CZ283598A3 - C3-konvertáza rezistentní k regulačnímu snížení aktivity - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká modifikovaných proteinů schopných vytvářet C3 konvertázy rezistentní k regulačnímu snížení aktivity (down-regulaci), DNA sekvencí kódujících takové proteiny použití takovýchto proteinů' j ako terapeutických prostředků zejména při snižování hladin proteinů komplementové dráhy a při specifickém nasměrování komplementového ataku do specifického místa (depozice proteinu C3b).

Dosavadní stav techniky

Komplementový systém hraje nejdůležitější roli v efektorových mechanismech imunitní odpovědi člověka a dalších obratlovců, jako je fagocytóza, cytolýza a vyzrávání buněk, které vedou k indukci lokální zánětlivé odpovědi (Rother, Κ. E Till, G.O. (editoři) (1988) v knize The complement System (nakladatelství Springer, Berlin Heidelberg, SRN). Tyto funkce komplementového systému jsou žádoucí tam, kde se jedná o eliminaci invazivních patogenů jakými jsou například bakterie, ale nežádoucí tam, kde působí proti tkáním samotného hostitele (například při post-ischemickém reperfuzním traumatu, viz Crawford, M.H. a další, (1988) Circulation. 78: strana Í449 až 58) nebo tam, kde působí proti cizímu terapeutickému materiálu (například při hyperakutním odvrhování cizorodých štěpů, viz Fořty, J, Hasan, R, Cary, N, White, DJ & Wallwork, J (1992) Transplant. Proč. 24: strana 488 až 489). Byly provedeny pokusy potlačit tyto nežádoucí účinky pomocí derivátů komplementových regulačních proteinů, jejíchž normální funkce je potlačovat aktivaci komplementu, viz Kalii, K.R., Hsu, P.

-215: strana 417 až 431; Weisman, HF a další (1990; Science 249: strana 146 až 151.

.Komplementový systém obsahuje proteiny nacházející se jak na buněčném povrchu (receptory a regulační faktory), tak v tělních tekutinách (t.j. V krevní plazmě a v dalších extracelulárních tekutinách). Kritickým krokem pro vyvolání odpovědí je proteolytická konverze proteinu C3 na fragmenty C3b a C3a. C3a působí jako anafylatoxin, který, podobně jako C5a, přitahuje do postiženého místa mastocyty. To má za následek místní uvolnění histaminu, vazodilataci a další efektorové mechanismy zánětlivé odpovědi. Vzniklý C3b má schopnost vázat se na povrchy v blízkosti svého vzniku. Prostřednictvím navázaného C3b je pak směřován atak cytolytických komponent komplementu (C5 - C9) .

Na povrch navázaný C3b a produkty jeho degradace jsou též ligandy pro C3 receptory, které' zprostředkují například fagocytózu, viz Rother, K. E Till, G.O. (editoři) (1988) v knize The complement System (nakladatelství Springer, Berlin Heidelberg, SRN. Existují dvě odlišné dráhy aktivace komplementu. Pro obě dvě je společné, že vedou ke konverzi C3 na C3b a k následným odpovědím.

.Klasická dráha aktivace komplementu je za normálních podmínek zahájena komplexy antigenu s protilátkou. Dochází k iniciaci enzymové kaskády, jenž zahrnuje proteiny Clq, Clr, Cis, C2, a C4. Alternativní dráha závisí na aktivační smyčce, která zahrnuje samotný C3 a nezbytné faktory B a D.

Výsledkem konverze C3 na C3b (nebo C3i) je produkt, jenž se může kombinovat s faktorem B, čímž vzniká C3bB (nebo C3iB). Z těchto komplexů dále působením faktoru D vzniká C3bBb, což je C3 konvertáza schopná štěpit další C3 na C3b. To vede k tvorbě dalšího C3bBb a následně k další konverzi C3. Za určitých podmínek je komplex C3bBb stabilizován asociací s pozitivním regulátorem • ·

-3properdinem (Ρ). Rychlost této pozitivní zpětnovazebně smyčky je však za normálních podmínek následkem působení regulačních proteinů, jmenovitě faktoru H a faktoru I, velmi omezená.

Faktor H (a strukturně příbuzné s buňkou asociované molekuly) (i) odstraňuje B a Bb z C3b, a (ii) působí jako iC3b, čímž , která by kofaktor faktoru I, který štěpí C3b na zamezuje jakékoliv rekombinaci s faktorem B vedla ke vzniku dalších C3 konvertáz. k amplifikaci tvorby C3b dochází za přítomnosti takových povrchů, jakými jsou například mnohé bakteriální stěny, které váží vznikající C3b a zabraňují regulaci faktory H a I.

Vznikajici endogenním se k buňkám

C3b má také schopnost vázat Endogenní buněčné povrchy běžně přicházející do styku s komplementem jsop proto navíc chráněny na membrány vázanými regulátory, jakými jsou například MCP, DAF a CRi. Tyto regulační faktory působí podobnými způsobem jako faktor H.

Existuje několik vzácných přirozeně se vyskytujících stavů, kdy nedochází k normální regulaci C3 v tělních tekutinách a kdy spontánní C3 konverze nakonec vede k úplnému odčerpání C3 z cirkulace. Mezi tyto případy patří (i) genetické deficience faktoru H nebo I (viz Nicol, P.A.E. & Lachmann, 'P.J. (1973) Immunol.

24:259 až 275), (ii) přítomnost protilátek (nefritických faktorů), které se váží k C3bBb a zabraňují disociaci (viz Daha, M.R. & van Es, L.A. (1982) Immunol. 43:33 až 38) a (iii) kontakt s proteinem přítomným v jedu kobry nazývaným faktor z jedu kobry (CVF = cobra venom factor), který se spojuje s faktorem B a vytváří enzym s C3 konvertázovou aktivitou, který neobsahuje C3b a není ovlivňován faktory H Eberhard, HJ (1984) strana 163 až 92).

aktivity (down-regulace) komplementu specifické aktivace je velmi důležité.

a I (viz Pangburn, NK & MullerSpringer Semin. Immunopathol. 7:

Je zřejmé, že regulační snížení v nepřítomnosti • · » · • 9

-4• 9 «· » 9 9 <

Existují též případy, kdy sice dochází ke specifické aktivaci, avšak tato aktivace je nežádoucí, neboť je namířená proti tkáním samotného hostitele (například tkáním, které byly poškozeny ischemií či chirurgickým zákrokem) nebo proti cizím materiálům, jež byly- použity k terapeutickým účelům (jakými jsou například cizorodé štěpy, umělé orgány nebo dialyzační membrány). Aktivace komplementu má za následek nežádoucí atak a následně poškození. V těchto případech by bylo užitečné blokovat či inhibovat aktivaci a odpověď.

Dosavadní způsoby řešení problému, jak zabránit poškození způsobenému komplementem, byly zaměřeny na použití proteinů, (CR1, MCP, DAF, jenž inhibují aktivaci faktor H a faktor I).

komplementu

Inhibitory komplementu jakými jsou faktor I, faktor H a rozpustné deriváty na membránu vázaných proteinů CR1, DAF, MCP potlačují amplifikační smyčku alternativní dráhy probíhající v tělních tekutinách. Proto bylo v modelových fyziologických situacích testováno, zda tyto molekuly, zvláště CR1, který je, zdá se, nejúčinnější, mohou být použity ke snížení poškození způsobenému komplementem (viz Kalii, K.R., Hsu, P. & Fearon, D.T. (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15: strana 417 až 431; Weisman, HF a další (1990) Science 249: strana 146 až 151).

Faktor H je endogenně přítomný v krevní plazmě ve vysokých koncentracích (typicky 0,3 až 0,5 mg/ml, viz

Rother, K. complement Heidelberg,

E Till, G.O. (editoři) (1988) v knize The

System (nakladatelství Springer, Berlin

SRN)), takže i když zvýšené hladiny inhibitorů tlumí reakci v kapalné fázi, jejich účinnost je malá a k efektivnímu snížení reakce by in vivo muselo být podáváno velké množství těchto purifikovaných proteinů (například možná více než 5 mg rozpustného CR1 na Ikg tělesné váhy) . Alternativní dráha je navíc aktivována povrchy, kde je efektu faktoru H již

-5zabráněno. Protože zároveň nedochází ke snížení aktivity ostatních inhibitorů, předpokládá se, že tytéž faktory nejsou zcela či univerzálně účinné.

Faktor z jedu kobry (CVF) má schopnost vytvářet stabilní C3 konvertázu, která může být u zvířat in vivo a v dalších případech in vitro (například ve vzorcích lidské plazmy) experimentálně použitá k odčerpání komplementu. CVF je velmi účinný (například 40 pg/kg může zrušit aktivitu komplementu u myši (viz Van den Be g, C.W., Aerts, P.C. & Van Dijk, H. (1991) J. Immunol. Methods 136: strana 287 až 294). Existují však nevýhody, kvůli kterým je použiti CVF u lidí nevhodné.

Zaprvé, CVF se získává z jedu kobry (který je obtížné získat a s kterým je nebezpečné pracovat) a musí tedy být pečlivě očištěn od neurotoxinů přítomných v tomto jedu. Zajistit dostatek jedu je také velmi obtížné. Tyto problémy není možné překonat pomocí klonování a exprese příslušného genu ex vivo, neboť v kobře dochází k posttranslačním modifikacím (ke specifickému proteolytickému zpracování), které by bylo obtížné či dokonce nemožné provést in vitro. Dosud není ani známo, jaké podmínky jsou nutné k danému proteolytickému štěpení, a nejsou známy ani příslušné enzymy. Zadruhé, daný protein je pro lidský organismus cizí a tedy imunogenní. K dekomplementaci pacienta by bylo nutné opakované terapeutické použití CVF po dobu několika týdnů (což by umožnilo například přežití cizorodého štěpu v organismu) . To však z' důvodů uvedené imunogenicity není možné.

Ačkoliv je CVF s lidským C3 zčásti strukturně a funkčně homologní (viz Vogel, CW, Smith, CA. 6 MullerEberhard, HJ (1984) J. Immunol. 133: strana 3235 až 3241) , má také v obou směrech velké rozdíly (mezi oběma proteiny jsou odlišnosti ve struktuře řetězce, v lokalizaci biosyntézy, dále v citlivosti k regulačním

-6• · · · · * • · · toto žaktorům komplementu, v tvorbě stabilní C3 ;VF není odvozený od kobřího ekvivalentu znám (byl strukturně Fritzinger, již klonován a a funkčně podobá sekvenován) lidskému C3

D.C. a další (1992) J. Immunol konvertázy) . C3, který je a který se více , viz . 149: strana

3554 až 3562.

CVF evolučně genetické aby se provedite je specifický produkt jedu zvířat, která jsou hodně vzdálená homo sapiens. Proto takové manipulace, které by změnily daný protein tak, stal pro člověka neimunogenním, nejsou né .

Vynález popisuje alternativní strategii, která obchází fyziologickou regulaci a která místo inhibice aktivace komplementu vyvolává superaktivaci tohoto systému. Existují dva způsoby aplikace této strategie. Zaprvé může být použita in vivo , kdy je vyvolána taková aktivace komplementu, která vede k úplnému odčerpání jedné či více komponent komplementové kaskády, čímž dojde ke ztrátě schopnosti produkovat lokální odpovědi na následný podnět, kterými může být například cizorodý štěp. Zadruhé, neregulovaná superaktivace může být záměrně omezena na konkrétní cílové místo (například na virus nebo na virově infikované buňky), čímž se zvýší citlivost tohoto cílového místa k obrannými reakcím zprostředkovaným komplementem.

Podstata vynálezu

Termínem regulátory aktivace komplementu se rozumí všechny proteiny, jejichž účinek vede k inhibici amplifikace- konverze C3, a neomezuje se pouze na proteiny, jejichž geny jsou lokalizovány na genetickém lokusu RCA. Nicméně nezahrnuje aktivátory (upregulators), mezi které patří například properdin. C3 konverze je definována, pokud není udáno jinak, jako

proteolytická konverze C3 na C3b a C3a. C3 konvertáza (nebo jednoduše konvertáza) je definována jako enzym (typicky komplex dvou nebo více proteinových komponent, například C3bBb, C3iBb, CVFBb nebo C4b2a), který katalyzuje tuto reakci.

...... Vynález komplementové způsobem, že rezistentní k regulaci).

. .popisuj e dráhy, který je schopen regulačnímu tvorbu nativního proteinu je modifikovaný takovým vytvářet C3 konvertázu snížení aktivity (downVýraz nativní znamená přirozeně se vyskytující, t.j. dosažitelný v přírodě. Definice tedy zahrnuje jakékoliv přirozeně se vyskytující proteiny komplementové dráhy modifikované výše popsaným způsobem. Nemusí přitom jít pouze o druhově specifické proteiny. Jinými slovy, například modifikovaný lidský protein by mohl být použit jako C3 konvertáza rezistentní k'regulačnímu snížení aktivity (down-regulaci) u jiných savčích druhů. Typicky však budou používány modifikované proteiny komplementové dráhy z těch samých druhů.

Modifikace DNA sekvence kódující C3, za použití například místně cílené mutageneze, může vést k produkci různých C3, které jsou rezistentní ke komplementovým regulačním proteinům. Zároveň si však uchovávají positivní funkční vlastnosti (štěpení na C3b pomocí C3 konvertázy) a znaky strukturní integrity (správná struktura řetězce, přítomnost thioesterové vazby). Zde popisovaný vynález se týká geneticky modifikovaných forem nativních komplementových proteinů, například lidského C3, jehož C3b fragment je rezistentní k fyziologické regulaci komplementu. Tato rezistence vede k tomu, že z těchto molekul mohou za fyziologických podmínek (např in vivo) vznikat stabilizované formy odpovídající C3 konvertázy, čímž dochází k amplifikaci konverze C3 na C3b a na následné degradační produkty.

• ·

-8Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je připravený modifikovaný lidský protein C3, který je rezistentní ke štěpení faktorem I.

Tenro pozměněný protein může být připravený modifikací zbytků v proteolytickém místě proteinu.

Obzvlášť výhodné je takové provedení vynálezu, ve kterém je lidský protein C3 modifikován tak, že je v něm zaměněn buď arginin v pozici 1303, nebo arginin v pozici 1320, nebo oba, za jinou aminokyselinu. Aminokyselinami, za které lze arginin zaměnit, mohou být tyrozin, cystin, tryptofan, glutamin, glutamová kyselina nebo glycin. Arginin v pozici 1303 je přednostně zaměňován za kyselinu giutamovou či glycin (méně za glutamin). Arginin v pozici 1320 je přednostně zaměňován za glutamin.

Další strategie produkce vhodných modifikovaných proteinů zahrnují:

i) Sníženi citlivosti k inhibičnim účinkům faktoru H a příbuzným proteinům (například MCP, DAF, CR1) . Například v lidském C3 se v oblasti aminokyselinových

zbytků 767 až 776	a	1209	až 1271	nachází vazebné	místo
pro faktor H (viz	Botto, h	f, Fong,	K.Y., So, A.K.,	Koch,
C. & Waiport, M.J.	(	1990)	J. Exp.	Med. 172: strana 1011
až 1017; Lambris,	J.	D.,	Avila,	D., Becherer, J.	D. &
Nulle, Eberhard, P	L. J	. (1988) J. Biol. Chem. 263:	strana
2147 až 2150) . Substituce	j ednoho	či více těchto	zbytků
nebo jiných zbytků,	které jsou	také spojeny s	funkcí
těchto proteinů,	by	tedy	mohla	vést k redukci	vazby

jednoho či více z těchto proteinů.

ii) Snížení rychlosti disociace C3bBb. Mohou být zavedeny takové mutace, které by posílily interakci mezi C3b a Bb.

Posílení této interakce by spontánního rozkladu enzymu, tak faktoru H (a příbuzných vedlo j ak ke snížení regulačních k redukci efektivity faktorů) v odstraňování Bb od C3b.

• ·

-9mutace, které sníží rychlost faktorem H zprostředkovaného za nepřítomnosti faktoru H má fázi při teplotě 37°C a poločas života jenom přibližně C., Lachmann, P.J. & Harrison, strana 667 až 675).

Žádoucí jsou takové jak spontánního, tak rozkladu C3bBb. Dokonce i C3bBb komplex v kapalné v přítomnosti properdinu 10 minut (viz Farries, T. RA (1988) Biochem. J. 253:

iii) Aminokyselinové zbytky 752 až 761 lidského C3 se podílí na vazbě faktoru B. Jedná se o velmi konzervovanou oblast C3. V C4 byla nalezena sekvence velmi podobná této oblasti. Protože C4 váže C2, což je -homolog faktoru B, velká podobnost těchto oblastí mezi C3 a C4, spolu s vysokou konzervovaností v C3, mohou svědčit pro to, že toto místo v C3 je vazebným místem faktoru H. Změny v této oblasti by tedy mohly ovlivňovat afinitu faktoru B a stabilitu C3bBb.

iv) žádoucí by též byla rezistence k dalším regulátorům aktivace komplementu, jakými jsou například CRÍ, DAF a MCP. Všechny tyto regulátory působí podobným mechanismem jako faktor H, proto by další mutageneze neměla být nezbytná. Podobně i některé patogenní organismy exprimují své komplementu, které jsou homologní s faktorem H Vaccinia viru) . Tyto mo imunitní odpovědi. Bylo by nasměrovanou modifikovanou rezistentní k této obraně.

vlastní inhibitory aktivace často strukturně i funkčně (například sekreční peptid Lekuiy chrání patogen proti výhodné atakovat je specificky C3 konvertázou, která by byla

v) mutace zvyšující stabilizaci C3 konvertázy oroperdinem. Aktivita properdinu je založena na tom, že stabilizuje komplex C3bBb a zabraňuje spontánní a na faktoru H závislé disociaci. Tato stabilizace je však v kapalné fázi neúčinná. Zdá se však, že je důležitá pro amplifikaci komplementové kaskády, která již byla spuštěna na vhodném aktivačním povrchu (viz Farries, • · • · · • 9

9 9

-109 99 9 4

T.C., Lachmann, P.J. &. Harrison, R.A. (1988) Biochem. J. 252: strana 47 až 54). Zvýšeni aktivity properdmu (zvýšením jeho afinity) by mohlo vést ke změně rovnováhy v kapalné fázi a tak i k iniciaci spontánní C3 konverze. Tento mechanismus by byl zvláště výhodný v kombinaci s výše uvedenými modifikacemi.

vi) Mutace zabraňující komplexu C3bBb získat C5 konvertázovou aktivitu. Při odstraňování aktivního C3 z cirkulace může být nežádoucím vedlejším účinkem vznik velkého množství anafylaktických peptidů. Z nich je nejúčinnější peptid C5a, který se odštěpuje z proteinu C5 některými C3 konvertázovými enzymy. Tato reakce pravděpodobně závisí na afinitě konvertázy k dalším molekulám C3b (viz' Kinoshita, T, Takata, Y, Kozono, H, Takeda, J, Hong, KS & Inoue, k (1988) J. Immunol. 141: strana 3895 až 901) . Mutace v proteinu C3 tedy může vést k potlačení této interakce.

vii) Zvýšená aktivita C3 konvertázy. Aktivní místo C3bBb C3 konvertázy se nachází v části Bb. Komponenta C3b pravděpodobně přispívá k tomu, aby Bb část zaujala správnou aktivní konformaci a/nebo k vazbě a orientaci substrátu před jeho přeměnou pomocí Bb části. Který z těchto mechanismů je správný, není zatím známo, nicméně v obou případech existuje možnost zvýšení aktivity konvertázy mutací na straně proteinu C3.

viii) Exprese ve funkční formě. C3 přirozeně se vyskytujícího typu vyžaduje nejprve konverzi pomocí C3b a teprve poté je schopen kombinace a tvorby nového C3 konvertázového komplexu. Při použití in vivo by požadavek na konverzi na modifikovaného C3

C3b (nebo C3i) zpomaloval aktivitu Proto by bylo výhodné podávat protein buď již ve formě, ve které je schopen okamžitě vytvářet konvertázový komplex, nebo podávat již předem vytvořený konvertázový komplex. Je proto výhodné vytvářet funkční ·» • · • · • ··

-11reagencie podobné Cob ex vivo. Téhož může být dosaženo in vizro (například pomocí proteoiýzy).

ix) Modifikace nativního proteinu, která slouží k zavedení nových míst, ve kterých může být příslušný protein štěpen. Modifikace je provedena tak, že oblasti peptidu, na které se -váže faktor B, jsou zachovány, ale ty, které jsou nutné pro vazbu faktoru H jsou specificky odstraněny. Místa lze například zavést tak, aby modifikovanou formu C3 podobnou C3b bylo možné dále štěpit na formu, která stále váže faktor B, která však v menší míře podléhá inaktivaci faktorem Hal.

x) Modifikace v dalších oblastech, které . mohou ovlivňovat interakci proteinu C3b s faktorem B a/nebo s faktorem H. Vynález mění tradiční přístup tak, že zvyšuje konverzi C3 proteinu, která vede k odstranění C3 a tedy k vyřazení komplementového systému. Další aplikace tohoto vynálezu je založena na možnosti zvyšovat C3 konverzi v určitém místě a vytvářet tak na komplementu závislý efektorový mechanismus k atakování specifického cílového místa.

Konečným efektem tedy bude zvýšení C3 konverze. Modifikovaný protein je přidán do média (například krve), které obsahuje regulátory aktivace komplementu. Toho se pak může využít buď k odstranění nativního C3 z média, nebo k omezení C3 konverze na určité cílové místo.

Analog C3, jehož C3b fragment je rezistentní k působení faktoru I (například derivát popisovaný v příkladu 1), by vázal faktor B, který by pak byl štěpen faktorem D a nakonec by se disociovai na inaktivní formu. Jestliže by nedošlo k inaktivaci faktorem I, byl by modifikovaný C3b schopen se opakovaně vázat na nové molekuly faktoru B a zvyšovat tak jeho inaktivaci. Další možnou aplikací modifikace popsané v tomto vynálezu by tedy byla inaktivace alternativní dráhy odstraněním ·· • ·· ······ η Ο ······· ··· · — 12 — ·.· · · ·· ··· ·» ··· *·· ·· ·· aktivity faktoru Β. Analogický přístup by též mohl být použit k modifikaci C4, která by vedla ke ' zvýšené spotřebě C2, čímž by došlo k vyřazení klasické dráhy aktivace komplementu.

Vynález zahrnuje jakékoliv další proteázy, které se používají., anaLogickým způsobem jako C3bBb, jenž štěpí C3 na C3b i za přítomnosti regulátorů aktivace komplementu.

Vynález také zahrnuje DNA sekvence, které kódují protein popisovaný ve vynálezu, stejně tak jako i DNA konstrukty obsahující tyto DNA sekvence.

DNA sekvence zahrnují všechny další sekvence, které, díky degenerovanosti genetického kódu, též kódují danou sekvenci aminokyselin, nebo které jsou s touto sekvencí značně homologní. Tyto sekvence jsou tedy v rámci tohoto vynálezu také popsány.

Sekvence nukleových kyselin, které jsou značně homologní jsou v rámci tohoto vynálezu též uvedeny. Značná homologie může být stanovena buď na úrovni nukleových kyselin, nebo na úrovni aminokyselin. Na úrovni nukleových kyselin mohou být za sekvence s velkou homologií považovány takové sekvence, které hybridizuji se sekvencemi tohoto vynálezu za stringentních podmínek (například.· při 35 až 65°C v roztoku soli o koncentraci zhruba 0,9M). Na úrovni aminokyselin mohou být proteinové sekvence považovány za značně homologní s jinými proteinovými sekvencemi tehdy, vykazuje-li významnou aminokyselinovou homologií. Aminokyselinové sekvence mohou být homologní z 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, či dokonce z 95%, přičemž výhodná je co největší homologie.

Jak již bylo zmíněno, proteiny tohoto vynálezu mohou být použity tak, aby mohly být účinky aktivace komplementu lokalizovány do určitého místa. Toho lze dosáhnout pomocí konjugace proteinu na funkční skupinu, jež se bude vázat na požadovanou tkáň.

-13Vynález dále popisuje konjugát obsahující protein podle vynálezu navázaný na specifickou vazebnou skupinu, například na specifický vazebný protein. Příkladem takového proteinu může být protilátka nebo její antigen vázající fragment.

Proteiny podle vynálezu budou podávány léčenému subjektu za účelem vyvolat požadovaný terapeutický efekt. Vynález tedy dále popisuje:

a) protein podle vynálezu pro použití v léčbě

b) použití proteinu nebo konjugátu podle vynálezu pro výrobu léku, vhodného pro snižování koncentrací proteinů komplementové dráhy a zejména pro použití při prevenci odmítnutí cizorodého materiálu.

c) farmaceutickou kompozici obsahující jeden nebo více proteinů nebo konjugátů podle vynálezu spolu s jedním nebo více farmaceuticky snesitelnými nosiči a/nebo excipienty

d) způsob snížení koncentrace proteinů komplementové dráhy v savčím organismu, který zahrnuje podání proteinů podle vynálezu tomuto savci, ve výhodném provedení ve formě farmaceutické kompozice.

Farmaceutické kompozice mohou být podávány ve formě jednotkových dávek, které obsahují určité množství účinné složky na dávku. Takováto jednotka může například obsahovat minimálně 1 mg účinné složky a výhodně 2 až 3mg účinné složky. Horní mez množství účinné složky může záviset na mnoha faktorech,· jako například na druhu onemocnění, které se má léčit, způsobu administrace, věku, hmotnosti a stavu pacienta, jakož i na ekonomických důvodech. Lze uvést, že jednotková dávka může obsahovat až 10 mg účinné složky nebo dokonce i až 100 mg účinné složky.

·

Proteiny podle vynálezu mohou být použity in vivo pro zablokování komplementové kaskády. To může být výhodné například za následujících okolností:

a) při prevenci komplementem způsobeného zničení nebo poškození transplantátu a to zejména xenotrasplantátu (transplantátu z jiného ' živočišného druhu) ' a nebo nesouhlasného xenotrasplantátu (xenotrasplantátu, kde donor a akceptor nesou nesouhlasné determinanty, discordant xenograft). Akceptorovi transplantátu je v tomco případě zablokován komplement (je dekomplementován) a v tomto stavu je udržován až do chvíle, kdy se transplantát ujme nebo je nahrazen kompatibilnějším orgánem.

Počáteční ošetření je třeba provést několik dní před transplantací. V případě krize způsobené odmítnutím transplantátu může být zapotřebí provést dodatečnou dekomplementaci. Léčbu je možno doprovázet antihistaminiky, kterými lze kontrolovat případné celkové zánětlivé reakce (například vazodilataci), ke kterým může dojít díky vzniku C3a a/nebo C5a.

Dekomplementace může být rovněž výhodná při použití umělých orgánů nebo tkání (například dialyzační membrány v umělé ledvině), které aktivují komplementový systém. Jak již bylo popsáno dříve, protein podle vynálezu může být podán buď v neaktivované formě, nebo ve formě funkčního proteinu podobného C3b přeformované aktivní C3 konvertázy nebo ve fromě (podobné C3bBb).

