovali pomocou štiepenia plazmidovej DNA reštrikčnými endonukleázami EcoRI, HindlII a AflII. Zodpovedajúce kolónie sa potom pestovali v kultúrach s objemom 100 ml a plazmidy sa ďalej izolovali štandardným postupom. Tieto mutanty sa od počiatku konštruovali z PGC3 a preto si zachovali dva zvyšné kodóny ATG-5', ktoré sú pripojené ku kódujúcej oblasti. Táto oblasť (ďalej ešte vrátane 5' C3 kódujúcej sekvencie s veľkosťou 3 kb) sa vystrihla pomocou reštrikčných enzýmov HindlII a EcoRI a nahradila sa ligáciou rovnakého segmentu vystrihnutého z plazmidu PC3. Tieto rekonštruované vektory sa pripravili štandardnými postupmi a použili sa na transfekciu COS buniek.

c) Expresia prirodzene sa vyskytujúceho typu (divého) proteínu C3 a mutantných foriem proteínu C3

Mutantné formy a prirodzene sa vyskytujúca forma proteínu C3 sa krátkodobo exprimovali z plazmidov, ktoré sa transfekciou vložili do buniek bunkovej línie COS-1. Na transfekciu sa použil lipofektamín (Gibco) podlá inštrukcií dodávateľa. Zvyčajne sa 1 až 1,5 x 10⁵ buniek na jednu jamku kultivačnej dosky s 6 jamkami podrobilo transfekcii pomocou 2 až 4 μg plazmidu, pričom sa použilo 9 μΐ lipofekatmínového činidla. V supernatantoch kultúr sa zisťovala prítomnosť sekretovaného proteínu C3. Typickým výsledkom boli výťažky 0,3 až 1,7 μg na 1 ml supernatantu 3 až 6 dní po transfekcii .

Výsledky

a) Príprava mutantných foriem

Nasledovné mutantné formy sa nazývajú podľa mutagénnych oligonukleotidových sekvencií, ktoré sa začlenili do sekvencií. Tieto mutanty sa aj izolovali:

(i) tri mutantné formy s oboma mutáciami QRI1 a QRI2 a ďalej s AFL4149: C3M-26, C3M-58 a C3M-61, (ii) jedna mutantná forma s mutáciami QRI1 a QRI2, ale bez mutácie AFL4149: C3M-8, a (iii) jedna mutantná forma s mutáciami QRI2 a AFL4149, ale bez mutácie QRI1: C3M-51 (použila sa v príklade 3).

b) Overenie, že účinky na funkciu spôsobili mutácie špecificky vložené na miesta štiepenia faktorom I

Sekvenovaním sa potvrdila správnosť sekvencii a absencia ďalších zmien na pozíciách 178 až 350 v okolí zmutovanej oblasti každého z mutantov. Sekvencia jednej mutantnej formy (C3M-51, pozri príklad 3) sa skúmala po celej dĺžke medzery (bázy 2463 až 5067) použitej na mutagenézu, pričom sa nenašli žiadne ďalšie odchýlky od prirodzenej sekvencie.

Ďalej sa uskutočnilo reprezentatívne sekvenovanie celkove 2922 báz všetkých mutantov, pričom sa neodhalila žiadna bodová mutácia, ktorá by mohla byť spôsobená chybami polymerázy. Všetky exprimované mutantné formy sa vyznačovali dvojreťazcovou štruktúrou a ich štiepenie C3 konvertázami bolo normálne. Celkove sa dá povedať, že je velmi málo pravdepodobné, že by niektorá z mutantných foriem obsahovala nežiaducu mutáciu, aj keď sa všetky kompletne nesekvenovali.

Príklad 2

Príprava proteínu C3 s arginínovým zvyškom v jednom štiepnom mieste pre faktor I (zvyšok v pozícii 1303) pozmenenom na glycínový zvyšok

Postupovalo sa podobne ako v príklade 1 s tým rozdielom, že na mutagenézu sa použili dvojice oligonukleotidov AFL4149 a QRI1 alebo AFL4149n a QRIln (t. j. nepoužili sa oligonukleotidy QRI2 alebo QRI2n).

Výsledky

a) Získané mutantné formy

Izolovali sa dve mutantné formy proteínu C3, pričom sa využili oligonukleotidy QRI1 a AFL4149, ale bez QRI2 a to C3M-I23 a C3M-I27. Mutantná forma C3M-I23 sa exprimovala spôsobom opísaným v príklade 1.

Získaný proteín bol štiepitelný pomocou CVFBb. Vzniknutý produkt podobný C3b bol (v porovnaní s prirodzeným typom) relatívne rezistentný voči štiepeniu faktormi I a H v pozícii 1303, avšak bol ešte stále štiepitelný v pozícii 1320. Tento derivát C3b je teda čiastočne rezistentný vzhladom na faktor I.

Príklad 3

Príprava proteínu C3 s arginínovým zvyškom v oblasti štiepenia faktorom I (zvyšok v pozícii 1320) pozmeneným na glycínový zvyšok.

Postupovalo sa podobne ako v príklade 1 s tým rozdielom, že na mutagenézu sa použili oligonukleotidy AFL4149 a QRI2 alebo AFL4149n a QRI2n (t. j. nepoužili sa oligonukleotidy QRI2 alebo QRI2n).

Výsledky

a) Získané mutantné formy

Izolovali sa tri mutantné formy, pričom sa využili oligonukleotidy QRI1 a AFL4149, ale bez oligonukleotidu QRI2 a to C3M-51, C3M-Q2 a C3M-Q13. Mutantná forma nazvaná C3M-53 sa exprimovala spôsobom opísaným v príklade 1.

Získaný proteín bol štiepitelný pomocou CVFBb. Vzniknutý produkt podobný C3b bol (v porovnaní s prirodzeným typom) relatívne rezistentný voči štiepeniu faktormi I a H v pozícii 1320, avšak bol ešte stále štiepitelný v pozícii 1303. Tento derivát C3b je teda čiastočne rezistentný vzhladom na faktor I.

Príklad 4

Analýza funkčných účinkov mutácií

100 až 400 μΐ supernatantov z transfekovaných COS buniek sa inkubovalo pri teplote 37° C počas 2 hodín.

Bunky COS sa infikovali pcDNA3, ktorý nesie nasledovné

	inzerty:
	D	nemutovanú sekvenciu C3;
	2)	mutovanú	C3M-I23 (so zmenou Argl303	-> Gin);
	3)	mutovaná Gin); a	C3M-26 (so zmenou Argl303	-> Gin a Argľ320 _>
•	4)	mutovanú	C3M-51 (so zmenou Argl320 .	-> Gin).
*	200 valo pri fluoridom	μΐ supernatantu z kultúr 3 dni po · teplote 0° C počas 15 minút s 2 (PMSF) a potom pri teplote 37°	transfekcii sa inkubo- mM fenylmetánsulfonyl C počas 2 hodín s

nasledovnými prídavkami:

A) bez prídavku,

B) s prídavkom preformované C3 konvertázy, CVFBb (10 μΐ z 200 μΐ zmesi obsahujúcej 6,6 μg CVF, 100 μg faktora B a 1,4 μg faktora D v PBS s prídavkom 10 mM MgCl2; zmes sa najskôr preinkubovala pri teplote 37° C počas 15 minút);

C) s prídavkom faktorov H (5 μg) a I (1 μg); a

D) s prídavkom CVFBb a faktorov Hal.

Po inkubácii sa supernatanty imunoprecipitovali pri teplote miestnosti prídavkom 0,6 μg afinitne purifikovanej ovčej anti-Iudskej C3 protilátky a po 1 hodine sa k reakčnej zmesi pridalo 20 μΐ 5 % suspenzie premytých, formaldehydom fixovaných buniek Streptococus sp. skupiny C (proteín G, Sigma) . Po 45 minútach pri teplote miestnosti sa častice jedenkrát premyli v PBS s 5 mM NaN3 a jedenkrát v 20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20, pH

7,6 a potom sa zriedili 1 % SDS/2 % 2-merkaptoetanolom. Vzorky sa zohrievali počas 5 minút na teplotu 90 až 100° C. Potom sa eluáty rozdelili elektroforézou na akrylamidovom géli (SDS-PAGE), elektricky preblotovali na nitrocelulózu a prúžky charakteristické pre C3 sa detegovali pomocou afinitne purifikovanej ovčej anti-ľudskej

C3 protilátky a konjugátu oslej anti-ovčej protilátky s chrenovou peroxidázou (Sigma). Na detekciu sa použili substráty pre zosilnenú chemiluminiscenciu od firmy Amersham. Priložená je rontgenová snímka po 2 minútovej expozícii.

Viditelné elektroforetické prúžky odvodené od proteínu C3 sú naznačené šípkami. Jednotlivé vzorky (1 až 4, A až D) zodpovedajú práve opísaným vzorkám. Významný elektroforetický pás s veľkosťou 50 kDa (medzi prúžkami 46 a 68 kDa), ktorý sa vyskytuje vo všetkých vzorkách je ťažký reťazec IgG použitý na imunoprecipitáciu a neskôr detegovaný konjugátom oslej anti-ovčej protilátky s chrenovou peroxidázou.

Výsledky (pozri obrázok 3)

1. Všetky neošetrené vzorky (1-A, 2-A, 3-A a 4-A) obsahujú správne migrujúce prúžky zodpovedajúce alfa a beta reťazcom proteínu C3, z čoho vyplýva, že všetky mutanty sa exprimujú a sú správne post-translačne spracované.

Prítomnosť 43 alebo 46 kDa elektroforetických prúžkov v týchto vzorkách indikuje prítomnosť aktivity podobnej faktorom H a I v živnej pôde. Spontánnou hydrolýzou proteínu C3 počas trojdenného biosyntetického obdobia vzniká proteín C3i, ktorý sa touto aktikvotou štiepi. V nezmutovanom proteíne C3 tak vznikajú prúžky s velkosťou 43 kDa a 75 kDa (75 kDa prúžok nie je vidieť, pretože (i) je zakrytý 75 kDa prúžkom reťazca beta, a (ii) protilátka použitá na detekciu vo Western blote sa vyznačuje veľmi malou afinitou k tejto časti C3 reťazca alfa. Prítomnosť tohto prúžku sa potvrdila až ďalšou detekciou pomocou potkanej monoklonálnej protilátky (klonu 3) špecifickej pre túto oblasť. Prídavok faktorov H a I bez prítomnosti CVFBb (vzorky 1-C, 2-C, 3-C a 4-C) nerozštiepil zvyšný C3, z čoho vyplýva, že ide o aktívny proteín C3 (s intaktnou tioesterovou väzbou).

2. Nezmutovaný proteín C3 (1) sa štiepi CVFHBb a vznikajúci C3b produkt sa ďalej štiepi endogénnymi enzýmami vo vzorke 1-B alebo dodanými faktormi H a I vo vzorke 1-D. Elektroforetický prúžok s veľkosťou 43 kDa indikuje štiepenie v pozícii Arg¹³²⁰ a protein s veľkosťou 68 kDa viditeľný po ďalších expozíciách indikuje štiepenie v pozícii Argl³Q³.

3. Mutantná forma C3M-I23 (Argl³²^ -> Gin) bola štiepiteľná pomocou CVFBb a vzniknutý produkt bol pomerne odolný voči aktivite podobnej endogénnym faktorom Haľ (2-B) so zreteľnými množstvami pretrvávajúceho reťazca alfa (C3b), ale bol stále štiepiteľný po prídavku faktorov Haľ (2—D). Produkt s veľkosťou 43 kDa indikuje štiepenie v pozícii Argl³²0 (slabý elektroforetický prúžok s veľkosťou 71 kDa reprezentujúci druhý fragment alfa reťazca je viditeľný po dlhšej expozícii). Ani po dlhšej expozícii však nebol viditeľný prúžok proteínu s veľkosťou 68 kDa, z čoho sa dá usúdiť, že tento mutant je odolný voči štiepeniu v mieste mutácie Glnl³^³.

4. Mutantná forma proteínu C3M-26 (Arg¹³0³ -> Gin, Arg¹³²0 -> Gin) bola štiepiteľná pomocou CVFBb a vznikajúci produkt podobný C3b (alfa') bol odolný voči aktivite podobnej endogénnym faktorom H a I (vzorka 3-B). Tento produkt bol veľmi odolný aj voči prídavku faktorov Haľ (vzorka 3-D) v porovnaní s nemutovaným proteínom C3 (vzorka 1) a ďalšími mutantami (vzorky 2 a 4) . Detegovalo sa síce malé množstvo proteínu s veľkosťou 46 kDa, z čoho vyplýva určitá možnosť štiepenia v mieste mutácie Glnl³^³ (sprevádzajúci proteínový fragment s veľkosťou 68 kDa bol taktiež viditeľný po dlhšej expozícii). Na uskutočnenej elektroforéze bolo veľmi málo alebo vôbec žiadny proteínový fragment s veľkosťou 43 kDa, ktorý by zodpovedal štiepeniu v mieste Glnl^32<\

Preto sa dá predpokladať, že mutácia Arg -> Gin v pozícii 1303 je na prevenciu štiepenia faktorom I menej účinná než mutácia v pozícii 1320. K tomuto pomalému reziduálnemu štiepeniu môže dochádzať aj u mutantnej formy C3M-I23 (Argl³²0 -> Gin), ale medziprodukt s veľkosťou 46 kDa sa pravdepodobne rýchlo štiepi na 43 kDa fragment v druhom nezmutovanom mieste (Argl³²^).

5. Mutantná forma C3M-51 (Arg^³²Q -> Gin) je štiepiteľná pomocou CVFHBb a vznikajúci produkt sa ďalej štiepil endogénnou aktivitou podobnou faktorom Hal (vzorka 4-B), ako aj prídavkom externých faktorov Hal (vzorka 4-D) . Produkt s velkosťou 46 kDa (a slabý prúžok s velkosťou 68 kDa) indikuje štiepenie v pozícii Argl³^³. Neprítomnosť fragmentu s veľkosťou 43 kDa však indikuje, že k štiepeniu nedochádza v zmutovanej pozícii Gin¹³²⁰.

Príklad 5

Porovnanie rôznych aminokyselinových substitúcií v pozícii 1303

1. Úvod

V predošlom príklade sa opísali mutácie Arg^³³³ a Arg^³²³ na glutamínový zvyšok. Obe mutácie dodali proteínu C3 rezistenciu voči štiepeniu faktorom I v týchto pozíciách.

Stále však dochádzalo k slabému, ale zistitelnému štiepeniu v pozícii Gin¹³⁰³. Preto sa teda v tejto pozícii vytvoril a vyskúšal rad aminokyselinových substitúcií. K štiepeniu na zvyšku 1303 dochádza so znižujúcou sa účinnosťou v rade: Arg > Tyr > [Cys alebo Trp] > Gin > [Glu alebo Gly]. Sú to neočakávané výsledky, pretože (i) ku všetkým známym prirodzene sa vyskytujúcim štiepeniam spôsobeným ludským faktorom I dochádza na C-konci vedia arginínového zvyšku, z čoho sa usudzovalo, že tento enzým má požiadavku na arginínový zvyšok; a (ii) ak by došlo k štiepeniu na inom než arginínovom zvyšku, bolo by pravdepodobné, že tento zvyšok bude mať podobné elektrostatické vlastnosti ako arginín, t. j. že pôjde o zásaditý zvyšok lys alebo his (napríklad trypsín selektívne štiepi na C-konci od arg, lys alebo his. Na základe uvedeného tvrdenia by teda nikto nepredpokladal, že k štiepeniu bude dochádzať po substitúcii tyrozínom.

Substitúcia Arg glycínom alebo kyselinou glutámovou je teda výhodná na tvorbu derivátov proteínu C3 odolných voči ’inaktivácii faktorom I.

2. Použité spôsoby

2.1 Mutagenéza

Použil sa degenerovaný mutagénny primer: caactgcccagc(gt)-(ag)(cg)agctccaagatcacc (písmená v zátvorkách označujú zmes báz na tejto pozícii) . Mutantné formy sa pripravili buď spôsobom gappedplazmid (pozri predošlé príklady) alebo použitím mega-primerov (pozri Picard, V. a ďalší, Nuc. Acid. Res. (1994) 22: strana 2587 až 2591), v ktorom sa ako upstream primer použil oligonukleotid cacca ggaac tgaat ctaga tgtgt ccct c a ako downstream primer sa použil oligonukleotid gtttt atagt gacct taagg tcgaa tttat. Všetky mutácie sa uskutočnili na matriciach, v ktorých C3-kódujúca DNA už bola mutovaná tak, že aminokyselinový zvyšok 1320 bol glutamín miesto arginínu a v pozícii 4149 sa vložilo a sekvenovaním DNA sa potvrdilo cieľové miesto pre reštrikčný enzým AflII (pozri predošlé príklady).

2.2. Expresia

Mutantné formy sa exprimovali v bunkách COS, pričom sa použil vektor pcDNA3 (pozri predošlé príklady) a biosynteticky sa označili [35$]-metionínom v médiu neobsahujúcom sérum.

2.3 Testovanie rezistencie

Supernatanty sa ošetrili prídavkom CVFHBb (pripraveným reakciou CVF s faktormi B a D v pufri s horečnatými iónmi) a s faktormi H a I. Potom sa imunoprecipitačne vyzrážali pomocou anti-C3 protilátky a rozdelili elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géli uskutočnenou použitím redukčných podmienok (pozri predošlé príklady). Potom sa gél fixoval a ošetril amplifikačným činidlom z firmy Amersham, vysušil a použil na autorádiografiu. Výsledky sú znázornené na obrázku 4.

3. Výsledky

Štiepenie faktorom I v pozícii 1303 (cieľové miesto 1), pričom súčasne nedochádzalo k štiepeniu v pozícii 1320 (cieľové miesto 2), ktoré sa mutáciou zmenilo na glutamín, poskytuje fragmenty migrujúce na elektroforéze ako proteíny s veľkosťou 46 a 68 kDa. Je zrejmé, že k štiepeniu dochádza v rade: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) a trp(W) > gin(Q) > gly(G) a glu(E), pričom proteíny s poslednými uvedenými zvyškami sa štiepia najhoršie. Prirodzene sa vyskytujúci proteín s arginínom v oboch pozíciách sa štiepi v oboch pozíciách, pričom vznikajú fragmenty s veľkosťou 43 kDa, ktoré sú príliš malé na to, aby boli na tomto géli viditeľné, a fragmenty s veľkosťou 68 kDa.

