RU2666957C1 - Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека - Google Patents
Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2666957C1 RU2666957C1 RU2017131871A RU2017131871A RU2666957C1 RU 2666957 C1 RU2666957 C1 RU 2666957C1 RU 2017131871 A RU2017131871 A RU 2017131871A RU 2017131871 A RU2017131871 A RU 2017131871A RU 2666957 C1 RU2666957 C1 RU 2666957C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysis
- convertase
- degree
- functional activity
- complement
- Prior art date
Links
- 108010067641 Complement C3-C5 Convertases Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000016574 Complement C3-C5 Convertases Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 41
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 17
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 17
- 230000004154 complement system Effects 0.000 abstract description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 9
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 4
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 4
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 4
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 3
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 3
- 101000962156 Homo sapiens N-acetylglucosamine-1-phosphodiester alpha-N-acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 3
- 102100039267 N-acetylglucosamine-1-phosphodiester alpha-N-acetylglucosaminidase Human genes 0.000 description 3
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108010003529 Alternative Pathway Complement C3 Convertase Proteins 0.000 description 2
- 208000035913 Atypical hemolytic uremic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 208000004451 Membranoproliferative Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- LZCXCXDOGAEFQX-UHFFFAOYSA-N N-Acryloylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C=C LZCXCXDOGAEFQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 108010089414 Anaphylatoxins Proteins 0.000 description 1
- 241000238888 Argasidae Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 1
- 208000029574 C3 glomerulopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 102100025680 Complement decay-accelerating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010018370 Glomerulonephritis membranoproliferative Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 101000856022 Homo sapiens Complement decay-accelerating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146216 Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027527 Microangiopathic haemolytic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010054979 Secondary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 201000008560 complement component 3 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000004074 complement inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000403 immunocorrecting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000027134 non-immunoglobulin-mediated membranoproliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 208000011511 primary membranoproliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 201000008171 proliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к клинической иммунологии и касается способа определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента (АПАК). Сущность способа: проводят реакцию лизиса эритроцитов кролика сывороткой крови человека в условиях VBS-Mg-EGTA при температуре 37,0±0,5°C с последующим определением степени лизиса эритроцитов спектрофотометрически при длине волны 405 нм. При этом лизис эритроцитов кролика проводят 3,5% сывороткой крови человека в течение 10 мин, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА, в контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса эритроцитов [У(контроль), %], опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определяют степень лизиса эритроцитов [У(опыт), %]. Затем рассчитывают функциональную активность С3-конвертазы АПАК как разность между степенью лизиса эритроцитов в опытной и контрольной пробах и при разнице степени лизиса между опытной и контрольной пробами до 15% принимают функциональную активность С3-конвертазы альтернативного пути комплемента в сыворотке крови обследуемого за нормальную величину. 1 ил., 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека.
Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом, и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.
Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 40 компонентов, которые действуют посредством каскадной активации. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе ИК, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки [Rittirsch D., Redl H., and Huber-Lang M. Roleof Complementin Multiorgan Failure // Clinical and Developmental Immunology. - 2012; 2012:962927. doi: 10.1155/2012/962927.].
Известны три пути активации системы комплемента: классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся способом образования С3-конвертаз. Субстратом С3-конвертаз всех трех путей активации системы комплемента является компонент С3, при расщеплении которого образуются С3а и C3b. Присоединение дополнительных молекул C3b к С3-конвертазам приводит к образованию С5-конвертаз, которые запускают реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).