Všechny tyto formy mohou být podány libovolným způsobem, při kterých dojde z cirkulujícím C3 intravenózně atd.) ke kontaktu (například aktivní tedy konvertázy subkutánně,

Jiným možným příkladem použití je léčba ex vivo, například propouštěním krevního oběhu přes matrici, na které je navázána aktivní konvertáza. Toto uspořádání • · • · « · • ·

-15může být výhodné tím, že umožní odstranit (například dialýzou) anafylaktické peptidy (C3a a C5a) a další nízkomolekulární mediátory zánětu (například histamin nebo oxid dusný) ještě předtím, než· je dekomplementovaná krev (nebo plazma) vrácena do krevního oběhu pacienta.

b) po vážné operaci. Pacient je v takovém případě dekomplementován výše popsanými způsobem výhodně před operací, nebo je-li to nutné po operaci, a v tomto stavu je udržován až do chvíle, kdy se sníží riziko dodatečného vnitřního poranění způsobeného na komplementu závislou imunitní reakcí.

c) pro minimalizaci komplementem způsobeného poškození po nechirurgickém poranění. V těchto případech se dekomplemetáce provede po zranění, ale framaceutické kompozice a způsoby jejich aplikace jsou jinak obdobné výše posaným. To může být zvláště výhodné, je-li pro uzdravení nutná reperfúze ischemické tkáně krevním oběhem (například ischemie myokardu, omrzliny, popáleniny atd.)

d) pro minimalizaci komplementem způsobeného poškození v důsledku interakcí mezi protilátkou a antigenem. Kompielementem zprostředkovaná obranná reakce je zvláště nežádoucí při autoimmunních onemocněních, které mohou zahrnovat glomerulární nefritidu (zánět ledvin), hemolytickou anémii, myasthenii gravis (těžkou svalovou ochablost), diabetes prvního typu, revmatickou artritidu a roztroušenou sklerózu. Zablokování komplementu během krizí může zmírnit a ulehčit stavu pacienta, například při lokálním aplikaci na kloub při revmatické artritidě.

e) pro . zvýšení citlivosti určitého patogenu ke komplementem zprostředkované imunitní odpovědi. Při tomto přístupu se nepoužije superaktivní C3 konvertáza, která by všeobecně snížila koncentraci C3, ale místo toho se aplikuje C3 konvertáza lokálně, tak aby se zakoncentrovala konverze C3 na tomto specifickém cíli.

-16·· ··

Takovým cílem může být patogenní organismus jako je bakterie, virus nebo jiný parazit, nebo zhoubná buňka nebo tkáň hostitele, jako například nádorová buňka nebo buňka infikovaná virem. C3 konvertáza může být na cílovou buňku nasměrována buď lokální administrací (například přímou injekcí v médiu, které stíží její další disperzi do oběhu) nebo pomocí navázání na cílově specifickou skupinu, například protilátku. Modifikovaný protein tak může být navázán na specifický imunoglobulin buď chemickým postupem, nebo spojením kódujících sekvencí DNA pro oba -tyto proteiny a expresí a purifikaci fúzních proteinů (například v případě IgG může být buď lehký nebo těžký řetězec navázán na protein C3 a poté společně exprimován nebo mohou být oba řetězce protilátky zkombinovány v jeden úplný fú;

navázání C3 je kódujících sekvencí (například sekvencí pro leucinové zipy) do DNA. obou fúzních partnerů (například modifikovaného proteinu C3 a specifické protilátky) tak, aby se po smíchání exprimované proteiny samy spojily a vytvořily stabilní konjugáty. Fúzní protein může být poté podáván lokálně nebo do celkového oběhu.

lí polypeptid) . Dalším specifické skupiny na vložení specifických způsobem vhodným pro modifikovaný protein

Pro transport proteinu podle vynálezu lze použít rovněž lipozómů, které nesou na povrchu specifickou protilátku a modifikovaný protein podle vynálezu buď rovněž na povrchu nebo uvnitř lipozómů, a/nebo lze použít virionů, například navržených tak, aby na svém povrchu nesly vhodné proteiny. Tato strategie může být použita přímo a to jak samostatně nebo v kombinaci s jinou léčbou v libovolném stádiu onemocnění. Zvláště výhodná může být při eliminaci všech zbylých nádorových buněk po chirurgickém odstranění nádoru. Konjugáty modifikovaného proteinu podle vynálezu s protilátkou mohou být rovněž použity pro eliminaci patogenních tkání ex vivo. Například pro usmrceni leukemických buněk v extrahované

0

kostní dřeni a navrácení zbývající dřeně do těla pacienta.

Popřípadě mohou být lymfocyty, které neodpovídají typu MHC příjemce, eliminovány z kostní dřeně ještě před transplantací. Rovněž upravený protein podle vynálezu může-být- navázán k antigenu a takovýto konjugát může být použít pro útok na lymfocyty s nežádoucí reaktivitou a to buď v in vivo nebo ex vivo podmínkách. Takový postup lze použít například pro eliminaci nežádoucích lymfocytů reagujících s transplantátem nebo tkání hostitele.

Stejný způsob lze použít pro léčbu jiných druhů a to za použití buď derivátu lidského modifikovaného protein podle vynálezu nebo podobného analogu připraveného specielně pro daný druh.

Vynález bude popsán v následujících příkladech, které však vynález žádným způsobem neomezují. Příklady jsou ilustrovány následujícími obrázky.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1: znázorňuje předpovězenou sekvenci lidského proteinu C3 kódovanou konstruktem PC3; v obrázku je použit standardní jednopísměnový aminokyselinový kód

Obrázek 2: znázorňuje cDNA sekvenci v konstruktu PC3; v obrázku je použit standardní jednopísměnový deoxynukleotidový kód pro sense-vlákno, sekvence je zapsána ve směru 5'-3'.

Obrázek 3: vizualizace modifikovaných proteinů podle vynálezu.

Obrázek 4: znázorňuje účinek různých mutací na lidský protein C3, při kterých byla zaměněna aminokyselina Arg

-18• ·

1303 (místo 1) nebo Arg 1320 (místo 2), tedy na místech, kde dochází ke štěpení zprostředkovanému faktorem I.

1. vzorky byly značené biosynteticky sírou [^J5S].

2. reakce byly provedeny za normální iontové síly.

3. -- -^proteiny byly imunoprecipitovány protilátkou anti-C3

4. byla provedena SDS-PAGE za redukčních podmínek.

5. byla provedena autoradiografie.

Obrázek 5: znázorňuje zvýšenou rezistenci lidského proteinu C3 s mutací Arg 1303 -> Gin 1303 vůči inaktivaci faktory I a H. Plné body platí pro přirozeně se vyskytující protein C3, prázdné čtverečky pro mutovaný. Na svislé ose je uvedeno procento lyžovaných buněk, na vodorovné ose je množství faktoru H/I v pg/ml.

Obrázek 6: znázorňuje analýzu štěpení C3 konvertázy zmutované v aminokyselinových zbytcích 752 až 754 a 758 až 760. Na obrázku je fotografie western blotu vyvolaného po elektroforéze na 7,5% polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS za redukčních podmínek, elektrotransferu na nitrocelulózovou membránu, inkubaci s ovčí protilátkou proti lidskému proteinu C3 a vizualizaci křenovou peroxidázou navázanou na protilátku proti ovčím imunoglobulinům. Pro vizualizaci bylo použito metody Enhanced ChemiLuminescence od firmy Amersham, Velká Británie a výsledek byl zachycen na rentgenovém filmu. Štěpící reakce a detekce jsou popsány v příkladu 4 s odvoláním na výsledky z obrázku 3.

V jednotlivých stopách byly puštěny následující vzorky:

Stopy 1 až 4: přirozeně se vyskytující protein C3 (exprimovaný v buňkách COS) • ·

Stopy 5 až 8: Mutantní protein C3 (aminokyselinové zbytky 752 až 754 byly změněny na Gly-Ser-Gly a zbytky 7_58 až 760 rovněž na Gly-Ser-Gly (protein byl exprimovaný v buňkách COS)

Stopy 1,5: žádný přídavek

Stopy 2,6: + CVF3B

Stopy 3,7: + faktory Kal.

Stopy 4,8: + CVFBB + faktory Hal

Jednotlivé elektroforetické proužky indikované	šipkami
j sou:
A:	C3 řetězec alfa
B:	C3 řetězec alfa'
C:	C3 řetězec beta
D: štěpný produkt C3 řetězce alfa' o velikosti 68 kDa
E:	těžký řetězec IgG
Obrázek	7: znázorňuje analýzu štěpení znázorňuje	analýzu

štěpení radioaktivně značeného faktoru B faktorem D v přítomnosti přirozeně se vyskytující a mutantní formy proteinu C3 '(C3i)

Jde o fotografii autoradiografického záznamu gelu z SDSPAGE. Všechny vzorky obsahovaly faktor D a faktor B značený . Vzorky byly 3 hodiny inkubovány při teplotě 37°C. V jednotlivých číslovaných stopách vzorky obsahovaly:

1. - samotný pufr

2. 1/125 přirozeně se vyskytujícího proteinu C3

3. 1/25 přirozeně se vyskytujícího proteinu C3

4. 1/5 přirozeně se vyskytujícího proteinu C3

5. 1/25 mutantního proteinu C3 (mutované zbytky 1427 Gin, 1431 Asp a 1433 Gin)

6. 1/5 mutantního proteinu C3

7. neředěný mutantní protein C3

Šipkami jsou označeny tyto elektroforetické proužky:

A. Neštěpený faktor B značený ¹²⁵I (93 kDa)

B. produkt štěpení o velikosti 60 kDa (Bb)

C. produkt štěpení o velikosti 33 kDa (Ba)

Obrázek 8: znázorňuje SDS-PAGE elektroforézu dokazující vznik konjugátu mezi C3i a IgG.

Jde o 4% akrylamidový gel (SDS-PAGE) spuštěný za neredukujících podmínek po obarvení Coomassie modří. Číslované stopy obsahují vzorky:

1. PDP-IgG

2. C3i

3. PDP-IgG + C3i reakčni směs Šipkami jsou naznačeny:

A. pravděpodobný konjugát C3i a IgG (350 kDa)

B. protein C3i (200 kDa)

C. IgG (150 kDa)

Obrázek 9: demonstruje specifické nasměrování aktivity konjugátu C3 konvertázy proti ovčím erytrocytům. Tento graf znázorňuje·% lyžovaných ovčích erytrocytů (osa Y) po potažení různými ředěními (osa X) buď C3i-IgG konjugátu (čtverečky) nebo PDP-IgG (kroužky) nebo C3i (kosočtverečky), po kterém následovalo promytí, vznik C3 konvertázy pomocí properdinu a faktorů B a D a konečně

vyvolání lýzy pomocí NGPS v CFD/EDTA, viz popsané způsoby. Pouze konjugát indukuje lýzu buněk a tato lýza je závislá na použité dávce.

Obrázky 10 a 11: ukazují štěpné vlastnosti mutantní formy C3 nazvané DV-1AM (viz příklady 12 až 14).

Na obrázku 10 byly supernatanty COS buněk obsahující exprimovanou přirozeně se vyskytující formu C3 (A) a mutantní formu DV-1AM (B) ošetřeny 1) ničím; 2) přídavkem CVFBb; 3) přídavkem 10 pg/ml faktoru I a 50 pg/ml faktoru H; nebo 4) CVFBb plus 10 pg/ml faktoru I a 50 pg/ml faktoru H, poté imunoprecipitovánv a analyzovány pomocí SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózovou membránu, viz příklad 4. V tomto případě byl blot vyvolán za použití kombinace krysích monoklonálních protilátek, klonu 3 a klonu 9, reagujících s C3dg oblastí proteinu C3 a s produkty její fragmentace (viz Lachmann, P.J. a další, J. Immunol, 41: strana 503 (1980). Poté následovala detekce konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti krysím imunoglobulinům (Sigma) a vizualizace pomocí ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Na obrázku 11 byly supernatanty z buněk COS obsahující exprimovaný mutantní protein DV-1B (A), přirozeně se vyskytující formu proteinu C3 (B) a mutantní protein DV-6 (C) ošetřeny v jednotlivých stopách následujícím způsobem: 1) ničím ; 2) přídavkem 10 pg/ml faktoru I a 50 pg/ml faktoru H; 3) CVFBb; 4) CVFBb s přídavkem 10 pg/ml faktoru I a 2 pg/ml faktoru H; 5) CVFBb s přídavkem 10 pg/ml faktoru I a 10 pg/ml faktoru H; nebo 6) CVFBb s přídavkem 10 pg/ml faktoru I a 50 pg/ml faktoru H, poté imunoprecipitovány a analyzovány pomocí SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózovou membránu, viz příklad 4. V tomto případě byl blot vyvolán za použití polyklonální ovčí anti-C3 protilátky.

Obrázek 12: znázorňuje analýzu proteinu příbuzného C3, který vzniká translací z genu s mutací s posunem čtecího rámce. Tento produkt je popisován jako HDV-3X. Výsledky proteinu HDV-3X jsou srovnány s výsledky pro protein DV3, který stejně jako protein HDV-3X obsahuje mutace T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N a K1036I, ale na rozdíl od HDV-3X nemá upravený C-konec.

Supernatanty z buněk COS obsahující exprimovaný protein DV-3 (A) a mutantní protein HDV-3X (B) byly v jednozlivých stopách ošetřeny následujícím způsobem: 1) ničím 2) přídavkem CVFBb + 10 pg/ml faktoru I; 3) přídavkem CVFBb a 10 μσ/ml faktoru I s 1 gg/ml faktoru H; 4) přídavkem CVFBb a lOug/ml faktoru I a 5 pg/ml faktoru H; 5) přídavkem CVFBb a lOug/ml faktoru I a 25 pg/ml faktoru H; poté imunoprecipitovány a analyzovány pomocí SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózovou membránu, viz příklad 4. V tomto případě byl blot vyvolán za použití kombinace krysích monoklonálních protilátek, klonu 3 a klonu 9, reagujících s C3dg oblastí proteinu C3 a s produkty její fragmentace (viz Lachmann, P.J. a další, J. Immunol, 41: strana 503 (1980). Poté následovala dezekce konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti krysím imunoglobulinům (Sigma) a vizualizace pomocí ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Obrázek 13 poukazuje k experimentu, ve kterém byly supernatanty z buněk COS obsahující exprimované mutantní formy proteinu C3 E1Q2(A), E1Q2QG3(B) a E1Q2E3(C)

ošetřeny	2,5	hodinovou inkubací	(při teplotě	37°C)
v jednotil	vých	stopách následujícími	přídavky:
1) CVFBB	s	10 pg/ml faktoru I;	2) CVFBB s 10	pg/ml
faktoru I	a	50 pg/ml faktoru H;	3) CVFBB s 10	pg/ml
faktoru I	a	25 pg/ml sCRl; poté	imunoprecipitovány a

analyzovány pomocí SDS-PAGE a elektroblotovány na

-23nitrocelulózovou membránu, viz příklad 4. V tomto případě byl blot vyvolán za použití kombinace krysích monoklonálních protilátek, klonu 3 a klonu 9 (viz příklad 12) reagujících s C3dg oblastí proteinu C3 a s produkty její fragmentace (viz Lachmann, P.J. a další, J. Immunol,

41:__________strana 503 (1980). Poté následovala detekce konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti krysím imunoglobulihům (Sigma) a vizualizace pomocí ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Elektroforetický proužek o velikosti 86 kDa (označený šipkou) je produktem štěpení zprostředkovaného faktorem I na třetím štěpném místě, přičemž nedošlo k předchozímu štěpení ve štěpných místech 1 nebo 2.

Obrázek 14 poukazuje k experimentu, ve kterém byly supernatanty z buněk COS obsahující exprimované mutantní formy proteinu C3 a to NC3 (A) , FT-1 (B) , FT-2 (C) , FT-3 (D) , FT-4 (E) a FT-5 (F) v jednotlivých stopách ošetřeny inkubací trvající 2,75 hodiny při teplotě 37°C následujícími přídavky: 1) bez přídavku 2) CVFBb s 10 pg/ml faktoru I a 50 pg/.ml faktoru H; poté imunoprecipitovány a analyzovány pomocí SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózovou membránu, viz příklad 4. V tomto případě byl blot vyvolán za použití kombinace krysích monoklonálních protilátek, klonu 3 a klonu 9 (viz příklad 12) reagujících s C3dg oblastí proteinu C3 a s produkty její fragmentace (viz Lachmann, P.J. a další, J. Immunol, 41: strana 503 (1980) . Poté následovala detekce konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti krysím imunoglobulinům (Sigma) a vizualizace pomocí ECL činidla a techniky firmy Amersham.

-24• · · • · · · · · ·«

Obrázek 15 poukazuje k experimentu, ve kterém byly supernatanty z buněk COS obsahující exprimované mutantní formy proteinu C3 a to NC3 (A), FR-1 (Β) , FR-2(C), FR-3 (D) , FR-4 (E) a FT-2 (F) v jednotlivých stopách ošetřeny inkubací trvající 2,5 hodiny při teplotě 37°C následujícími přídavky: 1) bez přídavku; 2) CVFBb s 10 pg/ml faktoru I a 50 ug/ml faktoru H; poté imunoprecipitovány a analyzovány pomocí SDS-PAGE a elektroblotovány na nitrocelulózovoú membránu, viz příklad 4. V tomto případě byl blot vyvolán za použití kombinace krysích monoklonálních protilátek, klonu 3 a klonu 9 (viz příklad 12) reagujících s C3dg oblastí proteinu C3 a s produkty její fragmentace (viz Lachmann, P.J. a další, J. Immunol, 41: strana 503 (1980) . Poté následovala detekce konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti krysím imunoglobulinům (Sigma) a vizualizace pomocí ECL činidla a techniky firmy Amersham.

Pro přehlednost je níže uvedena tabulka, ve které jsou uvedeny vztahy mezi nároky vztahujícími se k určitému modifikovanému proteinu, který může být použit jako C3 konvertáza odolná k regulačnímu snížení aktivity a mezi příklady a tabulkami popisujícími tento protein.

• · · · • · · ·

abulka A:	Oblast (číslování je	vztaženo k lidské C3
:onvertáze)	sekvence aminokyselin o	které se předpokládá,
e je důležitá pro rezistenci vůči regulačnímu snížení .ktivity (down regulaci)
Nároky	Oblast	Příklad	Tabulka
5 až 8	1303/1320	1 až 6,	11
9 až 11	7 58 až 780/752 až 754	7
12	1427, 1431, 1433	8	I
13 až 15	992 až 1005	12, 13	II
16 až 19	1152 až 1155	14	II
20 až 29	1546 až 1663	15, 17	III
30 až 34	954 až 955	16

Příklady provedení vynálezu

Následující standardní postupy a definice je možno použít ve všech příkladech:

Není-li uvedeno jinak, všechny zmiňované součásti komplementu jsou lidského původu a pro všechny proteiny a jejich odvozené fragmenty je použita standardní terminologie (to znamená jako v Rother, K. E., Till, G.O. (editoři) (1988) v knize The complement System (nakladatelství Springer, Berlin Heidelberg, SRN)). Kromě toho výraz C3i se vztahuje na všechny molekulární formy C3, ve kterých není intaktní thioesterová vazba, ale které si uchovávají polypeptid C3a v alfa řetězci.

Lidská C3 cDNA a kódující sekvence jsou číslovány tak, jak je ukázáno na obrázku 2, používá se číslování užité v nukleotidové databázi EMBL (viz de Bruijn, M.H. &

-26• · · * »

Fey, G.H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. S2: strana 708 až 712). Uvedená sekvence je také sekvence našeho konstruktu ('PC3'), ve které chybí prvních 11 nukleotidů z 5'nepřekládané oblasti, tak jak je uvedena v literárním odkazu (viz de Bruijn, M.H. & Fey, G.H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. S2: strana 708 až 712), a proto je první báze označena číslem 12. Předpokládaný iniciační kodón obsahuje nukleotidy s číslem 61 až 63, kodón pro koncový serinový aminokyselinový zbytek v beta řetězci sestává z nukleotidů 127 až 129 a kodón pro koncový aminokyselinový serinový zbytek v alfa řetězci jsou nukleotidy 2074 až 2076.

Číslování v sekvenci proteinu je provedeno podle sekvence prekurzoru tak, jak je uvedeno v Obrázku 1, je odvozeným překladem (translací) sekvence DNA v dodatku 1. Předpokládá se, že aminokyseliny 1 až 22 obsahují signální sekvenci, která je odstraněna během biosyntézy. Dále se předpokládá, že aminokyseliny 668 až 671 se odstraní v okamžiku, kdy se prekurzor štěpí na alfa a beta řetězec.

Následující zkratky mají níže uvedené významy:

CVF - faktor kobřího jedu,

ELISA - enzymoimunologické adsorpční testy,

E.coli - Escherichia coli, kb - kilobáze,

HSV-1 - herpes simplex virus prvního typu,

PBS - pufrovaný fyziologický roztok

COS -1 je buněčná linie odvozená z opičích ledvinových buněk.

-//Následující zkratky platí endonukleázy: - AflII, Dral,

HindlII, Nael, Nhel, Xbal.

pro

různé restrikční DralII, EcoRI, EcoRV,

Standardní způsoby'

Metody biologických používané postupech, ve standardních molekulárně jako jsou izolace plazmidů, elektroforézy na agarózovém gelu a ligace DNA lze nalézt například v Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. vydání, Cold Spring Karbor Laboratory Press).

Dvouvláknová DNA. byla sekvenována pomocí soupravy 'Sequenase' verze 2.0 dodávaného firmou United · States Biochemicals. Exprese proteinu C3 byla měřena pomocí ELISA testů, kde se používaly plastové destičky, které byly potaženy afinitně čištěnou polyklonální ovčí protilátkou proti lidskému proteinu C3. Na tyto potahované destičky se nanášely vzorky supernatantu z kultury. Navázaný protein C3 se detekuje monoklonálními krysími protilátkami proti proteinu C3 kojugovanými s alkalickou fosfatázou za použití chromogenního substrátu p-nitrofenylfosfátu. Testy se kalibrují pomocí purifikovaného lidského plazmatického proteinu C3.

Metody používané pro purifikaci proteinů komplementu a CVF a pro přípravu afinitně čištěných antiC3 protilátek použitých pro analýzu mohou být nalezeny například v Harrison, R.A. a Lachmann, P.J. (1986) Handbook of Experimental Immunology (editoři Weir, Herzenherg, Blackwell a Herzanberg, Blackwell, Oxford) 4. vydání. Rovnocené reagencie mohou být získány-také koupí od společnosti Sigma.

-28·· «

Sekvence cDNA kódující protein C3

Sekvence kódující protein C3 cDNA byly konstruovány ze dvou segmentů izolovaných z cDNA knihovny z lidských jaterních buněk, která byla získaná pomocí náhodných primerů, Tato knihovna se nalézá ve vektoru pGEM4 (Promega). Pět oligonukleotidů, odpovídajících známým segmentům v lidské sekvenci kódující protein C3, bylo radioaktivně označeno pomocí T4 poiynukleotidkinázy a (γ-³²P) ATP a použito jako hybridizační sonda s knihovnami přenesenými z agarózových ploten. Byly izolovány dva klony obsahující inzerty o velikosti přibližně 4 kb. Štěpením restrikčními endonukleázami, hybridizaci se specifickými polynukleotidovými sondami a částečnou sekvenční analýzou se prokázalo, že jeden z těchto klonů (Ά13') obsahoval 5'-konec fragmentu mRNA o velikosti 5.1 kb, zatímco druhý ('B44') dosahoval až k jejímu 3'konci.

Tyto inzerty se tudíž překrývají v oblasti přibližně 3 kb, která zahrnuje specifické štěpné místo pro EcoRI restrikční enzym. Nekompletní 5'část A13 lze odštěpit EcoRI a Nhel a nahradit kompletní částí izolovanou z B44 za užití štěpení EcoRI a Xbal. Oba kusy byly přečištěny gelovou elektroforézou na agarózovém gelu s nízkým bodem tání (low-melting point agarose). Potom byly spojeny ligací dohromady pomocí T4 DNA ligázy a tak byl vytvořen vektor ('PGC3') obsahující 5,1 kb dlouhý fragment DNA, která kóduje celý proteinový prekurzor C3.

Sekvence linkeru u 5'konce C3 kódující oblasti obsahuje dva ATG kódony, které jsou možnými chybnými místy pro iniciaci translace. Proto byly tyto kódony odstraněny z plazmidů způsobem „gapped plazmid mutageneze, jak je popsáno v Příkladu 1, s použitím oligonukleotidu PL-ATC-3 (taggg agacc ggaag cttgc cctct ccctc tgtcc ctcgt) . Tím bylo vynecháno přibližně 50 bází z linkerové-adaptorové DNA, aniž by se tím změnila

• ·· ·· «· · · · · • · · ·· • « ··· · · • · · · ··· ·· ·· sekvence kódující C3. Takto přeměněný vektor o velikosti 7,7 kb, který obsahuje sekvenci cDNA o velikosti 5,1 kb kódující protein C3 a sekvenci o velikosti 2,6 kb patřící vektoru pGEM4 (Promega) je dále označován jako PC3.

C3 kódující oblast v plazmidů PGC3 je kompletně sekvenovaná a vykazuje pouze čtyři změny od již dříve publikované lidské cDNA sekvence pro protein C3 (3 alela), viz publikace de Bruijn, M.H. & Fey, G.H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82: strana 708 až 712.

(i) změny C2481 za G a C2805 za T nemění kódovaný protein (ii) změna T1001 za C kóduje dříve popsanou polymorfní formu HAV 4-1-(leucin314->prolin) (20) a (iii) G2716 za A kóduje záměnu valinu 886 za isoleucin, což nebylo do této doby prokázáno v lidské C3, ačkoli Ile byl v této pozici nalezen v krysí a myší C3.

Sekvence podle vynálezu obsahují iniciační a terminační (stop) kodóny, jakož i celou signální sekvenci a mohou tedy kódovat funkční protein C3.

Pomocí ELISA testů byly detekovány hladiny koncentrací nad 1,7 pg/ml. Těchto hodnot bylo dosaženo expresí přirozeně se vyskytujícího typu C3 v supernatantech kultur COS-1 buněk. K transfekci těchto buněk byl použit lipofektamin a expresní vektor pcDNA3 (Invitrogen). Nedetekovatelné hladiny proteinu C3 byly zjištěny u buněk, kde byla provedena transfekce pouze samotným vektorem pcDNA3. Analýzou produktů exprese pomocí štěpných reakcí s následnou imunopřecipitací, SDS polyakrylamidovou elektroforézou a imunoblotem bylo dále prokázáno, že:

(i) primární produkt translace byl bezchybně přeměněn v maturovanou dvouřetězcovou formu, • fc

-30• · · · · · (ii) tento produkt lze, stejně jako je tomu u nativního proteinu C3, štěpit na C3b pomocí C3 konvertázy (CVFBb), a (iii) exprimovaný protein nebylo možné, stejně jako nativní protein C3, štěpit pomocí faktoru H a faktoru I, ale bylo ho možno štěpit po konverzi na C3b pomocí enzymu C3 konvertázy. Toto vše potvrzuje, že náš výchozí piazmid může být přeložen do funkčního proteinu C3.

Další popis konstrukce a exprese sekvence kódující protein C3 lze nalézt v publikaci Taniguchi-Sidle, A. a Isenman, D.E. (1992) J. Biol. Chem. 267: strana 635 až 643 .

Příklad 1: Příprava oroteinu

C3 s argimnovymi aminokyselinovými zbytky v obou štěpících místech pro faktor I v pozicích 1303 a glutaminové zbytky, štěpení C3b fragmentu faktorem I.