4. Obrázok

Výsledky sú znázornené na obrázku 4. Zvyšky v cieľových miestach 1 (pozícia 1303) a 2 (pozícia 1320) sú indikované nad jednotlivými vzorkami.

Príklad 6

Demonštrácia zvýšenej rezistencie voči inaktivácii faktormi I a H po mutácii arg!303 _na gi_n

1. Úvod

V predošlých príkladoch sa demonštrovalo, že zámena niektorého z arginínov 1303 alebo 1320 v proteíne C3 za glutamín vedie k tomu, že sa toto cieľové miesto stane odolným voči štiepeniu faktorom I. Zmenou oboch cieľových miest vzniká molekula odolná voči štiepeniu v oboch cieľových miestach. V tomto príklade ukážeme, že zámena arginínu 1303 za glutamín sama o sebe, t. j. bez mutácie arginínu 1320 vedie k značnej rezistencii voči inaktivácii faktormi I a H v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim proteínom C3.

2. Použité spôsoby

2.1 Expresia

Príprava mutantnej formy arg 1303 -> gin sa opísala v predošlých príkladoch. Zmutovaný gén sa transfekciou preniesol do buniek CHO (bežná laboratórna bunková línia pochádzajúca z vaječníkov čínskeho škrečka). Transfekcia sa uskutočnila štandardným spôsobom pomocou fosforečnanu vápenatého a stabilní transfektanti sa vybrali na základe rezistencie voči G418 (Geneticín dodávaný firmou Sigma). Supernatanty bunkových kultúr sa zhromaždili a exprimovaný protein C3 sa čiastočne prečistil zrážaním síranom sodným (odobrala sa frakcia zrážaná 10 až 20 % (w/v) činidlom) a ionomeničovou chromatografiou na Q-sepharóze a mono-Q-sepharóze (pozri Dodds, A. W., (1993) Methods. Enzymol. 223: strana 46).

2.2 Vlastný test

Ovčie erytrocyty sa potiahli monoklonálnou protilátkou SOI6 (pozri Harrison, R. A. & Lachmann, P. J., v knihe Handbook of Experimental Immunology, 4. vydanie, kapitola 39 (1986)) a 4,4 ml 5 % (v/v) suspenzie sa potom inkubovalo počas 10 minút s približne 10 μg C2, 24 μg C4 a 1 μg Cl (purifikované ludské komponenty) pri teplote 37° C v CFD (Harrison, R. A & Lachmann, P. J., pozri vyššie). 0,8 ml tejto zmesi sa potom inkubovalo počas 105 minút s 0,25 ml semipurifikovaného mutantného alebo prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3 s prídavkom EDTA tak, aby výsledná koncentrácia bola 12,5 mM. Bunky sa potom premyli v CFD a použili sa v CFD obsahujúcom 0,1 0 (w/v) želatíny (CFD-gél) . Na potvrdenie približne rovnakých množstiev deponovanej prirodzene sa vyskytujúcej alebo mutantnej formy C3b sa použila monoklonálna protilátka proti C3 (kloň 4) značená

Na vlastné testovanie sa použilo 40 μΐ 5 % bunkovej suspenzie v 250 μΐ CFD-gélu. 50 μΐ alikvoty tejto zmesi sa inkubovali počas 30 minút s 50 μΐ CFD-gélu obsahujúceho rôzne koncentrácie (100, 10, 1 a 0 μg/ml) faktorov I a H pri teplote 37° C. K jednotlivým alikvotom sa potom pridalo 0,9 ml CFD, bunky sa sedimentovali centrifugáciou a dvakrát sa premyli vždy 1 ml CFD. Potom sa bunky resuspendovali v 100 μΐ CFD-gélu obsahujúceho 100 μg/ml faktora B, 100 μg/ml properdínu, 1 μg/ml faktora D a 0,3 mM N1CI2· Po 10 minú41 tach pri teplote 37° C sa pridalo 0,9 ml CFD obsahujúceho 10 mM EDTA a 2 % (v/v) normálneho séra morčaťa. Po ďalších 30 minútach pri teplote 37° C nelyzované bunky sedimentovali centrifugáciou a stupeň lýzy sa stanovil meraním absorbancie supernatantu pri vlnovej dĺžke 412 nm. Absorbancia ekvivalentná 100 % bunkovej lýze sa stanovila z alikvotov buniek lyzovaných vo vode. Z tohto údaja sa stanovilo percento lýzy.

Týmto testom sa merala schopnosť deponovaného proteinu C3b tvoriť funkčnú C3bBbP konvertázu. Konverzia na iC3b zabráni vzniku konvertázy a následnej bunkovej lýzy v prostredí so sérom a EDTA.

3. Výsledky

Výsledky znázornené na obrázku 5 naznačujú, že na zrušenie hemolytickej aktivity mutantnej formy arg!303 _> gi_n j_e potrebný viac než desaťnásobok faktora I a H v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcou formou. Táto mutácia je preto výhodná na tvorbu derivátu C3, ktorého C3b produkt je odolný voči inaktivácii faktormi H a I. Tento efekt by sa dal vysvetliť buď väčšou rezistenciou voči štiepeniu v pozícii 1303 (arginín je zamenený za glutamín), alebo väčšou rezistenciou voči štiepeniu v pozícii 1320, kedy k štiepeniu môže najskôr dôjsť v pozícii 1303.

4. Obrázok

Uvedené výsledky sú znázornené na obrázku 5. Na osi x sú uvedené koncentrácie faktorov H a I. Q1 reprezentuje mutáciu arg!303 _> g]__n. Percento lyzovaných buniek sa meralo uvedeným spôsobom.

Diskusia

Podstatnými vlastnosťami ľudského C3 vzhľadom na modifikované varianty podľa vynálezu sú:

(i) Molekula funguje ako C3b derivát, čo sa prejavuje tým, že sa môže kombinovať s funkčne aktívnym ludským faktorom B, ktorý sa potom môže štiepiť ludským faktorom D, pričom vznikne enzým schopný štiepiť ľudský proteín C3.

(ii) Aminokyselinové sekvencie derivátov sú viac homologické s ludským proteínom C3 než s C3 proteínom ľubovoľných ďalších druhov, ktorých C3 sekvencie sú doteraz známe. Sú aj viac homologické s ludským proteínom C3 než s ľubovoľným iným doteraz známym proteínom. Štruktúrne rysy C3, ktoré sa vyskytujú v prirodzene sa vyskytujúcom proteíne, ale nie sú nevyhnutné pre mutovaný derivát sú:

(a) sekvencia kódujúca DNA a sekvencia variantu translatovaného proteínu (ľudského C3) použité v príkladoch sú uvedené na obrázku 2 resp. 1. Táto proteínová sekvencia sa líši od publikovanej sekvencie (de Bruijn, M. H. & Fey, G. H., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: strana 708 až 712) práve v dvoch aminokyselinách (detaily sú uvedené v príkladoch). Predpokladá sa, že so správnou funkciou proteínu C3 je kompatibilných ovela viac variantov, väčšina z nich však v populácii nebude prítomná;

(b) primárny produkt translácie sa proteolytický spracuje na dva reťazce spojené disulfidovými mostíkmi: reťazec alfa (aminokyselinové zvyšky 672 až 1663) a beta (zvyšky 23 až 667) pri post-translačných úpravách sa odstráni aj signálny peptid (zvyšky 1 až 22);

(c) maturovaný proteín obsahuje tioesterovú väzbu medzi zvyškami Cys 1010 a Gin 1013;

(d) C3 konvertáza odštepuje od proteínu C3 fragment C3a (zvyšky 672 až 748). Touto reakciou sa rozbíja tioesterová väzba;

(e) v prítomnosti faktora H štiepi faktor I C3b medzi zvyškom Arg 1303 a Ser 1304, a medzi Arg 1320 a Ser 1321.

Modifikácia natívnej molekuly proteínu C3

Náhrada Argl303 za Gin

K tejto modifikácii dochádza v jednom z cieľových miest štiepenia C3b faktorom I. Zmyslom tejto zámeny je zníženie rýchlosti štiepenia faktorom I v tejto pozícii. Zmena na glutamín sa vybrala preto, aby došlo k strate kladného náboja arginínu, ktorý je pravdepodobne dôležitý pre proteázovú aktivitu serínového typu faktora I. Pritom sa zachoval hydrofilný charakter a podobná velkosť bočného reťazca, čo by malo minimalizovať všetky vplyvy na terciárnu štruktúru proteínu. Dôkazom podporujúcim túto domnienku je skutočnosť, že táto mutácia nezabránila post-translačnému spracovaniu na dvojreťazcovú štruktúru, vzniku tioesterovej väzby alebo štiepeniu C3 konvertázou. Zámenou Arg 1303 za ďalšiu aminokyselinu by sa prípadne mohol dosiahnuť podobný alebo dokonca lepší účinok, pozri príklad 5.

Dá sa predpokladať, že tomuto štiepeniu môže zabrániť alebo ho spomaliť mutácia Ser 1304 (na opačnej strane miesta štiepenia) alebo mutácia iných aminokyselín, ktoré interagujú v tejto enzymatickej reakcii.

Náhrada arginínu 1320 za glutamín

K tejto modifikácii dochádza na druhej strane miesta štiepenia C3b faktorom I. V dôsledku tejto zmeny dochádza k výraznému zníženiu (v podstate k zastaveniu) rýchlosti štiepenia faktorom I v tejto pozícii. Mutácia na glutamín sa uskutočnila rovnakým spôsobom ako opísané zmeny a rovnako nezabráni post-translačnému spracovaniu na dvojreťazcovú štruktúru, vzniku tioesterovej väzby alebo štiepeniu C3 konvertázou. Opäť sa dá predpokladať, že mutáciou na inú aminokyselinu sa môže dosiahnuť rovnaký účinok, ako je tomu u mutácie Ser 1321 alebo ďalších zvyškov zúčastňujúcich sa interakcie enzým-substrát pri tomto štiepení.

Obe mutácie (Arg 1303 -> Gin a Arg 1320 -> Gin) v kombinácii chránia C3b pred inaktiváciou a udržiavajú jeho schopnosť tvoriť časť aktívnej C3bBb konvertázy. S rovnakým cieľom sa môžu použiť aj ďalšie mutácie (vrátane ich kombinácií), ktoré rušia obe štiepne reakcie (napríklad Arg 1303 -> Gin alebo Arg 1303 -> Gly sa môžu použiť v kombinácii s Arg 1320 -> Gin).

Príklad 7

Rôzne mutácie zabraňujú interakcii C3b/C3i s faktorom H

7.1 Úvod

Iné laboratóriá poskytli dôkazy založené buď na účinkoch syntetických peptidov (Ganu, V. S. & Muller-Eberhard, H. J., (1985)

Complement 2: strana 27; Becherer, J. D. a ďalší, (1992) Biochemis* try 31: strana 1787 až 1794), alebo na základe limitnej mutagenézy (Taniguchi-Sidle, A. & Isenman, D. E., (1994) J. Immunol. 153:

* strana 5285 až 5302) na základe ktorých sa dá predpokladať, že aminokyselinové zvyšky 752 až 761 v sekvencii primárneho transkriptu C3 (pozri obrázok 1) sa môžu podielať na interakcii s faktorom H. Ďalšia publikácia však predpokladá, že na tejto interakcii sa podielajú iba zvyšky 767 a 776, zatial čo aminokyselinové zvyšky 752 až 761 sú dôležité pri interakcii s faktorom B (Fishelson, Z.. (1991) Mol. Immunol. 28: strana 545 až 552). V tejto práci sme predpokladali, že rozsiahlejšia mutagenéza tejto oblasti by mohla znížiť afinitu k faktoru Hav dôsledku toho byť žiaduca pre tvorbu derivátu C3 odolného voči faktoru H. Ďalej sme predpokladali, že dôležitými aminokyselinovými zvyškami pre túto * interakciu a teda aj pre prípadnú mutáciu budú kyslé zvyšky (zvyšok kyseliny asparágovej a kyseliny glutámovej), a že by bolo žiaduce * zameniť ich za zvyšky neutrálne, u ktorých je menej pravdepodobné sprostredkovanie silnej inetrakcie. V tomto príklade sa zamenili zvyšky 752 až 754 zo sekvencie Asp-Glu-Asp na Gly-Ser-Gly v kombinácii s mutáciou zvyškov 758 až 760 z Glu-Glu-Asn na Gly-SerGly. Vzniknutý produkt sa vyznačoval redukovaným štiepením v dôsledku zníženia citlivosti na faktor H. Poskytuje to dôkaz, že proteín C3 sa dá upraviť tak, aby sa znížila jeho väzba na faktor H a v dôsledku toho aj citlivosť na faktory Hal. Ide o modifikácie žiaduce pre tvorbu C3 konvertázy stabilnej vo fyziologických podmienkach.

7.2 Spôsoby prípravy

Spôsoby mutagenézy, expresie a ďalšia analýza sa opísali v predošlých príkladoch. Na cielené vloženie mutácie sa nasyntetizoval mutagénny oligonukleotid so sekvenciou agtaa cctgg gttcg ggcat cattg cagga.

7.3 Výsledky

Výsledky štiepnej reakcie sú znázornené na obrázku 6. Z výsledkov vyplýva, že:

1. Prídavok CVFBb k prirodzene sa vyskytujúcemu C3 vedie k eliminácii alfa reťazca (stopa 2), pretože vznikajúci C3b je citlivý aj na nízke koncentrácie faktorov I a H prítomné v supernatante kultivačného média. C3i vznikajúci počas expresie alebo počas nasledovnej inkubácie sa štiepil na iC3i rovnakým spôsobom. Vonkajší prídavok faktorov I a H (stopy 3 a 4) sa preto podstatne nelíšil od stôp 1 a 2, vzhľadom na to, že médium samo o sebe obsahuje dostatok faktorov H a I na uskutočnenie kompletného štiepenia.

2. Na druhej strane, ak sa CVFBb pridá k mutantnému proteínu C3 (stopa 6), nedôjde na elektroforéze k vymiznutiu pásu reťazca alfa. Nejaké množstvo reťazca alfa' síce vzniká z C3b, ale podstatné množstvo alebo všetok takto vzniknutý alfa' reťazec zostáva vo vzorke, z čoho vyplýva, že trvanlivosť alfa reťazca nie je iba výsledkom neuskutočneného štiepenia pomocou CVFBb. Zvyšný neštiepený reťazec alfa v stope 2 môže preto reprezentovať C3i, ktorý sa neštiepil aktivitou endogénnych faktorov H a I. Je však možné aj to, že je to v dôsledku prítomnosti určitého množstva natívneho proteínu C3 vo vzorke s mutantnou formou, ktorá získala čiastočnú rezistenciu voči CVFHBb. Prídavok vysokých koncentrácií vonkajších faktorov H a I v stopách 7 a 8 vedie k vymiznutiu pásov zodpovedajúcich reťazcom alfa a alfa', z čoho vyplýva, že (i) mutantná forma nie je úplne odolná voči týmto faktorom, a (ii) alfa reťazec neštiepený pomocou CVFHBb v stope 2 prevažne vzniká z C3i (ktorý je štiepitelný faktormi H a I, ale nie pomocou CVFHBb) skôr než z natívneho proteínu C3 (ktorý je štiepitelný pomocou CVFHBb, ale nie faktormi H a I) . Dokonca aj v stope 8 nie je stále všetok alfa reťazec štiepený, pravdepodobne v dôsledku rezistencie voči faktorom Hal.

Preto teda mutáciou aminokyselinových zvyškov 752 až 754 a zvyškov 758 až 760 môže vzniknúť molekula C3, ktorá je stále štiepiteľná C3 konvertázami, ale je pritom čiastočne odolná voči štiepeniu faktormi Hal. S ohľadom na ďalšie publikované skutočnosti sa dá s najväčšou pravdepodobnosťou predpokladať, že príčinou * tejto rezistencie sú mutácie v oblasti, ktorá sa zúčastňuje na interakcii s faktorom H, čo má za následok zníženie afinity k tomu* to faktoru.

Príklad 8

Miesto v proteíne C3, ktoré sa dá mutáciou modifikovať tak, aby sa zmenila interakcia C3i s faktorom B

8.1 Úvod

V predošlom príklade sa demonštrovalo, že mutáciami proteínu C3 sa môžu zmeniť interakcie s faktormi Hal.

*

S cieľom objaviť ďalšie miesta v proteíne C3, ktoré by mohli * interagovať s faktorom B sa porovnali známe sekvencie C3 molekúl z rôznych živočíšnych druhov, ako aj dostupné sekvencie pre C4 a ďalšie homologické proteíny. Identifikovala sa oblasť zodpovedajúca aminokyselinovým zvyškom 1427 až 1433 ľudského proteínu C3, ktorá by sa mohla podieľať na špecifických funkciách C3 a C4. Tieto funkcie môžu zahŕňať inetrakciu s faktorom B (alebo jeho homológom C2 v prípade C4), čo však nie je isté, pretože ďalšími možnými funkciami tejto oblasti sú tvorba tioesterových väzieb, konverzia na C3b (alebo na C4b formu), interakcia so substrátom C3 a/alebo C5 v rámci konvertázovej aktivity a interakcia s faktorom I a jeho kofaktormi.

Preto sa vybrané zvyšky zmutovali na vhodné aminokyselinové zvyšky na základe porovnania sekvencií iných homológnych proteínov, v tomto prípade s ľudským proteínom C5. Tak sa aminokyselinový zvyšok 1427 zamenil z arginínu na glutamín, zvyšok 1431 z Lys na Asp a zvyšok 1433 z Glu na Gin. Výsledný mutantný proteín bol citlivý na štiepenie C3 konvertázou (CVFBb) a vznikajúci C3b bol ďalej štiepitelný faktormi H a I. Tento mutantný proteín však nepodporoval konverziu faktora B na faktory Bb a Ba. Táto konverzia závisí od väzby faktora H na faktor C3i (alebo C3b) . Dokazuje to skutočnosť, že zmenou tejto oblasti sa zmenšila interakcia s faktorom B. Zatial čo toto zníženie interakcie je nežiaduce pre tvorbu vysoko aktívnej C3 konvertázy, poskytuje to zároveň informáciu o tom, že ďalšie modifikácie tejto oblasti proteínu C3 tiež pozmenia interakciu s faktorom B a niektoré takéto modifikácie pravdepodobne afinitu zvýšia. V dôsledku takejto mutácie môže vzrásť aj stabilita a aktivita bimolekulárnej konvertázy C3bHb (alebo C3iHb).

