RU2549468C2 - Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека - Google Patents
Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2549468C2 RU2549468C2 RU2013137390/15A RU2013137390A RU2549468C2 RU 2549468 C2 RU2549468 C2 RU 2549468C2 RU 2013137390/15 A RU2013137390/15 A RU 2013137390/15A RU 2013137390 A RU2013137390 A RU 2013137390A RU 2549468 C2 RU2549468 C2 RU 2549468C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- convertase
- lysis
- degree
- activity
- experimental
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии. Cпособ определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека осуществляется путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением буфера, содержащего 10 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, определяют степень лизиса эритроцитов в контрольной пробе. Опытную пробу дополнительно инкубируют в течение 30 мин при 37°C, определяют степень лизиса, рассчитывают активность C3-конвертазы как разность между опытной и контрольной пробами, при разнице более 10% оценивают как аутоиммунное патологическое состояние. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, может служить специфическим маркером для иммуномодулирующей терапии, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний. 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека.
Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом, и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.
Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 30 компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе ИК, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки [Rittirsch D., Redl Н., and Huber-Lang М. Role of Complement in Multiorgan Failure // Clinical and Developmental Immunology. - 2012; 2012:962927. doi: 10.1155/2012/962927].
Известны три пути активации системы комплемента: классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся способом образования С3-конвертаз. Субстратом C3-конвертаз всех трех путей активации системы комплемента является компонент C3, при расщеплении которого образуются C3a и C3b. Присоединение дополнительных молекул C3b к C3-конвертазам приводит к образованию C5-конвертаз, которые запускают реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).
Классический путь является Ca2+/Mg2+-зависимым каскадом, который в норме запускается иммунными комплексами, активирующими C1, первый компонент комплемента, содержащий одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. Активация C1 в результате связывания C1q-субкомпонента с Fc-фрагментом иммуноглобулинов иммунного комплекса и образования активных протеиназ C1r и C1s инициирует ферментативный каскад комплемента, приводящий к образованию C3-конвертазы классического пути (C4b, C2a) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с].
Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (EA); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента (CH50) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% стандартной суспензии EA. В сыворотке здоровых доноров обычно содержится 20-40 гемолитических единиц комплемента [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/ Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с].
Однако существенным недостатком этого метода является низкая информативность и, как следствие, отсутствие интереса со стороны практического здравоохранения в лабораторной диагностике.
Известен способ определения активности C3-конвертазы (C4b2a) классического пути активации системы комплемента, основанный на гемолизе сенсибилизированных эритроцитов барана (EA) с использованием 2 разных сывороток в качестве источников компонентов комплемента: C4b2a генерируется на EA с использованием компонентов C1, C4 и C2 из первой сыворотки с последующей второй реакцией, приводящей к гемолизу с участием компонентов C3-C9 из второй сыворотки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) [Miller Е.С., Chase N.M., Densen P., et al. Autoantibody stabilization of the classical pathway C3 convertase leading to C3 deficiency and Neisserial sepsis: C4 nephritic factor revisited // Clinical Immunology. - 2012. - V.145. - P.241-250].
Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что используются две разные сыворотки, гетерологичные антитела для сенсибилизации эритроцитов барана.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности метода за счет исследования стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление.
Указанный результат достигается тем, что лизис эритроцитов барана проводят 0,8% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°C в течение 10 мин, добавляют в пробы буфер, содержащий 10 мМ ЭДТУК, в контрольные пробы добавляют 0,75 М NaCl, центрифугируют в течение 10 мин при 200 об/мин и определяют степень лизиса спектрофотометрически при длине волны 405 нм в супернатанте. Опытные пробы после добавления буфера, содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТУК), инкубируют дополнительно в течение 30 мин при 37°C. После инкубации степень лизиса определяют как в контрольных пробах. При разности степени лизиса между опытной и контрольной пробами более 10% оценивают как стабилизацию C3-конвертазы классического пути комплемента в сыворотке крови обследуемого.
Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет степени ингибирования лизиса. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×108 кл/мл) (ЭБ) в вероналовом солевом буфере (VBS), содержащем 0,5 мМ MgCl2 и 0,15М CaCl2 (VBS2+). Время проведения экспресс-способа 40 мин (в прототипе - 80 мин).
Пример 1. Определение оптимальной концентрации буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК для полного ингибирования активации системы комплемента.