(aminokyselinové zbytky

1320) zaměněnými za čímž bylo zabráněno

a) Mutageneze

Byly použity následující mutagenní oligonukleotidy

QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc)

QRI2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag) a

AFL4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaa a c) a dále také odpovídající anti-sense oligonukleotidy ORIla (ggtgatcttggaagctttggctgggcagttg),

QRI2a (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) a AFL4149a (gttttatggtgacctttaaggtcgaatttatta).

• ·

-31·· · • ·

Oligonukleotidy QRI1 a QRIln specifikují záměnu argininu za glutamin v místě štěpení faktorem I, a to u aminokyselinového zbytků 1303 v sekvenci prekurzoru proteinu C3 (děje se to záměnou nukleotidů v cDNA sekvenci, a to u G3968 a C3969 v obou případech za A) . Podobně...je .tomu u QRI2 a QRI2n, . které ovlivňují stejnou záměnu v štěpném místě faktoru, a to u aminokyselinového zbytku 1320 (změnou v nukleotidové sekvenci G4019 za A).

AFL4149 a AFL4149a zavádějí štěpící místo pro restrikční endonukleázu ' AflII v pozici 4149 v cDNA sekvenci (záměnou C4149 za T) bez záměny kódované aminokyselinové sekvence. Tyto dva primery byly použity jako markéry, které umožnily identifikaci toho, že mutageneze proběhla úspěšně, a to právě na základě štěpení DNA produktu restrikčním enzymem AflII.

Mutageneze byla provedena způsobem „gapped plazmid mutageneze. Dávka PGC3 (ÚPGC3'), obohacená uridinem na místě thymidinu, byla vypěstována v E.coli kmenu CJ236 v přítomnosti 0,25 pg/ml uridinu. Tento plazmid byl štěpen enzymem Smál a produkt štěpení o velikosti 7,2kb ('US1') byl přečištěn na agarozové elektroforéze, čímž byl odstraněn 0,5kb dlouhý fragment pocházející z C3 sekvence (aminokyselinové zbytky 1463 až 1947). Další součást „gapped plazmidů ('DN2') byla připravena štěpením PGC3 restrikčními enzymy DralII a Nael. Část o velikosti 5,lkb byla purifikována pomocí dvojnásobného čištění na agarózové elektroforéze. 200 ng DN2 bylo smícháno s přibližně 500 ng US1 v 50 pl H₂O, zahřáto na 100°C a pomalu ochlazeno pod teplotu 50°C. Potom bylo přidáno 20 až 25 pl 2XT7 pufru (lOOmM TRIS/HCl/pK7.4/, 14mM MgCl₂, lOOmM NaCl, 2mM dithiotreitolu a 1 mM koncentrace každého z následujících nukleotidů - ATP, dATP, dCTP , dTTP a dGTP. Dále bylo přidáno ještě lOnmol každého z 5'-fosforylovaných mutagenních primerů (jedna reakce použila QRI1, QRI2 a • 0

-32AFL4149, ve druhé reakci byly použity QRIla,QRI2a a AFL4149a).

Směs byla znovu zahřáta na 7 0 °C po dobu 5 minut a pomalu ochlazena (během 30 až 60 minut) na 20°C. Za teploty 0°C bylo přidáno 10 jednotek T7 DNA poiymerázy a 80 jednotek T4 DNA ligázy. Směs (celkový objem byl 50 μΐ) byla nejprve inkubována po dobu 5 minut při teplotě 0°C a potom při pokojové teplotě také po dobu 5 minut a nakonec při teplotě 37°C po tři hodiny. 1 μΐ z každé směsi byl použit k transformaci ΙΟΟμΙ superkompetentních buněk XLI E. coli (Stratagene). Transformace byla provedena dle instrukcí výrobce.

K ampicilinu resistentní kolonie byly podrobeny štěpení restrikčním enzymem AflII a požadovené mutantní formy enzymů byly namnoženy v kulturách o objemu lOOml, ze kterých byly potom izolovány a sekvenovány plazmidy. Sekvenace se prováděla pomocí sekvenačního primerů C3pa3876, cttca tggtg ttcca agcct, který odpovídal nukleotidům 3876 až 3895 v cDNA pro protein C3. Prováděná sekvenace by měla charakterizovat mutace ve štěpných místech pro faktor I.

Další možné provedení gapped plazmid mutageneze je popsáno například v publikacích Hofer, B. a Kuhlein, B. (1993) Methods Enzymol. 217: strana 173 až 189. Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. a Inouye, M. (1984) Bio-Technology 2: strana 636 až 639.

b) Přenos mutantní DNA do eukaryotického expresního vektoru

Fragmenty kódující C3 byly z mutant vyňaty pomocí dvojnásobného štěpení restrikčními enzymy HindlII a Nael. Dále se použil enzym'Dral, kterým se rozštěpila zbývající část plazmidů, tak aby byla vyřazena pro další použití.

• ·

-33- ··· ·· ··· ···

Sekvence kódující protein C3 byla přečištěna pomocí elektroforézy na agarózovém gelu a zaligována do plazmidu pcDNA3 (Invitrogen), který byl linearizován použitím enzymů HindlII a EcoRV a defosforylován pomocí fosforylázy izolované z telecích střev. Ligační směs se použila k transformaci superkompetentních buněk kmene XL1 E. coli. Tyto buňky byly potom pěstovány na kultivačních plotnách obsahujících ampicilin.

Tři nebo čtyři náhodně vybrané, k ampicilinu resistentní kolonie byly potom přeneseny a pěstovány ve 2 až 3 ml kulturách, které sloužily k izolaci plazmidové DNA v malém množství. Plazmidy obsahující správný inzert byly identifikovány pomocí štěpeni plazmidové DNA restrikčními endonukleázami EcoRI, HindlII a AflII. Odpovídající kolonie byly potom' pěstovány v kulturách o objemu 100 ml a plazmidy dále izolovány standardním postupem. Tyto mutanty byly od počátku konstruovány z PGC3 a proto si zachovaly dva zbývající kodóny ATG-5', které jsou připojeny ke kódující oblasti. Tato oblast (dále ještě včetně 5'C3 kódující sekvence o velikosti 3kb) byla vystřižena pomocí restrikčních enzymů HindlII a EcoRI a nahrazena ligací stejného segmentu vystřiženého z plazmidu PC3. Tyto rekonstruované vektory byly připraveny standardními postupy a použity pro transfekci COS buněk

c) Exprese přirozeně se vyskytujícího typu (divokého)proteinu C3 a mutantních forem proteinu C3

Mutantní formy a přirozeně se vyskytující forma proteinu C3 byly krátkodobě exprimovány z plazmidu, které byly transfekci vloženy do buněk buněčné linie COS-1. K transfekci byl použit lipofektamin (GIBCO) podle instrukcí dodavatele. Obvykle bylo 1 .až 1,5 χ 10⁵ buněk na jednu jamku kultivační desky s 6 jamkami podrobeno transfekci pomocí 2 až 4 pg plazmidu při použití 9pl lipofektaminového činidla. Supernatanty kultur byly • ·

-34• · · ·· ·· zkoumány na přítomnost sekretovaného proteinu C3. Typickým výsledkem byly výtěžky 0,3 až 1,7 pg na ml supernatantu 3 až 6 den po transfekci.

Výsledky

a) Příprava mutantních forem

Následující mutantní formy se jmenují podle mutagenních oligonukleotidových sekvencí, které· byly začleněny do sekvencí. Tyto mutanty byly také izolovány:

(i) 3 mutantní formy s oběma mutacemi QRI1 a QRI2 a dále s AFL4149: C3M-26, C3M-58 a C3M-61, (ii) 1 mutantní forma s mutacemi QRI1 aQRI2, ale bez mutace AFL4149: C3M-8 a (iii) 1 mutantní forma s mutacemi ORI2 a AFL4149, ale bez mutace QRI1: C3M-51 (byla použita v příkladu 3).

b) ověření, že účinky na funkci byly způsobeny mutacemi specificky vloženými na místa štěpení faktorem I.

Sekvenováním byla potvrzena správnost sekvencí a absence dalších změn v okolí 178 až 350 bází okolo zmutované oblasti každého z mutantů. Sekvence jedné mutantní formy (C3M-51, viz příklad 3) byla zkoumána po celé délce mezery (báze 2463 až 5067) použité pro mutagenezí, přičemž nebyly nalezeny žádné další odchylky od přirozené sekvence.

Dále bylo provedeno reprezentativní sekvenování celkem 2922 baží všech mutantů, přičemž nebyla odhalena žádná bodová mutace, která by mohla býti způsobena chybami polymerázy. Všechny exprimované mutantní formy vykazovaly dvouřetězcovou strukturu a jejich štěpení C3 • ·

-35konvertázami bylo normální. Celkově lze říci, že je velmi málo pravděpodobné, že by některá z mutantních forem obsahovala nežádoucí mutaci i když nebyly všechny kompletně sekvenovány.

Příklad 2:

Příprava v jednom v pozici proteinu C3 s argininovým štěpném místě faktor I 1303) pozměněným na glycinový zbytkem (zbytek zbytek

Bylo postupováno obdobně jako v příkladu 1 pouze stím rozdílem, že pro mutagenezi byly použity dvojice oligonukleotidů AFL4149 a QRI1 nebo AFL4149n a QRIln (t.j. nebyly použity oligonukleotidy QRI2 nebo QRI2n).

Výsledky

a) Získané mutantní formy

Byly izolovány dvě mutantní formy proteinu C3 s využitím oligonukleotidů QRI1 a AFL4149, ale bez QRI2 a to: C3M123 a C3M-I27. Mutantní forma C3M-I23 byl exprimován způsobem popsaným v příkladu 1.

Získaný protein byl štěpitelný pomocí CVFBb. Vzniklý produkt podobný C3b byl relativně (ve srovnání s přirozeným typem) rezistentní ke štěpení faktory I a H v pozici 1303, nicméně byl stále ještě štěpitelný v pozici 1320. Tento derivát C3b je tudíž částečně rezistentní vzhledem k faktoru I.

Příklad 3: Příprava C3 s argininovým zbytkem v oblasti štěpení faktorem I (zbytek v pozici 1320) pozměněným na glycinový zbytek

Bylo postupováno obdobně jako v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že pro mutagenezi byly použity oligonukleotidy

AFL4149 a QRI2 nebo AFL4149n a QRI2n (t.j. nebyly použity oligonukleotidy QRI2 nebo QRI2n). Navíc byl způsobem podle příkladu 1 připraven mutant s oligonukleotidy AFL4149 a QRI2 bez oligonukleotidu QRI1.

Výsledky

a) Získané mutantní formy

Byly izolovány 3 mutantní formy s využitím oligonukleotidů QRI1 a AFL4149, ale bez oligonukleotidu QRI2 a to: C3M-51, C3M-Q2 a C3M-Q13. Mutantní forma nazvaná C3M-53 byla exprimována způsobem popsaným v příkladu 1.

Získaný protein byl štěpitelný pomocí CVFBb. Vzniklý produkt podobný C3b byl relativně (ve srovnání s přirozeným typem) rezistentní ke štěpení fakrtory I a H v pozici 1320, nicméně byl stále ještě štěpitelný v pozici 1303. Tento derivát C3b je tudíž částečně rezistentní vzhledem k faktoru I.

Příklad4: Analýza funkčních účinků mutací

100 až 400 μΐ supernatantu z transfikovaných COS buněk bylo 2 hodiny inkubováno při teplotě 37°C.

Buňky COS byly infikovány pcDNA3 nesoucí následující inzerty:

1) nemutovanou sekvenci C3;

2) mutovanou C3M-I23 (se změnou Arg¹³⁰³->Gln)

3) mutovanou C3M-2 6 (se změnou Arg¹³⁰³->Gln a Arg¹³²⁰>Gln); a

4) mutovanou C3M-51 (se změnou Arg¹³²⁰->Gln) • ·

	-37-	• ·» w • · · · · • · · · ··· ·· ··· ·	• ··· · · • · · • ·· ··
200 pi	supernatantu	z kultur	3 dny po	trasfekci bylo	15
minut	inkubováno	při	teplotě	0°C	s 2	mM
fenylmethansulfonyl	fluoridem	(PMSF) a	poté	2 hodiny	při

teplotě 37°C s následujícími přídavky:

A) bez přídavku

B) s přídavkem přeformované C3 konvertázy, CVFBb (10 μΐ z 200 μΐ směsi obsahující 6,6 μg CVF, 100 μς faktoru B a 1,4 pg faktoru D v PBS s přídavkem 10 mM MgCl₂, směs byla nejprve preínkubována 15 minut při teplotě 37°C);

C) s přídavkem faktorů H (5 pg) a I (1 pg) a

D) s přídavkem CVFBb a faktorů Hal

Po inkubaci byly supernantanty za pokojové teploty imunoprecipitovány přídavkem 0,6 pg afinitně purifikované ovčí anti-lidské C3 protilátky a po 1 hodině bylo reakční směsi přidáno 20 μΐ 5% suspenze promvtých, formaldehydem fixovaných buněk Streptococcus sp. skupiny C. (protein G, Sigma) . Po 45 minutách při pokojové teplotě byly částice jednou promyty v PBS s 5mM NaN₂ a jednou v 20 mM Tris/HCi, 137mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,6 a poté byly naředěny 1% SDS/2% 2-merkaptoethanolem. Vzorky byly 5 minut zahřívány na 90 až 100°C. Poté byly eluáty rozděleny elekroforézou na akrylamidovém gelu (SDS-PAGE), elektricky přeblotovány na nitrocelulózu a proužky charakteristické pro C3 byly detekovány pomocí afinitně purifikované.ovčí anti-lidské C3 protilátky a konjugátu oslí anti ovčí protilátky s křenovou peroxidázou (Sigma). Pro detekci bylo použito substrátů pro zesílenou chemiluminiscenci od firmy Amersham. Je přiložen rentgenový snímek po 2 minutové expozici.

Viditelné elektroforetické proužky odvozené od proteinu C3 jsou naznačeny šipkami. Jednotlivé vzorky (1 až 4, A až D) odpovídají právě popsaným vzorkům. Významný

-38·· ·· » · · « > · ·· ·· · · ι • · « ·· *· elektroforetický pás o velikosti 50 kDa (mezi proužky 46 a 68 kDa), který se vyskytuje ve všech vzorcích je těžký řetězec IgG použitý pro imunoprecipitaci a později detekovaný konjugátem oslí anti-ovčí protilátky s křenovou peroxidázou.

Výsledky (viz obrázek 3)

1. Všechny neošetřené vzorky (1-A, 2-A, 3-A a 4-A) obsahují správně migrující proužky odpovídající alfa a beta řetězcům proteinu C3, z čehož vyplývá, že všechny mutanty se exprimují a jsou správně post-translačně zpracovávány.

Přítomnost 43 nebo 46 kDa elektroforetických proužků v těchto vzorcích indikuje přítomnost aktivity podobné faktorům H a I v živné půdě. Spontánní hydrolýzou proteinu C3 během 3 denního biosyntetického období vzniká protein C3i, který je touto aktivitou štěpen. V nezmutovaném proteinu C3 tak vznikají proužky o velikosti 43 kDa a 75 kDa (75 kDa proužek není vidět protože (i) je zakrytý 75 kDa proužkem řetězce beta, a (ii) protilátka použitá pro detekci ve western blotu vykazuje velmi malou afinitu k této části C3 řetězce alfa, přítomnost tohoto proužku byla potvrzena až další detekcí pomocí krysí monokionální protilátky (klonu-3) specifické pro tuto oblast. Přídavek faktorů Hal bez přítomnosti CVFHBb (vzorky 1-C, 2-C, 3-C, 4-C) , nerozštěpil zbývající C3, z čehož vyplývá, že jde o aktivní protein C3 (s intaktní thioesterovou vazbou).

2. Nezmutovaný protein C3 (1) je štěpen CVFHBb a vznikající C3b produkt je dále štěpen endogenními enzymy ve vzorku 1-B nebo dodanými faktory Hal ve vzorku 1-D. Elektroforetický proužek o velikosti 43 kDa indikuje štěpení v pozici Arg¹³²⁰ a protein o velikosti 68 kDa • · ► · « • « · · • ·

-39patrný po delších expozicích indikuje štěpení v pozici

3 Q

Arg .

3. Mutantní forma C3M-I23 (Arg¹³⁰³->Gln) byla štěpitelná pomocí CVFBb a vzniklý produkt byl poměrně odolný vůči aktivitě podobné endogenním faktorům Hal (2-B), se zřetelnými množstvími přetrvávajícího řetězce alfa (C3b), ale byl stále štěpitelný po přídavku faktorů Hal (2-D). Produkt o velikosti 43 kDa indikuje štěpení v pozici Arg^±J“'^; (slabý elektroforetický proužek o velikosti 71 kDa reprezentující druhý fragment alfa řetězce je patrný po delší expozici). Ani po delší expozici však nebyl patrný proužek proteinu o velikosti 68 kDa, z čehož lze soudit, že tento mutant je odolný proti štěpení v místě mutace Gin¹³⁰³ .

4. Mutantní forma proteinu C3M-2 6 (Arg^l303>Gln, Arg¹³ⁱ⁰->Gln) byla štěpitelná pomocí CVFBb a vznikající produkt podobný C3b (alpha’) byl odolný vůči aktivitě podobné endogenním faktorům Hal (vzorek 3-B). Tento produkt byl rovněž velmi odolný k přídavku faktorů Kal (vzorek 3-D) ve srovnání s nemutovaným proteinem C3 (vzorek 1) a dalšími mutanty (vzorky 2 a 4) . Bylo sice detekováno malé množství proteinu o velikosti 46 kDa z čehož plyne určitá možnost štěpení v místě mutace Gin¹“⁰³ (doprovázející proteinový fragment o velikosti 68 kDa byl rovněž patrný po delší expozici). · Na provedené elektroforéze bylo velmi málo nebo vůbec žádný proteinový fragment o velikosti 43 kDa, který by odpovídal štěpení v místě Gin¹³²⁰ .

Proto lze předpokládat, že mutace Arg->Gln v pozici 1303 je pro prevenci štěpení faktorem I méně účinná než mutace v pozici 1320. K tomuto pomalému reziduáinímu štěpení může rovněž docházet u mutantní formy C3M-I23 (Arg¹³⁰³->Gln) , ale meziprodukt o velikosti 46 kDa je pravděpodobně rychle štěpen na 43 kDa fragment v druhém, ne zrnu to váném místě (Arg¹³²⁰) .

• ·

-40• · · · • « · · • · · · · • · * • · ··

5. Mutantní forma C3M-51 (Arg^13z0->Gln) je štěpitelná pomocí CVFHBb a vznikající produkt byl dále štěpen endogenní aktivitou podobnou faktorům Hal (vzorek 4-B), jakož i přídavkem externích faktorů Hal (vzorek 4-D). Produkt o velikosti 46 kDa (a slabý proužek o velikosti 68 kDa) indikuje štěpení v pozici Arg^130j. Nepřítomnost fragmentu o velikosti 43 kDa nicméně indikuje, že ke štěpení nedochází ve zmutované pozici Gin¹³²⁰ .

Příklad 5: Srovnání různých aminokyselinových substitucí v pozici 1303

Úvod

V předchozím příkladu byly popsány mutace Arg¹³⁰“ a Argⁱ³²⁰ na glutaminový zbytek. Obě mutace udělily proteinu C3 rezistenci vůči štěpení faktorem I v těchto pozicích.

Nicméně stále docházelo ke slabému, ale zjistitelnému štěpení v pozici Gin¹³⁰³ . Proto tedy byla v této pozici vytvořena a vyzkoušena řada dalších aminokyselinových substitucí. Ke štěpení na zbytku 1303 dochází se snižující se účinností v řadě: Arg > Tyr > (Cys nebo Trp] > Gin > [Glu nebo Gly] . To jsou neočekávané výsledky, protože (i) ke všem známým, přirozeně se vyskytujícím štěpením způsobeným lidským faktorem I dochází na C konci vedle argininového zbytku, z čehož se vyvozovalo, že tento enzym má požadavek na argininový zbytek; a (ii) jestliže by došlo ke štěpení na jiném než argininovém zbytku, bylo by pravděpodobné, že tento zbytek bude mít podobné elektrostatické vlastnosti jako arginin, t.j. že půjde o zásaditý zbytek (lys nebo his), (například trypsin selektivně štěpí na C-konci od arg, lys nebo his. Z uvedeného by tudíž nikdo nepředpokládal, že ke štěpení bude docházet po substituci tyrosinem.

Substituce Arg^lj03 glycinem nebo kyselinou glutamovou je tedy výhodná pro tvorbu derivátů proteinu C3 odolných vůči inaktivaci faktorem I.

2. Použité způsoby

2.1 mutageneze’:

Byl použit degenerovaný mutagenní primer: caactgcccagc(gt)(ag)(cg)agctccaagatcacc (písmena v závorkách označují směs baží na této pozici). Mutantní formy byly připraveny buď způsobem gapped-plazmid (viz předchozí příklady) nebo s použitím mega-primerů (viz V. Picard a další, Nuc. Acid Res. 22: strana 2587 až 2591, (1994)), ve kterém jako upstream primer byl použit oligonukleotid cacca ggaac tgaat ctaga tgtgt ccct c a jako downstream primer byl použit oligonukleotid gtttt atagt gacct taagg tcgaa tttat. Všechny mutace byly provedeny na matricích, ve kterých C3-kódující DNA již byla mutována tak, že aminokyselinový zbytek 1320 byl glutamin místo argininu a v pozici 4149 bylo vloženo a sekvenováním DNA potvrzeno cílové místo pro restrikční enzym AflII (viz předchozí příklady).

2.2 exprese: mutantní formy byly exprimovány v buňkách COS za použití vektoru pcDNA3 (viz předchozí příklady), biosynteticky značeny [³⁵S j-methioninem. v séruprostém médiu.

2.3 testování rezistence: supernatanty byly ošetřeny přídavkem CVFHBb (připraveným reakcí CVF s faktory B a D v pufru s horečnatými ionty) a faktory Hal. Poté byly imunoprecipitačně vysráženy pomocí anti-C3 protilátky a rozděleny elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu provedenou za redukčních podmínek (viz předchozí příklady). Poté byl gel fixován a ošetřen amplifikačním

-42činidlem s firmy Amersham, vysušen a použit pro autoradiografii . Výsledky viz obrázek.

3. Výsledky

Štěpení faktorem I v pozici 1303 (cílové místo 1), za současného neštěpení v pozici 1320 .(cílové místo 2), které bylo mutací změněno na glutamin, dává vzniknout fragmentům migrujícím na elektroforéze jako proteiny o velikosti 46 a 68 kDa. Je patrné, že ke štěpení dochází v řadě : arg(R) > tyr(Y) > cys(C) a trp(W) > gln(Q) > gly(G) a glu(E), přičemž proteiny s posledními uvedenými zbytky se štěpí nejhůře. Přirozeně se vyskytující protein s argininem v obou pozicích je štěpen v obou pozicích za vzniku fragmentů o velikosti 43 kDa, který je příliš malý na to, aby byl na tomto gelu patrný, a fragmentu o velikosti 68 kDa.

4. Obrázek

Výsledky viz obrázek 4. Zbytky v cílových místech 1 (pozice 1303) a 2 (1320) jsou indikovány nad jednotlivými vzorky.

Příklad 6: Demonstrace zvýšené rezistence vůči inaktivaci faktory I a H po mutaci arg¹³⁰³ na gin

l.Úvod

V předchozích příkladech bylo demonstrováno, že záměna některého z argininů 1303 nebo 1320 za glutaminy proteinu C3 vede k tomu, že se toto cílové místo stane odolným vůči štěpení faktorem I. Změnou obou cílových míst vzniká molekula odolná vůči štěpení v obou cílových místech.

V tomto příkladu ukážeme, že záměna argininů 1303 za glutamin sama o sobě t.j. bez mutace argininů 1320 vede

-43ke značné rezistenci vůči inaktivaci faktory I a H srovnání s přirozeně se vyskytujícím proteinem C3.

ve

2. Použité způsoby

2.1 Exprese:

Příprava mutantní formy arg 1303->gln byla popsána v předchozích příkladech. Zmutovaný gen byl transfekci přenesen do buněk CHO (běžná laboratorní buněčná linie pocházející z vaječníků čínského křečka). Transfekce byla provedena standardním způsobem pomocí fosforečnanu vápenatého a stabilní transfektanti byli vybráni základě rezistence vůči G418 (Geneticin dodávaný firmou Sigma). Supernatanty buněčných kultur byly shromážděny a exprimovaný protein C3 byl částečně přečištěn srážením síranem sodným (byla odebrána frakce srážená 10 až 20 % (w/v) činidlem) a ionto-měničovou chromatografií na Qsepharóze a mono-Q-sepharóze (viz A W Dodds, Methods Enzymol 223: strana 46 (1993)).

2.2 Vlastní test: Ovčí erytrocyty byly potaženy moklonální protilátkou S016 (viz R A Harrison a P J Lachmann v knize: Handbook of Experimental Immunology 4. vydání kapitola 39, (1986)) a 4,4 ml 5% (v/v) suspenze byly poté 10 minut inkubovány s přibližně 10 ug C2, 24 pg C4 a 1 pg Cl (purifikované lidské komponenty) při teplotě 37°C v CFD (R Harrison a P J Lachman, viz výše) . 0,8 ml této směsi bylo poté po dobu 105 minut inkubováno s 0,25 ml semi-purifikovaného mutantního nebo přirozeně se vyskytujícího proteinu C3 s přídavkem EDTA tak, aby výsledná koncentrace byla 12,5mM. Buňky byly poté promyty v CFD a použity v CFD obsahujícím 0,1% (w/v) želatiny (CFD-gel) , Pro potvrzení přibližně stejných množství deponované přirozeně se vyskytující nebo mutantní formy

-44·· 4

G3b bylo použito monoklonální protilátky proti C3 (klon 4) značené ^13oI.

Pro vlastní testování bylo použito 40 μΐ 5% buněčné suspenze ve 250 μΐ CFD-gelu. 50 μΐ alikvoty této směsi byly 30 minut inkubovány s 50 μΐ CFD-gelu obsahujícího různé koncentrace (100, 10, 1 a 0 μς/ιηΐ) faktorů I a H při teplotě 37°C. K jednotlivým alikvotům bylo poté přidáno 0,9 ml CFD, buňky byly peletovány centrifugací a dvakrát promyty vždy s 1 ml CFD. Pak byly buňky resuspendovány v 100 μΐ CFD-gelu obsahujícího 100 pg/ml faktoru B, 100 pg/ml properdinu, 1 pg/ml faktoru D a 0,3mM NiCl?. Po 10 minutách v 37°C bylo přidáno 0,9 ml CFD obsahujícího lOmM EDTA a 2% (v/v) normálního séra morčete. Po dalších 30 minutách při teplotě 37 °C byly nelyžované buňky peletovány centrifugací, a stupeň lýzy buněk byl stanoven měřením absorbance supernatantu při vlnové délce 412 nm. Absorbance ekvivalentní 100% buněčné lýze byla stanovena z alikvotu buněk lyžovaných ve vodě. Z tohoto údaje bylo stanoveno procento lýzy.

Tímto testem byl měřena schopnost deponovaného proteinu C3b tvořit funkční C3bBbP konvertázu. Konverze na iC3b zabrání vzniku konvertázy a následné buněčné lýze v prostředí se sérem a EDTA.