8.2 Použité spôsoby

Porovnanie sekvencií podlá tabuľky 1 na ďalšej strane dokladajú, že táto oblasť sa vybrala ako vhodný kandidát mutagenézy. Východiskovým bodom bola skutočnosť, že charakter istých aminokyselinových zvyškov sa dobre konzervoval v proteínoch C3 a C4, ale zreteľne sa líšil v ostatných proteínoch. Zvyšky 1427, 1431 a 1433 sa vybrali preto, že vďaka ich náboju sa dá predpokladať účasť na interakciách proteín-proteín. Uskutočnili sa zmeny zodpovedajúce zvyškom v ľudskom C5 vzhladom na to, že zodpovedajúce zvyšky v proteíne majú veľmi rozdielne elektrostatické vlastnosti, ale v kontexte inak konzervovaných zvyškov v okolí, ktoré naznačujú, že by mohlo ísť o podobnú lokálnu štruktúru.

Spôsoby mutagenézy, expresie a analýzy štiepenia sprostredkované proteínom C3 sa opísali v predošlých príkladoch (v príkladoch 1 až 4) . Nasyntetizoval sa mutagénny oligonukleotid so sekvenciou tggtg ttgac caata catct ccgac tatca.

Porovnanie sekvencií C3 a molekúl príbuzných v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinovým zvyškom 1427 až 1435 ľudského proteínu C3

QSQQZQZQtddQtt: Eh tn O tň M μ O Cfi J

Ο22ΟΟη>2ΗΗΕ-Ή M H H os Q 02 & (P Q Od Od n

^HWWWWWWWWWCdfc] W OOWOWWCd o ω w

CN >4 >4 >4 >4 >1 Oj >4 En ti tj Oj >J >4 >H >4 J ,J J ,4 J hO J ^OdXXOdXXXXXXXO S Q Ω 2 P S S Od Od Od ^ωωωωωωωωωωω>

σι

CN

M H H K K K K K Od Od Od

M h P > > > > > >>>

CO ^J>4>-l>4>4>-l>4>-l>-.>-l>4>J>4 J J Eh W ŕi H W E-ι H r~

CN odcdcdcdcdodOdodododcdS Od o o p p p p p o o &

(0			.__
04	03	P
4-)	ω	0	Φ
P	•H	Ή	P
P	Ψ4	4-1	ft
N	CP	P	e
•H	P	04	P
(—1	X	O	x
m	—·		—·

04 fí 04 P n P p 04 .P 04 j, f \ Λί Λ μ, —X ^-( —, od φ ,_rn p .2 ·π 2 p Ρ φ „„ _wn ť 2 H 2 φ _irn φ p φ ,_m p ° (0 r4 S ^>w d Ό _4 Ll Λ j, _s IUJ nij iu -n -n m _s juj _s juj m < »uj 14 'U

Sh° O 2 O^_H° e 6 g_H e p >O >0 d >0 d d >o d S 04 ³⁴ d >o

P

Ή

Φ

4-)

O

P σ

CO o

»1 P ν’ d 03 U r-4 O \ cn ’C co o o

Oj

	O
	1—1
	p)	P
Oj	0	•H
N	P	r—1
Oj	•H	P
	P	03
	P
	s

m

M r—I <

Test na stanovenie metabolického obratu faktora B

Exprimovaný produkt sa prečistil a zbavil sa kultivačného média pre COS bunky pomocou afinitnej chromatografie na kolóne obsahujúcej Sepharózu s klonom 3 (pozri príklad 9). Týmto spôsobom sa získali značné množstvá formy C3i s rozbitou tioesterovou väzbou. Proteín C3 prirodzene sa vyskytujúceho typu sa izoloval rovnakým postupom. Rôzne riedenia prirodzene sa vyskytujúceho typu C3 (1/5, 1/25 a 1/125) sa naniesli na gél a uskutočnila sa štandardná SDS- -PAGE použitím redukčných podmienok. Elektroforéza sa uskutočnila spolu s mutantnou formou proteínu C3. Pomocou vyfarbenia striebrom sa podarilo stanoviť, že mutantnej formy bolo vo vzorkách o niečo menej než 1/25, ale ovela viac než 1/125 prirodzene sa vyskytujúcej formy. Rovnaké riedenia sa použili aj pri teste na stanovenie metabolického obratu faktora B. 5 μΐ alikvoty týchto C3' sa počas 3 hodín inkubovali s 25 μΐ CFD-G s obsahom 5 μg/ml faktora D a približne 1,6 μg/ml faktora B značeného pomocou 125j (_S aktivitou približne 1000 až 2000 dpm/μΐ) pri teplote 37° C. Vzorky sa potom analyzovali pomocou štandardnej SDSPAGE použitím redukčných podmienok a vysušený gél sa vyhodnotil autorádiograficky. Výsledky sú znázornené na obrázku 7.

8.3 Výsledky

Ako vyplýva z obrázku 7, k zreteľnému štiepeniu faktora B dochádza dokonca pri riedení 1/125 prirodzene sa vyskytujúceho C3 (C3i) . Na rozdiel od toho sa nepozorovalo žiadne významné štiepenie v prítomnosti mutantnej formy proteínu C3 dokonca ani u nezriedenej vzorky, ktorá by mala mať 125-krát vyššiu koncentráciu než prirodzene sa vyskytujúca forma.

Zdá sa teda, že táto mutantná forma má zníženú schopnosť podporovať štiepenie faktora B, najskôr vďaka tomu, že má zníženú väzbovú afinitu voči faktoru B. Preto teda ide o oblasť proteínu C3, ktorej mutáciou sa dá pozmeniť interakcia medzi C3i (alebo C3b) a faktorom B a možno aj stabilita konvertázy (C3iBb alebo C3bBb).

Príklad 9

Purifikácia exprimovanej mutantnej formy proteínu C3

9.1 Úvod

V tomto príklade sa opisuje spôsob izolácie mutantných molekúl proteínu C3 z expresného média, napríklad z kultivačného média transfekovaných eukaryotických buniek. Jednoduchou afinitnou purifikáciou podlá príkladu 10 sa získal proteín C3 v dostatočnej čistote na funkčné testy a na konjugáciu s protilátkou. Hoci vymývanie z protilátky naviazanej v afinitnej kolóne je sprevádzané hydrolýzou značnej časti vnútorných tioesterových väzieb, výsledný C3i produkt je stále ešte vhodným prekurzorom na prípravu aktívnej C3 konvertázy aj na produkciu konjugátu protilátky s proteínom C3i. Tento spôsob je pravdepodobne vhodný aj ako súčasť prípravy exprimovaného C3 na in vivo použitie.

9.2 Použité spôsoby

Afinitná purifikácia na kolóne obsahujúcej Sepharózu s protilátkou klonu 3

Kloň 3 je potkania monoklonálna protilátka špecifická pre proteín C3 a jeho deriváty, vrátane C3b a C3i (pozri Lachmann, P. J,, a ďalší, (1980) J. Immunol. 41: strana 503 až 515). Sú dostupné aj ďalšie monoklonálne protilátky proti C3, ktoré sa v niektorých prípadoch aj použili na izoláciu, proteínu C3 z malých množstiev ľudskej plazmy (Dodds, A. W., (1993) Methods Enzymol. 223: strana až 61) a sú preto aj pravdepodobne dobre použiteľné na izoláciu molekúl exprimovaných ex vivo. IgG frakcia sa naviazala na Sepharózu CL-4B pomocou CNBr (metodika sa dá získať napríklad z publikácie Harrison, R. A. & Lachmann, P. J., Handbook of Experimental Immunology, 4. vydanie, Weir, Herzenberg & Blackwell (editori), Oxford (1986). Kultivačné supernatanty sa bud naniesli priamo na kolónu s afinitným nosičom (kolóny sa dajú opakovane použiť) alebo sa najskôr zakoncentrovali zrážaním v 25 % (w/v)

Na2SC>4/ opäť sa rozpustili a dialyzovali proti PBS s 5 mM NaNg. Kolóna sa potom premyla rôznymi puframi v nasledovnom poradí: (i) PBS s 5 mM NaN3 a (ii) PBS s prídavkom 1 M NaCl. Naviazaný proteín C3 sa eluoval 50 mM Na-borátovým pufrom s pH 10,5. Eluát sa okamžite neutralizoval zberaním frakcií s objemom 0,9 ml do 0,1 ml Tris-HCl pufra s pH 7. Materiál sa potom dialyzoval proti PBS s prídavkom 5 mM NaN3.

Príprava proteínu C3 nesúceho histidínovú purifikačnú značku

Histidínová purifikačná značka je reťazec histidínových zvyškov, ktorý sa vyznačuje väzbovou afinitou voči kolóne s naviazanými nikelnatými iónmi. Tento spôsob sa použil na uľahčenie izolácie exprimovaných proetínov. Predpokladali sme, že tento spôsob bude výhodný na izoláciu exprimovaných mutantných proteínov C3. Preto sme inzertnou mutáciou vložili šesť histidínových zvyškov do plazmidu kódujúceho proteín C3 na C-koniec (hneď na C-koniec zvyšku 1663). Toto umiestnenie histidínovej značky sa vybralo preto, aby sa minimalizovala interferencia so syntézou, správnym zložením, spracovaním a tvorbou disulfidových väzieb vo vznikajúcom proteíne C3. Aminokyselina 1661 je cysteínový zvyšok, ktorý sa zúčastňuje na tvorbe disulfidovej väzby spolu so zvyškom na začiatku sekvencie (pravdepodobne s Cys 1537; pozri Dolmez, K. & Sottrun-Jensen, L., (1993) FEBS Lett. 315: strana 85 až 90). Z tohto dôvodu sa zdalo opodstatnené vložiť purifikačnú značku mimo túto štruktúru. Mutácia sa vložila spôsobom gapped-plazmid mutagenézy použitej v príklade 1. Použil sa pritom mutagénny syntetický oligonukleotid so sekvenciou tgggt gcccc aacca tcatc atcat catca.

Začlenenie správnej sekvencie sa potvrdilo sekvenovaním DNA. Potom sa mohla sekvencia DNA preniesť do expresívneho vektora. Po transfekcii eukaryotických buniek by sa mal dať izolovať exprimovaný proteín C3 afinitnou chromatografiou na kolóne s nikelnatými iónmi alebo s ľubovoľnou inou matricou so špecifickou afinitou voči histidínovej purifikačnej značke.

9.3 Výsledky

Rad mutantných foriem proteínu C3 sa purifikoval na kolóne so Sepharózou s protilátkou klonu 3, vrátane mutantov opísaných v príkladoch 1 a 2 exprimovaných v CHO bunkách. Produkty mali zachovanú schopnosť podporovať štiepenie faktora B faktorom D. Rovnaký spôsob sa použil na izoláciu mutantných foriem opísaných v príklade B2 exprimovaných v COS bunkách. Na géloch z SDS-PAGE vyfarbených striebrom je zrejmé, že izolované produkty nie sú 100 % čisté, ale často sa javia ako čisté aspoň z 50 % alebo viac. Tento výsledok sa dosiahol z východiskového materiálu, ktorý väčšinou obsahoval menej než 10 pg/ml proteínu C3 v 10 % (v/v) teľacom fetálnom sére s prídavkom ďalších bunkových proteínov. Navyše sa zdá, že proteín C3' sa počas izolácie nedegradoval a aj endogénna aktivita faktorov H a I sa zrejme odstránila.

Purifikácia pomocou histidínovej purifikačnej značky vyžaduje iba miernejšie podmienky elúcie z kolóny s iónmi niklu. Napríklad sa použila EDTA (chelatačné činidlo na vytesnenie His-značky z kolóny). Týmto spôsobom by sa mal dať izolovať proteín C3 bez zničenia vnútornej tioesterovej väzby.

Príklad 10

Konjugácia proteínu C3i a protilátky a použitie konjugátu na nasmerovanie C3 konvertázovej aktivity proti určitej bunke

10.1 Úvod

V jednom uskutočnení vynálezu stabilná C3 konvertáza odvodená od mutantnej formy proteínu C3 spôsobuje zvýšenú konverziu proteínu C3, ktorá ak je namierená na určité cieľové miesto, podporí napadnutie tohto miesta imunitnou odpoveďou závislou na komplemente. Výhodným spôsobom na nasmerovanie odpovede je spojenie mutantnej formy proteínu C3, ako aj jeho C3i alebo C3b derivát, s protilátkou špecifickou pre požadovaný ciel. V tomto príklade demonštrujeme fungujúcu metodológiu na tvorbu takýchto konjugátov.

Tento súbor spôsobov sa dá použiť na mutantné C3i alebo C3b molekuly a dá sa pri ňom použiť materiál získaný afinitnou purifikáciou z expresného systému dokonca aj v prípade, že tioesterová väzba v proteíne C3 sa počas purifikácie porušila. Väzbou proteínu C3i na protilátku, ktorá sa špecificky viaže na ovčie erytrocyty sa ďalej dokázalo, že konjugát zafixuje proteín C3i na povrchu erytrocytu tak, že sa vytvorí konvertáza C3iBbP, ktorá iniciuje lýzu týchto buniek v prítomnosti ďalších zložiek komplementu (napríklad z normálneho séra morčaťa s prídavkom EDTA, ktorý bráni de novo vzniku C3 konvertázy) . Z toho vyplýva, že konjugácia s protilátkou sa dá využiť na špecifické nasmerovanie molekuly C3i tak, aby iniciovala na komplemente závislý atak na bunky určitého typu. V tomto príklade sa použil prirodzene sa vyskytujúci C3i z ľudskej plazmy, ktorý tvorí C3 konvertázu in vitro. V in vivo podmienkach sa prirodzene sa vyskytujúce C3i a C3b štiepia faktormi Ha I. Preto teda mutantná forma proteínu C3 zostavená podľa vynálezu tak, aby bola odolná voči faktorom Hala vďaka tomu schopná utvoriť stabilnú C3 konvertázu, by bola výhodná z fyziologického hľadiska.

10.2 Použitý spôsob

Príprava a purifikácia konjugátu proteínu C3i s protilátkou

Ako protilátka sa použila IgG frakcia izolovaná z polyklonálneho králičieho antiséra pripraveného proti ovčím erytrocytom.

1,1 mg tejto frakcie sa inkubovalo počas 2 hodín so 75 nmol SPDP v konjugačnom pufri, pH 7,5 (20 mM KH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 0,12 M NaCl) pri teplote miestnosti. PDP-IgG sa purifikoval gélovou filtráciou na kolóne so Superose-6 (Pharmacia) vo fosfátovom pufri, pH 7,4 obsahujúcom 0,5 M NaCl.

Na odhad množstva 4-PDP skupín naviazaných na jednu molekulu IgG sa použila redukcia vzoriek ditiotreitolom. Proteín C3i sa pripravil 2 hodinovým ošetrením purifikovaného proteínu C3 0,1 M metylamínom, pH 7,2, pri teplote 37° C. Nadbytok metylamínu sa odstránil gélovou filtráciou a následnou dialýzou proti konju54 gačnému pufru. 18 nM proteínu C3i sa zmiešalo s 1,7 nM PDP-IgG v 1,26 ml konjugačného pufra a inkubovalo sa počas 1 dňa pri teplote miestnosti. Potom nasledovala 1,5 denná inkubácia pri teplote 4° C. Obrázok 8 znázorňuje gél SDS-PAGE obsahujúci reakčnú zmes po konjugácii vyfarbený Comassie modrou. Na géli je viditelné objavenie sa proteínov s velkosťou približne 350 kDa, ktoré sa nevyskytovali ani v PDP-IgG ani v proteíne C3i. Tieto proteíny sa čiastočne purifikovali gélovou filtráciou na kolónach so Superose-6 vo fosfátovom pufri s pH 7,4 obsahujúcom 0,5 M NaCl. Ďalší krok purifikácie spočíval v dialýze proti PBS. Tieto proteíny sa eluovali pred proteínom C3 vo frakciách, v ktorých dochádzalo k elúcii proteínov s molekulovou hmotnosťou 300 až 400 kDa. Na odhad veľkosti eluovaných proteínov v jednotlivých frakciách sa použila kalibračná krivka, zostrojená na základe použitia globulárnych štandardov molekulovej hmotnosti.

Koncentrácia konjugátu, nezlúčenej protilátky a naviazaného proteínu C3 sa odhadla z SDS-PAGE elektroforetických gélov vyfarbených Comassie modrou (použitím neredukujúcich podmienok). Dvojrozmerná elektroforéza SDS-PAGE (prvý rozmer použitím neredukujúcich a druhý rozmer použitím redukujúcich podmienok) odhalila vzor, ktorý bol v zhode s predpokladom stechiometrického pomeru medzi IgG a C3i v konjugáte zhruba 1:1.

Demonštrácia toho, že konjugát proteínu C3 s protilátkou sa dá použiť na nasmerovanie konvertázovej aktivity proti určitej bunke μΐ alikvoty rôznych riedení konjugátu (0 - žiadny konjugát, 1/100, 1/50 a 1/10) sa inkubovali počas 1 hodiny so 100 μΐ približne 1 % (v/v) ovčích erytrocytov (premytých v CFD) pri teplote 37° C. Paralelne sa uskutočnila inkubácia s ekvivalentným množstvom PDP-IgG (bez proteínu C3) a so samotným proteínom C3. Bunky sa potom 4-krát premyli v CFD a resuspendovali v 100 μΐ CFD-G. 50 μΐ tejto zmesi sa potom lyžovalo pomocou 150 μΐ vody, nasledoval prídavok 800 μΐ CFD s obsahom 10 mM EDTA a 2 % (v/v) NGPS. Druhá časť konjugátom potiahnutých buniek (50 μΐ) sa inkubovala počas 15 minút pri teplote 7° C s 50 μΐ CFD-G s obsahom

190 μς/πιΐ faktora B, 2 μg/ml faktora D, 20 μg/ml properdínu a 0,6 mM NiCl2· Po tejto inkubácii nasledovala lýza buniek pomocou 900 μΐ CFD s obsahom 10 mM EDTA a 2 % (v/v) NGPS. Po 30 minútovej inkubácii pri teplote 37° C bunky sedimentovali centrifugáciou (2000 x g počas približne 3 minút) a zmerala sa absorbancia supernatantu pri vlnovej dĺžke 412 nm. Ako štandardy sa použili vzorky ošetrené čistou vodou (100 % lýza buniek) a čistý puf or neobsahujúci bunky. Percento lýzy sa vypočítalo podlá obrázku 9. Konjugát vyvolával na dávke závislú lýzu buniek, zatiaľ čo ani PDP-IgG ani samotný proteín C3i žiadnu meratelnú lýzu buniek nevyvolávali (nad úroveň lýzy nameranej bez akéhokoľvek ošetrenia).