Альтернативный путь активации системы комплемента инициируется при спонтанном гидролизе компонента С3, который происходит при расщеплении тиоэфирной связи с образованием С3(Н2О) и формировании первоначальных жидкофазных С3-конвертаз после связывания фактора В и активации его фактором D (С3(H2O)Bb. Эта С3-конвертаза расщепляет молекулы С3 на С3а и C3b. C3b молекулы связываются ковалентно с патогенами или с любой поверхностью. Далее иммобилизованный C3b на поверхности взаимодействует с фактором В с образованием мембрано-связанной С3-конвертазы (C3bBb) альтернативного пути. Фактор В несет каталитический участок С3-конвертазы, C3bBb, которая является высокоспецифичной и эффективно регулируемой сериновой протеазой. С3-конвертаза стабилизируется при связывании пропердина, который также служит платформой для сборки С3-конвертазы на поверхности микроорганизмов, апоптозных или злокачественных клеток [Hourcade D.Е. Therole of properdinin the assembly of the alternative pathway C3 convertase of complement // J.Biol.Chem. - 2006. - V. 28, №4. - Р. 2128-2132]. Отрицательными регуляторами (ингибиторами) данного ферментного комплекса являются - фактор Н, мембранный кофакторный белок (МСР, CD46) и фактор ускоряющий распад (DAF, CD55). Все они, с одной стороны, поддерживают время функционирования С3-конвертазы альтернативного пути в пределах нескольких минут, с другой стороны, они предотвращают отложение С3 и формирование С3-конвертазы на здоровых клетках хозяина.
Избыточная (неконтролируемая) активация системы комплемента является частью патогенеза большого числа воспалительных заболеваний. Патологические эффекты могут быть обусловлены повышенной продолжительной активацией, например, вызванной присутствием иммунных комплексов (такой как системная красная волчанка и связанные с ней заболевания), а также или сниженной экспрессией или функция различных ингибиторов комплемента, или комбинацией этих двух факторов [Carroll M.V., R.В. Sim R.B. Complement in health and disease // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011. - V. 63, №12. - P. 965-975].
Ишемия и последующая реперфузия органов и тканей наблюдается при таких состояниях как инфаркт миокарда или инсульт. Активация комплемента и недостаточная регуляция играет важную роль при реперфузионном повреждении и активация всех трех путей комплемента участвует в данном процессе. Результатом является мультифункциональный воспалительный процесс, вовлекающий генерацию анафилатоксинов, повышенную экспрессию адгезивных белков и тканевых факторов на эндотелиальных клетках и выход из сосудов полиморфно-ядерных лейкоцитов [Banz Y., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage // Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, №3. - P. 205-217].
Мембрано-пролиферативный гломерулонефрит (МГТГН) тип II связан с С3 нефритическим фактором (С3НФ) [Sethi S., Nester С.М., Smith R.J. Membranoproliferative glomerulonephritis and С3 glomerulopathy: resolving the confusion // Kidney International. - 2012. - V. 81, №5. - P. 434-141.]. С3НФ является аутоантителом, связывающимся с С3-конверазой альтернативного пути, при этом взаимодействии наблюдается значительное возрастание времени полураспада конвертазы C3bBb. Результатом этих процессов является полное потребление (гидролиз) компонента С3, приводящее к функциональному дефициту С3. В результате тяжелого дефицита С3 может возрастать риск развития бактериальной инфекции.
Атипический гемолитический уремический синдром (АГУС) является заболеванием, которое встречается у детей и характеризуется микроангиопатической гемолитической анемией, тромбоцитопенией и острой почечной недостаточностью в результате МПГН. В случае этих заболеваний нарушается активация комплемента вследствие мутации фактора Н, фактора I, МСР, или фактор Н связанных белков (ФНСБ) 1, 3 или 5, которые нарушают функционирование этих ингибиторов. Кроме того, имеет значение мутации С3 и фактора В, которые приводят к нарушению регуляции активации [Sartz L., Olin A.I., Kristoffersson А.С., and Stahl A.L. A novel C3 mutation causing increased formation of the C3 convertase in familial atypical hemolytic uremic syndrome // J. of Immunol. - 2012. - V. 188, №4. - P. 2030-2037].
В настоящее время не существует доступных тест-систем для определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента.