К 200 мкл суспензии эритроцитов барана (ЭБ) (1,5×108 кл/мл) добавляли 40 мкл разведенной 1:9 пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 20-100 мкл VBS-E (интервал концентрации 0,4-2,0 ммоль/л ЭДТУК в системе), доводили объем до 500 мкл буфером VBS2+и инкубировали 30 мин при 37°C. Одновременно ставили контроль на спонтанный (200 мкл ЭБ+200 мкл VBS2+) и полный лизис ЭБ (200 мкл ЭБ+200 мкл H2O). После инкубации останавливали реакцию гемолиза добавлением 2,5 мл охлажденного 0,15 М раствора NaCl, центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин и определяли степень гемолиза по величине A405 супернатанта. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:
У(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,
где: H, R и X - величины оптической плотности A405 супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса ЭБ и в опытной пробе, соответственно.
Степень ингибирования (СИ) определяли как разность показателей лизиса в контрольной пробе и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации VBS-ЭДТУК, по формуле:
СИ(%)=(100-У),
где: 100 - степень лизиса в контрольной пробе, У - степень лизиса в опытных пробах. Полученные данные приведены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, лизис эритроцитов барана ингибируется дозозависимо при повышении концентрации ЭДТУК в гемолитической системе. Таким образом, при концентрации ЭДТУК в системе выше 1,4 мМоль/л наблюдается полное ингибирование гемолитической активности системы комплемента за счет хелатирования ионов кальция и магния.
Пример 2. Определение активности C3-конвертазы.
Определение активности C3-конвертазы классического пути основано на том, что после 10 мин инкубации 200 мкл (1,5×108 кл/мл) эритроцитов барана с 4 мкл сыворотки крови человека в конечном объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS2+, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК. В контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса [У(контроль),%], как описано выше. Опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°C. После инкубации определяют степень лизиса [У(опыт),%]. Активность C3-конвертазы определяют как разность между степенью лизиса в опытной и контрольной пробах. Проведены исследования активности C3-конвертазы в сыворотке крови 20 доноров. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, в 5 сыворотках активность C3-конвертазы была больше 10% и в среднем составила (13,8±2,0)%. В оставшихся 15 пробах среднее значение активности С3-конвертазы составило в среднем (3,8±1,9)%. Известно, что период полураспада С3-конвертазы составляет несколько минут, и при добавлении буфера, содержащего ЭДТУК, при связывании ионов CA2+ и Mg2+ полностью ингибируется активация комплемента по всем трем путям активации. Активность C3-конвертазы на уровне (3,8±1,9)% согласуется с литературными данными. Повышенная почти в 4 раза активность C3-конвертазы в 5 сыворотках свидетельствует о стабилизации C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента. Чаще всего это связано с наличием аутоантител к активированной форме компонента C4, C4b. Данный эффект стабилизации C3-конвертазы может наблюдаться также и при дефиците фактора I, который является естественным ингибитором C3-конвертазы классического пути активации комплемента.
Таким образом, способ определения стабилизации C3-конвертазы позволяет выявлять скрытый аутоиммунный процесс у относительно здоровых людей, который впоследствии может приводить к патологии почек, иммунодефициту по компоненту C3, а при тяжелых случаях - к сепсису.
Пример 3. Определение стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента в сыворотках крови беременных женщин.
Предлагаемым способом были тестированы сыворотки крови 18 беременных женщин, пациентов отделения патологии, и общая активность системы комплемента в этих же сыворотках, как описано в работе Шойбонов Б.Б. и др. Коэффициент эффекторной функции антител (КЭФГА) - новый показатель состояния гуморального иммунитета // Патогенез. - 2011. - Т.9, №1, с.с.43-49. Кратко: 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика, (ЭБ-АК) (1,5×108 кл/мл) инкубировали с разбавленной сывороткой крови человека в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS (концентрация сыворотки 0,4%). Одновременно ставили контроль на спонтанный гемолиз ЭБ-АК (200 мкл ЭБ-АК+300 мкл VBS2+) и контроль на полный лизис (200 мкл ЭБ-АК+300 мкл H2O). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37°C. После инкубации в пробы добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли степень гемолиза по величине A412 супернатанта. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, общая активность системы комплемента была снижена в 6-ти (35%) сыворотках из 17 тестированных, причем в этих же сыворотках выявлена повышенная активность C3-конвертазы классического пути активации комплемента. Только в сыворотке №13 повышенная активность C3-конвертазы не сопровождалась снижением общей гемолитической активности системы комплемента. Возможно, это связано либо с большими компенсаторными возможностями, либо же с более ранним выявлением аутоиммунного процесса в организме данного человека.