10.3 Zhrnutie výsledkov

Ukázalo sa, že použitý spôsob je vhodný na väzbu C3i na IgG, čo dokazujú nasledovné údaje:

1. Vznik elektroforetického prúžku so správnou veľkosťou (približne 350 kDa) , čo zodpovedá pomeru 1 : 1 molekúl C3 a IgG v konjugáte, čo sa preukázalo pomocou SDS-PAGE (pozri obrázok 8).

2. Dvojrozmerná SDS-PAGE (v prvom smere použitím neredukujúcich podmienok, v druhom smere použitím podmienok redukujúcich) dokazuje, že tento proteín obsahuje tak IgG ako aj C3i.

3. Elučná charakteristika tohto proteínu pri gélovej filtrácii opäť zodpovedá molekule s veľkosťou zhruba 350 kDa.

4. Konjugát sa vyznačuje hemolytíckou aktivitou, akú nemá ani PDP-IgG ani C3i (pozri obrázok 9).

Test hemolytických účinkov (obrázok 9) zároveň dokazuje, že:

1. Špecifická protilátka proti ovčím erytrocytom naviazala proteín C3i na membránu cieľovej bunky (ovčí erytrocyt), čím zabránila vymytiu tohto proteínu pri premývaní (na rozdiel od voľného proteínu C3i, ktorý sa vymyl).

2. Konjugát sa zachováva C3i aktivitu, čo sa prejavuje tým, že je stále schopný tvoriť C3 konvertázu reakciou s properdínom a faktormi B a D.

3. Táto konvertáza môže iniciovať na komplemente závislý atak na cieľovú bunku, v tomto prípade aktiváciou lytickej dráhy (C5-9) a lyžovať napadnuté erytrocyty.

Ďalšie údaje z rôznych iných laboratórií ukazujú, že faktor kobrieho jedu sa dá naviazať na protilátku, a že takýto konjugát môže nasmerovať a iniciovať aktiváciu komplementu proti bunkám určitého typu (pozri Vogel, (1988) Targeted Diagn. Ther. 1: strana 191 až 224; Muller, B. & Muller-Ruchholtz, W., (1987) Leuk. Res.

11: strana 461 až 468; Parkwer, C. T., White, V. F. & Falk, R. J., (1986) Complement 3: strana 223 až 235; Petrella, E. C. a ďalší, (1987) J. Immunol. Methods 104: strana 159 až 172).

Tieto údaje podporujú hypotézu, že proteín C3 upravený tak, aby bol schopný tvorby stabilnej C3 konvertázy, ako je tomu v prípade faktora kobrieho jedu, by sa mohol použiť na nasmerovanie komplementom sprostredkovanej imunitnej odpovede, tak ako sa to opisuje vo vynáleze.

Príklad 11

Demonštrácia toho, že mutantné C3 molekuly indikujú metabolický obrat faktora B v normálnom ľudskom sére.

11.1 Úvod

Vynález v prvom rade opisuje rýchle zníženie aktivity komplementu v biologických tekutinách. Vynález opisuje spôsoby prípravy molekuly C3, ktorá je odolná voči regulačnému zníženiu aktivity (down-regulácii) faktormi Haľ. V tomto stave sa C3 molekuly naviažu na faktor B a vytvoria aktívnu C3 konvertázu. Aktivita týchto konvertáz sa demonštrovala hemolytickým testom v príklade 6. Táto konvertáza bude spotrebovávať C3. Ak by bola konvertáza nestabilná, dôjde k jej disociácii bez konverzie významného množstva C3. Umožní to však aspoň naviazanie čerstvého faktora B a jeho konverziu na Bb a Ba. Tak mutantný protein C3 podporí spotrebu faktora B, čo nakoniec vedie k uzatvoreniu alternatívnej dráhy a k neschopnosti zosilňovať stimuláciu klasickou dráhou. Ak sa utvorí stabilná C3 konvertáza, zredukuje sa metabolický obrat faktora H, ale zvýši sa spotreba proteínu C3. Obe tieto vlastnosti môžu byť výhodné. V tomto príklade demonštrujeme, že mutantná C3 molekula so zvýšenou rezistenciou voči faktoru I, ale bez akejkolvek modifikácie upravujúcej stabilitu vznikajúcej konvertázy, zosilňuje zrýchlený metabolický obrat faktora B v ľudskom sére. Na rozdiel od toho prirodzene sa vyskytujúca molekula C3 nespôsobuje žiadny významný metabolický obrat faktora B pravdepodobne preto, že prirodzene sa vyskytujúci C3i sa rýchlo degraduje faktormi Haľ.

11.2 Použité spôsoby

Pripravili sa nasledovné mutantné formy:

Q1R2,	kde	sa	Arg	1303	zmenil	na	Gin	(pozri	príklad	2),
Q1Q2,	kde	sa	Arg	1303	zmenil	na	Gin	a Arg	1320 na	Gin	(pozri
príklad 1)	r
E1Q2,	kde	sa	Arg	1303	zmenil	na	Glu	a Arg	1320 na	Gin	(pozri

príklad 5).

Všetky tieto mutantné formy sa exprimovali v CHO bunkách a potom sa prečistili zrážaním v Na2SC>4 a následnou afinitnou purifikáciou na Sepharóze s protilátkou klonu 3, pozri príklad B3. Podobným spôsobom sa izoloval aj prirodzene sa vyskytujúci C3 (R1R2). Pomocou SDS-PAGE a vyfarbení striebrom sa odhadla koncentrácia Ql, ktorá bola približne 1/5 až 1/25 koncentrácie prirodzene sa vyskytujúcej formy, koncentrácia Q1Q2 bola približne 1/5 prirodzene sa vyskytujúcej formy a koncentrácia E1Q2 bola medzi 1/25 a 1/125 koncentrácie prirodzene sa vyskytujúcej formy. Všetky vzorky pravdepodobne obsahovali prevažne molekuly s väčšinou rozbitých tioesterových väzieb (C3i).

μΐ alikvoty týchto vzoriek C3 sa inkubovali počas 1 hodiny s 10 μΐ 20 % roztoku (v/v) normálneho ľudského séra v PBS s obsahom 1 mM MgCl2 a približne 300 ng faktora H značeného ¹²^I (približne 200 000 až 300 000 dpm) pri teplote 37° C. 5 μΐ zmesi sa potom analyzovalo pomocou SDS-PAGE použitím redukčných podmienkach. Vysušený gél sa exponoval s autorádiografickým filmom a stanovili sa pozície elektroforetických prúžkov zodpovedajúcich intaktnému faktoru B a jeho štiepnym produktom. Tieto prúžky sa potom vyrezali z gélu a presne sa zmerala ich aktivita, aby sa zistil stupeň štiepenia. Hodnota získaná meraním samotného pufra sa odčítala ako pozadie (v pozadí je tak zahrnuté nielen pozadie štiepenia, ale aj degradačné produkty a ďalšie nečistoty, ktoré sa vyskytujú v rádioligande).

11.4 Výsledky

Výsledný stupeň štiepenia faktora B je uvedený v tabuľke:

1/25 prirodzene sa vyskytujúci 1,49 %

1/5 prirodzene sa vyskytujúci 2,74 %

Q1R2 6,19 %

Q1Q2 7,41 %

E1Q2 6,42 %

Je zrejmé, že všetky mutantné formy odolné voči faktoru I produkujú vyššie koncentrácie štiepeného faktora B než ekvivalentné množstvo prirodzene sa vyskytujúceho proteinu C3 (C3i). S väčšími dávkami alebo pri dlhšej inkubácii by malo dôjsť k úplnému zastaveniu alternatívnej dráhy.

Skratky použité v predošlých príkladoch znamenajú:

CFD (complement fixation diluent) je pufor na fixáciu komplementu (pozri Harrison, R. A. & Lachmann, P. J., Handbook of Experimental Immunology, 4. vydanie, Weir, Herzehberg & Blackwell (editori), Oxford 1986);

CFD-G je CFD obsahujúci 0,1 % (w/v) želatíny;

PBS je fosfátom pufrovaný fyziologický roztok;

NGPS je normálne sérum morčaťa;

SDS-PAGE je gélová elektroforéza na polyakrylamidovom géli v prostredí detergenta SDS;

SPDP je N-sukcínimidyl-3-(2-pyridyl)ditiopropionát.

Príklad 12

Mutácia zvyškov 992 až 1000

1. Úvod

Iné laboratóriá poskytli dôkazy založené na účinkoch syntetických peptidov (pozri Ganu, V. S. & Muller-Eberhard, H. J., (1985) Complement 2: strana 27; Becherer, J. D a ďalší, (1992) Biochemistry 31: strana 1787 až 1794; Fishelson, Z., (1991) Mol.

Immunol. 28: strana 545 až 552; Lambris, J. D., Ganu, V. S., Hirani, S. & Muller-Eberhard, H. J., (1988) J. Biol. Chem. 263:

strana 12147 až 12150), na základe ktorých sa dajú odhadnúť rôzne aminokyselinové zvyšky v ľudskom C3b, ktoré by sa mohli podieľať na interakcii s faktorom H. V tomto vynáleze sa použil iný prístup porovnávania jednotlivých sekvencii. Pomocou tohto porovnania sa predpovedali aminokyselinové zvyšky zohrávajúce úlohu v interakciách a funkciách špecifických pre proteín C3. Uskutočnila sa cielená mutagenéza, ktorá naznačila, že väčšina týchto mutácií má malý alebo žiadny vplyv na funkčnú citlivosť na faktor H. Niekoľko mutácií však znížilo citlivosť na faktor H. Tieto mutácie sa uskutočnili v takých častiach molekuly, o ktorých sa predtým nepredpokladalo, že interagujú s faktorom H alebo ovplyvňujú jeho väzbu. Mutagenéza týchto definovaných aminokyselinových zvyškov sa teda dá použiť na prípravu mutantných derivátov proteínu C3, ktoré by boli čiastočne alebo úplne odolné voči inhibícii faktorom H vo fyziologickom prostredí a vytvárali by enzymatický komplex C3 konvertázy (C3bBb atď.), ktorý by bol podobne odolný voči inaktivácii faktorom H.

Faktor H je štruktúrne homologický s ďalšími inhibičnými proteínmi komplementu, vrátane CRL, MCP a DAF. Vzhľadom na tento zrejmý evolučný vzťah a vzájomnú väzbovú kompetíciu je pravdepodobné, že interagujú s C3b štruktúrne podobným spôsobom ako faktor H (pozri Ferries, T. C. a ďalší, (1990) Complement Inflamm. 7: strana 30 až 41). Dá sa teda predpokladať, že opísané mutácie, ktoré modulujú citlivosť na faktor H, budú pravdepodobne výhodné aj na moduláciu interakcií s týmito ďalšími proteínmi, obzvlášť na obídenie ich účinkov znižujúcich aktivitu komplementu. Môžu sa použiť aj na modifikáciu interakcie s SCR doménami vo faktore B (a s homologickými doménami v C2 podieľajúcimi sa na väzbe C4b) . Mutácie zodpovedajúcich oblastí C4 a C5 môžu byť vhodné aj na modifikáciu ich interakcií s SCR doménami v Clr a Cis (C4), C4väzbovom proteíne (C4b) a C6 a C7 (C5b).

2. Použité spôsoby

2.1 Hľadanie aminokyselinových zvyškov podieľajúcich sa na funkciách špecifických pre C3

Miesta podieľajúce sa na interakciách sa vytypovali na základe porovnania sekvencii pre ľudský proteín C3 so všetkými homologickými proteínmi, ktorých sekvencie boli dostupné vo verejných databázach. Medzi týmito sekvenciami boli funkčné ekvivalenty myšie, potkanie, morčacie, králičie, kobrie, ropušie (xenopus), kuracie a obdobný proteín zo pstruha, ako aj ľudský a myší proteín C4, ľudský a myší proteín C5, proteíny podobné C3 z ryby okatice (lamprey) a sliznatky (hagfish) , faktor kobrieho jedu (CVF) a ľudský alfa-2-makroglobulín a jeho homológ. Hľadali sa také miesta, ktoré sú konzervované medzi rôznymi proteínmi C3, ale zreteľne sa líšia v rôznych homológoch (hlavne C5 a CVF), ktoré neobsahujú hľadané funkcie špecifické pre C3. Niektoré takto nájdené miesta sa zmutovali tak, aby kódovali zodpovedajúce zvyšky v proteínoch C5 alebo CVF. DNA kódujúca takto zmutované proteíny sa exprimovala v COS bunkách a sekretované produkty sa testovali štiepením v prítomnosti CVFBb a faktorov Ha I. Všetky použité spôsoby sa ako štandardné opísali v príklade 1. Súhrn výsledkov je uvedený v tabulke II.

2.2 Konštrukcia a analýza mutantnej formy DV-1AM

Tento mutant sa pripravil rovnakým spôsobom ako iné uvedené mutanty pomocou tzv. megaprimerov (pozri Picard, V. a ďalší, (1994) Nuc. Acid Res. 22: strana 2587 až 2591). Mutagénny primer mal sekvenciu ccaga tgaca agtgc tgccg tcagc cagtc kódujúcu mutácie E992S, D993A, D996S, A997Q, E998S a R999G. Upstream primer mal sekvenciu tgtca tcgtg ccgct aaaga (zodpovedajúcu deoxynukleotidom 2754 až 2773) a downstream primer mal sekvenciu gtttt atggt gacct taagg tcgaa tttat (bol komplementárny k deoxynukleotidom 4130 až 4165, pričom na pozícii 4149 vložil cieľové miesto pre reštrikčný enzým AflII). Zmutovaný fragment DNA sa ligoval do vektora, ktorý obsahoval sekvenciu kódujúcu protein C3 taktiež vloženým cieľovým miestom pre AflII v pozícii 4149. Ligácia sa uskutočnila tak, že tak PCR produkt ako aj plazmid sa štiepili rovnakými enzýmami (AflII a EcoRI, ktoré štiepia v pozícii 2997), požadované fragmenty sa prečistili a spojili dohromady pomocou T4-DNA ligázy. Plazmidová DNA sa izolovala z kolónií transformovaných baktérií a správny mutant sa identifikoval pomocou sekvenovania DNA. Počas sekvenovania sa dokázalo, že v DNA sekvnecii došlo k dodatočnej mutácii v DNA kódujúcej zmenu L1000M. Výsledným expresívnym vektorom sa transfekovali bunky COS a sekretovaný exprimovaný produkt sa analyzoval štiepením tak, ako sa opísalo.

3. Vlastnosti mutantnej formy DV-1AM

Analýza exprimovaného produktu s mutáciami DV-1AM je znázornená na obrázku 10. K obrázku je potrebné uviesť nasledovné:

(i) Western blot sa vyvolal pomocou monoklonálnych protilátok proti C3dg oblasti proteínu C3, ktoré reagujú s prekurzorom, alfa, alfa', fragmentárni s velkosťou 68 a 77 kDa, ale nereagujú s beta reťazcom a s fragmentárni s velkosťou 43 alebo 46 kDa.

(ii) všetky elektroforetické prúžky zodpovedajúce produktu DV-1AM (stopy Hl až 4) sa zdajú byť o niečo nižšie než ich prirodzene sa vyskytujúce ekvivalenty (stopy Al až 4). Zmeny v pohyblivosti sú pravdepodobne dôsledkom mutácií.

(iii) štiepením prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3 pomocou CVFBb vzniká určité množstvo alfa' reťazca z C3b, ale zároveň štiepením proteínov C3b a iC3b endogénnou aktivitou podobnou faktorom Hal (stopa A3) vzniká väčšie množstvo fragmentu s velkosťou 68 kDa. Prídavok vonkajších faktorov Hal spôsobí úplnú konverziu proteínov C3b na iC3b (stopa A4).

Na druhej strane štiepením proteínu DV-1AM pomocou CVFBb vzniká väčšie množstvo reťazca alfa' a iba malé množstvo fragmentov s velkosťou 68 kDa (stopa B3) . prídavok vonkajších faktorov Hal potom konvertuje tento C3b na iC3b (stopa B4). Mutantný C3b je teda ovela viac odolný voči endogénnym faktorom Hal než prirodzene sa vyskytujúci C3b, hoci rezistencia nie je úplná, ako vyplýva z citlivosti na štiepenie pri vysokých koncentráciách exogénnych faktorov Hal.

4. Závery

Mutácia DV-1AM vytvára rezistenciu voči štiepeniu faktorom I v závislosti od faktora H. Mechanizmus tejto rezistencie nie je známy. Predpokladá sa, že vzhladom na to, že modifikované aminokyselinové zvyšky sú v primárnej štruktúre ďaleko od cielového miesta štiepenia faktorom I, je pravdepodobné, že je narušená interakcia s faktorom H. V tomto prípade mutácia udelí rezistenciu voči ďalším inhibičným činnostiam faktora H, a to (i) kompetícii s faktorom B o väzbu na C3b (alebo C3i) a (ii) zrýchlenej disociácii konvertáz C3bBb a C3bBbP. Mutáciou DV-1AM sa zmenili aminokyselinové zvyšky podieľajúce sa buď priamo alebo nepriamo na afinite voči faktoru H. Podobný účinok sa dá pravdepodobne dosiahnuť mnohými ďalšími mutáciami rovnakých zvyškov alebo mutáciami iba niektorých z tu uvedených zvyškov, ako aj mutáciami iných aminokyselinových zvyškov v zodpovedajúcich častiach primárnej štruktúry.

Príklad 13

Mutácia zvyškov 1001 až 1005

1. Úvod

Ako sa opísalo už v predošlom príklade, aj aminokyselinové zvyšky 1001, 1002 a 1005 sa identifikovali ako pravdepodobne podstatné pre C3-špecifické funkcie. Mutáciami v tejto oblasti sa potvrdilo, že modifikácia týchto zvyškov sa dá použiť na udelenie rezistencie voči faktoru H.

2. Použité spôsoby

2.1 Konštrukcia a analýza mutantnej formy DV-1B

Použili sa podobné spôsoby ako v predošlom príklade s výnimkou toho, že mutagénny primer mal sekvenciu aacgg ctgaa catat taatt catac cccct kódujúcu mutácie K1001N, H1002I a V1005H.

Sekvenčnou analýzou izolovanej plazmidovej DNA sa potvrdilo, že sa vložili správne mutácie. Žiadne iné mutácie sa v sekvencii neobj avili.