Из уровня техники и наиболее близким является способ определения активности С3-конвертазы (C3bBb) альтернативного пути комплемента, основанный на гемолизе эритроцитов кролика (ЕК) с использованием 2 разных сывороток в качестве источников компонентов комплемента: на первом этапе С3-конвертаза альтернативного пути активации системы комплемента (C3bBb) генерируется предварительно на поверхности эритроцитов кролика (ЕК) с использованием исследуемой (первой) сыворотки и специфических ингибиторов компонента С5 (OmCI, ингибитор С5, выделенный из клеща Ornitodorosmoubata и рекомбинантно продуцированный из Е. Coli [Nunn M.A., Sharma A., PaesenG.C, et al. Complement inhibitorof C5 activation from the softtick Ornitodorosmoubata // J. Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 2084-2091] или eculizumab, моноклональные антитела к C5 [Kaplan M. Eculizumab (Alexion) // Curr.Opinlnvestig Drugs. - 2002. - V. 3. - P. 1017-1023] для предотвращения формирования мебрано-атакующего комплекса (C5b-9, МАК). После, эритроциты кролика с иммобилизованными комплексами С3-конвертазы осаждают центрифугированием, супернатант декантируют и преципитированные комплексы, EKC3bBb, ресуспендируют в вероналовом буфере, содержащем ЭДТА и сыворотку морской свинки. Целью второй стадии теста является формирование МАК с использованием платформы конвертазы, образованной на первой стадии. После второй инкубации оставшиеся клетки осаждают центрифугированием, в супернатанте определяют выход гемоглобина спектрофотометрически при длине волны 405 нм. [Blom AM, Volokhina EV, Franson V, Stromberg P, et al. A novel method for direct measurement of complement convertases activity in human serum // Clinical and Experimental Immunology. - 2014. - V. 178. - P. 142-153].
Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что используются две разные сыворотки, в которых присутствуют дополнительные ингибиторы или стабилизирующие С3-конвертазу аутоантитела к этим ингибиторам, а также потребность использования моноклональных антител (eculizumab) к компоненту С5 или специфических ингибиторов компонента С5 (OmCI).
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности метода исследования функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента с использованием сыворотки крови только одного человека, а также адаптация метода для рутинных скрининг-исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий практического здравоохранения.
Указанный результат достигается тем, что функциональную активности С3-конвертазы альтернативного пути системы комплемента определяют путем проведения реакции лизиса эритроцитов кролика сывороткой крови человека в условиях VBS-Mg2+-EGTA при температуре 37,0±0,5°С с последующим определением степени лизиса эритроцитов спектрофотометрически при длине волны 405 нм, отличающийся тем, что лизис эритроцитов кролика проводят 3,5% сывороткой крови человека в течение 10 мин, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА, в контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса эритроцитов [У(контроль),%], опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определяют степень лизиса эритроцитов [У(опыт),%]. Функциональную активность С3-конвертазы определяют как разность между степенью лизиса эритроцитов в опытной и контрольной пробах. При разнице степени лизиса между опытной и контрольной пробами не более 15% принимают функциональную активность С3-конвертазы альтернативного пути комплемента в сыворотке крови обследуемого за нормальную величину.
Заявленное изобретение поясняется фиг. 1 на которой представлена активность альтернативного пути активации пулированной сыворотки крови человека в зависимости от концентрации.
Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет разности степени лизиса эритроцитов между опытной и контрольной пробами. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов кролика (1,5×108 кл/мл) (ЕК) в вероналовом солевом буфере (VBS), содержащем 7 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликольтетрауксусную кислоту (VBS-Mg2+-EGTA). Время проведения экспресс-способа 40 мин.
Титрование пулированной сыворотки крови человека на активность альтернативного пути активации системы комплемента. Предварительно от 5 до 30 мкл пулированной сыворотки крови от 10 здоровых доноров были разведены до конечного объема 300 мкл буфером VBS-Mg2+-EGTA. Затем 200 мкл стандартизированных эритроцитов кролика (1,5×108 кл/мл) были добавлены и инкубированы в течение 30 мин при 37°С. После инкубации реакцию лизиса эритроцитов останавливали добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин для осаждения оставшихся ЕК и степень лизиса эритроцитов определяли по выходу гемоглобина в супернатант спектрофотометрически при длине волны 405 нм. В качестве контроля были использованы бланк (спонтанный лизис эритроцитов) (200 мкл ЕК + 300 мкл VBS-Mg-EGTA) и полный лизис эритроцитов (200 ЕК + 300 мкл H2O). Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:
У(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,
где Н, R и X - величины оптической плотности А405 супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе эритроцитов, в контроле спонтанного лизиса ЕК и в опытной пробе соответственно. Полученные результаты представлены на фиг. 1. Как видно из фиг. 1, степень лизиса эритроцитов от 10 до 90% зависит линейно от концентрации сыворотки. Степень лизиса эритроцитов ЕК на уровне 50% наблюдается при концентрации сыворотки, равной 17,5 мкл в гемолитической системе, что составляет 3,5% сыворотки. Таким образом, для дальнейших исследований нами использовалась 3,5% концентрация сыворотки в тесте.