Таким образом, разработанная тест-система выявляет в 41% случаев скрытые аутоиммунные нарушения у беременных женщин. Обнаруженный факт стабилизации C3-конвертазы у беременных женщин может служить прогностическим показателем аутоиммунной природы ожирения в послеродовом периоде. Установлено, что при усиленном распаде компонента C3 образуются опсонин (C3b) и анафилотоксин (C3a). При инактивации анафилотоксина под действием карбоксипептидазы N образуется молекула C3adezArg, представляющая собой белок, стимулирующий ацилирование, т.е. стимулируется синтез нейтральных жиров.
Предлагаемый способ по сравнению с известными имеет преимущества, которые заключаются в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 40 минут, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов.
Таблица 1 | |||||||||
Ингибирование лизиса эритроцитов барана 0,8% пулированной сывороткой крови человека буфером, содержащим 10 мМ ЭДТУК | |||||||||
ЭДТУК в гемсистеме, мМ | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | 1,2 | 1,4 | 1,8 | 2,0 | 0 |
СИ (%) | 3 | 7 | 14 | 17 | 76 | 100 | 100 | 100 | 0 |
Таблица 2 | |||
Активность C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента в сыворотках крови доноров | |||
№ сыворотки | У(опыт), % лизиса | У(контроль), % лизиса | Активность C3-конвертазы, % |
1 | 72 | 60 | 12 |
2 | 12 | 10 | 2 |
3 | 49 | 36 | 13 |
4 | 89 | 77 | 12 |
5 | 7 | 3 | 4 |
6 | 12 | 10 | 2 |
7 | 11 | 5 | 6 |
8 | 8 | 4 | 4 |
9 | 13 | 10 | 3 |
10 | 15 | 13 | 2 |
11 | 18 | 15 | 3 |
12 | 90 | 84 | 6 |
13 | 12 | 13 | 1 |
14 | 53 | 37 | 16 |
15 | 16 | 14 | 2 |
16 | 16 | 21 | 5 |
17 | 10 | 3 | 7 |
18 | 81 | 77 | 4 |
19 | 57 | 41 | 16 |
20 | 13 | 7 | 6 |
M±m | 6,3±4,8 |
Таблица 3 | ||
Активность C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин | ||
№ сыворотки | Активность СК, % лизиса | Активность C3-конвертазы, % |
1 | 39 | 12 |
2 | 43 | 18 |
3 | 75 | 9 |
4 | 80 | 4 |
5 | 86 | 5 |
6 | 68 | 4 |
7 | 34 | 16 |
8 | 41 | 12 |
9 | 45 | 15 |
10 | 39 | 10 |
11 | 53 | 6 |
12 | 77 | 7 |
13 | 69 | 12 |
14 | 65 | 7 |
15 | 60 | 6 |
16 | 67 | 8 |
17 | 62 | 8 |
M±m | 59±16 | 9,4±4,2 |
Claims (1)
- Способ определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента путем проведения в контрольной и опытной пробах реакции лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека при температуре 37,0±0,5°C с последующим выявлением лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что лизис эритроцитов барана проводят 0,8% сывороткой крови человека в течение 10 мин, останавливают реакцию добавлением буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК, определяют степень лизиса эритроцитов в контрольной пробе, опытную пробу дополнительно инкубируют в течение 30 мин при 37°C и определяют степень лизиса эритроцитов, а активность C3-конвертазы рассчитывают как разность между степенями лизиса в опытной и контрольной пробах, при этом разность более 10% оценивают как аутоиммунное патологическое состояние.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013137390/15A RU2549468C2 (ru) | 2013-08-09 | 2013-08-09 | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013137390/15A RU2549468C2 (ru) | 2013-08-09 | 2013-08-09 | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013137390A RU2013137390A (ru) | 2015-02-20 |
RU2549468C2 true RU2549468C2 (ru) | 2015-04-27 |
Family
ID=53281976
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013137390/15A RU2549468C2 (ru) | 2013-08-09 | 2013-08-09 | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2549468C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2666957C1 (ru) * | 2017-09-12 | 2018-09-13 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2009496C1 (ru) * | 1989-10-11 | 1994-03-15 | Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии | Способ прогнозирования гнойно-воспалительных заболеваний у новорожденных |
US6268485B1 (en) * | 1996-03-07 | 2001-07-31 | Imutran Limited | Down-regulation resistant C3 convertase |
US20080234191A1 (en) * | 2004-04-30 | 2008-09-25 | Carl-Wilhelm Vogel | Human complement C3 derivates with cobra venom factor-like function |
RU2484097C2 (ru) * | 2006-04-03 | 2013-06-10 | Омерос Корпорейшен | Способ лечения заболеваний, связанных с masp-2-зависимой активацией комплемента (варианты) |