3. Výsledky

Výsledky znázorněné na obrázku naznačují, že na zrušení hemolytické aktivity mutantní formy arg¹³⁰³->gln je zapotřebí více než desetinásobek faktoru I a H ve srovnání s přirozeně se vyskytující formou. Tato mutace je proto výhodná pro tvorbu derivátu C3 jehož C3b produkt je odolný vůči inaktivace faktory Hal. Tento efekt by mohl vysvětlen buď větší rezistencí vůči štěpení v pozici 1303 (arginin je zaměněn za glutamin) , nebo větší * · 'fc fc · fc

-45-r • 9 fc · 0 rezistence vůči štěpení v pozici 1320, kdy ke štěpení může nejprve dojít v pozici 1303.

4. Obrázek

Výše uvedené výsledky viz obrázek 5. Na ose X jsou uvedeny koncentrace faktorů Ha I. Q1 reprezentuje mutaci arg^130j->gln. % lyžovaných buněk bylo měřeno výše popsanými způsobem.

Diskuse

Podstatné vlastnosti lidského C3 vzhledem k modifikovaným variantám podle vynálezu jsou:

(i) molekula funguje jako C3b derivát, což se projevuje tím, že se může kombinovat s funkčně aktivním lidským faktorem B, který může být poté štěpen lidským faktorem D za vzniku enzymu schopného štěpit lidský protein C3.

(ii) Aminokyselinové sekvence derivátů jsou více homologické s lidským proteinem C3 než s C3 proteinem libovolných dalších druhů, jejichž C3 sekvence jsou dosud známy. Jsou rovněž více homologické s lidským proteinem C3 než s libovolným jiným dosud známým proteinem. Strukturní rysy C3, které se vyskytují v přirozeně se vyskytujícím proteinu, ale nejsou nezbytné pro mutovaný derivát jsou:

(a) sekvence kódující DNA a sekvence varianty translatovaného proteinu (lidského C3) použité v příkladech jsou udány na obrázku 2 respektive 1. Tato proteinová sekvence se liší od publikované sekvence (de Bruijn, Μ.Ή. & Fey, G.H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. S2: strana 708 až 712) právě ve dvou aminokyselinách (detaily viz příklady). Předpokládá se, že se správnou funkcí proteinu C3 je kompatibilní mnohem • ·

-46více variant, nicméně většina z nich nebude v populaci přítomna.

(b) primární produkt translace je proteolyticky zpracováván na dva řetězce spojené disulfidovými můstky: řetězec alfa (aminokyselinové zbytky 672 až 1663) a beta (zbytky 23 až 667). Při post-translačních úpravách je rovněž odstraněn signální peptid (zbytky 1 až 22).

(c) maturovaný protein obsahuje thioesterovou vazbu mezí zbytky CyslOlO a Glnl013.

(d) C3 konvertáza odštěpuje od proteinu C3 fragment C3a (zbytky 672 až 748). Tato reakce rozbíjí thioesterovou vazbu.

(e) v přítomnosti faktoru H štěpí faktor I C3b mezi zbytkem Argl303 a Serl304, a mezi Argl32 a Serl321.

Modifikace nativní molekuly proteinu C3

Náhrada Argl303 za Gin

K ' této modifikaci dochází v jednom z cílových míst štěpení C3b faktorem I. Smyslem této záměny je snížení rychlosti štěpení faktorem I v této. pozici. Změna na glutamin byla vybrána tak, aby došlo ke ztrátě kladného náboje argininu, který je pravděpodobně důležitý pro proteázovou aktivita serinového typu faktoru I. Byl přitom zachován hydrofilní charakter a podobná velikost bočního-řetězce, což by mělo minimalizovat veškeré vlivy na terciární strukturu proteinu. Důkazem podporujícím tuto domněnku je, že tato mutace nezabránila posttranslačnímu zpračování na dvouřetězcovou strukturu, vzniku thioesterové vazby nebo štěpení C3 konvertázou. Záměnou Argl303 za další aminokyselinu by popřípadě mohlo být dosaženo podobného nebo dokonce lepšího účinku, viz příklad 5.

-4Ί• 99

Lze předpokládat, že tomuto štěpení může zabránit nebo jej zpomalit mutace Serl304 (na opačné straně místa štěpení) nebo mutace jiných aminokyselin, které interagují v této enzymatické reakci.

Náhrada argininu 1320 za glutamin

K této modifikaci dochází na druhé straně místa štěpení C3b faktorem I. V důsledku této změny dochází výraznému snížení (v podstatě k zastavení) rychlosti štěpení faktorem I v této pozici. Mutace na glutamin byla provedena stejným způsobem jako výše popsané změny a rovněž nebrání post-translačnímu zpracování na dvouřetězcovou strukturu, vzniku thioesterové vazby nebo štěpení C3 konvertázou. Opět lze předpokládat, že mutací na jinou aminokyselinu může býti dosaženo stejného účinku, jako je tomu u mutace Serl321 nebo dalších zbytků účastnících se interakce enzym-substrát při tomto štěpení.

Obě mutace (Argl303-Gln a Argl320-Gln) v kombinaci chrání C3b před inaktivaci a udržují jeho schopnost tvořit část aktivní C3bBb konvertázy. Ke stejnému účelu mohou být použity i další mutace (včetně jejich kombinací), které ruší obě štěpící reakce (například Argl303-Glu nebo Argl303-Gly mohou být použity v kombinaci s Argl320-Gln).

Příklad 7: Různé mutace zabraňující interakci C3b/C3i s faktorem H

7.1 Úvod

Jiné laboratoře poskytly důkazy, založené buď na účincích syntetických peptidů (Ganu, V.S. a MullerEberhard, H.J. , 1985, Complement 2:27; Becherer, J.D. a kolektiv 1992, Bíochemistry 31: strana 1787 až 1794),

-489

• 9 9 ·

9 9

99

99» 9 9 nebo na základě limitní . mutageneze (Taniguchi-Sídle, a Isenman, D.E. , 1994 J. Immunol. 153: strana 5285 až lze předpokládat, ze

5302) na jejichž základě aminokyselinové zbytky 752 až 761 v sekvenci primárního transkriptu C3 (viz obrázek 1) se mohou podílet na interakci s faktorem H. Nicméně další publikace předpokládá, že na této interakci se podílí pouze zbytky 767 až 776, kdežto aminokyselinové zbytky 752 až 761 jsou důležité pro interakci s faktorem B (Fishelson, 1991, Mol. Immunol. 28: strana 545 až 552) . V této práci jsme předpokládali, že rozsáhlejší mutageneze této oblasti by mohla snížit afinitu k faktoru H a proto být žádoucí pro tvorbu derivátu C3, odolného vůči faktoru H. Dále jsme předpokládali, že důležitými aminokyselinovými zbytky pro tuto interakci a tedy i pro případnou mutaci budou kyselé zbytky (zbytek kyseliny asparagové a glutamové), a že by bylo žádoucí je zaměnit za zbytky neutrální, u nichž je méně pravděpodobné zprostředkování silné

V tomto příkladu byly zaměněny zbytky 752 sekvence Asp-Glu-Asp na Gly-Ser-Gly, v kombinaci s mutací zbytků 758 až 760 z Glu-Glu-Asn na Gly-Ser-Gly. Vzniklý produkt vykazoval redukované štěpení v důsledku snížení citlivosti k faktoru H. Toto poskytuje důkaz, že protein C3 lze upravit tak, aby se snížila jeho vazba k faktoru H, a v důsledku toho i citlivost k faktorům Hal. Jde o modifikace žádoucí pro tvorbu C3 konvertázy stabilní za fyziologických podmínek.

interakce. až 754 ze

7.2 Způsoby přípravy

Způsoby mutageneze, exprese a další analýza byly popsány v předchozích příkladech. Pro cílené vložení mutace byl nasyntetizován mutagenní oiigonukleotid se sekvencí: agtaa cctgg gttcg ggcat cattg cagga.

7. 3 Výsledky

Výsledky štěpící reakce viz obrázek 6. Z výsledků vyp1ývá, že:

1. Přídavek CVFBb k přirozeně se vyskytujícímu C3 vede k eliminaci alfa řetězce (stopa 2) protože vznikající C3b je citlivý i na nízké koncentrace faktorů I a H přítomné v supernatantu kultivačního média. C3i vznikající během exprese nebo během následující inkubace byl štěpen na iC3i stejným způsobem. Vnější přídavek faktorů I a H (stopy 3 a 4) se proto v podstatě neliší od stop 1 a 2, vzhledem k tomu, že médium samo o sobě obsahuje dostatek faktorů H a I na provedení kompletního štěpení.

2. Naproti tomu je-li CVFBb přidán k mutantnímu proteinu C3 (stopa 6) nedojde na elektroforéze k vymizení pásu řetězce alfa. Nějaké množství řetězce alfa' sice vzniká z C3b, ale podstatné množství nebo všechen -takto vzniklý alfa' řetězec zůstává ve vzorku, z čehož plyne, že trvanlivost alfa řetězce není pouze výsledkem neuskutečněného štěpení pomocí CVFBb. Zbývající neštěpený řetězec alfa ve stopě 2 může proto reprezentovat C3i, který nebyl štěpen aktivitou endogenních faktorů Hal. Nicméně je rovněž možné, je to důsledkem přítomnosti určitého množství nativní protein C3 ve vzorku s mutantní formou, která získala částečnou rezistenci vůči CVFHBb. Přídavek vysokých koncentrací vnějších faktorů H a I ve stopách 7 a 8 vede k vymizení pásů odpovídajících řetězcům alfa a alfa', z čehož plyne že (i) mutantní forma není zcela odolná vůči těmto faktorům, a (ii ) alfa řetězec neštěpený pomocí CVFHBb ve stopě 2 převážně vzniká ze C3i (který je rozštěpitelný faktory Hal, ale ne pomocí CVFHBb) spíše než z nativního proteinu C3 (který je štěpitelný pomocí CVFHB, ale ne faktory Hal).

Dokonce i ve stopě 8 není stále všechen alfa řetězec štěpen, pravděpodobně v důsledku rezistence vůči faktorům

H .a I.

•	9 9		9	9	9 9			9 9
9 9 9		4	9 9	9 9	9	9	•		•
9	9 9			9	9	•		9 ·
9 9		9 9	4	9	9 99	•	•		•
9 9		9	•	4		•	9		•
99 9	9 ·		99 9	99 9	99			• ·

Proto tedy mutací aminokyselinových zbytků 752 až 754 a zbytků 758 až 760 může vzniknout molekula C3, která je stále štěpitelná C3 konvertázami, ale je přitom částečně odolná před štěpením faktory H a I. Se zřetelem k dalším publikovaným skutečnostem lze s největší pravděpodobností předpokládat, že příčinou této rezistence jsou mutace v oblasti, která se účastní do interakce s faktorem H což má za následek snížení afinity pro tento faktor.

Příklad 8: Místo v proteinu C3, které lze mutací modifikovat tak, aby se změnila interakce C3i s faktorem B

8.1 Úvod

Na předcházejícím příkladu bylo demonstrováno, že mutacemi proteinu C3 se mohou změnit interakce s faktory Hal.

Za účelem objevit další místa v proteinu C3, která by mohla interagovat s faktorem B byly srovnány známé sekvence C3 molekul z různých živočišných druhů, jakož i dostupné sekvence pro C4 a další homologické proteiny. Byla identifikována oblast odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1427 až 1433 lidského proteinu C3, která by se mohla podílet na specifických funkcích C3 a C4. Tyto funkce mohou zahrnovat interakci s faktorem B (nebo jeho homologem C2 v případě C4), což však není jisté, protože dalšími možnými funkcemi této oblasti jsou tvorba thioesterových vazeb, konverze na C3b (nebo C4b formu), interakce se substrátem C3 a/nebo C5 v rámci konvertázové aktivity a interakce s faktorem I a jeho kofaktory.

Proto byly vybrané zbytky zmutovány na vhodné aminokyselinové zbytky na základě srovnání sekvencí jiných homologních proteinů, v tomto případě s lidským

-51• » proteinem C5. Tak byl aminokyselinový zbytek 1427 zaměněn z argininu na glutamin, zbytek 1431 z Lys na Asp a zbytek 1433 z G,lu na Gin. Výsledný mutantní protein byl citlivý na štěpení C3 konvertázou (CVFBb) a vznikající C3b byl dále štěpitelný faktory H a I. Nicméně tento mutantní protein nepodporoval konverzi faktoru B na faktory Bb a Ba. Tato konverze je závislá na vazbě faktoru H na faktor C3i (nebo C3b) . To dokazuje, že změnou této oblasti se zmenšila interakce, s faktorem 3. Zatímco toto snížení interakce je nežádoucí pro tvorbu vysoce aktivní C3 konvertázy, poskytuje to zároveň informaci o tom, že další modifikace této oblasti proteinu C3 rovněž pozmění interakci s faktorem B a některá takováto modifikace pravděpodobně afinitu zvýší. V důsledku takové mutace může rovněž vzrůst stabilita a aktivita bimolekulární konvertázy C3bHb (nebo C3iHb).

8.2 Použité způsoby

Srovnání sekvencí podle Tabulky 1 na další straně dokládají, že tato oblast byla vybrána jako vhodný kandidát mutageneze. Výchozím bodem byla skutečnost že charakter jistých aminokyselinových zbytků byl dobře konzervovaný v proteinech C3 a C4, ale zřetelně se lišil v ostatních proteinech. Zbytky 1427, 1431 a 1433 byly vybrány protože díky jejich náboji se dá předpokládat účast na protein-proteinových interakcích. Byly provedeny změny odpovídající zbytkům v lidském C5 vzhledem k tomu, že odpovídající zbytky v proteinu mají velmi rozdílné elektrostatické vlastnosti, ale v kontextu jinak konzervovaných zbytků v okolí, které naznačují, že by mohlo jít o podobnou lokální strukturu.

Způsoby mutageneze, exprese a analýzy štěpení zprostředkované proteinem C3 byly popsány v předchozích příkladech (v příkladech 1 až 4) . Byl nasyntetizován mutagenní oligonukleotid se sekvencí: tggtg ttgac caata catct ccgac tatca.

-52Tabulka 1

Srovnání sekvencí C3 a molekul příbuzných v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1427 až 1435 lidského proteinu C3 ωωωω^ω^ωωωωω ω ω Ω ω o ω ca ω o ca ω

Ω££ΩΩω>£ΩΩΩ ι—ι Η-1 Pd Ω qd Od ρβ Ω Ω (2

catacacacacacaWcacaca>

Μ Μ Ηdl·-I Ω Ω Ω I-I > > > ΩI

ΩΩΩΩΩΩΩΩΩΩΩΩ

’í? >w m >υ μ Ω >1 n 9 β Μ Ο ,ο * e rt ω

Ω Ω rt β κυ Λ Μ > Ω Ω Ο >ν m

Ω >θ οσκσωωω ο ω ω

Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω ω ω ω

Ω Ω S Pí S S !4 Ω Ω Ω e e « ίϋ ω ω ω

Ω Ω > > > > > >>>

Ω Ω Ω VI Ε-* Ε-η Ω ca ω Ω α α Ω Ω Ω Ω Ω ΩΩΩ

Ω Ω Ο > Ω rt Ο >rt >rt rt Ω -rt

KU

Ω

KU ν σι rt s -rt rt Ω rt Ω Ω O Ω ο

r-Η >ο >ο <0 >φ >rt rt r >w Ω Ω S Ω E β 9 g ·* >O

Ω <U rt >, V

Lt

Ω

KU >M

Ω

rt
					O
Ώ					i—l
c					cn	c
a n	o	Lf)	s	Ω	O	•H
Ω O	\	CN	ΙΩ	C	i—1
ca Ω	co	O		Ω	-rt	3
0	O				M	Ω
Qj					□

ca

-53Test na stanovení metabolického obratu faktoru B

Exprimovaný produkt byl přečištěn a zbaven kultivačního média pro COS buňky pomocí afinitní chromatografie na koloně obsahující Sepharosu s klonem-3 (viz Příklad 9). Tímto způsobem byly získána značné množství formy C3i s rozbitou thioesterovou vazbou. Protein C3 přirozeně se vyskytujícího typu byl izolován stejným-postupem. Různá ředění přirozeně se vyskytujícího typu C3 (1/5, 1/25 a 1/125) byla nanesena na gel a byla provedena standardní SDS-PAGE za redukčních podmínek. Elektroforéza byla provedena spolu s mutantní formou proteinu C3. Pomocí barvení stříbrem se podařilo stanovit, že mutantní formy bylo ve vzorcích o něco méně než 1/25, ale mnohem více než 1/125 přirozeně se vyskytující formy. Stejná ředění byla použita v testu na stanovení metabolického obratu faktoru B. 5 μΐ alikvoty těchto C3' byly po dobu 3 hodin inkubovány s 25 μΐ CFD-G s obsahem 5μg/ml faktoru D a přibližně 1,6 μς/ιηΐ faktoru B značeného pomocí ¹²⁵I (s aktivitou přibližně 1000 až 2000 dpm/μΐ) při teplotě 37°C. Vzorky byly poté analyzovány pomocí standardní SDS-PAGE za redukčních podmínek a vysušený gel byl vyhodnocen autoradiograficky. Výsledky viz obrázek 7.

8.3 výsledky

Jak vyplývá z obrázku 7, ke zřetelnému štěpení faktoru B dochází dokonce pří ředění 1/125 přirozeně se vyskytujícího C3(C3i). Na rozdíl od toho nebylo patrné žádné významné štěpení v přítomnosti mutantní formy proteinu C3, dokonce u nezředěného vzorku, který by měl být ve 125-krát vyšší koncentraci než přirozeně se vyskytující forma.

Zdá se tedy, že tato mutantní forma má sníženou schopnost podporovat štěpení faktoru B, nejspíše díky tomu, že má sníženou vazebnou afinitu k faktoru B. Proto jde tedy o oblast proteinu C3, jejíž mutací lze pozměnit interakci mezi C3i (nebo C3b) a faktorem B a možná rovněž stabilitu konvertázy (C3iBb nebo C3bBb).

Příklad 9: Purifikace exprimované mutantní formy proteinu C3

9.1 Úvod

V tomto příkladu je mutantních molekul proteinu například z kultivačního eukaryotických podle příkladu popsán způsob izolace

C3 z expresního média, média transfikovaných buňek. Jednoduchou afinitní purifikací 10 byl získán protein C3 v dostatečné čistotě pro funkční testy a pro konjugaci s protilátkou. Ačkoli vymývání z protilátky navázané v afinitní koloně je doprovázeno hydrolýzou značné části vnitřních thioesterových vazeb, výsledný C3i produkt je stále ještě vhodným prekurzorem pro přípravu aktivní C3 konvertázy, i pro produkci konjugátu protilátky s proteinem C3i. Tento způsob je pravděpodobně rovněž vhodný jako součást přípravy exprimovaného C3 pro in vivo užití.

9.1 Použité způsoby

Afinitní purifikace na koloně obsahující Sepharosu s protilátkou klonu-3.

Klon-3 je krysí moklonální protilátka specifická pro protein C3 a jeho deriváty, včetně C3b a C3i (viz Lachmann, P.J. a další 1980, J. Immunol. 41: strana 503 až 515). Jsou dostupné i další monoklonální protilátky proti C3, které byly v některých případech rovněž použity

pro izolaci proteinu C3 z malých množství lidské plazmy (Dodds, A. W. , 1993, Methods Enzymol. 223: strana 46 až

61) a jsou proto také pravděpodobně dobře použitelné pro izolaci molekul exprimovaných ex vivo. IgG frakce byla navázána na Sepharosu CL-4B pomocí CNBr (metodiku lze získat například v publikaci Harrison a Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4. vydání, editoři Herzenberg, Blackwell, Oxford) . Kultivační supernatanty byly buď naneseny přímo na kolonu s afinitním nosičem (kolony lze opakovaně použít) nebo byly nejprve zakoncentrovány srážením ve 25% (w/v) Na₂S0₄, opět rozpuštěny a dialýzovány proti BBS s 5mM NaN₃. Kolona byla poté promyta různými pufry v následujícím pořadí (i) PBS s 5mM NaN₃ a (ii) PBS s přídavkem 1 M NaCl. Navázaný protein C3 byl eluován 50mM Na-borátovým pufrem o pH 10,5. Eluát byl okamžitě neutralizován sbíráním frakcí o objemu 0,9 ml do 0,1 ml 1 M Tris/HCl pufru o pH 7. Materiál byl poté dialyzován proti PBS s přídavkem 5 mM NaN₃.

Příprava proteinu C3 nesoucího histidinovou purifikační značku

Histidinová purifikační značka je řetězec histidinových zbytků, který vykazuje vazebnou afinitu ke koloně s navázanými nikelnatými ionty. Tento způsob byl použit pro usnadnění izolace exprimovaných proteinů. Předpokládali jsme, že tento způsob bude výhodný pro izolaci exprimovaných mutantních proteinů C3. Proto jsme inzertní mutací vložili 6 histidinových zbytků do plazmidů kódujícího protein C3 na C-konec (hned na Ckonec zbytku 1663). Toto umístění histidinové značky bylo vybráno proto, aby se minimalizovala interference se syntézou, správným složením, zpracováním a tvorbou disulfidových vazeb ve vznikajícím proteinu C3. Aminokyselina 1661 je cysteinový zbytek, který se účastní tvorby disulfidové vazby spolu se zbytkem na začátku

• 4 « ·· 44 sekvence (pravděpodobně s Cys 1537; viz Dolmez, K. a Sottrun-Jensen, L. , 1993, FEBS-Lett 315: strana 85 až 90) . Z tohoto důvodu se zdálo opodstatněné vložit purifikační značku mimo tuto strukturu. Mutace byla vložena způsobem gapped-plazmid mutageneze, použitým v Příkladu 1. Byl přitom použit mutagenní syntetický oligonukleotid se sekvencí: tgggt gcccc aacca tcatc atcat catca.

Začlenění správné sekvence bylo potvrzeno sekvenováním DNA. Poté mohla být sekvence DNA přenesena do expresivního vektoru. Po transfekci eukaryotických buňek by mělo být možné izolovat exprimovaný protein C3 afinitní chromatografií na koloně s nikelnatými ionty nebo s libovolnou jinou matricí' se specifickou afinitou pro nistidinovou purifikační značku.

9.3 výsledky

Řada mutantních forem proteinu C3 bylo purifikováno na koloně se Sepharosou s protilátkou klonu-3, včetně mutantů popsaných v příkladech 1 a 2 exprimovaných v CHO buňkách. Produktům měly zachovanou schopnost podporovat štěpení faktoru B faktorem D. Stejný způsob byl použit pro izolaci mutantních forem popsaných v Příkladu B2, exprimovaných v COS buňkách. Na gelech z SDS-PAGE barvených stříbrem je patrné, že izolované produkty nejsou 100% čisté, ale často se jeví jako čisté alespoň z 50% nebo více. Tohoto výsledku bylo dosaženo z výchozího materiálu, který většinou obsahoval méně než 10 pg/ml proteinu C3 v 10% (v/v) telecím fetálním séru s přídavkem dalších buněčných proteinů. Navíc se zdá, že protein C3‘ nebyl během izolace degradován a endogenní aktivita faktorů Hal byla zřejmě rovněž odstraněna.

·»

-57Purifikace pomocí histidinové purifikační značky vyžaduje pouze mírnější podmínky eluce z kolony s ionty niklu. Například byla použita EDTA (chelatační činidlo pro vytěsnění His-značky z kolony). Tímto způsobem by mělo být možné izolovat protein C3 bez zničení vnitřní thioesterové vazby.

Příklad 10: Konjugace proteinu C3i a protilátky a použití konjugátu pro nasměrování C3 konvertázové aktivity proti určité buňce

10.1 úvod

V jednom provedení vynálezu stabilní C3 konvertáza odvozená od mutantní formy proteinu C3 způsobuje zvýšenou konverzi proteinu C3, která, je-li zamířena na určité cílové místo, podpoří napadnutí tohoto místa imunitní odpovědí závislou na komplementu. Výhodným způsobem pro nasměrovaní odpovědi je' spojit mutantní formu proteinu C3, jakož i jeho C3i nebo C3b derivát s protilátkou specifickou pro požadovaný cíl. V tomto příkladu demonstrujeme fungující metodologii pro tvorbu takových konjugátů. Tento soubor způsobů je možno použít na mutantní C3i nebo C3b molekuly a lze při něm použít materiál získaný afinitní purifikaci z expresního systému, dokonce i v případě, že thioesterová vazba v proteinu C3 byla v průběhu purifikace porušena. Vazbou proteinu C3i k protilátce, která se specificky váže na ovčí erytrocyty, bylo dále dokázáno, že konjugát zafixuje protein C3i na povrchu erytrocytu tak, že se vytvoří konvertáza C3iBbP, která iniciuje lýzu těchto buňek v přítomnosti dalších složek komplementu (například z normálního séra morčete s přídavkem EDTA, který brání de-novo vzniku C3 konvertázy). Z toho plyne, že konjugace s protilátkou lze využít pro specifické nasměrování molekuly C3i tak, aby iniciovala na komplementu závislý

-53útok na buňky určitého typu. V tomto příkladu je použit přirozeně se vyskytující C3i z lidské plazmy, který tvoří C3 konvertázu in vitro. V in vivo podmínkách jsou přirozeně se vyskytující C3i a C3b štěpeny faktory Hal. Proto tedy mutantní forma proteinu C3, sestavená podle vynálezu tak, aby byla odolná vůči faktorům Hala díky tomu schopná utvořit stabilní C3 konvertázu, by byla výhodná z fyziologického hlediska.

10.2 Použitý způsob (i) Příprava a purifikace konjugátu proteinu C3i s protilátkou

Jako protilátka byla použita IgG frakce izolovaná z polyklonálního králičího antiséra připraveného proti ovčím erytrocytům 1,1 mg této frakce bylo inkubováno 2 hodiny se 75 nmol SPDP v konjugačním pufru, pH 7,5 (20 mM KH2PO4, 60 mM Na₂HPO₄, 0,12 M NaCl) za pokojové teploty. PDP-IgG byl purifikován gelovou filtrací na koloně se Superose-6 (Pharmacia) ve fosfátovém pufru, pH 7,4 obsahujícím 0,5 M NaCl).

Redukce vzorků dithíothreitolem bylo použito pro odhad množství 4-PDP skupin navázaných na jednu molekulu IgG. Protein C3i byl připraven 2 hodinovým ošetřením purifikovaného proteinu C3 0,lM methylaminem, pH 7,2 při teplotě 37°C. Přebytek methylaminu byl odstraněn gelovou filtrací následovanou dialýzou proti konjugačnímu pufru. 18 nanomolů proteinu C3i bylo smíšeno s 1,7 nanomoly PDPIgG v 1,26 ml konjugačního pufru inkubováno 1 den za pokojové teploty. Poté následovala 1,5 denní inkubace při teplotě 4°C. Obrázek 8 znázorňuje gel SDS-PAGE obsahující reakční směs po konjugaci, barvený Coomassie modří. Na gelu je patrné objevení se proteinů o velikosti přibližně 350 kDa, které se nevyskytovaly ani v PDP-IgG ani

-59fc · «

• fc v proteinu C3i. Tyto proteiny byly částečně purifikovány gelovou filtrací na kolonách se Superose-6 ve fosfátovém pufru o pH 7,4, obsahujícím 0,5M NaCl. Další krok purifikace spočíval v dialýze proti PBS. Tyto proteiny byly eluovány před proteinem C3 ve frakcích, ve kterých docházelo k eluci proteinů molekulární hmotnosti 3Q0 až 400 kDa. K odhadu velikosti eluovaných proteinů v jednotlivých frakcích bylo použito kalibrační křivky, sestrojené na základě použití globulárních standardů molekulové hmotnosti.