Определение гемолитической активности альтернативного пути активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин. 200 мкл эритроцитов кролика (ЕК) (1,5×108 кл/мл) инкубировали с 17,5 мкл сыворотки крови человека, в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS-Mg2+-EGTA (концентрация сыворотки 3,5%). Одновременно ставили контроль на спонтанный лизис эритроцитов ЕК (200 мкл ЕК + 300 мкл VBS-Mg2+-EGTA) и контроль на полный лизис эритроцитов (200 мкл ЕК + 300 мкл H2O). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37°С. После инкубации в пробы добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли степень лизиса эритроцитов по величине А405 супернатанта. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, гемолитическая активность АПАК колебалась от 13% до 74%, что укладывается в калибровочный график (см. фиг. 1). По уровню активности АПАК тестированные пробы можно распределить на 3 группы: 1 группа - активность АПАК до 25% лизиса эритроцитов ЕК (8 проб, что составляет 36,4%)); 2 группа - от 26% до 40% лизиса эритроцитов (также 8 проб, 36,4%); 3 группа лизис эритроцитов от 41% и выше (6 проб, 27,2%).
Определение оптимальной концентрации вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА (VBSE) для полного ингибирования системы комплемента по альтернативному пути. К 200 мкл суспензии эритроцитов кролика (ЕК) (1,5×108 кл/мл) добавляли 17,5 мкл пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 20-100 мкл VBSE (интервал концентрации 0,4-2,0 ммоль/л ЭДТА в системе), доводили объем до 500 мкл буфером VBS-Mg2+-EGTA и инкубировали 30 мин при 37°С. Одновременно ставили контроль на спонтанный (200 мкл ЕК + 200 мкл VBS-Mg2+-EGTA) и полный лизис эритроцитов ЕК (200 мкл ЕК + 200 мкл H2O). После инкубации останавливали реакцию лизиса эритроцитов добавлением 2,5 мл охлажденного 0,15 М раствора NaCl, центрифугировали 10 мин. при 2500 об/мин и определяли степень лизиса эритроцитов по величине А405 супернатанта, как описано выше.
Степень ингибирования альтернативного пути активации комплемента определяли как разность показателей лизиса эритроцитов контрольной пробе и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации VBS-ЭДТА, по формуле:
СИ АПАК (%)=(100-У),
где 100 - степень лизиса эритроцитов в контрольной пробе, У - степень лизиса эритроцитов в опытных пробах. Полученные данные приведены ниже (таблица 2).
Как видно из данных, представленных в таблице 2, лизис эритроцитов кролика ингибируется дозозависимо при повышении концентрации ЭДТА в гемолитической системе. Таким образом, при концентрации ЭДТА в системе выше 1,4 мМоль/л наблюдается полное ингибирование гемолитической активности системы комплемента по альтернативному пути за счет хелатирования ионов магния.
Пример 1. Определение функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути системы комплемента. Определение ФА С3-конвертазы АПАК основано на том, что после 10 мин инкубации 200 мкл (1,5×108 кл/мл) эритроцитов кролика с 17,5 мкл сыворотки крови человека в конечном объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS-Mg2+-EGTA, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА (VBSE). В контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса эритроцитов [У(контроль),%], как описано выше. Опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°С. После инкубации определяют степень лизиса эритроцитов [У(опыт),%]. ФА С3-конвертазы АПАК определяют как разность между степенью лизиса эритроцитов в опытной и контрольной пробах. Проведены исследования ФА С3-конвертазы АПАК в сыворотке крови 20 здоровых доноров. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, во всех исследованных сыворотках ФА С3-конвертазы АПАК была не более 15% (колебания от 1 до 15%). Известно, что период полураспада С3-конвертазы составляет несколько минут, и при добавлении вероналового буфера, содержащего ЭДТА, при связывании ионов Mg2+ полностью ингибируется дальнейшая активация комплемента по всем трем путям. ФА С3-конвертазы на уровне 15% и ниже нами предварительно принято за нормальную величину.