-
2013
- 2013-08-09 RU RU2013137390/15A patent/RU2549468C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2009496C1 (ru) * | 1989-10-11 | 1994-03-15 | Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии | Способ прогнозирования гнойно-воспалительных заболеваний у новорожденных |
US6268485B1 (en) * | 1996-03-07 | 2001-07-31 | Imutran Limited | Down-regulation resistant C3 convertase |
US20080234191A1 (en) * | 2004-04-30 | 2008-09-25 | Carl-Wilhelm Vogel | Human complement C3 derivates with cobra venom factor-like function |
RU2484097C2 (ru) * | 2006-04-03 | 2013-06-10 | Омерос Корпорейшен | Способ лечения заболеваний, связанных с masp-2-зависимой активацией комплемента (варианты) |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MILLER Е.С. et al. Autoantibody stabilization of the classical pathway C3 convertase leading to C3 deficiency and Neisserial sepsis: C4 nephritic factor revisited, Clinical Immunology, 2012, V.145, p.241-250. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2666957C1 (ru) * | 2017-09-12 | 2018-09-13 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013137390A (ru) | 2015-02-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mikes et al. | Elevated plasma neutrophil elastase concentration is associated with disease activity in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura | |
RU2666957C1 (ru) | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека | |
Zhang et al. | Analysis of immunoglobulin, complements and CRP levels in serum of captive northern pig-tailed macaques (Macaca leonina) | |
Luterotti et al. | Contribution to diagnostics/prognostics of tuberculosis in children. II. Indicative value of metal ions and biochemical parameters in serum | |
RU2549468C2 (ru) | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека | |
Zhao et al. | Downregulation of JKAP is correlated with elevated disease risk, advanced disease severity, higher inflammation, and poor survival in sepsis | |
Coovadia et al. | Alterations in immune responsiveness in acute measles and chronic post-measles chest disease | |
RU2213976C2 (ru) | Способ оценки агрегационных свойств тромбоцитов | |
Çekmez et al. | Diagnostic value of 25-hydroxyvitamin D level and new cytokines in neonatal sepsis | |
SAYAN et al. | Serum interleukin-8, CA-125 levels, neutrophil-to-lymphocyte ratios, and combined markers in the diagnosis of endometriosis | |
RU2704121C1 (ru) | Скрининг-тест для определения функциональной активности классического пути системы комплемента | |
RU2530627C2 (ru) | Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах | |
Kibrick et al. | A comparative study of the serum albumin-globulin ratio, the cephalin-cholesterol flocculation, and the thymol turbidity tests for liver function | |
RU2452962C2 (ru) | Способ и тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов | |
Van Dreden et al. | Procoagulant phospholipids and tissue factor activity in cerebrospinal fluid from patients with intracerebral haemorrhage | |
Jabber et al. | Assessment of Some Biomarkers Related with Recurrent Miscarriages in Iraq. | |
RU2422831C1 (ru) | Экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека | |
EP4136458A1 (en) | D-dimer, glial fibrillary acidic protein (gfap), osteoprotegerin (opg) and osteopontin (opn) as biomarkers for stroke caused by large vessel occlusion | |
Webb-Robertson et al. | Decrease in multiple complement protein levels is associated with the development of islet autoimmunity and type 1 diabetes | |
RU2455924C1 (ru) | Способ прогнозирования метастазирования опухолевого процесса у больных раком желудка | |
SWETHA | A Comparative Study on Coagulation Profile and Neutrophil-Lymphocyte Ratio in Pregnancy Induced Hypertension | |
Ahmed et al. | Effect of raised serum uric acid level on perinatal and maternal outcome in cases of pregnancy-induced hypertension | |
JPH10267932A (ja) | 生物系による試験法 | |
Knapp et al. | Blood bioactive sphingolipids in patients with advanced serous epithelial ovarian cancer–mass spectrometry analysis | |
RU2596798C1 (ru) | Способ оценки влияния снижения магния в эритроцитах периферической крови беременных на развитие позднего токсикоза |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180810 |