Koncentrace konjugátu, nesloučené protilátky a nenaváženého proteinu C3 byla odhadnuta z SDS-PAGE elektroforetických gelů barvených Coomassie-modří (za neredukujících podmínek). Dvojrozměrná elektroforéza SDSPAGE (první rozměr za neredukujících podmínek, druhý rozměr za redukujících) odhalila vzor, který byl ve shodě s předpokladem stechiometrického poměru mezi IgG a C3i v konjugátu zhruba 1:1.

(ii) Demonstrace toho, že konjugát proteinu C3 s protilátkou lze použít k nasměrování konvertázové aktivity proti určité buňce.

μΐ alikvoty různých ředění konjugátu (0 - žádný konjugát, 1/100, 1/50, 1/10) byly 1.hodinu inkubovány se 100 pl přibližně 1% (v/v) ovčích erytrocytů (promytých v CFD) při teplotě 37°C. Paralelně byla provedena inkubace s ekvivalentním množstvím PDP-IgG (bez proteinu C3) a se samotným proteinem C3. Buňky byly poté 4-krát promyty v CFD a resuspendovány ve 100pl CFD-G. 50 pl této směsi bylo poté lyžováno pomocí 150 pl H₂0, následoval přídavek 800μ1 CFD s obsahem lOmM EDTA a 2% (v/v) NGPS. Druhá část konjugátem potažených buněk (50pl) byla 15 minut inkubována při teplotě 7°C s 50 pl CFD-G obsahujícími 190 pg/ml faktoru B, 2 pg/ml faktoru D, 20 pg/ml properdinu a 0,6mM NiCl₂. Po této inkubaci • * • · ·

-60následovala lýza buněk pomocí 900 μΐ CFD s obsahem lOmM EDTA a 2% (v/v) NGPS. Po 30 minutové inkubaci při teplotě 37°C byly buňky zpeletovány centrifugaci (2000 X g, po přibližně 3 minuty) a byla změřena absorbance supernatantu při vlnové délce 412 nm. Jako standardy byly vzaty vzorky ošetřené čistou vodou (100% lýza buněk) a čistý pufr prostý buněk. Procento lýzy bylo vypočítáno podle obrázku p. Konjugát vyvolával na dávce závislou lýzu buněk, kdežto ani PDP-IgG ani samotný protein C3i žádnou měřitelnou lýzu buněk nevyvolávaly (nad úroveň lýzy naměřené bez jakéhokoli ošetření).

10.3 Shrnutí výsledků

Ukázalo se, že použitý způsob je vhodný pro vazbu C3i k IgG což dokládají následující údaje:

1. Vznik elektroforetického proužku správné velikosti (přibližně 350 kDa) což odpovídá poměru 1:1 molekul C3 a IgG v konjugátu, prokázáno pomocí SDS-PAGE (viz obrázek 8) .

2. Dvojrozměrná SDS-PAGE (v prvním směru za neredukujicích podmínek, v druhém směru za podmínek redukujících) dokazuje, že tento protein obsahuje jak IgG a C3i.

3. Eluční charakteristika tohoto proteinu při gelové filtraci opět odpovídá molekule o velikosti zhruba 350 kDa.

4. Konjugát vykazuje hemolytickou aktivitu, jakou nemá ani PDP-IgG ani C3i (viz obrázek 9).

• · · • ·

-61Test hemolytických účinků (obrázek. 9) navíc dokazuje, že:

1. Specifická protilátka proti ovčím erytrocytům navázala protein C3i na membránu cílové buňky (ovčí erytrocyt), čímž zabránila odmytí tohoto proteinu při promývání (na rozdíl od volného proteinu C3i, který byl odmyt)

2. Konjugát si uchovává C3i aktivitu,_ což se projevuje tím, že je stále schopen tvořit C3 konvertázu reakci s properdinem a faktory B a D.

3. Tato konvertáza může iniciovat na komplementu závislý útok na cílovou buňku, v tomto případě aktivací lytické dráhy (C5-9) a lyžovat napadené erytrocyty.

Další data z různých dalších laboratoří ukazují, že faktor kobřího jedu lze navázat na protilátku, a že takový konjugát může nasměrovat a iniciovat aktivaci komplementu proti buňkám určitého typu (viz Vogel, 1988, Targeted Diagn. Ther. 1: strana 191 až 224; Muller, B. a Muller-Ruchholtz, W. , 1987, Leuk. Res. 11: strana 461 až 468; Parker, C. ,T. , White, V.F. a Falk, R.J. , 1986, Komplement 3: strana 223 až 235; Petrella, E.C. a další, 1987, J. Immunol. Methods 104: strana 159 až 172).

Tyto údaje podporují hypotézu, že protein C3 upravený tak, aby byl schopen tvorby stabilní C3 konvertázy, jako je tomu v případě faktoru kobřího jedu, by se mohl použít pro nasměrování komplementem zprostředkované imunitní odpovědi, tak jak je to popsáno ve vynálezu.

-62Příklad 11: Demonstrace toho, že mutantní C3 molekuly indukují metabolický obrat v normálním lidském séru faktoru

11.1 Úvod spotřeba výhodné. molekula

-Vynález v první řadě popisuje rychlé snížení aktivity komplementu v biologických tekutinách. Vynález popisuje způsoby přípravy molekuly C3, která je odolná vůči regulačnímu snížení aktivity (down-regulaci) faktory H a I. V tomto stavu se C3 molekuly navážou na faktor B a vytvoří aktivní C3 konvertázu. Aktivita těchto konvertáz byla demonstrována hemolytickým testem v příkladu 6. Tato konvertáza bude spotřebovávat C3. Jestliže by byla konvertáza nestabilní, dojde k její disociaci bez konverze významného množství C3. Nicméně to alespoň umožní navázání čerstvého faktoru B a jeho konverzi na Bb a Ba. Tak mutantní protein C3 podpoří spotřebu faktoru B, což nakonec vede k uzavření alternativní dráhy, a k neschopnosti zesilovat stimulaci klasickou drahou. Jestližě je utvořena stabilní C3 konvertáza, bude zredukován metabolický obrat faktoru H, ale zvýší se proteinu C3. Obě tyto vlastnosti mohou být V tomto příkladu demonstrujeme že mutantní C3 se zvýšenou rezistencí vůči faktoru I, ale bez jakékoliv modifikace upravující stabilitu vznikající konvertázy, zesiluje zrychlený metabolický obrat faktoru B v lidském séru. Na rozdíl od toho přirozeně se vyskytující molekula C3 nezpůsobuje žádný významný metabolický obrat faktoru B, pravděpodobně proto, že přirozeně se vyskytující C3i je rychle degradován faktory Hal.

• ·

1.2 Použité způsoby

Byly připraveny následující mutantní formy:

Q1R2 kde byl Argl303 změněn na Gin (viz příklad 2)

Q1Q2 kde byl Argl303 změněný na Gin a Argl320 změněn na Gin (viz příklad 1)

E1Q2 kde byl Argl303 změněný na Glu a Argl320 změněn na Gin (viz příklad 5)

Všechny tyto mutantní formy byly exprimovány v CHO buňkách a poté přečištěny srážením v Na₂S0₄, následovaným afinitní purifikací na Sepharose s protilátkou klonu-3, viz příklad B3. Podobným způsobem byl izolován i přirozeně se vyskytující C3 (R1R2). Pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem byla odhadnuta koncentrace Ql, která činila přibližně 1/5 až 1/25 koncentrace přirozeně se vyskytující formy, koncentrace Q1Q2 činila přibližně 1/5 přirozeně se vyskytující formy a koncentrace E1Q2 byla mezi 1/25 až 1/125 koncentrace přirozeně se vyskytující formy. Všechny vzorky pravděpodobně obsahovaly převážně molekuly s většinou rozbitých thioesterových vazeb (C3i).

10μ1 alikvoty těchto vzorků C3 byly 1 hodinu inkubovány s 10 μΐ 20% roztoku (v/v) normálního lidského séra v PBS s obsahem lmM MgCl_z a přibližně 300 ng faktoru H značeného ¹²⁵I- (přibližně 200, 000 až 300, 000 dpm) při teplotě 37°C. 5 μΐ směsi bylo poté analyzováno pomocí

SDS-PAGE za redukčních podmínek. Vysušený gel byl exponován s autoradiografickým filmem a byly stanoveny pozice elektroforetických proužků, odpovídajících intaktnímu faktoru B a jeho štěpným produktům. Tyto proužky byly poté vyříznuty z gelu byla přesně změřena jejich aktivita, aby se zjistil stupeň štěpení. Hodnota získaná měřením samotného pufru byla odečtena jako pozadí (v pozadí je tak zahrnuto nejen pozadí štěpení, ale také • · · • · · <

• · · · • ·

-64degradační produkty a další nečistoty, které se vyskytují v radioligandu).

11.3 Výsledky

Výsledný stupeň štěpení faktoru B je uveden v tabulce:

1/25 přirozeně se vyskytující 1,49%

1/5 přirozeně se vyskytující 2,74%

Q1R2 6, i9%

Q1Q2 7,41%

E1Q2 6,42%

Je patrné, že všechny mutantní formy odolné vůči faktoru I produkují vyšší koncentrace štěpeného faktoru 3 než ekvivalentní množství přirozeně se vyskytujícího proteinu C3 (C3i). S většími dávkami nebo při delší inkubaci by mělo dojít k úplnému zastavení alternativní dráhy.

Zkratky použité v předchozích příkladech znamenají:

CFD, (complement fixation diluent) pufr pro fixaci komplementu (viz Harrison a Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4. vydání, editoři Weir, Herzenberg, Blackwell; Oxford);

CFD-G je CFD obsahující 0,1% (w/v) želatinu;

PBS je fosfátem pufrovaný fyziologický roztok;

NGPS je normální sérum morčete;

SDS-PAGE je gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí detergentu SDS;

SPĎP je N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyl- dithio)pronionát.

• · · *

-65·· »

• ·

Příklad 12: Mutace zbytků 992 až 1000

I. Úvod

Jiné laboratoře poskytly důkazy založené na účincích syntetických peptidů (viz Ganu, V.S. a MullerEberhard, H.J. , 1985, Complement 2: strana 27; Becherer,

J. D. a další 1992, Biochemistry 31: strana 1787 až 1794; Fishelson, Z. , 1991, Molecular Immunology 28: strana 545 až 552; Lambris, J.D. , Ganu, V.S. , Hirani, S. a MullerEberhard, H.J. , 1988, J. Biol. Chem. 263; strana 12147 až 12150) na jejichž základě lze odhadnout různé aminokyselinové zbytky v lidském C3b, které by se mohly podílet na interakci s faktorem Η. V tomto vynálezu byl použit jiný přístup srovnávání jednotlivých sekvencí. Pomocí tohoto srovnání byly předpovězeny aminokyselinové zbytky hrající roli v interakcích a funkcích specifických pro protein C3. Byla provedena cílená mutageneze, která naznačila, že většina těchto mutací má malý nebo žádný vliv na funkční citlivost k faktoru H. Nicméně několik mutací snížilo citlivost k faktoru H. Tyto mutace byly provedeny v takových částech molekuly, o kterých se dříve nepředpokládalo, že interagují s faktorem H nebo ovlivňují jeho vazbu. Mutageneze těchto definovaných aminokyselinových zbytků lze tedy použít pro přípravu mutantních derivátů proteinu C3, které by byly částečně nebo úplně odolné vůči inhibici faktorem H ve fyziologickém prostředí a vytvářely by enzymatický komplex C3 konvertázy (C3bBb atd.), který by byl podobně odolný vůči inaktivaci faktorem H.

Faktor H je strukturně homologický s dalšími inhibiční proteiny kompiementu, včetně CRL, MCP a DAF. Vzhledem k tomuto zřejmému evolučnímu vztahu a vzájemné vazebné kompetici je pravděpodobné, že interagují s C3b strukturně podobným způsobem jako faktor H (viz Farries a další 1990, Complement Inflamm. 7: strana 30 až 41). Lze • ·

-66tedy předpokládat, že popsané mutace, který modulují citlivost k faktoru H budou pravděpodobně rovněž výhodné pro modulaci interakcí s těmito dalšími proteiny, zvláště pro obejití jejich účinků snižujících aktivitu komplementu. Mohou být rovněž použity pro modifikaci interakce se SCR doménami ve faktoru B (a s homologickými doménami v C2 podílejícími se na vazbě C4b). Mutace odpovídajících oblastí C4 a C5 mohou být také vhodné pro modifikaci jejich interakcí se SCR doménami v Clr a Cis (C4), C4b-vazebném proteinu (C4b) a C6 a C7 (C5b).

2. Použité způsoby

2.1 Hledání aminokyselinových zbytků podílejících se na funkcích specifických pro C3

Místa podílející se na interakcích byla vytipována na základě porovnání sekvencí pro lidský protein C3 se všemi homologickými proteiny jejichž sekvence byly dostupné ve veřejných databázích. Mezi těmito sekvencemi byly funkční ekvivalenty myší, krysí, morčecí králičí, kobří, ropuší (xenopus), kuřecí a obdobný protein ze pstruha jakož i lidský a myší protein C4, lidský a myší protein C5, proteiny podobné C3 z ryby okatice (lamprey) a sliznatky (hagfish), faktor kobřího jedu (CVF) a lidský alfa-2-makroglobulin a jeho homolog. Byla hledána taková místa, která jsou konzervovaná mezi různými .proteiny C3, ale zřetelně se liší v různých homolozích (hlavně C5 a CVF), které postrádají hledané funkce specifické pro C3. Některá takto nalezená místa byla zmutována tak, aby kódovala odpovídající zbytky v proteinech C5 nebo CVF. DNA kódující takto zmutované proteiny byla exprimována v COS buňkách a sekretované produkty byly testovány štěpením v přítomnosti CVFBb a faktorů Ha I. Všechny použité způsoby byly jako standardní popsány v příkladu

1. Souhrn výsledků viz Tabulka II.

• ·

-672.2 Konstrukce a analýza mutantní formy DV-1AM

Tento mutant- byl připraven stejným způsobem jako jiné uvedené mutanty, pomocí tzv. megaprimerů viz V. Picard a další 1994, Nuc. Acid. Res. 22: strana 2587 až 2591. Mutagenní primer měl sekvenci ccaga tgaca agtgc tgccg tcagc cagtc kódující mutace E992S, D993A, D996S, A997Q, E998S a R999G. Upstream primer měl sekvenci tgtca tcgtg ccgct aaaga (odpovídající deoxynukleotidům 2754 až 2773) a downstream primer měl sekvenci gtttt atggt gacct taagg tcgaatttat (byl komplementární k deoxynukleotidům 4130 až 4165, přičemž na pozici 4149 vložil cílové místo pro restrikční enzym Afl II) . Zmutovaný fragment DNA byl ligován do vektoru, že obsahoval sekvenci kódující protein C3 rovněž vloženým cílovým místem pro Afl II v pozici 4149. Ligace byla provedena tak, že jak PCR produkt tak plazmid byly štěpeny stejnými enzymy (Afl II a EcoRI, které štěpí v pozici 2997), požadované fragmenty byly přečištěny a spojeny dohromady pomocí T4-DNA ligázy. Plazmidová DNA byla izolována z kolonií transformovaných bakterií, a správný mutant 'identifikován pomocí sekvenování DNA. Během sekvenování bylo prokázáno že v DNA sekvenci došlo k dodatečné mutaci v DNA kódující změnu L1000M. Výsledným expresivním vektorem byly transfikovány buňky COS a sekretovaný exprimovaný produkt byl analyzován štěpením tak, jak bylo popsáno výše.

3. Vlastnosti mutantní formy DV-1AM

Analýza exprimovaného produktu s mutacemi DV-1AM je znázorněna na obrázku 10. K obrázku je třeba úvést následuj ící:

(i) western blot byl vyvolán pomocí monoklonálních protilátek proti C3dg oblasti proteinu C3, které reagují s prekurzorem, alfa, alfa', 77 a 68 kDa fragmenty, ale

nereagují s beta řetězcem a s fragmenty o velikosti 43 nebo 46 kDa.

(ii) všechny elektroforetické proužky odpovídající produktu DV-1AM (stopy H1 až 4) se zdají nepatrně níže než jejich přirozeně se vyskytující ekvivalenty (stopy Al až 4) . Změny v pohyblivosti jsou pravděpodobně důsledkem mutací.

(iii) štěpením přirozeně se vyskytujícího proteinu C3 pomocí CVFBb vzniká určité množství alfa' řetězce z C3b, ale zároveň štěpením proteinů C3b na iC3b endogenní aktivitou podobnou faktorům Hal (stopa A3) vzniká větší množství fragmentu o velikosti 68 kDa. Přídavek vnějších faktorů Hal způsobí úplnou konverzi proteinů C3b na iC3b (stopa A4).

Naproti tomu, štěpením proteinu DV-1AM pomocí CVFBb vzniká větší množství řetězce alfa' a pouze malé množství fragmentů o velikosti 68 kDa (stopa B3) . Přídavek vnějších faktorů Hal poté konvertuje tento C3b na iC3b (stopa B4) . Mutantní C3b je tedy mnohem více odolný než přirozeně se vyskytující C3b vůči endogenním faktorům H a I, ačkoli rezistence není úplná, jak vyplývá z citlivosti na štěpení při vysokých koncentracích exogenních faktorů Hal.

4. Závěry

Mutace DV-1AM vytváří rezistenci vůči štěpení faktorem I v závislosti na faktoru H. Mechanismus této rezistence není znám. Předpokládá se, že vzhledem k tomu, že modifikované aminokyselinové zbytky jsou v primární struktuře daleko od cílového místa štěpení faktorem I je pravděpodobné, že je narušena interakce s faktorem H. V tomto případě mutace také udělí rezistenci vůči dalším

• · · · • · ·· 4

-69inhibičním činnostem faktoru H, a to:- (i) kompetice s faktorem B o vazbu na C3b (nebo C3i) a (ii) zrychlenou disociaci konvertáz C3bBb a C3bBbP. Mutací DV-1AM byly změněny aminokyselinové zbytky buď přímo nebo nepřímo se podílející na afinitě k faktoru H. Podobného účinku lze pravděpodobně dosáhnout mnoha dalšími mutacemi stejných zbytků nebo mutacemi pouze některých ze zde uvedených zbytků jakož, i mutacemi jiných aminokyselinových zbytků v odpovídajících částech primární struktury.

Příklad 13: Mutace zbytků 1001 až 1005

1. Úvod

Jak bylo popsáno již v předchozím příkladě, aminokyselinové zbytky 1001, 1002 a 1005 byly rovněž identifikovány jako pravděpodobně podstatné pro C3l specifické funkce. Mutacemi v této oblasti bylo potvrzeno, že modifikaci těchto zbytků lze použít k udělení rezistence vůči faktoru H.

2. Použité způsoby

2.1 Konstrukce a analýza mutantní formy DV-1B

Byly použity podobné způsoby jako v předcházejícím příkladě s výjimkou toho, že mutagenní primer měl sekvenci aacgg ctgaa catat taatt catac cccct kódující mutace K1001N, H1002I a V1005H. Sekvenční analýzou izolované plazmidové DNA bylo potvrzeno, že byly vloženy správné mutace. Žádné jiné mutace v sekvenci nebyly obj eveny.

3. Vlastnosti mutantní formy DV-1B

-70• · · · · • · · ·· ··

Analýza exprimovaného znázorněna na obrázku následuj ící:

produktu s mutacemi DV-1B je 10. K obrázku je třeba úvést pomoci které polyklonálních silně reagují a 43 kDa fragmenty, (i) western blot byl vyvolán protilátek proti proteinu C3, s prekurzorem, alfa, alfa', beta, ale pouze slabě s fragmenty o velikosti 77 nebo 68 kDa. Je třeba si povšimnout, že řetězce alfa a alfa' nejsou přeneseny a detekovány se 100% účinností a tak je intenzita těchto elektroforetických proužků nižší než bylo očekáváno a lze ji stěží využít pro odhad skutečného množství proteinu.

(ii) štěpením přirozeně se vyskytujícího proteinu C3 pomocí CVFBb vzniká určité množství alfa' řetězce z C3b, ale většina tohoto řetězce se ztrácí díky štěpení C3b na na iC3b endogenními aktivitou podobnou faktorům Hal (stopa B3). Tento proces je patrný převážně jako proužek o velikosti 43 kDa, i když lze detekovat i malé množství meziproduktu o velikosti 46 kDa. Přídavek 2 pg/ml exogenního faktoru H (stopa B4) s faktorem I způsobuje další štěpení a přídavek 10 až 50 pg/ml exogenního faktoru H (stopa B5, B6) způsobuje kompletní konverzi C3b na zcela štěpený iC3b (tzn. není patrný elektroforetický proužek odpovídající alfa' řetězci ani 46 kDa fragmentu). Štěpením mutantní formy DV-1B pomocí CVFBb také vzniká malé množství ře-tězce alfa' (stopa A3; celkové množství C3 je výrazně nižší, elektroforetické proužky pro řetězce alfa a alfa' jsou velmi slabé).

Množství . řetězce o velikosti 43 kDa vznikajícího v nepřítomnosti vnějšího faktoru H a I je menší než u přirozeně se vyskytujícího proteinu, zatímco poružek odpovídající 46 kDa intermediárnímu fragmentu je relativně větší, z čehož lze usuzovat na méně účinné štěpení. Přídavek vnějších faktorů Hal (stopy A4 až 6)

-71·· ·· • · · • ·· • · · · · ·· ·· dokončí konverzi tohoto C3b na iC3b, ale množství 43 kDa produktu se zvyšuje v závislosti na dávce faktoru H až do přibližně 50 pg/ml faktoru H (stopa A6) , kdy je stále ještě patrný meziprodukt o velikosti 46 kDa. Proto lze tedy tvrdit, že mutantní C3b je vůči endogenním a exogenním faktorům H a I odolnější než přirozeně se vyskytující protein, ačkoli tato rezistence není úplná, jak vyplývá z citlivosti ke štěpení vysokými koncentracemi přidaných faktorů Hal.

Naproti tomu, štěpením DV-1AM pomocí CVFBb vzniká větší množství řetězce alfa' a pouze malé množství fragmentů o velikosti 68 kDa (stopa B3) . Přídavek vnějších faktorů Hal poté konvertuje tento C3b na iC3b (stopa B4) . Mutantní C3b je tedy mnohem více odolný než přirozeně se vyskytující C3b vůči endogenním faktorům H a I, ačkoli rezistence není úplná, jak vyplývá z citlivosti na štěpení při vysokých koncentracích exogenních faktorů Hal.

4. Závěr

Mutace DV-1B vytváří rezistenci vůči štěpení faktorem I závislému na přítomnosti faktoru H. Mechanismus této resistence není zcela jistý, nicméně vzhledem k tomu, že modifikované aminokyselinové zbytky jsou v primární struktuře daleko od míst štěpení faktorem I a účinek byl závislý na dodané dávce faktoru H, je pravděpodobné, že účinek těchto mutací souvisí se zhoršením interakce s faktorem Η. V takovém případě tato mutace bude rovněž udělovat rezistenci vůči dalším inhibičním aktivitám faktoru H a to vůči: (i) kompetici s faktorem B o vazbu na C3b (nebo C3i) a (ii) zrychlené disociáci konvertáz C3bHb a C3bBbP. Mutací DV-1B byly modifikovány aminokyselinové zbytky buď přímo nebo nepřímo vytvářející afinitu pro faktor H. Podobný účinek

-72• 4« 4 4 44 ·4 • 4 4 4 44 44 · 4 4 · • ·4 4 4 4 4 ·4

4 4 4 4 · 4 44· · 4

444 4 4 444

444 44 4·· 444 4· 44 lze očekávat i u mnoha různých dalších mutací stejných aminokyselinových zbytků jakož i u mutací pouze některých z uvedených zbytků nebo všech aminokyselinových zbytků této části primární struktury.

Příklad 14: Mutace zbytků 1152 až 1155

1. Úvod

Jak již bylo popsáno v předchozích příkladech, aminokyselinové zbytky 1152, 1153 a 1155 byly rovněž na navrženy jako pravděpodobní nositelé funkcí specifických pro C3. Mutacemi bylo potvrzeno, že modifikací těchto zbytků lze udělit rezistenci vůči faktoru H.

2. Použité způsoby

2.1 Konstrukce a analýza mutantní formy DV-6

Byly použity podobné způsoby jako v předchozích příkladech s výjimkou toho, že mutagenní primer měl sekvenci atctc gctgc gcaagg ctttc gatat ttgc kódující mutace Q1152R, E1153K a K1155F. Sekvenční analýzou izolované plazmidové DNA bylo potvrzeno, že byly vloženy správné mutace. Žádné jiné mutace v sekvenci nebyly objeveny.

3. Vlastnosti mutantní formy DV-6

Analýza exprimovaného produktu s mutacemi DV-β je znázorněna na obrázku 11. K obrázku je třeba uvést následuj ící:

(i) jako tomu bylo i v předchozím příkladě western blot byl vyvolán pomocí polyklonální protilátky proti proteinu C3, která silně reaguje s prekurzorem, alfa, alfa', beta, 46 a 43 kDa fragmenty, ale pouze slabě s fragmenty o

• · • 4

-73velikosti 77 nebo 68 kDa. Je třeba si povšimnout, že řetězce alfa a alfa' nejsou přeneseny a detekovány se

100% účinností a tak je intenzita těchto elektroforetických proužků nižší než bylo očekáváno a lze ji stěží využít pro odhad skutečného množství proteinu.

(ii) štěpením přirozeně se vyskytujícího proteinu C3 pomocí CVFBb vzniká určité množství alfa' řetězce z C3b, ale většina tohoto řetězce se ztrácí díky štěpení C3b na na iC3b endogenními aktivitou podobnou faktorům H a I (stopa B3) . Tento proces je patrný převážně jako proužek o velikosti 43 kDa, i když lze detekovat i malé množství meziproduktu o velikosti 46 kDa. Přídavek 2 ug/ml exogenního faktoru H (stopa B4) s faktorem I způsobuje další štěpení a přídavek 10 až 50 ug/ml exogenního faktoru H (stopa B5, B6) způsobuje kompletní konverzi C3b na zcela štěpený iC3b (tzn. není patrný elektroforetický proužek odpovídající alfa' řetězci ani 46 kDa fragmentu). Štěpením mutantní formy DV-6 pomocí CVFBb také vzniká malé množství řetězce alfa' (stopa C3).

Množství řetězce o velikosti 43 kDa vznikajícího v nepřítomnosti vnějšího faktoru H a I je menší než u přirozeně se vyskytujícího proteinu, zatímco proužek odpovídající 46 kDa intermediárnímu fragmentu je relativně větší, z čehož lze usuzovat na méně účinné štěpení. Přídavek vnějších faktorů Hal (stopy C4 až 6) dokončí konverzi tohoto C3b na iC3b.

Zatímco u přirozeně se vyskytující formy dochází k úplnému vymizení meziproduktu o velikosti 46 kDa již po přídavku 10 ug/ml vnějšího faktoru H (stopa B5), tento meziprodukt za stejné koncentrace faktoru H u mutantní formy stále přetrvává (stopa C5) a ke kompletnímu štěpení dochází až po přídavku 50 ug/ml faktoru H. Proto lze tedy tvrdit, že mutantní C3b je vůči endogenním a exogenním faktorům H a I odolnější než přirozeně se vyskytující • · protein, ačkoli tato rezistence není úplná, jak vyplývá z citlivosti ke štěpení vysokými koncentracemi přidaných faktorů Hal.