3. Vlastnosti mutantnej formy DV-1B

Analýza exprimovaného produktu s mutáciami DV-1B je znázornená na obrázku 10. K obrázku je potrebné uviesť nasledovné:

(i) Western blot sa vyvolal pomocou polyklonálnych protilátok proti proteínu C3, ktoré silne reagujú s prekurzorom, alfa, alfa', beta, fragmentárni s velkosťou 46 a 43 kDa, ale len slabo s fragmentárni s velkosťou 77 alebo 68 kDa. Je potrebné povšimnúť si, že reťazce alfa a alfa' sa nepreniesli a nedetegovali so 100 % účinnosťou a tak je intenzita týchto elektroforetických prúžkov nižšia než sa očakávalo a dá sa len ťažko využiť na odhad skutočného množstva proteínu.

(ii) štiepením prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3 pomocou CVFBb vzniká určité množstvo alfa' reťazca z C3b, ale väčšina tohto reťazca sa stráca vďaka štiepeniu C3b na iC3b endogénnou aktivitou podobnou faktorom H a I (stopa B3) . Tento proces je viditeľný prevažne ako prúžok s velkosťou 43 kDa, aj keď sa dá detegovať aj malé množstvo medziproduktu s velkosťou 4 6 kDa. Prídavok 2 gg/ml exogénneho faktora H (stopa B4) s faktorom I spôsobuje ďalšie štiepenie a prídavok 10 až 50 μς/ιηΐ exogénneho faktora H (stopa B5 a B6) spôsobuje kompletnú konverziu C3b na úplne štiepený iC3b (t. j. nie je viditeľný elektroforetický prúžok zodpovedajúci alfa' reťazcu ani 46 kDa fragmentu). Štiepením mutantnej formy DV-1B pomocou CVFBb vzniká aj malé množstvo reťazca alfa' (stopa A3; celkové množstvo C3 je výrazne nižšie, elektroforetické prúžky pre reťazce alfa a alfa' sú velmi slabé).

Množstvo reťazca s velkosťou 43 kDa vznikajúceho v neprítomnosti vonkajšieho faktora H a I je menšie než u prirodzene sa vyskytujúceho proteínu, zatial čo prúžok zodpovedajúci 46 kDa intermediárnemu fragmentu je relatívne väčší, z čoho sa dá usudzovať na menej účinné štiepenie. Prídavok vonkajších faktorov H a I (stopy A4 až 6) dokončí konverziu tohto C3b na iC3b, ale množstvo 43 kDa produktu sa zvyšuje v závislosti od dávky faktora H až do približne 50 μg/ml faktora H (stopa A6), kedy je ešte stále viditeľný medziprodukt s velkosťou 46 kDa. Preto sa teda dá tvrdiť, že mutantná C3b je voči endogénnym a exogénnym faktorom H a I odolnejšia než prirodzene sa vyskytujúci proteín, hoci táto rezistencia nie je úplná, ako vyplýva z citlivosti na štiepenie vysokými koncentráciami pridaných faktorov H a I.

Na druhej strane štiepením DV-1AM pomocou CVFBb vzniká väčšie množstvo fragmentov s veľkosťou 68 kDa (stopa B3). Prídavok vonkajších faktorov H a I potom konvertuje tento C3b na iC3b (stopa B4). Mutantný C3b je teda oveľa viac odolný voči endogénnym faktorom H a I než prirodzene sa vyskytujúci C3b, hoci rezistencia nie je úplná, ako vyplýva z citlivosti na štiepenie pri vysokých koncentráciách exogénnych faktorov H a I.

4. Záver

Mutácia DV-1B vytvára rezistenciu voči štiepeniu faktorom I závislému od prítomnosti faktora H. Mechanizmus tejto rezistencie nie je úplne jasný, avšak vzhľadom na to, že modifikované aminokyselinové zvyšky sú v primárnej štruktúre ďaleko od miest štiepenia faktorom I a účinok závisel od dodanej dávky faktora H, je pravdepodobné, že účinok týchto mutácií súvisí so zhoršením interakcie s faktorom H. V takomto prípade aj táto mutácia udelí rezistenciu voči ďalším inhibičným aktivitám faktora H a to voči (i) kompetícii s faktorom B o väzbu na C3b (alebo C3i); a (ii) zrýchlenej disociácii konvertáz C3bHb a C3bBbP. Mutáciou DV-1B sa modifikovali aminokyselinové zvyšky vytvárajúce buď priamo alebo nepriamo afinitu voči faktoru H. Podobný účinok sa dá očakávať aj u mnohých ďalších rôznych mutáciách rovnakých aminokyselinových zvyškov ako aj u mutáciách iba niektorých z uvedených zvyškov alebo všetkých aminokyselinových zvyškov tejto časti primárnej štruktúry.

Príklad 14

Mutácia zvyškov 1152 až 1155

1. Úvod

Ako sa už opísalo v predošlých príkladoch, aminokyselinové zvyšky 1152, 1153 a 1155 sa tiež navrhli ako pravdepodobní nositelia funkcií špecifických pre C3. Mutáciami sa potvrdilo, že modifikáciou týchto zvyškov sa dá udeliť rezistencia voči faktoru

H.

2. Použité spôsoby

2.1 Konštrukcia a analýza mutantnej formy DV-6

Použili sa podobné spôsoby ako v predošlých príkladoch s výnimkou toho, že mutagénny primer mal sekvenciu atctc gctgc gcaagg ctttc gatat ttgc kódujúcu mutácie Q1152R, E1153K a K1155F.

Sekvenčnou analýzou izolovanej plazmidovej DNA sa potvrdilo, že sa vložili správne mutácie. Žiadne iné mutácie sa v sekvencii neobjavili .

3. Vlastnosti mutantnej formy DV-6

Analýza exprimovaného produktu s mutáciami DV-6 je znázornená na obrázku 11. K obrázku je potrebné uviesť nasledovné:

(i) tak ako to bolo aj v predošlom príklade, Western blot sa vyvolal pomocou polyklonálnej protilátky proti proteínu C3, ktorá silne reaguje s prekurzorom, alfa, alfa', beta, 46 a 43 kDa fragmentárni, ale iba slabo s fragmentárni s veľkosťou 77 alebo 68 kDa. Je potrebné všimnúť si, že reťazce alfa a alfa' sa neprenášajú a nedetegujú so 100 % účinnosťou a tak je intenzita týchto elektroforetických prúžkov nižšia než sa očakávalo a dá sa len ťažko využiť na odhad skutočného množstva proteínu.

(ii) štiepením prirodzene sa vyskytujúceho proteínu C3 pomocou CVFBb vzniká určité množstvo alfa' reťazca z C3b, ale väčšina tohto reťazca sa stráca vďaka štiepeniu C3b na iC3b endogénnou aktivitou podobnou faktorom H a I (stopa B3) . Tento proces je viditeľný prevažne ako prúžok s veľkosťou 43 kDa, aj keď sa deteguje aj malé množstvo medziproduktu s veľkosťou 46 kDa. Prídavok 2 gg/ml exogénneho faktora H (stopa B4) s faktorom I spôsobuje ďalšie štiepenie a prídavok 10 až 50 μg/ml exogénneho faktora H (stopa B5, B6) spôsobuje kompletnú konverziu C3b na úplne štiepený iC3b (t. j.

nepozoruje sa elektroforetický prúžok zodpovedajúci alfa' reťazcu ani 46 kDa fragmentu). Štiepením mutantnej formy DV-6 pomocou CVFBb tiež vzniká malé množstvo reťazca alfa' (stopa C3).

Množstvo reťazca s veľkosťou 43 kDa vznikajúceho v neprítomnosti vonkajšieho faktora H a I je menšie než u prirodzene sa vyskytujúceho proteínu, zatiaľ čo prúžok zodpovedajúci 46 kDa intermediárnemu fragmentu je relatívne väčší, z čoho sa dá usudzovať na menej účinné štiepenie. Prídavok vonkajších faktorov H a I (stopy C 4 až 6) dokončí konverziu tohto C3b na iC3b.

Zatiaľ čo u prirodzene sa vyskytujúcej formy dochádza k úplnému vymiznutiu medziproduktu s veľkosťou 46 kDa už po prídavku 10 μg/ml vonkajšieho faktora H (stopa B5), tento medziprodukt pri rovnakej koncentrácii faktora H u mutantnej formy stále pretrváva (stopa C5) a ku kompletnému štiepeniu dochádza až po prídavku 50 μς/πιΐ faktora H. Preto sa teda dá tvrdiť, že mutantná C3b je voči endogénnym a exogénnym faktorom H a I odolnejšia než prirodzene sa vyskytujúci proteín, hoci táto rezistencia nie je úplná ako vyplýva z citlivosti na štiepenie vysokými koncentráciami pridaných faktorov Haľ.

4. Záver

Mutácia DV-6 vytvára rezistenciu voči štiepeniu faktorom I závislým od prítomnosti faktora H. Mechanizmus tejto rezistencie nie je úplne jasný, avšak vzhľadom na to, že modifikované aminokyselinové zvyšky sú v primárnej štruktúre ďaleko od miest štiepenia faktorom I a účinok závisel od dodanej dávky faktora H, je pravdepodobné, že účinok týchto mutácií súvisí so zhoršením interakcie s faktorom H. V takomto prípade táto mutácia bude udeľovať aj rezistenciu voči ďalším inhibičným aktivitám faktora H a to voči (i) kompetícii s faktorom B o väzbu na C3b (alebo C3i a (ii) zrýchlenej disociácii konvertáz C3bHb a C3bBbP. Mutáciou DV-6 sa modifikovali aminokyselinové zvyšky vytvárajúce buď priamo alebo nepriamo afinitu pre faktor H. Podobný účinok sa dá očakávať aj u mnohých ďalších rôznych mutáciách rovnakých aminokyselinových zvyškov ako aj u mutáciách iba niektorých z uvedených zvyškov alebo všetkých aminokyselinových zvyškov v tejto časti primárnej štruktúry.

tc

Zhrnutie účinkov mutácií na citlivosť na faktor

	TJ 0
tu •H	-H
tí	44
tu	to
a	0
(U	1—1
-H	to
44	•H
>t0	>
to	'(0 N
tí 44 to	> l—l
0 >	e
•H	0
i—1	M
44	O
-H	4-)
O	X!

(0

Ψ4

X t0

M

O

Xi <0 m

•H

4->

m

O

C e

o '1-1

M a

g

Ή rH tu to x:

o c

•H e

(U (0 o

(U e

'to

N to

-Η ο

>(0 o

σ σ

σ

X

X kD rrW

X kD kD σ

Q x

X m

kD

ΟΊ kD σ

cu

X m

kD σ

Cu w

ao σ

σ ω

o rσ σ

cn kD σ

σ

Q cn σ

σ

Q ω

CM σ

σ ω

M < ko m ro o τ—I i—l kí x

W σι

CM

	x	'z	x		Pm		i-4		σ
	LD	m	co		Lf)		X		CO
	O	m	r-		LO				n
	O	o	o		t—1		v		•^r
	i—1	r4	i—1		t—1		Q	ω	i-4
	>	W			Pd		CO	*3»	ω
							i—1	kD
	X	x			x		CM	CM	x
Z	H	x	o	σ	x	z	r4	1-4	Q
O	CM	co	CM		n	•^r	Z	O	r~l
O	O	n	r~	co	m	r-			ΓΠ
o	O	o	o	r—1	!—1	r—1	s	..
r—1	i-4	t—1	i—1		i—1	r—1	W	z	r-4
X	X	σ	x	X	w	Q	Γ-	o	X

ι-4 kD

x	x	χ	x	CM	CM	x
z	z	Ľ)	x	1-4	i-4	σ
i—1	CM	i—1	CM	X	X	r~~
O	CO	>	m			CM
o	o	O	t—1	X		sr
i—1	r-1	i—l	i—1	0		r—1
x	ω	X	o	kD		x
				r4
	v	x		CM
	o	x		i-4
	i—1	o		O
	en	Γ-
	o	o
	i—f	i-1
	E-i	>

CM 1	i—1 1	r—1	x i—1	co 1	•θ’ 1	m 1	kD 1	& r-	σ 1	1	i—1 I
>	>	1	1	>	>	>	>	l <>	í>	>	>U
U	u	%	Q	Q	Q	o	Q	§	Q	U	x

Xi tu

Μ (U

C >o •H n

•H x

o •H >>

Xi r—1 (U >

II +

+ <0 •H o

Ή

Λ

H

X (0 •1-1 •<0 i—I to e

II +

* to •H

O

Ή

X

Ή

X!

C

-H tú

C

Ό (0 •H >N fO ω

to u

ω •H

N (U tí

II

I to

Ό

C tu im (U

X

Príklad 15

Mutácia aminokyselinových zvyškov 1546 až 1663

1. Úvod

Na rozdiel od predošlých príkladov (príklady 12 až 14) sa modifikácia zvyškov 1546 až 1663 nezakladala na porovnaní rôznych sekvencii proteínu C3 a príbuzných proteínov. Miesto toho sa opísala modifikácia vytvorená náhodne v dôsledku neúmyselnej delécie nukleotidu, ktorá spôsobila posun čítacieho rámca v translácii C-terminálnej časti proteínu. Výsledný produkt sa vyznačoval značnou mierou rezistencie voči štiepeniu faktorom I závislým od faktora H. Dá sa teda predpokladať, že podobné modifikácie vytvorené úmyselne budú výhodné na udelenie rezistencie voči regulačným účinkom faktora H a/alebo faktora I.

2. Použité spôsoby

Vektor ekvivalentný vektoru NC3, ale na rozdiel od neho nesúci dodatočné mutácie 3151g, 3152g, 3154a, 3156c, 3159c, 3163a, 3165t, 3167t, 3168t, a ktorý je translatovaný s mutáciami T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N a K1036I, sa naštiepil pozri čnými enzýmami Pvul (štiepi v sekvencii vektora) a BsrGI (štiepi po nukleotide 4692). Po pozri cii sa elektroforézou na agarózovom géli izoloval fragment s veľkosťou 6,1 kb. Iný ekvivalent vektora NC3 s oligonukleotidom catcatcatcatcatcat vloženým po nukleotide 5049 a kódujúcim vloženie aminokyselín HHHHHH na C-koniec, sa podobným spôsobom naštiepil enzýmami Pvul a BsrGI a izoloval sa fragment s dĺžkou 4,4 kb. Tieto dva fragmenty sa spojili ligáciou dohromady a potom sa vyizoloval kompletný plazmid. Sekvenovanie DNA odhalilo, že došlo k strate jedného nukleotidu (a4696 alebo a4697). Predpokladaným dôsledkom tejto straty je skutočnosť, že aminokyseliny 1546 až 1663 nie sú prekladané v správnom čítacom rámci.

Miesto toho sa 48 amino kyselinových zvyškov číta mimo normálny čítací rámec až po dosiahnutie stop kodónu.

Produkt nazvaný HDV-3X sa exprimoval v bunkách COS a testoval sa podľa predošlých príkladov.

3. Vlastnosti mutantnej formy HDV-3X

Analýza exprimovaného produktu s mutáciami HDV-3X je znázornená na obrázku 12. K obrázku je potrebné uviesť nasledovné:

(i) Western blot sa vyvolal pomocou monoklonálnych protilátok proti C3dg oblasti proteínu C3, ktoré reagujú s prekurzorom, alfa, alfa', 77 a 68 kDa fragmentárni, ale nereagujú s beta reťazcom a fragmentárni s veľkosťou 43 alebo 46 kDa.

(ii) produkt HDV-3X sa porovnal s mutantnou formou DV-3 ako ekvivalentným produktom bez prídavnej C-terminálnej modifikácie. HDV-3X sa vyznačoval kratším alfa reťazcom, ale produkty 68 kDa a 77 kDa mali rovnakú veľkosť, čo je v súlade so skutočnosťou, že k štiepeniu dochádza na C-konci.

(iii) štiepením proteínu DV-3 C3 pomocou CVFBb v prítomnosti faktora I vzniká z C3b určité množstvo reťazca alfa', ale zároveň väčšie množstvo 68 kDa fragmentu, ktorý je výsledkom štiepenia C3b na iC3b závislého od endogénneho faktora H (stopa A2) . Prídavok vonkajšieho faktora H dovŕši konverziu C3b na iC3b (stopy A3 až 5). Konverzia je takmer úplná aj po prídavku iba 1 gg/ml faktora H (stopa A3) . Na druhej strane štiepením produktu HDV-3X pomocou CVFBb vzniká väčšie množstvo reťazca alfa' a iba malé množstvo fragmentu s veľkosťou 68 kDa (stopa B2).

Prídavok vonkajšieho faktora H nespôsobí konverziu tejto formy C3b na iC3b (stopy B3 až 5). Dokonca aj po prídavku 25 μg/ml faktora H sa deteguje len nepatrné množstvo vznikajúcich fragmentov s veľkosťou 68 kDa 77 kDa (stopa A5). Preto sa dá tvrdiť, že HDV-3X C3b je oveľa odolnejší voči endogénnemu faktoru Hal než prirodzene sa vyskytujúci proteín. Skutočnosť, že táto rezistencia sa čiastočne prekonáva pri vyšších koncentráciách faktora H sa dá vysvetliť tým, že mechanizmus tejto rezistencie spočíva v podstatnom znížení afinity k faktoru H.

4. Záver

Mutácia HDV-3X vytvára rezistenciu voči štiepeniu faktorom I závislým na prítomnosti faktora H. Mechanizmus tejto rezistencie nie je úplne jasný, avšak vzhľadom na to, že modifikované aminokyselinové zvyšky sú v primárnej štruktúre ďaleko od miest štiepenia faktorom I a účinok závisel od dodanej dávky faktora H, je pravdepodobné, že účinok týchto mutácií súvisí so zhoršením interakcie s faktorom H. V takomto prípade táto mutácia bude udeľovať aj rezistenciu voči ďalším inhibičným aktivitám faktora H a to voči (i) kompetícii s faktorom B o väzbu na C3b (alebo C3i a (ii) zrýchlenej disociácii konvertáz C3bHb a C3bBbP. Mutáciou HDV-3X sa modifikovali aminokyselinové zvyšky vytvárajúce buď priamo alebo nepriamo afinitu k faktoru H. Podobný účinok sa dá očakávať aj u mnohých ďalších rôznych mutáciách rovnakých aminokyselinových zvyškov ako aj u mutáciách iba niektorých z uvedených zvyškov alebo všetkých aminokyselinových zvyškov v tejto časti primárnej štruktúry.

Modifikácia HDV-3X sa nevytvorila zámerne. Výhodnými spôsobmi na tvorbu tejto a jej podobných modifikácií sú špecifické spôsoby cielenej mutagenézy, vrátane postupov opísaných v predošlých príkladoch .

Príklad 16

Modifikácia zvyškov 954 a 955 vedúca k rezistencii voči štiepeniu faktorom I

1. Úvod

Mutácie uskutočnené už skôr v PI zvyškoch (1303 a 1320) poskytovali rezistenciu voči štiepeniu faktorom I na prvých dvoch miestach (pozri príklady 1 až 6). Nebolo však známe, či zabránenie štiepeniu na týchto dvoch miestach vedie aj k zabráneniu štiepenia na mieste treťom, ktoré je zodpovedné za uvoľnenie proteínu C3c z C3dg. Toto tretie štiepenie, ktoré za normálnych okolností závisí od CR1 (čo je membránový receptor, ktorý sa upravil do rozpustnej formy označenej ako sCRl) ako kofaktoru reakcie, je relatívne pomalé. Toto štiepenie sa pozorovalo u iC3b (alebo iC3i) (t. j. po štiepení na miestach 1 a 2), ale nie na miestach C3i alebo C3b. Na otestovanie tejto skutočnosti sa použila mutantná forma E1Q2 (opísaná v príklade 11), ktorá je vysoko rezistentná voči štiepeniu na miestach 1 a 2: Keďže bola táto mutantná forma ešte stále citlivá na štiepenie v mieste 3, bolo potrebné uvažovať o zavedení vhodnej mutácie do tohto miesta, ktorá by zabránila odbúraniu molekuly vo fyziologických kvapalinách. V literatúre sa našli odporujúce si odkazy o tom, či k štiepeniu dochádza výlučne na miestach väzby v pozícii 954 až 955 (pozri Davis, A. E., Harrison, R. A. & Lachmann, P. J., (1984) J. Immunol. 132: strana 1960 až 1966) alebo k nemu môže dochádzať aj na ďalších miestach, ako sú aminokyselinové zvyšky na pozíciách 959 až 960 (pozri Harrison, R. A. a ďalší, (1966) Mol. Immunol. 33, dodatok 1, 59, abstrakt 235; Ekdahl, K. N., Nilsson, U. R. & Nilsson, B., (1990) J. Immunol. 144: strana 4269 až 4274).

Preto sa najskôr uskutočnila mutácia vo zvyšku 954, a to výmena arginínu za kyselinu glutámovú (tak sa pripravila mutantná forma E1Q2E3), keďže:

(i) ako je zrejmé z uvedených literárnych odkazov, je to Pl zvyšok jedného zo štiepnych miest, a ďalej (ii) z príkladu 5 vyplýva, že v mieste 1 vedie mutácia za kyselinu glutámovú k nastoleniu vyššej odolnosti voči štiepeniu, než je tomu v prípadoch ďalších substitúcií. Navyše aj ďalšie druhy cicavčích proteínov C3 (myších, potkaních, morčacích, králičích) majú na miestach zodpovedajúcim pozíciám 954 a 955 glutamín a glycín miesto arginínu a kyseliny glutámovej, ktoré sa vyskytujú v rovnakých pozíciách u ľudských proteínov C3 (ako napríklad uvádzajú Mavrodis,

Ί4

M., Sunyer, J. O. & Lambris, J. D., (1995) J. Immunol. 154: strana 2164 až 2174) . Tieto výsledky naznačujú, že toto miesto (954 a 955) nie je možné úspešne štiepiť u ďalších druhov a že ďalšie miesto, ako je pozícia 959 a 960, môže byť ešte dôležitejšie (Harrison, R. A. a ďalší, (1966) Molecular Immunology 33, dodatok 1, 59, abstrakt 235). Preto sa zaviedli ďalšie rovnocenné mutácie do ľudského C3, a to Arg 954 za Gin a Glu 955 za Gly, a tak vznikla mutantná forma E1Q2G3.

2. Použité spôsoby

Metodika použitá na prípravu mutantných foriem bola rovnaká ako v predošlých príkladoch, výnimku tvoril primer pre mutantnú formu E1Q2E3, ktorý mal sekvenciu gaacg cctgg gcgaa gaagg agtgc ag a kódoval mutácie R954E, a ďalej primer pre mutantnú formu E1Q2QG3, ktorý mal sekvenciu aacgc ctggg ccaag aggag tgcag aa kódujúci mutácie R954Q a E955G. Vzniknutý produkt sa vložil ligáciou do konštruktu, ktorý obsahoval mutácie kódujúce E1Q2 (E1303, Q1320 tak, ako sa opisuje v príklade 5 a 11) .

Sekvenčná analýza vyizolovanej plazmidovej DNA potvrdila správnosť zavedených mutácií. Nedetegovali sa žiadne ďalšie mutácie. Takto vzniknuté expresívne vektory sa zaviedli transfekciou do COS buniek a exprimovaný produkt sa analyzoval na citlivosť na štiepne reakcie, tak ako sa opísalo skôr.

3. Faktorom I sprostredkované štiepenie mutantných foriem E1Q2, E1Q2E3 a E1Q2QG3

Analýzy produktov expresie sú znázornené na obrázku 13.

Za obzvlášť dôležité považujeme nasledovné body:

(i) na vyvolanie Western blotu sa použili monoklonálne protilátky reagujúce s C3dg oblasťou na C3, ktoré detegujú prekurzory alfa, alfa', fragmenty s veľkosťou 77 a 68 kDa, ale nie beta alebo fragmenty s veľkosťou 43 a 46 kDa. Navyše sa detegoval produkt štiepenia v mieste 3 s veľkosťou 86 kDa a to bez súčasného štiepenia v mieste 1 alebo 2.

(ii) z obrázku je zrejmé, že produkt štiepenia s veľkosťou 86 kDa sa skutočne tvorí štiepením sprostredkovaným faktorom I v mieste E1Q2 v prítomnosti sCRl (stopa A3), ale nie v prítomnosti faktora H ako kofaktora (dráha A2).

(iii) produkt s veľkosťou 86 kDa sa netvorí ani u ďalších mutantných foriem E1Q2E3 (C) alebo E1Q2QG3 (B) , dokonca ani v prítomnosti sCRl (C3 a B3).

4. Záver (i) K štiepeniu v mieste 3 sprostredkovanému faktorom I môže dochádzať aj v prípade, že štiepenie v miestach 1 a 2 je zablokované. Preto je nutné zaviesť ďalšiu blokáciu štiepenia pre miesto 3 tak, aby sa vhodne zabránilo odbúravanie každej zo všetkých pripravených mutantných foriem, ktorá je rezistentná k štiepeniu len v mieste 1 alebo 2, ak by sa použili vo fyziologickom prostredí.

(ii) Štiepenie v mieste 3 môže byť zablokované mutáciou zvyšku 954 na Glu a mutáciu v mieste 954 a 955 na Gin a Gly. Z tohto dôvodu sa môžu zaviesť ešte ďalšie mutácie v pozíciách 954 a/alebo 955, ktoré by pravdepodobne poskytli rezistenciu v mieste 3.

(iii) Opísané mutácie nedovoľujú štiepenie na ďalších uvažovaných pozíciách v štiepnom mieste 3 (ako je 959 až 960) , dokonca ani vtedy, ak nie sú uvažované miesta mutované. Toto potvrdzuje, že buď pozície 954 až 955 sú jediným signifikantným miestom na štiepenie, alebo že mutácia u týchto zvyškov bráni štiepeniu v ďalších pozíciách iným spôsobom (ako je napríklad konformačná deformácia). Vo všetkých prípadoch mutácia uskutočnená v pozícii 954 a/alebo v pozícii 955 sa javí ako účinný prostriedok proti degradácii C3balebo C3i-podobných produktov.

Príklad 17

Modifikácie C-koncovej oblasti proteínu C3, ktoré vedú k inhibícii štiepenia faktorom I

1. Úvod

V príklade 15 sa opisuje, že mutácia alebo delécia zvyškov 1546 až 1663 v proteíne C3 slúži na udelenie rezistencie voči štiepeniu faktorom I. V tomto prípade sa uvádzajú ďalšie mutácie menšieho rozsahu, ktoré rovnako vedú k tejto rezistencii, ale aj rôzne mutácie, ktoré toho nie sú schopné.

2. Použité spôsoby

Metodika použitá na prípravu mutantných foriem bola rovnaká ako v predošlých príkladoch, výnimku tvorili primery pre mutantné formy, ktoré majú sekvencie uvedené v tabuľke III a kódujú vyznačené mutácie. Sekvenčná analýza izolovaných plazmidových DNA potvrdila správnosť zavedených mutácií. Nedetegovali sa žiadne ďalšie mutácie.

Takto vzniknuté expresné vektory sa zaviedli transfekciou do COS buniek a uvoľňovaný exprimovaný produkt sa analyzoval na citlivosť na štiepne reakcie tak, ako sa opísalo skôr.

3. Rezistencia rôznych mutantných foriem voči štiepeniu faktorom I

Výsledky získané zo štiepnych reakcií uskutočnených pomocou aplikácie faktora I a H na uvedené mutantné formy sú znázornené na obrázku 14 a 15.

Poznamenajme, že na vyvolanie Western blotu sa použili monoklonálne protilátky vytvorené proti C3dg oblasti proteínu C3, ktoré detegujú prekurzory alfa, alfa', fragmenty s veľkosťou 77 a 68 kDa, ale nie reťazec beta, alebo fragmenty s veľkosťou 43 a 46 kDa.

Obrázok 14 znázorňuje, že prirodzene sa vyskytujúce typy produktov (NC3,A), FT-3(D), FT-4(E) a FT-5(F) sa štiepia faktorom I, ako o tom svedčí na elektroforéze vznik fragmentov s veľkosťou 77 kDa a/alebo 68 kDa a ďalej vymiznutie pruhu zodpovedajúceho alfa reťazcu. Na rozdiel od toho, FT-1 a FT-2 sa neštiepia vôbec.

Obrázok 15 znázorňuje, že prirodzene sa vyskytujúci protein (NC3,A) , FR-1(B), FR-2(C), FR-3(D) a FR-4(E) sa štiepi, zatiaľ čo u proteínu FT-2 (stopa F) k štiepeniu opäť nedochádza.

4. Záver (i) Na zavedenie rezistencie voči štiepeniu pomocou faktora I postačuje dokonca i len malé skrátenie FT-2. Táto rezistencia sa preto môže dosiahnuť vynechaním niektorých alebo všetkých zvyškov v oblasti 1636 až 1663. Tento záver podporuje aj rezistencia voči štiepeniu, ktorá sa objavila u FT-1, kde sa vynechali zvyšky 1636 až 1663 s následnou deléciou či modifikáciou zvyškov 1591 až 1635.

(ii) Pretože sú aminokyselinové zvyšky 1636 až 1663 nutné na štiepenie sprostredkované faktorom I, je pravdepodobné, že aj mnoho ďalších modifikácií zvyškov spadajúcich do tejto oblasti vyvolá rezistenciu.

(iii) Nie všetky modifikácie týchto zvyškov prepožičiavajú rezistenciu voči štiepeniu. Medzi modifikácie, ktoré nevedú k udeleniu rezistencie patria FT-5, FR-1, FR-2, FR-3 a FR-4, ďalej aj modifikácie FT-3 a FT-4, u ktorých však dochádzalo k modifikácii iných zvyškov, než zvyškov s číslami 1636 až 1663.

(iv) Tieto údaje nutne vedú k záveru, že zvyšky medzi pozíciami 1636 až 1663, ktoré sú nutné na štiepenie sú tie, ktoré sa nemodifikovali u FT-5, FR-1, FR-2, FR-3 alebo FR-4. Z uvedeného vyplýva záver, že zvyšky s číslami 1649 až 1663 by mohli zohrávať klúčovú úlohu.

fO o

r-i (0 i-4 fO ·Η C/3

N	0	a			Q
Ό	P	o		t—t	PI
'(0	Φ	-U		O	a			O
M	>	CO	a	PI	>*	P		OS
PS	Pi		0		M	Eh		Eh
tO	Φ	S	4->	W	>*	Q	CO	CO
2S	co	H	CO	a	OS	co ps	CO	OS

b

	n 0Ί m .—t	’ζΓ r-í 1”l	m (N LO 1—1	LO 00 LO rH	m <D 1—1	m VO i—(
(0	>N		>N	>N		>N	>N	>N
•H	CO		ÍÚ	(0		CO	íO	(0
O
M-f	t-.	LO	r-	.—1	i—l	00	00	00
N	σ.	00	o	CM	LO	00	m	m
O	lo	LO	VD	LO	LO	LO	VO	vo
(X.	,—.	r—t	cH	,—1	i—l	rH	T~t	r-H

-a*

LO

'(0
P	<0					α	σ
(0	•H		H			a	X
N	U		O			α	σ
n	P		S			s	s
'fO	Φ		a	Q		ω	ω
P	>		Q	a	ω	ω	ω
PS	Pi	ŕíj	CO	o	Q	ω	ω
(0	Φ	W	CO	H	ω	ο	Q
S	ω	PS W	PI	M O	ω	α	σ

Mutantné formy použité v príklade 17 (O

4-1 ω

e •rd

P a

o ps ω

p p

o en

P +j

P g

P •H u

P

Φ >

Pá

Φ w

4-1
Ρ
(0	ί—1	CM	00	Ό1	P)	t-4	CM	co
4-1	1	1	1	1	I	1	1	1	1
3	Η	Eh	Eh	EH	Eh	os	os	ps	oS
S	a	a	a	a	a	a	a	a	a

ZOZNAM SEKVENCII

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 41 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 1:

TAGGGAGACC GGAAGCTTGC CCTCTCCCTCTGTCCCTCTG T 41

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 2:

CAACTGCCCA GCCAAAGCTC CAAGATCACC 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 3:

GCCAGCCTCC TGCAATCAGA AGAGACCAAG 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 4:

TAATAAATTC GACCTTAAGG TCACCATAAA AC 32

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 5:

GGTGATCTTG GAGCTTTGGC TGGGCAGTTG 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 6:

CTTGGTCTCT TCTGATTGCA GGAGGCTGGC 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 7:

GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA 32

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 8:

CAACTGCCCA GCKRSAGCTC CAAGATCACC 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 9:

CACCAGGAAC TGAATCTAGA TGTGTCCCTC 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 10:

GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA 32

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 45 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 11:

AGTAACCTGG GTTCGGGCAT CATTGCAGGA TCGGGCATCG TTTCC 45

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 12:

TGGTGTTGAC CAATACATCT CCGACTATCA GCTGGACAA 39

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 44 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 13:

TGGGTGCCCC AACCATCATC ATCATCATCA TTGACCACAC CCCC 44

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 44 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 14:

CCAGATGACA AGTGCTGCCG TCAGCCAGTC AGGGCTGAAG CACC 44

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 15:

TGTCATCGTG CCGCTAAAGA 20

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 16:

GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA 32

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 17:

AACGGCTGAA CATATTAATT CATACCCCCT CGGGC 35

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 18:

ATCTCGCTGC GCAAGGCTTT CGATATTTGC GAG 33

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 27 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 19:

GAACGCCTGG GCGAAGAAGG AGTGCAG 27

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i i)TYP MOLEKULY: cDNA (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 20:

AACGCCTGGG CCAAGGAGGA GTGCAGAA 28

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii)TYP MOLEKULY: peptid (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 21:

Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu íle Val 15 10

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1663 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi)POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 22:

Met 1	Gly	Pro	Thr	Ser 5	Gly	Pro	Ser
Leu	Pro	Leu	Ala 20	Leu	Gly	Ser	Pro
íle	Leu	Arg 35	Leu	Glu	Ser	Glu	Glu 40
Ala	Gin 50	Gly	Asp	Val	Pro	Val 55	Thr
Lys 65	Lys	Leu	Val	Leu	Ser 70	Ser	Glu
Asn	His	Met	Gly	Asn 85	Val	Thr	Phe
Lys	Ser	Glu	Lys 100	Gly	Arg	Asn	Lys
Gly	Thr	Gin 115	Val	Val	Glu	Lys	Val 120
Tyr	Leu 130	Phe	íle	Gin	Thr	Asp 135	Lys
Val 145	Leu	Tyr	Arg	íle	Phe 150	Thr	Val
Arg	Thr	Val	Met	Val 165	Asn	íle	Glu
Gin	Asp	Ser	Leu 180	Ser	Ser	Gin	Asn
Trp	Asp	íle 195	Pro	Glu	Leu	Val	Asn 200
Tyr	Tyr 210	Glu	Asn	Ser	Pro	Gin 215	Gin
Lys 225	Glu	Tyr	Val	Leu	Pro 230	Ser	Phe
Lys	Phe	Tyr	Tyr	íle 245	Tyr	Asn	Glu
Ala	Arg	Phe	Leu 260	Tyr	Gly	Lys	Lys
Phe	Gly	íle 275	Gin	Asp	Gly	Glu	Gin 280
Lys	Arg 290	íle	Pro	íle	Glu	Asp 295	Gly
Lys 305	Val	Leu	Leu	Asp	Gly 310	Val	Gin

Leu	Leu 10	Leu	Leu	Leu	Leu	Thr 15	His
Met 25	Tyr	Ser	íle	íle	Thr 30	Pro	Asn
Thr	Met	Val	Leu	Glu 45	Ala	His	Asp
Val	Thr	Val	His 60	Asp	Phe	Pro	Gly
Lys	Thr	Val 75	Leu	Thr	Pro	Ala	Thr 80
Thr	íle 90	Pro	Ala	Asn	Arg	Glu 95	Phe
Phe 105	Val	Thr	Val	Gin	Ala 110	Thr	Phe
Val	Leu	Val	Ser	Leu 125	Gin	Ser	Gly
Thr	íle	Tyr	Thr 140	Pro	Gly	Ser	Thr
Asn	His	Lys 155	Leu	Leu	Pro	Val	Gly 160
Asn	Pro 170	Glu	Gly	íle	Pro	Val 175	Lys
Gin 185	Leu	Gly	Val	Leu	Pro 190	Leu	Ser
Met	Gly	Gin	Trp	Lys 205	íle	Arg	Ala
Val	Phe	Ser	Thr 220	Glu	Phe	Glu	Val
Glu	Val	íle 235	Val	Glu	Pro	Thr	Glu 240
Lys	Gly 250	Leu	Glu	Val	Thr	íle 255	Thr
Val 265	Glu	Gly	Thr	Ala	Phe 270	Val	íle
Arg	íle	Ser	Leu	Pro 285	Glu	Ser	Leu
Ser	Gly	Glu	Val 300	Val	Leu	Ser	Arg
Asn	Pro	Arg 315	Ala	Glu	Asp	Leu	Val 320

Gly Lys

Ser

Leu Tyr 325

Val

Ser Ala Thr Val 330

íle

Leu

His

Ser

Gly 335

Ser

Asp

Met

Val

Gin

Ala

Glu

Arg

Ser

Gly

íle

Pro

íle

Val

Thr

Ser

Pro

340

345

350

Tyr

Gin

íle

His

Phe

Thr

Lys

Thr

Pro

Lys

Tyr

Phe

Lys

Pro

Gly

Met

355

360

365

Pro

Phe

Asp

Leu

Met

Val

Phe

Val

Thr

Asn

Pro

Asp

Gly

Ser

Pro

Ala

370

375

380

Tyr

Arg

Val

Pro

Val

Ala

Val

Gin

Gly

Glu

Asp

Thr

Val

Gin

Ser

Leu

385

390

395

400

Thr

Gin

Gly

Asp

Gly

Val

Ala

Lys

Leu

Ser

íle

Asn

Thr

His

Pro

Ser

405

410

415

Gin

Lys

Pro

Leu

Ser

íle

Thr

Val

Arg

Thr

Lys

Lys

Gin

Glu

Leu

Ser

420

425

430

Glu

Ala

Glu

Gin

Ala

Thr

Arg

Thr

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Tyr

Ser

Thr

435

440

445

Val

Gly

Asn

Ser

Asn

Asn

Tyr

Leu

His

Leu

Ser

Val

Leu

Arg

Thr

Glu

450

455

460

Leu

Arg

Pro

Gly

Glu

Thr

Leu

Asn

Val

Asn

Phe

Leu

Leu

Arg

Met

Asp

465

470

475

480

Arg

Ala

His

Glu

Ala

Lys

íle

Arg

Tyr

Tyr

Thr

Tyr

Leu

íle

Met

Asn

485

490

495

Lys

Gly

Arg

Leu

Leu

Lys

Ala

Gly

Arg

Gin

Val

Arg

Glu

Pro

Gly

Gin

500

505

510

Asp

Leu

Val

Val

Leu

Pro

Leu

Ser

íle

Thr

Thr

Asp

Phe

íle

Pro

Ser

515

520

525

Phe

Arg

Leu

Val

Ala

Tyr

Tyr

Thr

Leu

íle

Gly

Ala

Ser

Gly

Gin

Arg

530

535

540

Glu

Val

Val

Ala

Asp

Ser

Val

Trp

Val

Asp

Val

Lys

Asp

Ser

Cys

Val

545

550

555

560

Gly

Ser

Leu

Val

Val

Lys

Ser

Gly

Gin

Ser

Glu

Asp

Arg

Gin

Pro

Val

565

570

575

Pro

Gly

Gin

Gin

Met

Thr

Leu

Lys

íle

Glu

Gly

Asp

His

Gly

Ala

Arg

580

585

590

Val

Val

Leu

Val

Ala

Val

Asp

Lys

Gly

Val

Phe

Val

Leu

Asn

Lys

Lys

595

600

605

Asn

Lys

Leu

Thr

Gin

Ser

Lys

íle

Trp

Asp

Val

Val

Glu

Lys

Ala

Asp

610

615

620

íle Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser

625 630

Asp	Ala	Gly	Leu	Thr 645	Phe	Thr	Ser
Arg	Ala	Glu	Leu 660	Gin	Cys	Pro	Gin
Val	Gin	Leu 675	Thr	Glu	Lys	Arg	Met 680
Glu	Leu 690	Arg	Lys	Cys	Cys	Glu 695	Asp
Phe 705	Ser	Cys	Gin	Arg	Arg 710	Thr	Arg
Lys	Lys	Val	Phe	Leu 725	Asp	Cys	Cys
Gin	His	Ala	Arg 740	Ala	Ssľľ	His	Leu
Glu	Asp	íle 755	íle	Ala	Glu	Glu	Asn 760
Glu	Ser 770	Trp	Leu	Trp	Asn	Val 775	Glu
Glv 785	íle	Ser	Thr	Lys	Leu 790	Met	Asn
Thr	Trp	Glu	íle	Leu 805	Ala	Val	Ser
Val	Ala	Asp	Pro 820	Phe	Glu	Val	Thr
Leu	Arg	Leu 835	Pro	Tyr	Ser	Val	Val 840
Ala	Val 850	Leu	Tyr	Asn	Tyr	Arg 855	Gin
Glu 865	Leu	Leu	His	Asn	Pro 870	Ala	Phe
Arg	His	Gin	Gin	Thr 885	íle	Thr	íle
Pro	Tyr	Val	íle 900	Val	Pro	Leu	Lys
Lys	Ala	Ala 915	Val	Tyr	His	His	Phe 920
Leu	Lys 930	Val	Val	Pro	Glu	Gly 935	íle

635 640

Ser	Ser 650	Gly	Gin	Gin	Thr	Ala 655	Gin
Pro 665	Ala	Ala	Arg	Arg	Arg 670	Arg	Ser
Asp	Lys	Val	Gly	Lys 685	Tyr	Pro	Lys
Gly	Met	Arg	Glu 700	Asn	Pro	Met	Arg
Phe	íle	Ser 715	Leu	Gly	Glu	Ala	Cys 720
Asn	Tyr 730	íle	Thr	Glu	Leu	Arg 735	Arg
Gly 745	Leu	Ala	Arg	Ser	Asn 750	Leu	Asp
íle	Val	Ser	Arg	Ser 765	Glu	Phe	Pro
Asp	Leu	Lys	Glu 780	Pro	Pro	Lys	Asn
íle	Phe	Leu 795	Lys	Asp	Ser	íle	Thr 800
Met	Ser 810	Asp	Lys	Lys	Gly	íle 815	Cys
Val 825	Met	Gin	Asp	Phe	Phe 830	íle	Asp
Arg	Asn	Glu	Gin	Val 845	Glu	íle	Arg
Asn	Gin	Glu	Leu 860	Lys	Val	Arg	Val
Cys	Ser	Leu 875	Ala	Thr	Thr	Lys	Arg 880
Pro	Pro 890	Lys	Ser	Ser	Leu	Ser 895	Val
Thr 905	Gly	Leu	Gin	Glu	Val 910	Glu	Val
íle	Ser	Asp	Gly	Val 925	Arg	Lys	Ser
Arg	Met	Asn	Lys 940	Thr	Val	Ala	Val

Arg 945	Thr Leu Asp	Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gin Lys	Glu 960
950	955
Asp	íle Pro Pro	Ala Asp Leu Ser 965	Asp Gin Val Pro Asp Thr Glu 970 975	Ser
Glu	Thr Arg íle 980	Leu Leu Gin Gly	Thr Pro Val Ala Gin Met Thr 985 990	Glu
Asp	Ala Val Asp 995	Ala Glu Arg Leu Lys His Leu íle Val Thr Pro 1000 1005	Ser
Gly	Cys Gly Glu 1010	Gin Asn Met íle 1015	Gly Met Thr Pro Thr Val íle 1020	Ala
Val 1025	His Tyr Leu	Asp Glu Thr Glu 1030	Gin Trp Glu Lys Phe Gly Leu 1035	Glu 1040
Lys	Arg Gin Gly	Ala Leu Glu Leu 1045	íle Lys Lys Gly Tyr Thr Gin 1050 1055	Gin
Leu	Ala Phe Arg Gin Pro Ser Ser 1060	Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys 1065 1070	Arg
Ala	Pro Ser Thr 1075	Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser 1080 1085	Leu
Ala	Val Asn Leu 1090	íle Ala íle Asp 1095	Ser Gin Val Leu Cys Gly Ala 1100	Val
Lys 1105	Trp Leu íle	Leu Glu Lys Gin 1110	Lys Pro Asp Gly Val Phe Gin 1115	Glu 1120
Asp	Ala Pro Val	íle His Gin Glu 1125	Met íle Gly Gly Leu Arg Asn Asn 1130 1135
Asn	Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr 1140	Ala Phe Val Leu íle Ser Leu 1145 1150	Gin
Glu	Ala Lys Asp 1155	íle Cys Glu Glu Gin Val Asn Ser Leu Pro Gly 1160 1165	Ser
íle	Thr Lys Ala 1170	Gly Asp Phe Leu 1175	Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu 1180	Gin
Arg 1185	Ser Tyr Thr 1	Val Ala íle Ala 1190	Gly Tyr Ala Leu Ala Gin Met 1195	Gly 1200
Arg	Leu Lys Gly	Pro Leu Leu Asn 1205	Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp 1210 1215
Lys	Asn Arg Trp 122C	Glu Asp Pro Gly I	Lys Gin Leu Tyr Asn Val Glu 1225 1230	Ala
Thr	Ser Tyr Ala 1235	Leu Leu Ala Leu Leu Gin Leu Lys Asp Phe Asp 1240 1245	Phe

Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gin Arg Tyr Tyr Gly Gly 1250 1255 1260

Gly Tyr 1265	Gly	Ser Thr Gin Ala 1270	Thr	Phe Met Val Phe 1275	Gin	Ala Leu Ala 1280
Gin Tyr	Gin	Lys Asp Ala Pro 1285	Asp	His Gin Glu Leu 1290	Asn	Leu Asp Val 1295
Ser Leu	Gin	Leu Pro Ser Arg 1300	Ser	Ser Lys íle Thr 1305	His	Arg íle His 1310
Trp Glu	Ser	Ala Ser Leu Leu	Arg	Ser Glu Glu Thr	Lys	Glu Asn Glu
	1315	1320	1325
Gly Phe	Thr	Val Thr Ala Glu	Gly	Lys Gly Gin Gly	Thr	Leu Ser Val
1330	1335	1340
Val Thr 1345	Met	Tyr His Ala Lys 1350	Ala	Lys Asp Gin Leu 1355	Thr	Cys Asn Lys 1360
Phe Asp	Leu	Lys Val Thr íle 1365	Lys	Pro Ala Pro Glu 1370	Thr	Glu Lys Arg 1375
Pro Gin	Asp	Ala Lys Asn Thr 1380	Met	íle Leu Glu íle 1385	Cys	Thr Arg Tyr 1390
Arg Gly	Asp	Gin Asp Ala Thr	Met	Ser íle Leu Asp	íle	Ser Met Met
	1395	1400	1405
Thr Gly	Phe	Ala Pro Asp Thr	Asp	Asp Leu Lys Gin	Leu	Ala Asn Gly
1410	1415	1420
Val Asp 1425	Arg	Tyr íle Ser Lys 1430	Tyr	Glu Leu Asp Lys 1435	Ala	Phe Ser Asp 1440
Arg Asn	Thr	Leu íle íle Tyr 1445	Leu	Asp Lys Val Ser 1450	His	Ser Glu Asp 1455
Asp Cys	Leu	Ala Phe Lys Val 1460	His	Gin Tyr Phe Asn 1465	Val	Glu Leu íle 1470
Gin Pro	Gly	Ala Val Lys Val	Tyr	Ala Tyr Tyr Asn	Leu	Glu Glu Ser
	1475	1480	1485
Cys Thr	Arg	Phe Tyr His Pro	Glu	Lys Glu Asp Gly	Lys	Leu Asn Lys
1490	1495	1500
Leu Cys 1505	Arg	Asp Glu Leu Cys 1510	Arg	Cys Ala Glu Glu 1515	Asn	Cys Phe íle 1520
Gin Lys	Ser	Asp Asp Lys Val 1525	Thr	Leu Glu Glu Arg 1530	Leu	Asp Lys Ala 1535
Cys Glu	Pro	Gly Val Asp Tyr 1540	Val	Tyr Lys Thr Arg 1545	Leu	Val Lys Val 1550
Gin Leu	Ser	Asn Asp Phe Asp	Glu	Tyr íle Met Ala	íle	Glu Gin Thr

1555 1560 1565 íle Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gin Val Gly Gin Gin Arg Thr Phe

	1570	1575	1580
íle 1585	Ser Pro íle	Lys Cys Arg Glu Ala 1590	Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys 1595 1600
His	Tyr Leu Met	Trp Gly Leu Ser Ser 1605	Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro 1610 1615
Asn	Leu Ser Tyr íle íle Gly Lys Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro 1620 1625 1630
Glu	Glu Asp Glu 1635	Cys Gin Asp Glu Glu 1640	Asn Gin Lys Gin Cys Gin Asp 1645
Leu	Gly Ala Phe 1650	Thr Glu Ser Met Val 1655	Val Phe Gly Cys Pro Asn 1660

INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 5067 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA ID. Č. 23:

CTCCTCCCCA TCCTCTCCCT CTGTCCCTCT GTCCCTCTGA CCCTGCACTG TCCCAGCACC 60

ATGGGACCCA CCTCAGGTCC CAGCCTGCTG CTCCTGCTAC TAACCCACCT CCCCCTGGCT 120

CTGGGGAGTC CCATGTACTC TATCATCACC CCCAACATCT TGCGGCTGGA GAGCGAGGAG 180

ACCATGGTGC TGGAGGCCCA CGACGCGCAA GGGGATGTTC CAGTCACTGT TACTGTCCAC 240

GACTTCCCAG GCAAAAAACT AGTGCTGTCC AGTGAGAAGA CTGTGCTGAC CCCTGCCACC 300

AACCACATGG GCAACGTCAC CTTCACGATC CCAGCCAACA GGGAGTTCAA GTCAGAAAAG 3 60

GGGCGCAACA AGTTCGTGAC CGTGCAGGCC ACCTTCGGGA CCCAAGTGGT GGAGAAGGTG 420

GTGCTGGTCA GCCTGCAGAG CGGGTACCTC TTCATCCAGA CAGACAAGAC CATCTACACC 4 80

CCTGGCTCCA CAGTTCTCTA TCGGATCTTC ACCGTCAACC ACAAGCTGCT ACCCGTGGGC 54 0

CGGACGGTCA TGGTCAACAT TGAGAACCCG GAAGGCATCC CGGTCAíkGCA GGACTCCTTG 600

TCTTCTCAGA ACCAGCTTGG CGTCTTGCCC TTGTCTTGGG ACATTCCGGA ACTCGTCAAC 660

ATGGGCCAGT GGAAGATCCG AGCCTACTAT GAAAACTCAC CACAGCAGGT CTTCTCCACT 720

GAGTTTGAGG TGAAGGAGTA CGTGCTGCCC AGTTTCGAGG TCATAGTGGA GCCTACAGAG 780

ÁAATTCTACT ÁCAŤCŤATÁA CGAGAAGGGC CTGGAGGTCA CCATCACCGC. CAGGTTCCTC 840

TACGGGAAGA	AAGTGGAGGG	AACTGCCTTT	GTCATCTTCG	GGATCCAGGA	TGGCGAACAG	900
AGGATTTCCC	TGCCTGAATC	CCTCAAGCGC	ATTCCGATTG	AGGATGGCTC	GGGGGAGGTT	960
GTGCTGAGCC	GGAAGGTACT	GCTGGACGGG	GTGCAGAACC	CCCGAGCAGA	AGACCTGGTG	1020
GGGAAGTCTT	TGTACGTGTC	TGCCACCGTC	ATCTTGCACT	CAGGCAGTGA	CATGGTGCAG	1080
GCAGAGCGCA	GCGGGATCCC	CATCGTGACC	TCTCCCTACC	AGATCCACTT	CACCAAGACA	1140
CCCAAGTACT	TCAAACCAGG	AATGCCCTTT	C-ACCTCATGG	TGTTCGTGAC	GAACCCTGAT	1200
GGCTCTCCAG	CCTACCGAGT	CCCCGTGGCA	GTCCAGGGCG	AGGACACTGT	GCAGTCTCTA	1260
ACCCAGGGAG	ATGGCGTGGC	CAAACTCAGC	ATCAACACAC	ACCCCAGCCA	GAAGCCCTTG	1320
AGCATCACGG	TGCGCACGAA	GAAGCAGGAG	CTCTCGGAGG	CAGAGCAGGC	TACCAGGACC	1380
ATGCAGGCTC	TGCCCTACAG	CACCGTGGGC	AACTCCAACA	ATTACCTGCA	TCTCTCAGTG	1440
CTACGTACAG	AGCTCAGACC	CGGGGAGACC	CTCAACGTCA	ACTTCCTCCT	GCGAATGGAC	1500
CGCGCCCACG	AGGCCAAGAT	CCGCTACTAC	ACCTACCTGA	TCATGAACAA	GGGCAGGCTG	1560
TTGAAGGCGG	GACGCCAGGT	GCGAGAGCCC	GGCCAGGACC	TGGTGGTGCT	GCCCCTGTCC	1620
ATCACCACCG	ACTTCATCCC	TTCCTTCCGC	CTGGTGGCGT	ACTACACGCT	GATCGGTGCC	1680
AGCGGCCAGA	GGGAGGTGGT	GGCCGACTCC	GTGTGGGTGG	ACGTCAAGGA	CTCCTGCGTG	1740
GGCTCGCTGG	TGGTAAAAAG	CGGCCAGTCA	GAAGACCGGC	AGCCTGTACC	TGGGCAGCAG	1800
ATGACCCTGA	AGATAGAGGG	TGACCACGGG	GCCCGGGTGG	TACTGGTGGC	CGTGGACAAG	1860
GGCGTGTTCG	TGCTGAATAA	GAAGAACAAA	CTGACGCAGA	GTAAGATCTG	GGACGTGGTG	1920
GAGAAGGCAG	ACATCGGCTG	CACCCCGGGC	AGTGGGAAGG	ATTACGCCGG	TGTCTTCTCC	1980
GACGCAGGGC	TGACCTTCAC	GAGCAGCAGT	GGCCAGCAGA	CCGCCCAGAG	GGCAGAACTT	2040
CAGTGCCCGC	AGCCAGCCGC	CCGCCGACGC	CGTTCCGTGC	AGCTCACGGA	GAAGCGAATG	2100
GACAAAGTCG	GCAAGTACCC	CAAGGAGCTG	CGCAAGTGCT	GCGAGGACGG	CATGCGGGAG	2160
AACCCCATGA	GGTTCTCGTG	CCAGCGCCGG	ACCCGTTTCA	TCTCCCTGGG	CGAGGCGTGC	2220
AAGAAGGTCT	TCCTGGACTG	CTGCAACTAC	ATCACAGAGC	TGCGGCGGCA	GCACGCGCGG	2280
GCCAGCCACC	TGGGCCTGGC	CAGGAGTAAC	CTGGATGAGG	ACATCATTGC	AGAAGAGAAC	2340
ATCGTTTCCC	GAAGTGAGTT	CCCAGAGAGC	TGGCTGTGGA	ACGTTGAGGA	CTTGAAAGAG	2400
CCACCGAAAA	ATGGAATCTC	TACGAAGCTC	ATGAATATAT	TTTTGAAAGA	CTCCATCACC	2460
ACGTGGGAGA	TTCTGGCTGT	GAGCATGTCG	GACAAGAAAG	GGATCTGTGT	GGCAGACCCC	2520
TTCGAGGTCA	CAGTAATGCA	GGACTTCTTC	ATCGACCTGC	GGCTACCCTA	CTCTGTTGTT	2580