Пример 2. Определение ФА С3-конвертазы АПАК в сыворотках крови беременных женщин. Предлагаемым способом были тестированы сыворотки крови 22 беременных женщин, пациентов отделения патологии. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Определение ФА С3-конвертазы АПАК в этих же пробах показало, что только в 9 пробах (41%) данный показатель в пределах нормальных величин (до 15% лизиса эритроцитов ЕК), предварительно полученных в группе доноров (пример 1). В остальных 13 пробах ФА С3-конвертазы АПАК существенно различалась. В 6 пробах (27%) ФА С3-конвертазы АПАК варьировала от 16 до 28%), а в 7 пробах (32%) - лизис эритроцитов от 29% и выше.
Анализ полученных данных показывает, что скорость лимитирующей стадией активации альтернативного пути системы комплемента является функционирование С3-конвертазы, C3bBb. Только в одной пробе №19 высокая функциональная активность С3-конвертазы не дала повышенного лизиса эритроцитов по альтернативному пути (см. таблицу 1). Данный факт прямо свидетельствует о снижении уровня компонента С3, т.е. мы наблюдаем повышенное потребление за счет стабилизации С3-конвертазы. В остальных же пробах высокая ФА С3-конвертазы, возможно компенсируется повышенным синтезом компонента С3.
Таким образом, предлагаемый способ определения ФА С3-конвертазы АПАК по сравнению с известными имеет преимущества, которые заключаются в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 40 минут, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, а также контролировать эффективность проводимого лечения.
Claims (1)
- Способ определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента (АПАК) путем проведения реакции лизиса эритроцитов кролика сывороткой крови человека в условиях VBS-Mg2+-EGTA при температуре 37,0±0,5°C с последующим определением степени лизиса эритроцитов спектрофотометрически при длине волны 405 нм, отличающийся тем, что лизис эритроцитов кролика проводят 3,5% сывороткой крови человека в течение 10 мин, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА, в контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса эритроцитов [У(контроль), %], опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определяют степень лизиса эритроцитов [У(опыт), %] и функциональную активность С3-конвертазы АПАК рассчитывают как разность между степенью лизиса эритроцитов в опытной и контрольной пробах и при разнице степени лизиса между опытной и контрольной пробами до 15% принимают функциональную активность С3-конвертазы альтернативного пути комплемента в сыворотке крови обследуемого за нормальную величину.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017131871A RU2666957C1 (ru) | 2017-09-12 | 2017-09-12 | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017131871A RU2666957C1 (ru) | 2017-09-12 | 2017-09-12 | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2666957C1 true RU2666957C1 (ru) | 2018-09-13 |
Family
ID=63580310
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017131871A RU2666957C1 (ru) | 2017-09-12 | 2017-09-12 | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2666957C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2696981C1 (ru) * | 2019-05-24 | 2019-08-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Определение чувствительности эритроцитов человека к лизису при активации системы комплемента по тромбиновому пути |
RU2717946C1 (ru) * | 2019-06-13 | 2020-03-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ определения тромбинового пути активации системы комплемента |
RU2756764C1 (ru) * | 2021-06-09 | 2021-10-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России) | Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2232992C1 (ru) * | 2003-04-09 | 2004-07-20 | Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации |
RU2380707C1 (ru) * | 2008-09-30 | 2010-01-27 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации |
RU2549468C2 (ru) * | 2013-08-09 | 2015-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИНФ им. П.К. Анохина" РАМН") | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека |
-
2017
- 2017-09-12 RU RU2017131871A patent/RU2666957C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2232992C1 (ru) * | 2003-04-09 | 2004-07-20 | Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации |
RU2380707C1 (ru) * | 2008-09-30 | 2010-01-27 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации |
RU2549468C2 (ru) * | 2013-08-09 | 2015-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИНФ им. П.К. Анохина" РАМН") | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
KAPLAN M. Eculizumab (Alexion) // Curr.OpinInvestig Drugs. 2002. V. 3. P. 1017-1023. * |