4. Závěr

Mutace DV-6 vytváří rezistenci vůči štěpení faktorem I závislému na přítomnosti faktoru H. Mechanismus této resistence není zcela jistý, nicméně vzhledem k tomu, že modifikované aminokyselinové zbytky jsou v primární struktuře daleko od míst štěpení faktorem I a účinek byl závislý na dodané dávce faktoru H, je pravděpodobné, že účinek těchto mutací souvisí se zhoršením interakce s faktorem Η. V takovém případě tato mutace bude rovněž udělovat rezistenci vůči dalším inhibičním aktivitám faktoru H a to vůči: (i) kompetici s faktorem B o vazbu na C3b (nebo C3i) a (ii) zrychlené disociaci konvertáz C3bHb a C3bBbP. Mutací DV-β byly modifikovány aminokyselinové zbytky buď přímo nebo nepřímo vytvářející afinitu pro faktor H. Podobný účinek lze očekávat i u mnoha různých dalších mutací stejných aminokyselinových zbytků jakož i u mutací pouze některých z uvedených zbytků nebo všech aminokyselinových zbytků této části primární struktury.

• · » <

·· • ·

-75>»·

Tabulka 2: Shrnutí účinků mutací na citlivost k faktoru

H

£	Ή
o	4->
M	<n
0 4-> Λί	0
(ti	0
Ή	+j Ή
Ή	>C ffi
C	n.
(D	3
CU	(ti H
»(U	C O
+J	-P
><n	-H
	P (ti
O)	tn M
	O I-1
-μ	n
0)	Ή
0	>
>	'(ti
Ή ι—i	N
+J •H υ	>

c •H i—I o

w

X

O r* •H £

(ti (ti c

><u £

'(ti

EsJ

Cí	HH
				<0
		«.		CO
		O		O	o
		σ		τ—(	,—1				W
		Ch		&	CU				σ
	l:	Ch							T-H
	co	íL			X				Ol
	co		Hr-4 HH	£	cn		ÍX4		.—1
	Ch	Xk	LO	LO	cn		LO		(k
	Q	tn	o	cn	ο*		LO
		CO	o	o	o		rH
	«.	Ch	rH	.—I	cH		rH		Q	ω
	(X	Ch	>	ω					co
	Lf) .	W							l-1	k0
	CO		X	x	X				Ol	CN
v	Ch	X	H	K	o	a	&	S	t-1	5—1
PH KO		σ	Ol	cn	CN		CO	o*	£	o
		Γ	O	cn	Γ	cn	LO	o-
l	X»	σ.	o	o	O	τ—Η	r-4	r~l		X
L r_T		σ	r-4	j	rH	r—1	t—(	rH	ω	£
W			K	σ		ck	w	Q	Γ	o
	co								r—1	k0
	Ch				x		X		Ol	CN
	04	cn	%	S	O		(L		T-H	t-H
		co	.—i	Ol	<—1		Ol		l;	&
	X.	σ	o	cn	r-		un
	LI	σ	o	o	o		τ—1		X
	m	Q	r—(	r—1	t—l		r—l		o
	co		l:	w			o		CO
	Ch								r-H
	CL.			X	X				<N
		on		o					T~i
		σ		t—1	o				Q

cn cn . t~~

Q o o *· E-* í>

cn

Ol σ

σ ω

Φ u (ti	OJ ... 1	x—1 . 1	T-H	PQ rH	cn . I	θ’ 1	LO 1	co 1	Γ-	σ 1	1
+J	>	>	1	►x.	>	>	>	>	hL	>	>
3 2	u	o	> Q	k·3* Q	a	Q	o	a	K> Q	a	o

RY-1 R1427Q, K1431D, E1433Q (Legenda: - = nebyla zjištěna žádná Inhibice, + = malá inhibice, ++ velký inhibiční efektj • · • · · • · · ·

>

Příklad 15: Mutace aminokyselinových zbytků 1546 až 1663

1. Úvod

Na rozdíl od předchozích příkladů (příklady 12 až 14) nebyla modifikace zbytků 1546 až 1663 založena na srovnání různých sekvencí proteinu C3 a příbuzných proteinů. Namísto toho byla popsaná modifikace vytvořena náhodou, následkem nezamýšlené delece nukleotidu, která způsobila posun čtecího rámce v translaci C-terminální části proteinu. Výsledný produkt vykazoval značnou míru rezistence vůči štěpení faktorem I závislým na faktoru H. Lze tedy předpokládat, že podobné modifikace vytvořené záměrně budou výhodné pro udělení rezistence vůči regulačním účinkům faktoru H a/nebo faktoru I.

2. Použité způsoby

Vektor ekvivalentní vektoru NC3, ale na rozdíl o něj nesoucí dodatečné mutace 3151g, 3152g, 3154a, 3156c,

3159c, 3163a, 3165t, 3167t, 3168t a který je translatován s mutacemi T1031G, E1032N, Q1033H, E1035N a K1036I byl naštěpen restrikčními enzymy Pvu I (štěpí v sekvenci vektoru) a BsrG I (štěpí po nukleotidu 4692) . Po restrikci byl elektroforézou na agarózovém gelu izolován fragment o velikosti 6,1 kb. Jiný ekvivalent vektoru NC3 s oligonukleotidem catcatcatcatcatcat vloženým po nukleotidu 5049 a kódující vložení aminokyselin HHHHHH na C-konec, byl podobným způsobem naštěpen enzymy Pvu I a BsrG I a byl vyizolován fragment o délce 4,4 kb. Tyto dva DNA fragmenty byly spojeny ligací dohromady a poté byl vyizolován kompletní plazmid. Sekvenování DNA odhalilo, že došlo ke ztrátě jednoho nukleotidu (a4696 nebo a4697). Předpokládaným důsledkem této ztráty je, že aminokyseliny 1546 až 1663 nejsou překládány ve správném čtecím rámci.

• · » « • · • *

-77Namísto toho se 48 aminokyselinových zbytků čte mimo normální čtecí rámec až do dosažení stop kodónu.

Produkt nazvaný HDV-3X byl exprimován v buňkách COS a testován podle předcházejících příkladů.

3. Vlastnosti mutantní formy HDV-3X

Analýza exprimovaného produktu s mutacemi HDV-3X je znázorněna na obrázku 12. K obrázku je třeba uvést následující:

(i) western blot byl vyvolán pomocí monoklonálních protilátek proti C3dg oblasti proteinu C3, které reagují s prekurzorem, alfa, alfa', 77 a 68 kDa fragmenty, ale nereagují s beta řetězcem a s fragmenty o velikosti 43 nebo 46 kDa.

(ii) produkt HDV-3X byl porovnán s mutantní formou DV-3, jakožto ekvivalentním produktem bez přídavné C-terminální modifikace. HDV-3X vykazoval kratší alfa řetězec, ale produkty 68 kDa a 77 kDa měly normální velikost, což je v souladu s tím, že ke štěpení dochází na C-konci.

(iii) štěpením proteinu DV-3 C3 pomocí CVFBb v přítomnosti faktoru I vzniká z C3b určité množství řetězce alfa', ale zároveň větší množství 68 kDa fragmentu, který je výsledkem štěpení C3b na iC3b závislého na endogenním faktoru H (stopa A2) . Přídavek vnějšího faktoru H dovrší konverzi C3b na iC3b (stopy A3 až 5) . Konverze je téměř úplná i po přídavku pouhého 1 pg/ml faktoru H (stopa A3) . Naproti tomu štěpením produktu HDV-3X pomocí CVFBb vzniká větší množství řetězce alfa' a pouze malé množství fragmentu o velikosti 68 kDa (stopa B2).

-78Přídavek vnějšího faktoru H nezpůsobí konverzi této formy C3b na iC3b (stopy B3 až 5). Dokonce i po přídavku 25 pg/ml faktoru H lze detekovat pouze nepatrné množství vznikajících fragmentů o velikosti 68 kDa a 77 kDa (stopa A5) . Proto lze tvrdit, že HDV-3X C3b je mnohem odolnější vůči endogennímu faktoru Hal než přirozeně se vyskytující protein. Skutečnost, že tato rezistence je částečně překonána za vyšších koncentrací faktoru H lze vysvětlit tím, že mechanismus této rezistence spočívá v podstatném snížení afinity pro faktor H.

4. Závěr

Mutace HDV-3X vytváří rezistenci vůči štěpení faktorem I závislému na přítomnosti faktoru H. Mechanismus této resistence není zcela jistý, nicméně vzhledem k tomu, že modifikované aminokyselinové zbytky jsou v primární struktuře daleko od míst štěpení faktorem I a účinek byl závislý na dodané dávce faktoru H, je pravděpodobné, že účinek těchto mutací souvisí se zhoršením interakce s faktorem Η. V takovém případě tato mutace bude rovněž udělovat rezistenci vůči dalším inhibičním aktivitám faktoru H a to vůči; (i) kompetici s faktorem B o vazbu na C3b (nebo C3i) a (ii) zrychlené disociaci. konvertáz C3bHb a C3bBbP. Mutací HDV-3X byly modifikovány aminokyselinové zbytky buď přímo nebo nepřímo vytvářející afinitu pro faktor H. Podobný účinek lze očekávat i u mnoha různých dalších mutací stejných aminokyselinových zbytků jakož i u mutací pouze některých z uvedených zbytků nebo všech aminokyselinových zbytků této části primární struktury.

Modifikace HDV-3X nebyla vytvořena záměrně. Výhodnými způsoby pro tvorbu této modifikace a jí podobných jsou specifické způsoby cílené mutageneze, včetně způsobů popsaných v předcházejících příkladech.

• · · · · · 4 • · ·· • · · · fl • · « • ♦ · 9

-79Příklad 16: Modifikace žbytků 954 a 955 vedoucí k rezis.tenci vůči štěpení faktorem I

1. Úvod

Mutace provedené již dříve v PÍ zbytcích (1303 a 1320) poskytovaly rezistenci vůči štěpení faktorem I v prvních dvou místech (viz příklady 1 až 6 ) . Nebylo ovšem známo, zda zabránění štěpení na těchto dvou místech vede také k zabránění štěpení na místě třetím, které je odpovědné za uvolnění proteinu C3c z C3dg. Toto třetí štěpení, které je za normálních okolností závislé na CR1 (což je membránový receptor, který byl upraven do rozpustné formy, označené sCRl) jako kofaktoru reakce, je relativně pomalé. Toto štěpení bylo pozorováno u iC3b (nebo iC3i) (to znamená po štěpení na místech 1 a 2), ale ne na místech C3i nebo C3b. K otestování této skutečnosti byla použita mutantní forma E1Q2 (popsaná v příkladu 11), která je vysoce rezistentní ke štěpení v místech 1 a 2 . Jelikož byla tato mutantní forma stále ještě citlivá ke štěpení v místě 3, bylo nutné uvažovat o zavedení vhodné mutace do tohoto místa, která by zabránila odbourání molekuly ve fyziologických kapalinách. V literatuře byly nalezeny odporující si odkazy o tom, zda ke štěpení dochází výlučně na místech vazby v pozici 954 až 955 (viz Davis, A.E. 3d. Harrison, R.A. a Lachmann, P.J., 1984, J. Immunol., 132: strana 1960 až 1966) nebo k němu může docházet také na dalších místech, jako jsou aminokyselinové zbytky na pozicích 959 až 960 (viz Harrison, R.A. a další, 1996 Molecular Immunology 33, dodatek 1, 59, abstrakt 235, Ekdahl, K.N., Nilsson, U.R. a Nilsson, B.,1990, J.Immunol. 144: strana 4269 až 4274).

Proto byla nejdříve provedena mutace ve zbytku 954, a to výměna argininu za kyselinu glutamovou (tak byla připravena mutantní forma E1Q2E3), jelikož

-80• c « · ft · · · • * ft* • · · · · · • · ♦ • ft · · (i) jak je zřejmé z literárních odkazů uvedených výše, je to Pl zbytek jednoho ze štěpných míst a dále (ii ) z příkladu 5 vyplývá, že v místě 1 vede mutace za kyselinu glutamovou k ustavení vyšší odolnosti proti štěpení, než je tomu v případech dalších substitucí. Navíc i další druhy savčích proteinů C3 (myších, krysích, morčecích, králičích) mají na místech odpovídajících pozicím 954 a 955 glutamin a glycin, místo argininu a kyseliny glutamové, které se vyskytují ve stejných pozicích u lidských proteinů C3 (jak například uvádějí Mavroidis, M., Sunyer, J.O. a Lambris, J.D. 1995, J.Immunol. 154: strana 2164 až 2174). Tyto výsledky naznačují, že toto místo (954 až 955) není možno úspěšně štěpit u dalších druhů a že další místo, jako je pozice 959 až 960, může být ještě důležitější (Harrison, R.A. a další, 1996, Molecular Immunology 33, dodatek 1, 59, abstrakt 235). Proto byly zavedeny další rovnocenné mutace do lidského C3, a to Arg 954 za Gin a Glu 955 za Gly, a tak vznikla mutantní forma E1Q2QG3.

2. Použité způsoby

Metodika použitá pro přípravu mutantních forem byla stejná jako v předchozích příkladech, výjimku tvořil primer pro mutantní formu E1Q2E3, který měl sekvenci gaacg cctgg gcgaa gaagg agtgc ag a kódoval mutace R954E, a dále primer pro mutantní formu E1Q2QG3, který měl sekvenci aacgc ctggg ccaag aggag tgcag aa kódující mutace R954Q a E955G. Vzniklý produkt byl vložen ligací do konstruktu, který obsahoval mutace kódující E1Q2 (E1303, Q1320, tak, jak je popsáno v příkladu 5 a 11).

Sekvenční analýza vyizolované plazmidové DNA potvrdila správnost zavedených mutací. Nebyly detekovány žádné další mutace. Takto vzniklé expresivní vektory byly • · · · • «

-81• · > 9 9 4 • · ·

9 9 4 • · « • * · 9 zavedeny transfekci do COS buněk a exprimovaný produkt byl analyzován na citlivost ke štěpným reakcím, tak, jak bylo popsáno dříve.

3. faktorem I zprostředkované štěpení mutantních forem E1Q2, E1Q2E3 a E1Q2QG3

Analýzy produktů exprese jsou ukázány na obrázku 13.

Za zvláště důležité považujeme následující body:

(i) k vyvolání Western blotu byly použity monoklonální protilátky reagující s C3dg oblastí na C3, které detekují prekurzory alfa, alfa', fragmenty o velikosti 77 a 68 kDa, ale nikoli beta , nebo fragmenty o velikosti 43 a 46 kDa. Navíc byl detekován produkt štěpení v místě 3 o velikosti 86 kDa, a to bez současného štěpení v místě 1 nebo 2 .

(ii) Z obrázku je zřejmé, že produkt štěpení o velikost.) kDa se skutečně tvoří štěpením zprostředkovaným faktorem I vmiste E1Q2 za přítomnosti sCRl (stopa A3), ale nikoli za přítomnosti faktoru H jako kofaktoru (dráha A2) (iii) produkt o velikosti 86 kDa se také netvoří u dalších mutantních forem E1Q2E3 ( C) nebo E1Q2QG3 (B) , dokonce ani v přítomnosti sCRI ( C3 a B3)

4. Závěr (i) Ke štěpení, v místě 3 zprostředkovanému faktorem I může docházet i v případě, že štěpení v místech 1 a 2 je zablokováno. Proto je nutné zavést další blokaci štěpení pro místo 3 tak, aby se vhodně zabránilo odbourávání každé ze všech připravených mutantních forem, která je rezistentní ke štěpení jen v místě 1 nebo 2, kdyby byly použity ve fyziologickém prostředí.

• · ·

-82(ii) Štěpení v místě 3 může být zablokováno mutací zbytku 954 na Glu a mutací v místě 954 a 955 na Gin a Gly. Z tohoto důvodu je možné zavést ještě další mutace v pozicích 954 a/nebo 955, které by pravděpodobně poskytly rezistenci v místě 3.

(iii) Popsané mutace nedovolují štěpení na dalších uvažovaných pozicích v štěpném místě 3 .(jako je 959 až 960), dokonce ani tehdy, nejsou-li uvažovaná místa mutovaná. Toto potvrzuje, že buď pozice 954 až 955 jsou jediným signifikantním místem pro štěpení, nebo že mutace u těchto zbytků zabraňuje štěpení v dalších pozicích jiným způsobem (jako je například konformační deformace). Ve všech případech, mutace provedená v pozici 954 a/nebo v pozici 955 se jeví jako účinný prostředek k proti degradaci C3b nebo C3i- podobným produktům.

Příklad 17: Modifikace C-koncové oblasti proteinu C3, které vedou k inhibici štěpení faktorem I

1. Úvod

V příkladu 15 je popsáno, že mutace nebo delece zbytků 1546 až 1663 v proteinu C3 slouží k ustavení rezistence ke štěpení faktorem I. V tomto příkladu jsou uvedeny další mutace menšího ¹ rozsahu, které rovněž vedou k této rezistenci, ale i různé mutace, které toho nejsou schopny.

2. Použité způsoby

Metodika použitá pro přípravu mutantních forem byla stejná jako v předchozích příkladech, výjimku tvořily primery pro mutantní formy, které mají sekvence uvedené v tabulce III a kódují vyznačené mutace. Sekvenční analýza izolovaných plazmidových DNA potvrdila správnost zavedených mutací. Nebyly detekovány žádné další mutace.

• • ·

I <

• ·

-83Takto vzniklé expresní vektory byly zavedeny transfekcí do COS buněk a uvolňovaný exprimovaný produkt byl analyzován na citlivost ke štěpným reakcím, tak, jak bylo popsáno dříve.

3. Rezistence různých mutantních forem ke štěpení faktorem I.

Výsledky získané ze štěpících reakcí uskutečněných pomocí aplikace faktoru I a H na uvedené mutantní formy jsou shrnuty v obrázku 14 a 15.

Poznamenejme, že k vyvolání western blotu byly použity monoklonální protilátky vytvořené proti C3dg oblasti proteinu C3, které detekují prekurzory alfa, alfa', fragmenty o velikosti 77 a 68 kDa, ale nikoli řetězec beta, nebo fragmenty o velikosti 43 a 46 kDa.

Obrázek 14 znázorňuje, že přirozeně se vyskytující typy produktů (NC3,A), FT-3(D), FT-4 (E) a FT-5(F) jsou štěpeny faktorem I, jak o tom vypovídá na elektroforéze vznik fragmentů o velikosti 77 kDa a/nebo 68 kDa a dále vymizení pruhu odpovídajícího alfa řetězci. Na rozdíl od toho, FT-1 a FT-2 nejsou štěpeny vůbec.

Obrázek 15 znázorňuje, že přirozeně se vyskytující protein (NC3,A), FR-1(Β), FR-2(C) , FR-3(D) a FR-4(E) se štěpí, zatímco opět u proteinu FT-2 (stopa F) ke štěpení nedochází

4. Závěr (i) K zavedení rezistence ke štěpení pomocí faktoru I postačuje dokonce i jen malé zkrácení FT-2. Této rezistence může být proto dosaženo vynecháním některých nebo všech zbytků v oblasti 1636 až 1663. Tento závěr podporuje i rezistence ke štěpení, která se objevila u

Μ

• « ‘ <

• ·

FT-1, kde byly vynechány zbytky 1636 až 1663 s následnou delecí či modifikací zbytků 1591 až 1635.

(ii) Protože jsou aminokyselinové zbytky 1636 až 1663 nutné pro štěpení zprostředkované faktorem I, je pravděpodobné, že i mnoho dalších modifikací zbytků spadajících do této oblasti vyvolá rezistenci.

(iii) Ne všechny modifikace těchto zbytků propůjčí rezistenci vůči Štěpení. Mezi modifikace, které nevedou k ustavení rezistence patří FT-5, FR-1, FR-2, FR-3 a FR4, dále také modifikace FT-3 a FT-4, u kterých však docházelo k modifikaci jiných zbytků, než zbytků s čísly 1636 až 1663.

(iv) Tato data nutně vedou k závěru, že zbytky mezi pozicemi 1636 až 1663, které jsou nutné pro štěpení jsou ty, které nebyly modifikovány u FT-5, FR-1, FR-2, FR-3 nebo FR-4. Z tohoto docházíme k závěru, že zbytky s čísly 1649 až 1660 by mohly hrát klíčovou roli.

•85r2 Ό ti ι—ι 44 Ή >2 a >

oj +J

Ή >Ν

Ο &

>ι

Ο <44

Ή

4-) ti

4-1 σι ti Λ! ι—I 3 • · <

• · · • · · · I • · «

Ή ο

Μ—| •Γ-1 Φ 2 Ο Ν 2 ti Φ 2 > 42 44 ti φ 2 W φ

υ

Ή ο

•ti ti > Φ Ο Φ Ν 2 ti Φ 2 > 42 44 ti φ 2 ω

Φ

S

Ή a

ο

Ή

Φ tn ti

4-1 g

Φ

Φ

Φ >

Φ ω

4->

ti

4-1

S

44	σ	a	α 2
Μ	a	a	>Η		Η		a
	ο		1—		Η		Ě-l
2	44	a			Ο	ω	ω	ta
Η	OT	2	a	cn	a	W	(2	<

η σ\ ιτ) ί—1	<—ι CO ϊ—1	m 04 OC cH	oc <n oc i—f	If} CO i—1	lD 31 OC t~4
>Ν		>N	>N		>N	>N	>N
(0		rd	(0		ítf	tri	(0
ι—1	CO	r~~	ΐ—1	t—(	00	co	CO	CO
σι	00	o	CN	oo	00	00	o-)
m	CO	co	CO	OO	CO	co	co	co
t-)	Τ-i	i—i	r*H	rH	Γ—f	i-H	i—!	1—|

	o	σ
B				2	2
O				a	σ
3				2	2
a	o			a	a
o	a		a	a	a
co	o		Q	a	a
ω	1-4		a	Q	Q
a	1—1	o	a	o	o

CN	oo		LQ	i—1	CN	00
1 H	1	t H	1 H	1 a	1	1	1
ta	tu	ta	ta	a	ta	ta	ta

• ·

-86INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 1:

TAGGGAGACC GGAAGCTTGC CCTCTCCCTC TGTCCCTCTG T 41

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 31 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID

CAACTGCCCA GCCAAAGCTC CAAGATCACC 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:

.(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(Xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID

GCCAGCCTCC' TGCAATCAGA AGAGACCAAG 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA: 32 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE 11

TAATAAATTC GACCTTAAGG TCACCATAAA AC 32

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID

GGTGATCTTG GAGCTTTGGC TGGGCAGTTG 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č

CTTGGTCTCT TCTGATTGCA GGAGGCTGGC 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. C. 7:

-88(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

·· ·

(A) DÉLKA: 32 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.

GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA 32

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č:

CAACTGCCCA GCKRSAGCTC CAAGATCACC 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č

CACCAGGAAC TGAATCTAGA TGTGTCCCTC 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží • · · · • · · • ·· ·· · · ·

-89(B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 10: GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA 32

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 45 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID

AGTAACCTGG GTTCGGGCAT CATTGCAGGA TCGGGCATCG TTTCC 45

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 39 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.

TGGTGTTGAC CAATACATCT CCGACTATCA GCTGGACAA 39

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44.párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno

9

-9044 • ·

• · • · (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 13:

TGGGTGCCCC AACCATCATC ATCATCATCA TTGACCACAC CCCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 14:

CCAGATGACA AGTGCTGCCG TCAGCCAGTC AGGGCTGAAG CACC 44

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 15:

TGTCATCGTG CCGCTAAAGA 2 0

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

• ·

·· ·

-91(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 16: GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA 32

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.

AACGGCTGAA CATATTAATT CATACCCCCT CGGGC 35

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 33 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID

ATCTCGCTGC GCAAGGCTTT CGATATTTGC GAG 33

INFORMACE O SEKVENCI ID. C. 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 19:

-92• · ·· • · · · • · ·· ··

GAACGCCTGG GCGAAGAAGG AGTGCAG 27

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 28 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.

AACGCCTGGG CCAAGGAGGA GTGCAGAA 28

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 14 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: peptid
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č

Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val

10

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1663 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 22:

Lys	Ser	Glu	Lys 100	Gly	Arg	Asn	Lys
Gly	Thr	Gin 115	Val	Val	Glu	Lys	Val 120
Tyr	Leu 130	Phe	Ile	Gin	Thr	Asp 135	Lys
Val' 145	Leu	Tyr	Arg	Ile	Phe 150	Thr	Val
Arg	Thr	Val	Met	Val 165	Asn	Ile	Glu
Gin	Asp	Ser	Leu 180	Ser	Ser	Gin	Asn
Trp	Asp	Ile 195	Pro	Glu	Leu	Val	Asn 200
Tyr	Tyr 210	Glu	Asn	Ser	Pro	Gin 215	Gin
Lys 225	Glu	Tyr	Val	Leu	Pro 230	Ser	Phe
Lys	Phe	Tyr	Tyr	Ile 245	Tyr	Asn	Glu
Ala	Arg	Phe	Leu 260	Tyr	Gly	Lys	Lys
Phe	Gly	Ile 275	Gin	Asp	Gly	Glu	Gin 280
Lys	Arg 290	Ile	Pro	Ile	Glu	Asp 295	Gly

Phe Val Thr Val Gin Ala Thr Phe 105 110

Val Leu Val Ser Leu Gin Ser Gly 125

Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr 140

Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly 155 160

Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys 170 175

Gin Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser 185 190

Met Gly Gin Trp Lys Ile Arg Ala 205

Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu·Val 220

Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu 235 240

Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr

250 255

Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile

265 “ 270

Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu

285

Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg

300

Lys Val Leu Leu Asp Gly Val Gin Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val

305 310 315 320

-94• · · ·· • · ··· · · • · · · ··· ·♦ ··

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr 325

Val

Ser

Ala

Thr

Val 330

Ile

Leu

His

Ser

Gly 335

Ser

Asp

Met

Val

Gin

Ala

Glu

Arg

Ser

Gly

Ile

Pro

Ile

Val

Thr

Ser

Pro

340

345

350

Tyr

Gin

Ile

His

Phe

Thr

Lys

Thr

Pro

Lys

Tyr

Phe

Lys

Pro

Gly

Plet

355

360

365

Pro

Phe

Asp

Leu

Met

Val

Phe

Val

Thr

Asn

Pro

Asp

Gly

Ser

Pro

Ala

370

375

380

Tyr

Arg

Val

Pro

Val

Ala

Val

Gin

Gly

Glu

Asp

Thr

Val

Gin

Ser

Leu

385

390

395

400

Thr

Gin

Gly

Asp

Gly

Val

Al a

Lys

Leu

Ser

Ile

Asn

Thr

His

Pro

Ser

405

410

415

Gin

Lys

Pro

Leu

Ser

Ile

Thr

Val

Arg

Thr

Lys

Lys

Gin

Glu

Leu

Ser

420

425

430

Glu

Ala

Glu

Gin

Ala

Thr

Arg

Thr

Met

Gin

Ala

Leu

Pro

Tyr

Ser

Thr

435

440

445

Val

Gly

Asn

Ser

Asn

Asn

Tyr

Leu

His

Leu

Ser

Val

Leu

Arg

Thr

Glu

450

455

460

Leu

Arg

Pro

Gly

Glu

Thr

Leu

Asn

Val

Asn

Phe

Leu

Leu

Arg

Met

Asp

465

470

475

480

Arg

Ala

His

Glu

Ala

Lys

Ile

Arg

Tyr

Tyr

Thr

Tyr

Leu

Ile

Met

Asn

485

490

495

Lys

Gly

Arg

Leu

Leu

Lys

Ala

Gly

Arg

Gin

Val

Arg

Glu

Pro

Gly

Gin

500

505

510

Asp

Leu

Val

Val

Leu

Pro

Leu

Ser

Ile

Thr

Thr

Asp

Phe

Ile

Pro

Ser

515

520

525

Phe

Arg

Leu

Val

Ala

Tyr

Tyr

Thr

Leu

Ile

Gly

Ala

Ser

Gly

Gin

Arg

530

535

540

Glu

Val

Val

Ala

Asp

Ser

Val

Trp

Val

Asp

Val

Lys

Asp

Ser

Cys

Val

545

550

555

560

Gly

Ser

Leu

Val

Val

Lys

Ser

Gly

Gin

Ser

Glu

Asp

Arg

Gin

Pro

Val

565

570

575

Pro

Gly

Gin

Gin

Met

Thr

Leu

Lys

Ile

Glu

Gly

Asp

His

Gly

Ala

Arg

580

585

590

Val

Val

Leu

Val

Ala

Val

Asp

Lys

Gly

Val

Phe

Val

Leu

Asn

Lys

Lys

595

600

605

Asn

Lys

Leu

Thr

Gin

Ser

Lys

Ile

Trp

Asp

Val

Val

Glu

Lys

Ala

Asp

610

615

620

Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser

-950 0 0 · · · • · * · · • · · · · · · 0 · · · • 0« ·® ··

625 630

Asp	Ala	Gly	Leu	Thr 645	Phe	Thr	Ser
Arg	Ala	Glu	Leu 6 60	Gin	Cys	Pro	Gin
Val	Gin	Leu 67 5	Thr	Glu	Lys	Arg	Met 680
Glu	Leu 690	Arg	Lys	Cys	Cys	Glu 695	Asp
Phe 705	Ser	Cys	Gin	Arg	Arg •710	Thr	Arg
Lys	Lys	Val	Phe	Leu 725	Asp	Cys	Cys
Gin	His	Ala	Arg 740	Ala	Ser	His	Leu
Glu	Asp	Ile 755	Ile	Ala	Glu	Glu	Asn 760
Glu	Ser 770	Trp	Leu	Trp	Asn	Val 775	Glu
Gly 785	Ile	Ser	Thr	Lys	Leu 790	Met	Asn
Thr	Trp	Glu	Ile	Leu 805	Ala	Val	Ser
Val	Ala	Asp	Pro 820	Phe	Glu	Val	Thr
Leu	Arg	Leu 835	Pro	Tyr	Ser	Val	Val 840
Ala	Val 850	Leu	Tyr	Asn	Tyr	Arg 855	Gin
Glu 865	Leu.	Leu	His	Asn	Pro 870	Ala	Phe
Arg	His	Gin	Gin	Thr- 885	Ile	Thr	Ile
Pro	Tyr	Val	Ile 900	Val	Pro	Leu	Lys
Lys	Ala	Ala 915	Val	Tyr	His	His	Phe 920
Leu	Lys 930	Val	Val	Pro	Glu	Gly 935	Ile

635 640

Ser	Ser 650	Gly	Gin	Gin	Thr	Ala 655	Gin
Pro 665	Ala	Ala	Arg	Arg	Arg 670	Arg	Ser
Asp	Lys	Val	Gly	Lys 685	Tyr	Pro	Lys
Gly	Met	Arg	Glu 700	Asn	Pro	Met	Arg
Phe	Ile	Ser 715	Leu	Gly	Glu	Ala	Cys 720
Asn	Tyr 730	Ile	Thr	Glu	Leu	Arg 735	Arg
Gly 745	Leu	Ala	Arg	Ser	Asn 750	Leu	Asp
Ile	Val	Ser	Arg	Ser 765	Glu	Phe	Pro
Asp	Leu	Lys	Glu 780	Pro	Pro	Lys	Asn
Ile	Phe	Leu 795	Lys	Asp	Ser	Ile	Thr 800
Met	Ser 810	Asp	Lys	Lys	Gly	Ile 815	Cys
Val 825	Met	Gin	Asp	Phe	Phe 830	Ile	Asp
Arg	Asn	Glu	Gin	Val 845	Glu	Ile	Arg
Asn	Gin	Glu	Leu 860	Lys	Val	Arg	Val
Cys	Ser	Leu 875	Ala	Thr	Thr	Lys	Arg 880
Pro	Pro 890	Lys	Ser	Ser	Leu	Ser 895	Val
Thr 905	Gly	Leu	Gin	Glu	Val 910	Glu	Val
Ile	Ser	Asp	Gly	Val 925	Arg	Lys	Ser
Arg	Met	Asn	Lys	Thr	Val	Ala	Val

940

Arg 945	Thr	Leu	Asp	Pro	Glu 950	Arg	Leu
Asp	Ile	Pro	Pro	Ala 965	Asp	Leu	Ser
Glu	Thr	Arg	Ile 980	Leu	Leu	Gin	Gly
Asp	Ala	Val 995	Asp	Ala	Glu	Arg	Leu 1000
Gly	Cys 101C	Gly )	Glu	Gin	Asn	Met 1015	Ile
Val 1025	His	Tyr	Leu	Asp	Glu Thr 1030	Glu
Lys	Arg	Gin	Gly	Ala	Leu	Glu	Leu

1045 c ·

-9 6-

	• 4 · • • • • · a	<· · 9 · • 4 • t 9 · 4 4	4 • · • 4 9 4 • · ·	• • · • • • • 4 ·	• · 4 • • ·· • ·	• 4 • · * • 4 · • » · • 4 4 • 4
Gly	Arg	Glu 955	Gly	Val	Gin	Lys	Glu 960
Asp	Gin 970	Val	Pro	Asp	Thr	Glu 975	Ser
Thr 985	Pro	Val	Ala	Gin	Met 990	Thr	Glu
Lys	His	Leu	Ile	Val	Thr	Pro	Ser

Leu	Ala	Phe	Arg 1060	Gin	Pro	Ser	Ser
Ala	Pro	Ser 1075	Thr	Trp	Leu	Thr	Al a 10 8 0
Ά1 a	Val 109	Asn 0	Leu	Ile	Ala	Ile 1095	Asp
Lys 1105	Trp	Leu	Ile	Leu	Glu 1110	Lys	Gin
Asp	Ala	Pro	Val	Ile	His	Gin	Glu

1125

1005

Gly	Met	Thr	Pro 102C	Thr	Val	Ile	Ala
Gin	Trp	Glu 1035	Lys 1	Phe	Gly	Leu	Glu 1040
Ile	Lys 105C	Lys J	Gly	Tyr	Thr	Gin 1055	Gin
Ala 1065	Phe 1	Ala	Ala	Pne-	Val 107	Lys 0	Arg
Tyr	Val	Val	Lys	Val	Phe	Ser	Leu

Asn	Glu	Lys	Asp 114C	Met 1	Ala	Leu	Thr
Glu	Ala	Lys 1155	Asp	Ile	Cys	Glu	Glu 1160
Ile	Thr Lys 1170	Ala	Gly	Asp	Phe 1175	Leu
Arg 1185	Ser	Tyr	Thr	Val	Ala 119C	Ile )	Ala
Arg	Leu	Lys	Gly	Pro	Leu	Leu	Asn

1205

1085

Ser	Gin	Val	Leu 1100	Cys	Gly	Ala	Val
Lys	Pro	Asp 1115	Gly	Val	Phe	Gin	Glu 1120
Met	Ile 1130	Gly	Gly	Leu	Arg	Asn 1135	Asn
Ala 1145	Phe	Val	Leu	Ile	Ser 1150	Leu 1	Gin
Gin	Val	Asn	Ser	Leu	Pro	Gly	Ser

Lys	Asn	Arg	Trp 1220	Glu 1	Asp	Pro	Gly
Thr	Ser	Tyr 1235	Ala 1	Leu	Leu	Ala	Leu 1240
Val	Pro	Pro	Val	Val	Arg	Trp	Leu

1165

Glu	Ala	Asn	Tyr Met Asn 1180	Leu	Gin
Gly	Tyr	•Ala 1195	Leu Ala Gin	Met	Gly 1200
Lys	Phe Leu 1210	Thr Thr Ala	Lys Asp 1215
Lys 1225	Gin 1	Leu	Tyr Asn Val Glu 1230	Ala
Leu	Gin	Leu	Lys Asp Phe 1245	Asp	Phe
Asn	Glu	Gin	Arg Tyr Tyr	Gly	Gly

1250 1255

1260 • 4

	-97-	• · · A « 4 4	4 4 4 4 k 4 4 4 44	« 4 · 4 • 4 4 4 4	44 4 4 4 4 4 4«	4 4 4 4 9 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ·
• • • • 4 ·	• · • · < 4 » 4 ·
Gly Tyr	Gly Ser Thr Gin Ala Thr Phe	Met	Val ·	Phe	Gin	Ala	Leu Ala
1265	1270		1275			1280
Gin Tyr	Gin Lys Asp Ala Pro Asp His	Gin	Glu	Leu	TVsn	Leu	Asp Val
	. 1285	1290				1295
Ser Leu	Gin Leu Pro Ser Arg Ser Ser	Lys	Ile	Thr	His .	Arg	Ile His
	1300 1305				1310
Trp Glu	Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser	Glu	Glu	Thr	Lys	Glu	Asn Glu
	1315 1320				1325
Gly Phe	Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys	Gly	Gin	Gly	Thr	Leu	Ser Val
133C	1335			1340
Val Thr	Met Tyr His Ala Lys Ala Lys	Asp	Gin	Leu	Thr	Cys	Asn Lys
1345	1350		1355			1360
Phe Asp	Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro	Ala	Pro	Glu	Thr	Glu	Lys.Arg
	1365	1370				1375
Pro Gin	Aso Ala Lys Asn Thr Met Ile	Leu	Glu	Ile	Cys	Thr	Arg Tyr
	1380 1385				1390
Arg Gly	Asp Gin Asp Ala Thr Met Ser	Ile	Leu	Asp	Ile	S G ΊΓ	Mec Met
	1395 1400				1405
Thr Gly	Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp	Leu	Lys	Gin	Leu	Ala	Asn Gly
1410 '1415			1420
Val Asp	Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu	Leu	Asp	Lys	Ala	Phe	Ser Asp
1425	1430		1435			1440
Arg Asn	Thr Leu Ile Ile Tyr Leu A.sp	Lys	Val	Ser	His	Ser	Glu Asp
	1445	1450				1455
Asp Cys	Leu Ala Phe Lys Val His Gin	Tyr	Phe	Asn	Val	Glu	Leu Ile
	1460 1465				1470
Gin Pro	Gly Ala Val Lys Val Tyr Ala	Tyr	Tyr	Asn	Leu	Glu	Glu Ser
	1475 1480				1485
Cys Thr	Arg Phe Tyr His Pro Glu Lys	Glu	Asp	Gly	Lys	Leu	Asn Lys
1490 1495			1500
Leu Cys	Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys	Ala	Glu	Glu	Asn	Cys	Phe Ile
1505	1510		1515			1520
Gin Lys	Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu	Glu	Glu	Arg	Leu	Asp	Lys Ala
	1525	1530				1535
Cys Glu	Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr	Lys	Thr	Arg	Leu	Val	Lys Val
	1540 1545				1550
Gin Leu	Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr	Ile	Met	Ala	Ile	Glu	Gin Thr

1555 1560 1565

Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gin Val Gly Gin Gin Arg Thr Phe

-98»a· • · · · » · » · ► · ··» « · · · * • · * • · · ·’

1570 1575

Ile	Ser	Pro	Ile	Lys	Cys	Arg	Glu
1585					1590
His	Tyr	Leu	Met	Trp 1605	Gly	Leu	Ser
Asn	Leu	Ser	Tyr	Ile	Ile	Gly	Lys

1620

Glu	Glu	Asp Glu 1635	Cys	Gin	Asp Glu 164
Leu	Gly	Ala Phe	Thr	Glu	Ser Met
	1650			1655

1580

Ala	Leu	Lys 1595	Leu 1 .	Glu	Glu	Lys	Lys 1600
Ser	Asp 161C	Phe 1	Trp	Gly	Glu	Lys 1615	Pro
Asp 1625	Thr	Trp	Val	Glu	His 163C	Trp )	Pro
Glu	Asn	Gin	Lys	Gin 1645	Cys	Gin	Asp
Val	Val	Phe	Gly	Cys	Pro	Asn

1660

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5067 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 23:

CTCCTCCCCA TCCTCTCCCT CTGTCCCTCT GTCCCTCTGA CCCTGCACTG TCCCAGCACC 60

ATGGGACCCA CCTCAGGTCC CAGCCTGCTG CTCCTGCTAC TAACCCACCT CCCCCTGGCT 120

CTGGGGAGTC CCATGTACTC TATCATCACC CCCAACATCT TGCGGCTGGA GAGCGAGGAG 180

ACCATGGTGC TGGAGGCCCA CGACGCGCAA GGGGATGTTC CAGTCACTGT TACTGTCCAC 240

GACTTCCCAG GCAAAAAACT AGTGCTGTCC AGTGAGAAGA CTGTGCTGAC CCCTGCCACC 300

AACCACATGG GCAACGTCAC CTTCACGATC CCAGCCAACA GGGAGTTCAA GTCAGAAAAG 360

GGGCGCAACA AGTTCGTGAC CGTGCAGGCC ACCTTCGGGA CCCAAGTGGT GGAGAAGGTG ' 420

GTGCTGGTCA GCCTGCAGAG CGGGTACCTC TTCATCCAGA CAGACAAGAC CATCTACACC 480

CCTGGCTCCA CAGTTCTCTA TCGGATCTTC ACCGTCAACC ACAAGCTGCT ACCCGTGGGC 540

CGGACGGTCA TGGTCAACAT TGAGAACCCG GAAGGCATCC CGGTCAAGCA GGACTCCTTG 600

TCTTCTCAGA ACCAGCTTGG CGTCTTGCCC TTGTCTTGGG ACATTCCGGA ACTCGTCAAC 660

ATGGGCCAGT GGAAGATCCG AGCCTACTAT GAAAACTCAC CACAGCAGGT CTTCTCCACT 720

GAGTTTGAGG TGAAGGAGTA CGTGCTGCCC AGTTTCGAGG TCATAGTGGA GCCTACAGAG 780

AAATTCTACT ACATCTATAA CGAGAAGGGC CTGGAGGTCA CCATCACCGC CAGGTTCCTC 840 ·

-99«· ·

TACGGGAAGA	AAGTGGAGGG	AACTGCCTTT	GTCATCTTCG	GGATCCAGGA	TGGCGAACAG	•900
AGGATTTCCC	TGCCTGAATC	CCTCAAGCGC	ATTCCGATTG	AGGATGGCTC	GGGGGAGGTT	960
GTGCTGAGCC	GGAAGGTACT	GCTGGACGGG	GTGCAGAACC	CCCGAGCAGA	AGACCTGGTG	1020
GGGAAGTCTT	TGTACGTGTC	TGCCACCGTC	ATCTTGCACT	CAGGCAGTGA	CATGGTGCAG	1080
GCAGAGCGCA	GCGGGATCCC	CATCGTGACC	TCTCCCTACC	AGATCCACTT	CACCAAGACA	1140
CCCAAGTACT	TCAAACCAGG	AATGCCCTTT	GACCTCATGG	TGTTCGTGAC	GAACCCTGAT	1200
GGCTCTCCAG	CCTACCGAGT	CCCCGTGGCA	GTCCAGGGCG	AGGACACTGT	GCAGTCTCTA	1260
ACCCAGGGAG	ATGGCGTGGC	CAAACTCAGC	ATCAACACAC	ACCCCAGCCA	GAAGCCCTTG-	1320
AGCATCACGG	TGCGCACGAA	GAAGCAGGAG	CTCTCGGAGG	CAGAGCAGGC	TACCAGGACC	1380
ATGCAGGCTC	TGCCCTACAG	CACCGTGGGC	AACTCCAACA	ATTACCTGCA	TCTCTCAGTG	1440
CTACGTACAG	AGCTCAGACC	CGGGGAGACC	CTCAACGTCA	ACTTCCTCCT	GCGAATGGAC	1500
CGCGl.CC ACG	AGGCCAAGAT	CCGCTACTAC	ACCTACCTGA	TCATGAACAA	GGGCAGGCTG	1560
TTGAAGGCGG	GACGCCAGGT	GCGAGAGCCC	GGCCAGGACC	TGGTGGTGCT	GCCCCTGTCC	1620
ATCACCACCG	ACTTCATCCC	TTCCTTCCGC	CTGGTGGCGT	ACTACACGCT	GATCGGTGCC	1680
AGCGGCCAGA	GGGAGGTGGT	GGCCGACTCC	GTGTGGGTGG	ACGTCAAGGA	CTCCTGCGTG	1740
GGCTCGCTGG	TGGTAAAAAG	CGC-CCAGTCA	GAAGACCGGC	AGCCTGTACC	TGGGCAGCAG	1800
ATGACCCTGA	AGATAGAGGG	TGACCACGGG	GCCCGGGTGG	TACTGGTGGC	CGTGGACAAG	1860
GGCGTGTTCG	TGCTGAATAA	GAAGAACAAA	CTGACGCAGA	GTAAGATCTG	GGACGTGGTG	1920
GAGAAGGCAG	ACATCGGCTG	CACCCCGGGC	AGTGGGAAGG	ATTACGCCGG	TGTCTTCTCC	1980
GACGCAGGGC	TGACCTTCAC	GAGCAC-CAGT	GGCCAGCAGA	CCGCCCAGAG	GGCAGAACTT	2040
CAGTGCCCGC	AGCCAGCCGC	CCGCCGACGC	CGTTCCGTGC	AGCTCACGGA	GAAGCGAATG	2100
GACAAAGTCG	GCAAGTACCC	CAAGGAGCTG	CGCAAGTGCT	GCGAGGACGG	CATGCGGGAG	2160
AACCCCATGA	GGTTCTCGTG	CCAGCGCCGG	ACCCGTTTCA	TCTCCCTGGG	CGAGGCGTGC	2220
AAGAAGGTCT	TCCTGGACTG	CTGCAACTAC	ATCACAGAGC	TGCGGCGGCA	GCACGCGCGG	2280
GCCAGCCACC	TGGGCCTGGC	l. AGG AGT AAC	CTGGATGAGG	ACATCATTGC	AGAAGAGAAC	2340
ATCGTTTCCC	GAAGTGAGTT	CCCAGAGAGC	TGGCTGTGGA	ACGTTGAGGA	CTTGAAAGAG	2400
CCACCGAAAA	ATGGAATCTC	TACGAAGCTC	ATGAATATAT	TTTTGAAAGA	CTCCATCACC	2460
ACGTGGGAGA	TTCTGGCTGT	GAGCATGTCG	GACAAGAAAG	GGATCTGTGT	GGCAGACCCC	2520
TTCGAGGTCA	CAGTAATGCA	GGACTTCTTC	ATCGACCTGC	GGCTACCCTA	CTCTGTTGTT	2580

, ,. · · ....

··· « ·· ·· · · · · . ·· · · » · ·· ,.,. · .··.·*· . , . · · ·· ·

... ,. ... ... »· ··

CGAAACGAGC	AGGTGGAAAT	CCGAGCCGTT	CTCTACAATT	ACCGGCAGAA	CCAAGAGCTC	2640
AAGGTGAGGG	TGGAACTACT	CCACAATCCA	GCCTTCTGCA	GCCTGGCCAC	CACCAAGAGG	2700
CGTCACCAGC	AGACCATAAC	CATCCCCCCC	AAGTCCTCGT	TGTCCGTTCC	ATATGTCAT-C	2760
GTGCCGCTAA	AGACCGGCCT	GCAGGAAGTG	GAAGTCAAGG	CTGCTGTCTA	CCATCATTTC	2820
ATCAGTGACG	GTGTCAGGAA	GTCCCTGÁAG	GTCGTGCCGG	AAGGAATCAG	AATGAACAAA	2880
ACTGTGGCTG	TTCGCACCCT	GGATCCAGAA	CGCCTGGGCC	GTGAAGGAGT	GCAGAAAGAG	2940
GACATCCCAC	CTGCAGACCT	CAGTGACCAA	GTCCCGGACA	CCGAGTCTGA	GACCAGAATT	3000
CTCCTGCAAG	GGACCCCAGT	GGCCCAGATG	ACAGAGGATG	CCGTCGACGC	GGAACGGCTG	3060
AAGCACCTCA	TTGTGACCCC	CTCGGGCTGC	GGGGAACAGA	ACATGATCGG	CATGACGCCC	3120
ACGGTCATCG	CTGTGCATTA	CCTGGATGAA	ACGGAGCAGT	GGGAGAAGTT	CGGCCTAGAG	318Ό
AAGCGGCAGG	GGGCCTTGGA	GCTCATCAAG	AAGGGGTACA	CCCAGCAGCT	GGCCTTCAGA	3240
CAACCCAGCT	CTGCCTTTGC	GGCCTTCGTG	AAACGGGCAC	CCAGCACCTG	GCTGACCGCC	3300
TACGTGGTCA	AGGTCTTCTC	TCTGGCTGTC	AACCTCATCG	CCATCGACTC	CCAAGTCCTC	3360
TGCGGGGCTG	TTAAATGGCT	GATCCTGGAG	AAGCAGAAGC	CCGACGGGGT	CTTCCAxGGA.G	3420
GATGCGCCCG	TGATACACCA	AGAAATGATT	GGTGGATTAC	GGAACAACAA	CGAGAAAGAC	3430
ATGGCCCTCA	CGGCCTTTGT	TCTCATCTCG	CTGc ALjGAGG	CTAAAGATAT	TTGCGAGGAG	3540
CAGGTCAACA	GCCTGCCAGG	CAGCATCACT	AAAGCAGGAG	ACTTCCTTGA	AGCCAACTAC	3600
ATGAACCTAC	AGAGATCCTA	CACTGTGGCC	ATTGCTGGCT	ATGCTCTGGC	CCAGATGGGC	3660
AGGCTGAAGG	GGCCTCTTCT	TAACAAATTT	CTGACCACAG	CCAAAGATAA	GAACCGCTGG	3720
GAGGACCCTG	GTAAGCAGCT	CTACAACGTG	GAGGCCACAT	CCTATGCCCT	CTTGGCCCTA	3780
CTGCAGCTAA	AAGACTTTGA	CTTTGTGCCT	CCCGTGGTGC	GTTGGCTCAA	TGAACAGAGA	3840
TACTACGGTG	GTGGCTATGG	CTCTACCCAG	GCCACCTTCA	TGGTGTTCCA	AGCCTTGGCT	3900
CAATACCAAA	AGGACGCCCC	TGACCACCAG	GAACTGAACC	TTGATGTGTC	CCTCCAACTG	3960
CCCAGCCGCA	GCTCCAAGAT	CACCCACCGT	ATCCACTGGG	AATCTGCCAG	CCTCCTGCGA	4020
TCAGAAGAGA	CCAAGGAAAA	TGAGGGTTTC	ACAGTCACAG	CTGAAGGAAA	AGGCCAAGGC	4080
ACCTTGTCGG	TGGTGACAAT	GTACCATGCT	AAGGCCAAAG	ATCAACTCAC	CTGTAATAAA	4140
TTCGACCTCA	AGGTCACCAT	AAAACCAGCA	CCGGAAACAG	AAAAGAGGCC	TCAGGATGCC	4200
AAGAACÁCTA	TGATCCTTGA	GATCTGTACC	AGGTACCGGG	GAGACCAGGA	TGCCACTATG	4260
TCTATATTGG	ACATATCCAT	GATGACTGGC	TTTGCTCCAG	ACACAGATGA	CCTGAAGCAG	4320
CTGGCCAATG	GTGTTGACAG	ATACATCTCC	AAGTATGAGC	TGGACAAAGC	CTTCTCCGAT	4380

AGGAACACCC

TTCAAAGTTC

GCCTATTACA

AAGCTGAACA

CAAAAGTCGG

GTGGACTATG

TACATCATGG

CAGCGCACGT

CACTACCTCA

ATCATCGGGA

GAGAACCAGA • «

	-	101-	• · · fc ·· · · fcfc • · · * • 9 · · · • · · · ··· 99 999	• · · · · « · 9 9 9 9 9 9 9 99 • 9 99 9 9 9 9 9 9 · 999 99 99
TCATCATCTA	CCTGGACAAG	GTCTCACACT	CTGAGGATGA	CTGTCTAGCT	4 440
ACCAATACTT	TAATGTAGAG	CTTATCCAGC	CTGGAGCAGT	CAAGGTCTAC	4500
ACCTGGAGGA	AAGCTGTACC	CGGTTCTACC	ATCCGGAAAA	GGAGGATGGA	4560
AGCTCTGCCG	tgatgaActg	TGCCGCTGTG	CTGAGGAGAA	TTGCTTCATA	4620
ATGACAAGGT	CACCCTGGAA	GAACGGCTGG	ACAAGGCCTG	TGAGCCAGGA	4680
TGTACAAGAC	CCGACTGGTC	AAGGTTCAGC	TGTCCAATGA	CTTTGACGAG	4740
CCATTGAGCA	GACCATCAAG	TCAGGCTCGG	ATGAGGTGCA	GGTTGGACAG	4800
TCATCAGCCC	CATCAAGTGC	AGAGAAGCCC	TGAAGCTGGA	GGAGAAGAAA	4860
TGTGGGGTCT	CTCCTCCGAT	TTCTGGGGAG	AGAAGCCCAA	CCTCAGCTAC	4920
AGGACACTTG	GGTGGAGCAC	TGGCCTGAGG	AGGACGAATG	CCAAGACGAA	4980
AACAATGCCA	GGACCTCGGC	GCCTTCACCG	AGAGCATGGT	TGTCTTTGGG	5040

0 67

TGCCCCAACT GACCACACCC CCATTCC □ ·

· · *

-102-

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY modifikován tak, že je schopen vytvářet C3 konvertázu rezistentní k regulačnímu snížení aktivity.

   Protein podle -nároku 1, který je modifikovaným lidským proteinem.

   3. Protein podle nároku 1 nebo 2, který je oproti nativnímu proteinu odolnější vůči štěpení faktorem

   I.

   4. Protein podle libovolného z nároků 1 až 3, který je modifikovaným proteinem C3.

   5. Protein podle nároku 4, který je modifikován náhradou buď argininu 1303 nebo argininu 1320 nebo obou za jinou aminokyselinu.

   6. Protein podle nároku 5, ve kterém je arginin 1320, arginin 1303 nebo oba jsou zaměněny za glutamin, tyrosin, cystin, tryptofan, kyselinu glutamovou nebo glycin.

   7. Protein podle nároku 5, ve kterém je arginin 1320 je nahrazen glutaminem.

   8. Protein podle libovolného z nároků 6 a 7, ve kterém je arginin 1303 nahrazen kyselinou glutamovou, glycinem nebo glutaminem.

   -1039. Protein podle libovolného z předcházejících nároků, který má ve srovnání s nativním lidským proteinem C3 sníženou citlivost k faktoru H a/nebo faktoru I, přičemž má tento protein oproti nativnímu lidskému proteinu C3 jednu nebo více aminokyselinových záměn v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům 752 až 754 a/nebo aminokyselinovými zbytkům 758 až 780 nativního lidského proteinu C3.

   10. Protein podle nároku 9, ve kterém je jedna nebo více aminokyselinových záměn výměnou kyselého aminokyselinového zbytku za zbytek neutrální.

   11. Protein podle nároku 9 nebo 10, ve kterém je uvedená záměna aminokyselin záměnou Asp-Glu-Asp za Gly-Ser-Gly.

   12. Protein podle libovolného z předcházejících nároků, ve kterém jsou změněny aminokyseliny odpovídající v lidském nativním proteinu C3 aminokyselinám na pozicích 1427, 1431 a/nebo 1433.

   13. Protein podle libovolného z předcházejících nároků, který obsahuje jednu nebo více mutací v aminokyselinách odpovídajících v lidském nativním proteinu C3 aminokyselinovým zbytkům 992 až 1005 (EDAVDAERLKHLIV), takže jeho produkty C3b a C3i nebo od nich odvozené C3 konvertázy jsou rezistentní vůči komplement inhibující aktivitě faktoru H.

   14. Protein podle nároku 13, který obsahuje jednu nebo více mutací v aminokyselinách odpovídajících v lidském nativním proteinu C3 aminokyselinovým

   -104zbytkům 992 (Ε) , 993 (D) , 996 (D) , 997 (A), 993 (Ε), 999 (R) , 1000 (L) , 1001 (K) , 1002 (Η), 1005 (V) .

   15. Protein podle nároku 14, který obsahuje jednu nebo více z následujících mutací E992S, D993A, D996S,

   A997Q, E998S a R999G, L1000M, K1001N, H1002I a

   V1005H.

   16. Protein podle libovolného z předcházejících nároků, který obsahuje jednu nebo více mutací v aminokyselinách odpovídajících v lidském nativním proteinu C3 aminokyselinovým zbytkům 1152 až 1155 (QEAK) takže jeho produkty C3b a C3i nebo od nich odvozené C3 konvertázy jsou rezistentní vůči komplement inhibující aktivitě faktoru H.

   17. Protein podle nároku 16, který obsahuje jednu nebo více mutací v aminokyselinách odpovídajících v lidském nativním proteinu C3 zbytkům 1152 (Q),

   1153 (E) a 1155 (K).

   18. Protein podle nároku 17, který obsahuje jednu nebo více z následujících mutací Q1152R, E1153K a

   K1155F.

   19. Protein podle libovolného z nároků 13 až 18, který je rezistentní vůči komplement inhibující aktivitě CR1, MCP a/nebo DAF.

   20. Protein podle libovolného z předcházejících nároků, který má jednu nebo více aminokyselinových delecí, substitucí nebo inzercí v místech odpovídajících aminokyselinám 1546 až 1663 nativního lidského • · · · φ φ φ · • φφφ

   -105proteinu C3, přičemž tento protein má vzhledem k nativnímu lidskému proteinu C3 sníženou citlivost k faktoru H a/nebo I.

   21. Protein podle nároku 20, který má jednu nebo více aminokyselinových delecí v oblasti odpovídající aminokyselinám 1546 až 1663 nativního lidského proteinu C3.

   22. Protein podle nároku 20 nebo 21, který má deleci zahrnující všechny aminokyseliny v oblasti odpovídající aminokyselinám 1546 až 1663 nativního lidského proteinu C3.

   23. Protein podle nároku 20, změněných aminokyselin aminokyselinám 1546 až proteinu C3.

   který má jednu nebo více v oblasti odpovídající

   1663 nativního lidského

   24. Protein podle nároku 23, který má v oblasti odpovídající aminokyselinám 1546 až 1663 nativního lidského proteinu C3 aminokyseliny vzniklé mutací s posunem čtecího rámce v DNA kódující nativní lidský protein C3.

   25. Protein podle libovolného z nároků 20 až 24, který obsahuje jednu nebo více aminokyselinových delecí, substitucí nebo inzercí v aminokyselinách odpovídajících v lidském nativním proteinu C3 aminokyselinovým zbytkům 1636 až 1663, přičemž tento protein má vzhledem k nativnímu lidskému proteinu C3 sníženou citlivost k faktoru H a/nebo I.

   • ·

   -10626. Protein podle nároku 25, který má jednu nebo více aminokyselinových delecí v oblasti odpovídající aminokyselinám 1636 až 1663 nativního lidského proteinu C3.

   27. Protein podle nároku 25 nebo 26, který má deleci zahrnující všechny aminokyseliny v oblasti odpovídající aminokyselinám 1546 až 1663 nativního lidského proteinu C3.

   28. Protein podle nároku 25, který má v oblasti odpovídající aminokyselinám 1636 až 1663 nativního lidského proteinu C3 jednu nebo více jiných aminokyselin.

   29. Protein podle nároku 25, který obsahuje jednu nebo více aminokyselinových delecí, substitucí nebo inzercí v aminokyselinách odpovídajících v lidském nativním proteinu C3 aminokyselinovým zbytkům 1649 až 1660, přičemž tento protein má vzhledem k nativnímu lidskému proteinu C3 sníženou citlivost k faktoru H a/nebo I.

   30. Protein podle libovolného z předcházejících nároků, který má jednu nebo více aminokyselinových delecí, substitucí nebo inzercí v aminokyselinách odpovídajících aminokyselinám 954 a/nebo 955 nativního lidského proteinu C3, a který má v tomto místě...........sníženou citlivost ke štěpení zprostředkovanému faktorem I a které je závislé na přítomnosti kofaktoru, například CRI nebo faktoru

   H.

   -10731. Protein podle nároku 30, který má v místě odpovídající aminokyselině 954 lidského proteinu C3 jinou aminokyselinu než lidský protein C3, přičemž tento protein má v tomto místě sníženou citlivost ke štěpení zprostředkovanému faktorem I, které je závislé na přítomnosti kofaktoru, například CR1 nebo faktoru H.

   32. Protein podle nároku 31, ve kterém je zmíněnou aminokyselinou kyselina glutamová a přičemž tento protein má v tomto místě sníženou citlivost ke štěpení zprostředkovanému faktorem I, které je závislé na přítomnosti kofaktoru, například CR1 nebo faktoru H.

   33. Protein podle nároku 30, který má v místech odpovídajícím aminokyselinám 954 a 955 lidského proteinu C3 glutamin a glycin, přičemž tento protein má v tomto místě sníženou citlivost ke štěpení zprostředkovanému faktorem I, které je závislé na přítomnosti kofaktoru, například CR1 nebo faktoru H.

   34. Protein podle nároku 30, který má v místě odpovídající aminokyselině 955 lidského proteinu C3 jinou aminokyselinu než lidský protein C3, přičemž tento protein má v tomto místě sníženou citlivost ke štěpení zprostředkovanému faktorem I, které je závislé na přítomnosti kofaktoru, například CR1 nebo faktoru H.

   35. Fragment nebo varianta proteinu podle libovolného z předcházejících nároků, přičemž má tento fragment nebo varianta C3 konvertázovou aktivitu a je rovněž • · · · · • · · · · rezistentní vůči komplement inhibující aktivitě faktoru H, faktoru I, CR1, MCP a/nebo DAF.

   36. Sekvence DNA kódující protein podle libovolného z nároků 1 až 34 nebo jeho fragment či variantu podle nároku 35.

   37. DNA konstrukt (například vektor) obsahující sekvenci DNA podle nároku 36.

   38. Terapeutické použití proteinu podle libovolného z nároků 1 až 34 nebo jeho fragmentu či varianty podle nároku 35.

   39. Konjugát, který obsahuje protein podle libovolného z nároků 1 až 34 nebo jeho fragment či variantu podle nároku 35 navázaný na specifickou vazebnou skupinu.

   40. Konjugát podle nároku 39, ve kterém specifickou vazebnou skupinou je specifický vazebný protein.

   41. Konjugát podle nároku 40, ve kterém je specifickým vazebným proteinem skupinou protilátka nebo její antigen vázající fragment.

   42. Použití proteinu podle libovolného z nároku 1 až 34 nebo jeho fragmentu či varianty podle nároku 35, nebo konjugátu podle libovolného z nároků 39 až 41 pro výrobu léčiva vhodného pro snižování koncentrací proteinů komplementové kaskády.

   -109·· ·· · · · · • · · · · · • · 9 ·· · · · • · * · · ··· ··· ·· ··

   43. Použití podle nároku 42 vyznačující se t í m , že léčivo je použito pro prevenci odmítnutí cizorodé látky.

   44. Použití podle nároku 42 vyznačující se tím , že léčivo je použito pro lokalizaci a/nebo amplifikaci endogenní konverze komplementových proteinů a pro jejich depozici na specifickém místě.

   45. Farmaceutická kompozice, která obsahuje jeden nebo více proteinů definovaných v libovolném z nároků 1 až 34, nebo jejich fragmenty či varianty podle nároku 35, nebo konjugáty podle libovolného z nároků 39 až 41 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.

   46. Farmaceutická kompozice podle nároku 45 pro použití při snižování koncentrací proteinů kompleměntové kaskády.

   47. Farmaceutická kompozice podle nároku 45 pro použití při prevenci odmítnutí cizorodé látky.

   48. Farmaceutická kompozice podle nároku 45 pro použití při lokalizaci a/nebo amplifikaci endogenní konverze komplementových proteinů a pro jejich depozici na specifickém místě.

   49. Způsob snížení koncentrace proteinů komplementové kaskády v savčím organismu vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podání proteinu podle libovolného z nároků 1 až 34 nebo jeho fragmentu či

   -110• · · • ·· »· · · varianty podle nároku 35, nebo konjugátu podle libovolného z nároků 39 až 41 tomuto savci.

   50. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že pro podání je použita farmaceutická kompozice podle nároku 45.

   • · » 4

   1/19 . · TWP?/

   OBR. 1(1)

   10 20 30 40 50 60

   MGP7S3PSEX LXEXTHLPLA LGSPMYSXIT PNXLRXXSEE TMVLZAHDAC GDVPVTVTVH

   70 80 90 100 110 120 XT? GKX17XS ÍEKTVLTFAT nhmgnvtft: ?ΑΝΑΖΓΗΞΕΧ gRNKFV tvqa TFGTG7VEKV 130 140 150 160 170 180

   vlvsigsgyi fxgtektxyx pcstviyrif tvnhkllfvg rtvmvnienp egxpvkoosi

   190 200 210 220 230 240 ssokcíSV-? ls«e:?ex.vn mgowkxrayy e.wspcsvfxx efevkeyvl? sfevxvepte

   250 260 270 2BC 290 300

   ΚΤΪΎΧΥΝΕΚΧ LEVTITARTL YGKKVEGTA? VXFGXXXGX2 ?.X3X?E3U0R XPXEXGSGEV

   31C 320 230 340 350 360

   7ESRSVLLE3 7QNPRAE21.V GK2X.Y7SA77 XEHSGSDMVC AXESSIPIYX SPYQXSTTJ^

   370 380 390 40C 410 420

   PKYFXPGKPF XIKVFYTNPX G3PAYR7PVA VQ-GEETVCSl TCG3GVAK23 XNTHPSOKPL

   430 440 450 460 470 480

   S277R7KKCS X3EAEGAXRX MQALPY3TVG NSNNYXKX.SV LRTEERPGEX ENVNFLLRř©

   490 500 510 520 530 540

   RAKEAXIRTY TYEIHNKGRL LKAGRQVRE? GOCL7VEP1S XXTDFIPSFR Ι'.’λΠΧΙΙΟλ

   550 560 570 580 590 600 S G O REVV AE· 3 VWVEVK2SGV G3LWKSGC3 EXROPVPGGC KTLKIEGDKG ARVVL7AVDK 610 G7F7LNKKNK 620 LTOSKXWDW 630 2KA2XGGTFG 640 SGKXYAGTFÍ 650 CAGLTFT3SS 660 ^AQRAEX# 670 680 590 700 710 720

   CCPC-PAARRR ,-.S7GLTEXRH DKVGKYPXEL RKGGEDGMPT NPMRT3GQRP. TRTESLGEAC

   730 KKVFLXCGNY 740 ITELRAQHAR 750 760 asklglarsn leediiaeek 770 XVSRSEFPES 780 WLWNVEDLKE 790 800 810 620 830 840 PPKKGI3TXL MNXFLKCSIT TWEILAVSMS XKKGXXVAXF FEVTVMQDFF 12LRLPYSW '850 860 S70 880 890 900 RNECVEIRAV LYÍÍYRQNOEL KVRVELLHN? AF23LATTKR RHQCTXTXFP X3SLSVP YVI 910 920 530 940 950 960 LKTGLCG*·* ETKAAVYHHF ISXGVRXSLK WFEGIRMNK XVAVRTLXPE Al# G λ£ GVQ KK ?7C 980 99C 1000 1010 1020 2X??A2L32; 7^T27ESET?v? LLCGTFVAXM TEXAVDAEF.L KKLIVTFSGX GEONMXGMTP 1030 1040 1050 1060 1070 1080 77XA7HY122 TEQKEKFGLS .’.ΛνυΛλ.ί.»1λ .‘v JÍ. xsJv*-AÍ ť. Qř S iAl AAc v KRAP STwL.A 1090 1100 1110 1120 1130 1140 YWF. .-3LA7 NLIAIXSQVL GljAVKWL-. — — v 2 w — XAFVTKQEříI GG1# RNNN £ Kl- 115: 1160 117C 1180 1190 1200 HALTAFA L·i LOEAKEIGEE OVNSLFGXIT řlAGDFLEANY KJJLOP.SYTVA x AGl λ*·Α0Μο
2. 2/19

   1210 RX,KGPLLNKF ' 22 0 LTTAKDKNRW 1220 E3FGKQLYNV 1240 EATSYALLAL 1250 LGDKDFDFYP 1260 PWRWLNEQR 1270 YYGGGYGS72 1280 ArfMVFGALA 1290 GYQKDAPDHQ 1200 ELNLDVSLGL 1310 PSRSSXITHR 1220 IHHESASLLR 1230 SEETKEKSGF 1340 TVTAEGXGGG 1350 TLSWTMYKA 1360 KAKDGLTCIIX 1370 FDLXVTIKPA 1380 PETEXRPQDA 1290 KNTMILEZ2T 1400 RYR3DCDATH 1410 21LDI2HHTG 1420 FAPGTDCLXG 1430 LANGVTRY Z — 1440 XYELDKAPSE 1450 RN7LIIYL2X 1460 VSHSEDDGLA 1470 FKVHQYFNVE 1480 LZQPGAVKVY 1490 AYYNLEESGT 1500 RFYHFEKEDG 1510 KLNXLCRDEl 1520 CRCAEENC! 1530 QKSDDKVTLE 1540 ERLDKACEPG 1550 VDYVYKTRLV 1560 KVQLSNDFDE 1570 YIHAZEQTZX 1580 SGGDEVQVGQ 1590 GRTFISPTKG 1600 FXALKLEEXK 1610 HYLMWGLSSD 1620 FWGEXPNLSY 1630 1ZGXGTWVEH 1640 WPEEDEGCDE 1650 ENQKCGQCLG 1660 AFTESMWFG CPN

   OBR. 1(11)
3. 3/19

   OBR. 2(1) cctctccct ctgtecctct gtccctctga ecctccactg tcccagcaec 12 20 30 40 50 60 azgccaccca cctcaggtcc cagcctgctg ctcctgctac taacccacct ccccctggct 70 80 90 100 110 120 zzggggizzz ccatgtactc tatcatcacc cccaacatct tgcggctgga gagcgaggag 130 140 150 160 170 180 accarggxsc tocagcccca zgacgcgcaa ggccatgtt; cactcactgt taetgtccac 190 200 210 220 230 240 gaccxcccac ocaaaaaact agtgctctcc actgagaaga ctgtgctcac ccctcceaec 250 260 270 280 290 300 a&zzac&zzz ccaacgtcac cttcaccatc ccacccaaca cgtrasxtcaa erteaoaaaag 3Í0 320 330 340 350 360

   ggzczcaaca acttcgtcac corscaoczc accttcggga cccaagtggt ggagaaggtg 370 380 390 400 410 420 gzcstggxca gcetccacac egggtacctc ttcatccaca cacaeaasae cacctacacc 430 440 450 460 470 480 cctgcctcca cagttctcta wi-LL c d«w^LwA4UÍ acaagctgct acscgtgggc 490 500 510 520 530 540 cccacggtca tggtcaacat tgagaacccg gaaggeatcc cggtcaagca ggactccttg 550 560 570 580 590 600 xcttctcaoa accagettgg cgtcttoccc ttctcttggg acattccgga aeccgt.eaac 6X0 620 630 640 650 660 acgggccagt ggaagaz.ccg agcctactat gaaaactzac cacaccaggz cttctccact 670 6B0 690 700 710 720 cactttgagg toaaggagta cgtgctgccc actttcoagg tcatagtgga gcctacagag 730 740 750 760 770 780 aaxttctact acatctataa cgaqaagggc ccggaggtca ccatcaccgc caggttcctc 790 800 810 820 830 840 tacgggaaga aagtggaggo aactgccttt otcatcttcg ggatccagga tggcgaacag 850 860 870 880 890 900

   aggatttccc 910 cgcctgaatc 920 cctcaagcgc 930 attccgattg »4 0 aggatggctc 950 gggggaggtt 960 zzzzza&zzz 970 ggaaggtact 980 gecccacggc 990 ctccagaacc 1000 cccgagcaoa 1010 acacctggtg 1020 ggoaagtctt 1030 totacgtgtc 1040 tgccaccgtc 1050 atcctgcact 1060 caoccagtoa 1070 catggtgcag 1080 gcacagccca 1Ó90 gcgggatccc 1100 catcgtgacc tctcsctacc 1120 agatccactt 1130 caccaagaca 1140 eccaactacc ' 1150 tcaaaccagg 1160 aatgcccttt 1170 qzzzzzazzz 1180 tgttcgccac 1190 gaaccctgat 1200 ccctccccac 121Ó cctaccgagt 1220 1230 gtccagggcc 1240 aggacactgt 1250 gcagtcteta 1260

   ·· » < • ·

   OBR. 2(11) 1/19 acccagggag 1270 a & ggcg l ggc 1280 caaactcacc 1290 atcaacacac 1300 accccagcca 1310 gaageccccg 1320 accatcacgg 1230 c;:c:accaa 1340 gaagcaggag 125Ó ctctcsgagg 1360 aacaecage: 1370 taccasgacc 1380 atg=agg=ta 1390 tgccctacac 14 0Ó caccgtgggc 1410 aactccaaca 1420 atcacctgca 1430 tctctcagtg 1440 ctaccrcacag 1450 agctcagacc í 4 60 cggggagacc 1470 ctcaacgtca 14 80 acttcctcct 1490 gcgaacggac 1500 cgcgcccacg 1510 agcccaaoat 1520 cccctactac 1530 acctacctga 1540 tcatoaacaa 1550 gggcaggctg 1560 ttcaaggccg 1570 ga.zzzzaggz 1580 gzzazazzzz 1590 cgccaggacc 1600 tggtggtgct 1610 gcccctgtcc 1620

   atcaccaccg acttcatccc ttccttccgc ctggtggcgt actacacgct 1660 1670 gatcgctgcc 1680 1630 1640 1650 gg^agg L..I zroTcggr-c aczr-waaaaa 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ccctccctcc tgctaaaaag cgcccactca saaoa:::;: accctgtacc tgggcaccag 1750 176Ó 1770 1780 1790 1800 atcaccctaa agatagaggg tgaccacggc gcccgggtgg tactggtggc cgtgcacaag 1810 182Ó 1830 1840 1850 1860 ggcgtettcg tgctgaacaa gaagaacaaa ctgacgcaga gtaagatctg ggacgtggtg 1870 1880 1890 1900 1910 1920 aaaaagccac acatccgctc actcccaagc attacccccg tgtcttctcc 1930 1940 1950 1960 1970 ISLflO gacgcagcgc tcaccttcac gagcagcagt ccccagcaga zcgcccagag ggcagaactt í 99 0 2000 2010 2020 2030 2040 caatcccccc agccaccccc ccctccaccc ccctccctcc acctcacgga caacccaatg 2050 2060 2070 2080 2090 2100 gacaaagtcg ccaaota::: caaggacctc cgcaagcgct gccaggacsrg catgcgggag 2110 2120 2130 2Í40 2150 2160 aaccccatca ggttctcgtc cacccczgc acccctttca tctccctggg cgacgcctgc • 2170 2180 2190 2200 2210 2220 aagaagctct ccctocactc ctgcaacta: atcacagacc cgcgccgcca gcacccgcgg 2230 2240 * *> c r 2260 2270 2280

   ccc3gccacc zzzzzzzggz caggagtaac cxzcaccacc acatcatccc agaagagaac 2290 2300 2310 2320 2330 2340 accgtttccc gaactcagtc cccagagacc cccctctcca accttoacca cttgaaagag 2350 2360 2370 23Š0 2390 2400 czaccgaaaa atogaat^tε tacaaagctc acgaatacac ttttaaaaga ctccatcacc 2410 2420 243C 2440 2450 2460 acccccoaaa ”2470 2480 2490 m4).ÚÚUŮQ(í^ 2500 gga»c«»<«..w. 2510 2520 ctcg3gctca caataaccca ggacttcttc atccacccgc cgccacccta ccctcttgtt 253C 2540 2550 2560 2570 258C

   OBR. 2(111) 5/19 csaaacoagc aggtggaaat ccgacccctt ztctacaatt accggcagaa ccaagagcc

   2590 '2600 ' 2610 2620 2630 264 aazzzaazzz cgcaactact :;acaatc:a gccttctcca ccctggccac caccaagagg

   2650 ’ 2660 267C 2680 2690 2700 cgzcacsagc agaccataac catcccccc: aagtcctcet tetcecttee atatgtcatc

   2710 2720 2730 2740 ' 2750 2760 gcccccccaa agacccccct ccagaaactc gaactcaagc ctgccctcta ccatcatttc '2770 '2780 ' 2750 ' 2800 2810 2820

   atcaccgacc ctctcaggaa 2830 2840 ctccctcaac ctcctccccc aaccaatcac 2870 aatgaacaaa 2880 2850 2860 azzzzzzzzz zzzzzazzzz ggatccagaa ccrstcgccc etcaaggact gcaaaaagag 2890 2900 2910 2920 2930 2940 aacaceceac ctccacacct tagtcaccaa ctcccgcaca cccactctga gaccagaatt 2250 2960 2970 2980 2990 3000 czrctzzaac gcrazzzcacz zzzzzazazz acaoaqga:; ggaacggccg 301C 3020 3030 3040 3050 3060 aao;j::::2 ctetgacccc zzzzggzzqz ggoíiaacaga acatsategg catcxacgccc 3070 3080 3090 3100 3110 3120 azzzzzazzz ctgtccatta ^..L^JáLuáe 3130 3140 2150 3160 3170 3180 aaazzzzacz qgzzzzzgga cctcatcaac aaggga-taca cccagcagct ggccttcaga 3190 3200 3210 3220 3230 3240 caacccaccc ctccctttgc ccccttcctc aaacgggcac xcaacaccz^ cctcaccgcc 3250 3260 3270 3280 3290 3300 tacctcctca aceccttctc zczgzzzgzz aazzzzazcg ccatcgactc ccaagtcctc 3312 3320 2230 3340 2350 3360 <* u — ccaggag 3370 3380 2390 3400 3410 3420 satccctccg tcatacacca aaaaataatt ggtggattac zzaazaazaa cgaoaaaaae 3430 3440 3450 3460 34?0 3480 at:::::::a ceccccttct tctcatctcc ctccagaacc ctaaacatat ttgcgaggag 3490. 3500 7 : ' ^Λ 3520 3530 3540 zazzzzaaza zzzZzzzazz caccateaet aaagcaggag acttccttca acccaactac 3550 3560 3570 358C 2590 3600

   azcaac az acagatccta cactctcccc acccctcgct azzzzzzzzz ccacatgggc 2 cl 2 3620 2620 3640 2650 3660 aggztzaacz ggcctcttct taacaaattt ctc3ccacag ccaaagataa zaazzgzzgg 2c2 368 0 2690 3700 2710 372 0 aaoaa:;::; zzaagzazzz zzazaazzzz cagcscacat cctatcccct cttgccccta 373C 3740 3750 3760 3770 3780 aacactttca ctttgtccct tcctcc gttccctcaa tgaacagaga 75C 28CC 3810 3820 3830 3840 caztacgctc gtggctatgg ctctacccac gccaccttca tggtgttcca accttcggst 3252 2660 2370 28 eo 3690 3900
4. 6/19

   OBR. 2(IV) caataccaaa acroacocccc tgaccaceag gaactgaac: ttgatgtctc cct==aactg 3910 ” 3920 3930 3940 3950 3960 cccagccgca gctccaagat ca==cac=gt at==a;tggg aazctgccag cctcctgsga

   3970 3980 3990 4000 4010 4020

   ccaoaaoaaa 4030 caaaggaaaa 4040 teaggcrtttc 4050 acactcacac 4060 ctgaagsaaa '4070 aggccaaggc 4080 acxttgtcgg 4090 tggtgacaat 4100 gtaccatget 4110 aaggccaaag 4120 atcaactcac 4130 ctgtaataaa 4140 ttcaacctca 4150 aggtxaccat 4160 aaaaccagca 4170 ccggaaacac 4180 aaaagaggcc 4190 tcagoacgcc 4200 aaoaacacta 4210 tgatccttga 4220 gatctgtacc '4230 aggtaccggg 4240 gagaccagga 4250 tgccactatg 4260 4270 acatatccac 4280 catsactgcc 4290 tttgctccag 4300 acacagatga *4310 cccgaagcag 4320 =tgg=caatc 4330 gtgttgaeac 4340 atacatctcc 4350 aagtatgagc 4360 tggacaaagc 4370 cttctcccat 4380 aggaacaccc 4390 tcaccatcta 4400 cctggacaag 4410 gtctcacact 4420 ctgaggatga 4430 ctgtctagct 4440 :aaat; 4450 aeeaatactt 4460 taatgtagag 4470 cttatccagc 4480 ctggagcagt 4490 caaggtctac 4500

   acctggagga 4520 aagctgtacc 4330 cggttctacc 4540 atccggaaaa 4550 ggaoaatgga 4560 4510 aacctgaaca *4570 agctctcccg 4580 tcatgaactg 4590 tgccgctgtc 4600 ctgaggagaa 4610 ttccttcata 4620 caaaactcgg '4630 atgacaagct 4640 caccctggaa 4650 gaacggctgg 4 660 acaagccctc '4670 tgacccagga 4680 gtggactatg 4690 tgtacaagac 4700 cccactgatc 4710 aaccttcagc 4720 tgtccaatga 4730 ctttgacgag 4740 t&zzzzzzzz 4750 ccattgagca *4760 gazzaccaag 4770 tcaccctccg 4780 atgaggtgca 4790 gcttcgacag 4800

   :ecacct 4810 tcatcagccc 4820 catcaagtgc 4830 aaaaaaczc* 4 84 0 tgaagctgga ggagaagaaa 485C ' 4860 tctcggctct 4880 ctcctccgat 4890 _ _r______ agaaccccaa cctcagetac 4910 4920 4870 4 90Ó itccgca 4 930 aggac3Cttg 494C zztzzazcac 4 950 tggcctgagc 4 9 6 0 agtzacgaatc zcaagacgaa 4970 ' 4980 .accaca 4 9 9 C aacaatgcc3 5000 C Λ · * 5020 agagcatggt tgtctttggg 5030 5040 ccaact C Λ e Λ ;’::aca::c 5060 ccattcc

   • ·
5. 7/19

   12 3 4

   ABCDABCDABCDABC. D