CGAAACGAGC	AGGTGGAAAT	CCGAGCCGTT	CTCTACAATT	ACCGGCAGAA	CCAAGAGCTC	2640
AAGGTGAGGG	TGGAACTACT	CCACAATCCA	GCCTTCTGCA	GCCTGGCCAC	CACCAAGAGG	2700
CGTCACCAGC	AGACCATAAC	CATCCCCCCC	AAGTCCTCGT	TGTCCGTTCC	ATATGTCATC	2760
GTGCCGCTAA	AGACCGGCCT	GCAGGAAGTG	GAAGTCAAGG	CTGCTGTCTA	CCATCATTTC	2820
ATCAGTGACG	GTGTCAGGAA	GTCCCTGAAG	GTCGTGCCGG	AAGGAATCAG	AATGAACAAA	2880
ACTGTGGCTG	TTCGCACCCT	GGATCCAGAA	CGCCTGGGCC	GTGAAGGAGT	GCAGAAAGAG	2940
GACATCCCAC	CTGCAGACCT	CAGTGA.CCAA	GTCCCGGACA	CCGAGTCTGA	GACCAGAATT	3000
CTCCTGCAAG	GGACCCCAGT	GGCCCAGATG	ACAGAGGATG	CCGTCGACGC	GGAACGGCTG	3060
AAGCACCTCA	TTGTGACCCC	CTCGGGCTGC	GGGGAACAGA	ACATGATCGG	CATGACGCCC	3120
ACGGTCATCG	CTGTGCATTA	CCTGGATGAA	ACGGAGCAGT	GGGAGAAGTT	CGGCCTAGAG	3180
AAGCGGCAGG	GGGCCTTGGA	GCTCATCAAG	AAGGGGTACA	CCCAGCAGCT	GGCCTTCAGA	3240
CAACCCAGCT	CTGCCTTTGC	GGCCTTCGTG	AAACGGGCAC	CCAGCACCTG	GCTGACCGCC	3300
TACGTGGTCA	AGGTCTTCTC	TCTGGCTGTC	AACCTCATCG	CCATCGACTC	CCAAGTCCTC	3360
TGCGGGGCTG	TTAAATGGCT	GATCCTGGAG	AAGCAGAAGC	CCGACGGGGT	CTTCCAGGAG	3420
GATGCGCCCG	TGATACACCA	AGAAATGATT	GGTGGATTAC	GGAACAACAA	CGAGAAAGAC	3480
ATGGCCCTCA	CGGCCTTTGT	TCTCATCTCG	CTGCAGGAGG	CTAAAGATAT	TTGCGAGGAG	3540
CAGGTCAACA	GCCTGCCAGG	CAGCATCACT	AAAGCAGGAG	ACTTCCTTGA	AGCCAACTAC	3600
ATGAACCTAC	AGAGATCCTA	CACTGTGGCC	ATTGCTGGCT	ATGCTCTGGC	CCAGATGGGC	3660
AGGCTGAAGG	GGCCTCTTCT	TAACAAATTT	CTGACCACAG	CCAAAGATAA	GAACCGCTGG	3720
GAGGACCCTG	GTAAGCAGCT	CTACAACGTG	GAGGCCACAT	CCTATGCCCT	CTTGGCCCTA	3780
CTGCAGCTAA	AAGACTTTGA	CTTTGTGCCT	CCCGTCGTGC	GTTGGCTCAA	TGAACAGAGA	3840
TACTACGGTG	GTGGCTATGG	CTCTACCCAG	GCCACCTTCA	TGGTGTTCCA	AGCCTTGGCT	3900
CAATACCAAA	AGGACGCCCC	TGACCACCAG	GAACTGAACC	TTGATGTGTC	CCTCCAACTG	3960
CCCAGCCGCA	GCTCCAAGAT	CACCCACCGT	ATCCACTGGG	AATCTGCCAG	CCTCCTGCGA	4020
TCAGAAGAGA	CCAAGGAAAA	TGAGGGTTTC	ACAGTCACAG	CTGAAGGAAA	AGGCCAAGGC	4080
ACCTTGTCGG	TGGTGACAAT	GTACCATGCT	AAGGCCAAAG	ATCAACTCAC	CTGTAATAAA	4140
TTCGACCTCA	AGGTCACCAT	AAAACCAGCA	CCGGAAACAG	AAAAGAGGCC	TCAGGATGCC	4200
AAGAACACTA	TGATCCTTGA	GATCTGTACC	AGGTACCGGG	GAGACCAGGA	TGCCACTATG	4260
TCTATATTGG	ACATATCCAT	GATGACTGGC	TTTGCTCCAG	ACACAGATGA	CCTGAAGCAG	4320
CTGGCCAATG	GTGTTGACAG	ATACATCTCC	AAGTATGAGC	TGGACAAAGC	CTTCTCCGAT	4380

AGGAACACCC	TCATCATCTA	CCTGGACAAG	GTCTCACACT	CTGAGGATGA	CTGTCTAGCT	4440
TTCAAAGTTC	ACCAATACTT	TAATGTAGAG	CTTATCCAGC	CTGGAGCAGT	CAAGGTCTAC	4500
GCCTATTACA	ACCTGGAGGA	AAGCTGTACC	CGGTTCTACC	ATCCGGAAAA	GGAGGATGGA	4560
AAGCTGAACA	AGCTCTGCCG	TGATGAACTG	TGCCGCTGTG	CTGAGGAGAA	TTGCTTCATA	4620
CAAAAGTCGG	ATGACAAGGT	CACCCTGGAA	GAACGGCTGG	ACAAGGCCTG	TGAGCCAGGA	4680
GTGGACTATG	TGTACAAGAC	CCGACTGGTC	AAGGTTCAGC	TGTCCAATGA	CTTTGACGAG	4740
TACATCATGG	CCATTGAGCA	GACCATCAAG	TCAGGCTCGG	ATGAGGTGCA	GGTTGGACAG	4800
CAGCGCACGT	TCATCAGCCC	CATCAAGTGC	AGAGAAGCCC	TGAAGCTGGA	GGAGAAGAAA	4860
CACTACCTCA	TGTGGGGTCT	CTCCTCCGAT	TTCTGGGGAG	AGAAGCCCAA	CCTCAGCTAC	4920
atcatcggga	AGGACACTTG	GGTGGAGCAC	TGGCCTGAGG	AGGACGAATG	CCAAGACGAA	4980
GAGAACCAGA	AACAATGCCA	GGACCTCGGC	GCCTTCACCG	AGAGCATGGT	TGTCTTTGGG	5040

TGCCCCAACT GACCACACCC CCATTCC

Claims (50)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Natívny protein komplementovej dráhy, ktorý je modifikovaný tak, že je schopný vytvárať C3 konvertázu rezistentnú voči regulačnému zníženiu aktivity.
2. 2. Protein podľa nároku 1, ktorý je modifikovaný ľudským proteínom.
3. 3. Protein podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je v porovnaní s natívnym proteínom odolnejší voči štiepeniu faktorom I.
4. 4. Protein podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 3, ktorý je modifikovaný proteínom C3.
5. 5. Protein podľa nároku 4, ktorý je modifikovaný náhradou buď arginínu 1303 alebo arginínu 1320 alebo oboch za inú aminokyselinu.
6. 6. Protein podlá nároku 5, v ktorom sú arginín 1320, arginín 1303 alebo oba zamenené za glutamín, tyrozín, cystín, tryptofán, kyselinu glutámovú alebo glycín.
7. 7. Protein podľa nároku 5, v ktorom je arginín 1320 nahradený glutamínom.
8. 8. Protein podľa lubovolného z nárokov 6 a 7, v ktorom je arginín 1303 nahradený kyselinou glutámovou, glycínom alebo glutamínom.
9. 9. Protein podlá ľubovoľného z predošlých nárokov, ktorý má v porovnaní s natívnym ludským proteínom C3 zníženú citlivosť na faktor H a/alebo faktor I, pričom má tento proteín v porovnaní s natívnym ľudským proteínom C3 jednu alebo viac aminokyselinových zámien v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinovým zvyškom 752 až 754 a/alebo aminokyselinovým zvyškom 758 až 780 natívneho ľudského proteínu C3.
10. 10. Proteín podľa nároku aminokyselinových zámien

    9, v ktorom je spočíva vo jedna alebo viac výmene kyslého aminokyselinového zvyšku za neutrálny aminokyselinový zvyšok.
11. 11. Proteín podľa nároku 9 alebo 10, v ktorom je uvedená zámena aminokyselín zámenou Asp-Glu-Asp za Gly-Ser-Gly.
12. 12. Proteín podía ľubovoľného z predošlých nárokov, v ktorom sú zámeny aminokyseliny zodpovedajúce v ludskom natívnom proteíne C3 aminokyselinám na pozíciách 1427, 1431 a/alebo 1433.
13. 13. Proteín podľa ľubovoľného z predošlých nárokov, ktorý obsahuje jednu alebo viac mutácií v aminokyselinách zodpovedajúcich v ludskom natívnom proteíne C3 aminokyselinovým zvyškom 992 až 1005 (EDAVDAERLKHLIV) , takže jeho produkty C3b a C3i alebo od nich odvodené C3 konvertázy sú rezistentné voči komplement inhibujúcej aktivite faktora H.
14. 14. Proteín podlá nároku 13, ktorý obsahuje jednu alebo viac mutácií v aminokyselinách zodpovedajúcich v ludskom natívnom proteíne C3 aminokyselinovým zvyškom 992 (E), 993 (D), 996 (D), 997 (A), 998 (E), 999 (R), 1000 (L), 1001 (K), 1002 (H), 1005 (V).
15. 15. Proteín podľa nároku 14, ktorý obsahuje jednu alebo viac z nasledovných mutácií: E992S, D993A, D996S, A997Q, E998S a R999G,

    L1000M, K1001N, H1002I a V1005H.
16. 16. Protein podľa ľubovoľného z predošlých nárokov, ktorý obsahuje jednu alebo viac mutácii v aminokyselinách zodpovedajúcich v ľudskom natívnom proteíne C3 aminokyselinovým zvyškom 1152 až 1155 (QEAK) , takže jeho produkty C3b a C3i alebo od nich odvodené C3 konvertázy sú rezistentné voči komplement inhibujúcej aktivite faktora H.
17. 17. Protein podía nároku 16, ktorý obsahuje jednu alebo viac mutácií v aminokyselinách zodpovedajúcich v ludskom natívnom proteíne C3 zvyškom 1152 (Q), 1153 (E) a 1155 (K).
18. 18. Protein podľa nároku 17, ktorý obsahuje jednu alebo viac z nasledovných mutácií: Q1152R, E1153K a K1155F.
19. 19. Protein podía ľubovoľného z nárokov 13 až 18, ktorý je rezistentný voči komplement inhibujúcej aktivite CR1, MCP a/alebo DAF.
20. 20. Protein podľa ľubovoľného z predošlých nárokov, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových delécií, substitúcií alebo inzercií v miestach zodpovedajúcich aminokyselinám 1546 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3, pričom tento protein má vzhladom na natívny ľudský protein C3 zníženú citlivosť na faktor H a/alebo faktor I.
21. 21. Protein podľa nároku 20, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových delécií v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1546 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3.
22. 22. Protein podľa nároku 20 alebo 21, ktorý má deléciu zahŕňajúcu všetky aminokyseliny v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1546 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3.
23. 23. Proteín podľa nároku 20, ktorý má jednu alebo viac zmenených aminokyselín v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1546 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3.
24. 24. Proteín podľa nároku 23, ktorý má v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1546 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3 aminokyseliny vzniknuté mutáciou s posunom čítacieho rámca v DNA kódujúcej natívny ľudský proteín C3.
25. 25. Proteín podľa ľubovoľného z nárokov 20 až 24, ktorý obsahuje jednu alebo viac aminokyselinových delécií, substitúcií alebo inzercií v aminokyselinách zodpovedajúcich v ľudskom natívnom proteíne C3 aminokyselinovým zvyškom 1636 až 1663, pričom tento proteín má vzhľadom na natívny ľudský proteín C3 zníženú citlivosť na faktor H a/alebo I.
26. 26. Proteín podľa nároku 25, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových delécií v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1636 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3.
27. 27. Proteín podľa nároku 25 alebo 26, ktorý má deléciu zahŕňajúcu všetky aminokyseliny v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1546 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3.
28. 28. Proteín podľa nároku 25, ktorý má v oblasti zodpovedajúcej aminokyselinám 1636 až 1663 natívneho ľudského proteínu C3 jednu alebo viac iných aminokyselín.
29. 29. Proteín podľa nároku 25, ktorý obsahuje jednu alebo viac aminokyselinových delécií, substitúcií alebo inzercií v aminokyselinách zodpovedajúcich v ľudskom natívnom proteíne C3 aminokyselinovým zvyškom 1649 až 1660, pričom tento proteín má vzhľadom na natívny ľudský proteín C3 zníženú citlivosť na faktor H a/alebo I.

    100
30. 30. Proteín podía ľubovoľného z predošlých nárokov, ktorý má jednu alebo viac aminokyselinových delécií, substitúcií alebo inzercií v aminokyselinách zodpovedajúcich aminokyselinám 954 a/alebo 955 natívneho ľudského proteínu C3, a ktorý má v tomto mieste zníženú citlivosť na štiepenie sprostredkované faktorom I, ktoré je závislé od prítomnosti kofaktora, napríklad CR1 alebo faktora H.
31. 31. Proteín podía nároku 30, ktorý má v mieste zodpovedajúcom aminokyseline 954 ľudského proteínu C3 inú aminokyselinu než ľudský proteín C3, pričom tento proteín má v tomto mieste zníženú citlivosť na štiepenie sprostredkované faktorom I, ktoré je závislé od prítomnosti kofaktora, napríklad CR1 alebo faktora H.
32. 32. Proteín podía nároku 31, v ktorom je uvedenou aminokyselinou kyselina glutámová, pričom tento proteín má v tomto mieste zníženú citlivosť na štiepenie sprostredkované faktorom I, ktoré je závislé od prítomnosti kofaktora, napríklad CRl alebo faktora H.
33. 33. Proteín podía nároku 30, ktorý má v miestach zodpovedajúcich aminokyselinám 954 a 955 ludského proteínu C3 glutamín a glycín, pričom tento proteín má v tomto mieste zníženú citlivosť na štiepenie sprostredkované faktorom I, ktoré je závislé od prítomnosti kofaktora, napríklad CRl alebo faktora H.
34. 34. Proteín podía nároku 30, ktorý má v mieste zodpovedajúcom aminokyseline 955 ludského proteínu C3 inú aminokyselinu než ľudský proteín C3, pričom tento proteín má v tomto mieste zníženú citlivosť na štiepenie sprostredkované faktorom I, ktoré je závislé od prítomnosti kofaktora, napríklad CRl alebo faktora H.
35. 35. Fragment alebo variant proteínu podía ľubovoľného z predošlých nárokov, pričom má tento fragment alebo variant C3 konvertázovú aktivitu a je zároveň rezistentný voči komplement inhibujúcej aktivite faktora H, faktora I, CRl, MCP a/alebo DAF.

    101
36. 36. Sekvencia DNA kódujúca proteín podlá ľubovoľného z nárokov 1 až 34 alebo jeho fragment či variant podľa nároku 35.
37. 37. DNA konštrukt (napríklad vektor) obsahujúci sekvenciu DNA podľa nároku 36.
38. 38. Terapeutické použitie proteínu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 34 alebo jeho fragmentu či variantu podľa nároku 35.
39. 39. Konjugát, ktorý obsahuje proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 34 alebo jeho fragment či variant podľa nároku 35 naviazaný na špecifickú väzbovú skupinu.
40. 40. Konjugát podľa nároku 39, v ktorom špecifickou väzbovou skupinou je špecifický väzbový proteín.
41. 41. Konjugát podľa nároku 40, v ktorom je špecifickým väzbovým proteínom je protilátka alebo jej antigén viažuci fragment.
42. 42. Použitie proteínu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 34 alebo jeho fragmentu či variantu podľa nároku 35, alebo konjugátu podľa ľubovoľného z nárokov 39 až 41 na výrobu liečiva vhodného na znižovanie koncentrácií proteínov komplementovej kaskády.
43. 43. Použitie podľa nároku 42, vyznačujúce sa tým, že liečivo sa použije na prevenciu odmietnutia cudzorodej látky.
44. 44. Použitie podľa nároku 42, vyznačujúce sa tým, že liečivo sa použije na lokalizáciu a/alebo amplifikáciu endogénnej konverzie komplementových proteínov a na ich depozíciu na špecifickom mieste.

    102
45. 45. Farmaceutická kompozícia, ktorá obsahuje jeden alebo viac proteínov definovaných v ľubovoľnom z nárokov 1 až 34, alebo ich fragmenty či varianty podľa nároku 35, alebo konjugáty podľa ľubovoľného z nárokov 39 až 41 spolu s farmaceutický prijateľným nosičom alebo excipientom.
46. 46. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 45 na použitie pri znižovaní koncentrácií proteínov komplementovej kaskády.
47. 47. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 45 na použitie pri prevencii odmietnutia cudzorodej látky.
48. 48. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 45 na použitie pri lokalizácii a/alebo amplifikácii endogénnej konverzie komplementových proteínov a na ich depozíciu na špecifickom mieste.
49. 49. Spôsob zníženia koncentrácie proteínov komplementovej kaskády v organizme cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie proteínu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 34 alebo jeho fragmentu či variantu podľa nároku 35, alebo konjugátu podľa ľubovoľného z nárokov 39 až 41 tomuto cicavcovi.
50. 50. Spôsob podlá nároku 49, vyznačujúci sa tým, že na podanie sa použije farmaceutická kompozícia podľa nároku 45.