Melchers F. et. al. Growth control of activated, synchronized murine B-cells by the C3d fragment of human component.// Nature. 1985. V.317. P.264-267. * |
NUNN M.A. et al. Complement inhibitor of C5 activation from the soft tick Ornitodoros moubata // J. Immunol. 2005. V. 174. P. 2084-2091. * |
РОМАНОВ С.В. и др. Определение активности протеина систем коплемента иммуноферментными методами. Биомедицинская химия, 2003, том 49, N6, с.604-612. * |
РОМАНОВ С.В. и др. Определение активности протеина систем коплемента иммуноферментными методами. Биомедицинская химия, 2003, том 49, N6, с.604-612. KAPLAN M. Eculizumab (Alexion) // Curr.OpinInvestig Drugs. 2002. V. 3. P. 1017-1023. Melchers F. et. al. Growth control of activated, synchronized murine B-cells by the C3d fragment of human component.// Nature. 1985. V.317. P.264-267. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2696981C1 (ru) * | 2019-05-24 | 2019-08-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Определение чувствительности эритроцитов человека к лизису при активации системы комплемента по тромбиновому пути |
RU2717946C1 (ru) * | 2019-06-13 | 2020-03-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ определения тромбинового пути активации системы комплемента |
WO2020251403A1 (ru) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Терапии И Профилактической Медицины" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Способ определения тромбинового пути активации системы комплемента |
RU2756764C1 (ru) * | 2021-06-09 | 2021-10-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России) | Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Deban et al. | Binding of the long pentraxin PTX3 to factor H: interacting domains and function in the regulation of complement activation | |
Foell et al. | Phagocyte-specific calcium-binding S100 proteins as clinical laboratory markers of inflammation | |
Creagh-Brown et al. | The RAGE axis in systemic inflammation, acute lung injury and myocardial dysfunction: an important therapeutic target? | |
Clark et al. | Tissue-specific host recognition by complement factor H is mediated by differential activities of its glycosaminoglycan-binding regions | |
Willis et al. | Pathophysiology of the antiphospholipid antibody syndrome | |
RU2666957C1 (ru) | Способ определения функциональной активности с3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека | |
Salama et al. | Red blood cell transfusion in warm-type autoimmune haemolytic anaemia | |
Schemmer et al. | Glycine reduces platelet aggregation | |
Lobo et al. | Natural IgM anti-leukocyte autoantibodies attenuate excess inflammation mediated by innate and adaptive immune mechanisms involving Th-17 | |
AU2017289214B2 (en) | Complement inhibitors and uses thereof | |
Gao et al. | Endothelial cell-derived CD95 ligand serves as a chemokine in induction of neutrophil slow rolling and adhesion | |
AU2016224962B2 (en) | Assay to diagnose and treat disorders of the alternative pathway of complement activation | |
WO2016081889A1 (en) | Recombinant c1 esterase inhibitor and use thereof | |
Dhaeze et al. | Sex-dependent factors encoded in the immune compartment dictate relapsing or progressive phenotype in demyelinating disease | |
Irawaty et al. | Characteristics Of Crossmatch Types In Compatibility Testing On Diagnosis And Blood Types Using Gel Method (Ciri Inkompatibilitas Uji Cocok Serasi Metode Gel Terhadap Diagnosis Dan Golongan Darah) | |
Demirtas et al. | Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker for acute kidney injury in patients undergoing coronary artery bypass grafting | |
Djunic et al. | Specific binding of paraprotein to platelet receptors as a cause of platelet dysfunction in monoclonal gammopathies | |
WO2023061946A1 (en) | Use of trem-1 for predicting and preventing postoperative complications after cardiac surgery with cardiopulmonary by-pass | |
RU2704121C1 (ru) | Скрининг-тест для определения функциональной активности классического пути системы комплемента | |
Ludvigsen et al. | Identification and characterization of novel ERC‐55 interacting proteins: Evidence for the existence of several ERC‐55 splicing variants; including the cytosolic ERC‐55‐C | |
RU2530627C2 (ru) | Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах | |
Kenney et al. | Evidence implicating calpain (Ca2+‐dependent neutral protease) in the destructive thrombocytopenia of the Wiskott‐Aldrich syndrome | |
Brown et al. | Waldenströms Macroglobulinaemia | |
RU2549468C2 (ru) | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека | |
RU2452962C2 (ru) | Способ и тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |