CN1214733A - 负调节抗性c3转化酶 - Google Patents
负调节抗性c3转化酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1214733A CN1214733A CN97193318A CN97193318A CN1214733A CN 1214733 A CN1214733 A CN 1214733A CN 97193318 A CN97193318 A CN 97193318A CN 97193318 A CN97193318 A CN 97193318A CN 1214733 A CN1214733 A CN 1214733A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- factor
- residue
- amino
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010067641 Complement C3-C5 Convertases Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000016574 Complement C3-C5 Convertases Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 155
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 153
- 101000901154 Homo sapiens Complement C3 Proteins 0.000 claims abstract description 144
- 102000057770 human C3 Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 146
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 133
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 117
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 claims description 110
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 claims description 110
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 52
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 41
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 35
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 34
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 34
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 16
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 11
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 102100030386 Granzyme A Human genes 0.000 claims description 6
- 101001009599 Homo sapiens Granzyme A Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 2
- 101710131943 40S ribosomal protein S3a Proteins 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 abstract 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract 1
- 102100022133 Complement C3 Human genes 0.000 description 88
- 239000000047 product Substances 0.000 description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 50
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 50
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 47
- 108010003529 Alternative Pathway Complement C3 Convertase Proteins 0.000 description 44
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 28
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 28
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 21
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 21
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 101710172562 Cobra venom factor Proteins 0.000 description 15
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 13
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 101100315731 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) QRI1 gene Proteins 0.000 description 10
- 101100315730 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) uap1 gene Proteins 0.000 description 10
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 10
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 9
- 101100080597 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NSE4 gene Proteins 0.000 description 9
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 8
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010005642 Properdin Proteins 0.000 description 7
- 102100038567 Properdin Human genes 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 108010052926 complement C3d,g Proteins 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 7
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 6
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 6
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100006976 Mus musculus C4b gene Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000028982 Nestor-Guillermo progeria syndrome Diseases 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000002642 cobra venom Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000016918 Complement C3 Human genes 0.000 description 3
- 108010028780 Complement C3 Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 description 2
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108090000955 Complement C2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004381 Complement C2 Human genes 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000799972 Homo sapiens Alpha-2-macroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 101100440311 Homo sapiens C5 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000405718 Lethenteron camtschaticum Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000428199 Mustelinae Species 0.000 description 2
- 241000272041 Naja Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108700001232 mouse P Proteins 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 2
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009295 sperm incapacitation Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- 230000001196 vasorelaxation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 2
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 2
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100401739 Caenorhabditis elegans mlc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- QQLBPVKLJBAXBS-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QQLBPVKLJBAXBS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061245 Internal injury Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 101100440312 Mus musculus C5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251752 Myxine glutinosa Species 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010043943 Starch Phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001468181 Streptococcus sp. 'group C' Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002391 anti-complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000049437 human A2M Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002399 phagocytotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
描述了天然补体途径蛋白质,这些蛋白质被修饰得能够形成负调节抗性C3转化酶,所说的修饰的蛋白质优选的是一种修饰的人类C3蛋白质。也提供了编码这些蛋白质的DNA序列以及DNA构建体。也描述了包含这些蛋白质和特异性结合部分的缀合体,例如抗体。同样也描述了这些蛋白质和/或缀合体在治疗中的用途。
Description
本发明涉及一种新的能够形成对负调节有抗性的C3转化酶的修饰蛋白质,编码这些蛋白质的DNA序列以及这些蛋白质作为治疗剂的用途,特别是在用于减少补体途径蛋白质水平或者在特异性位点上靶向补体攻击(C3b沉积)上的用途。
补体系统在人类和其它脊椎动物的免疫应答中起作用,并且在效应功能诸如细胞吞噬、细胞溶解以及细胞反射增进方面是十分重要的,它引起局部炎症反应[15]。这些性质对于除去侵入病原体(如细菌)是合乎需要的,但是当触发宿主组织(例如在后局部出血再灌注伤害[3])或者异治疗物质(例如异种抑制的超急性排斥[7])时不受欢迎的。通过利用补体抑制蛋白质以试图废除这些不受欢迎的性质的蛋白质,其正常的功能在于抑制补体活化[10,18]。
补体系统包含细胞表面的蛋白质(受体和调节物)以及液相(血浆和其它胞外环境)的蛋白质。用于产生应答关键的步骤是将C3的蛋白水解转化成为片段C3b和C3a。C3a是过敏毒素,它如同C5a一样吸引肥大细胞到攻击位点,导致组胺的局部释放、血管舒张和其它炎症反应。新生的C3b在它产生的位点周围具有表面结合能力。于是这种C3b集中在由溶细胞补体组分(C5-C9)产生的攻击上。
例如,表面结合C3b和它的降解产物也作为C3受体介导吞噬作用的配体而起作用[15]。补体活化有两条明显的途径,它们全都导致C3转化成为C3b和随后的应答。通常通过抗体与抗原的复合体触发典型的途径,该途径引起牵涉蛋白质Clq、Clr、Cls、C2以及C4的酶级联。可选择的途径取决于牵涉C3自身和所需因子B和D的活化环。
C3转化为C3b(或者C3i)产生可以与因子B结合的产物,并且给出C3bB(或者C3iB)。这些复合体通过因子D起作用而产生C3bBb,该C3bBb是能够从C3b切除更多C3的C3转化酶,这将导致更多的C3bBb和更多的C3转化。在特定环境下,C3bBb复合物通过与正调节物备解素(P)缔合而是稳定的。然而,通常将这种正反馈环由调节蛋白质(显著地因子H和因子I)限制为一种缓慢的反转。
因子H(和结构上相关细胞结合分子)(ⅰ)从C3b取代B和Bb,以及(ⅱ)充当因子I的辅因子,它通过抑制与因子B的任何重组切开C3b成为iC3b由此形成更多C3的转化酶。该途径用于扩增在表面上存在的C3b的世代,如许多细菌细胞壁,它们结合新生C3b,并且通过因子H和I抑制它的调节。也能够将新生C3b固定到内源性细胞上。因此,通过膜结合调节物(如MCP、DAF和CR1)附加地保护通常暴露于补体的内源性细胞表面,该调节物与因子H表现出一种类似的方式。
具有一些稀有的天然存在的条件,其中不能产生正常的液相调节并且自发的C3转化最终导致从循环中C3的全身性衰竭:-(ⅰ)因子H或I的遗传失调[13],(ⅱ)抗体的存在(肾因子)结合C3bBb,并且抑制解离[4],以及(ⅲ)在眼镜蛇毒液中与一种蛋白质相联系,称之为眼镜蛇毒毒因子(CVF),它与因子B结合,并且形成C3转化酶,该酶不合有C3b,并且不受到因子H和I的影响[14]。在缺少特异性活化的情况下,这表明补体负调节的正常生理重要性。
也具有发生特异性活化的环境,但是不需要,特别是当它针对宿主组织(例如通过局部缺血或外科破坏的组织)时,或者针对为了治疗目的有意提供的异物(如异种移植物、人工器官或者透析膜)时。补体活化导致不合要求的侵袭并且进一步破坏,那么在这些情况下它对抑制或者抑制活化和应答将是有益的。
抑制补体介导损伤的现有方法已将负调节蛋白质(CR1、MCP、DAF以及因子H和I)的运用作为目标以抑制补体活化。补体如同因子I、一样的抑制剂,因子H和膜结合蛋白质CR1、DAF、MCD的可溶性衍生物确实抑制可选择途径的液相扩增环。因此,利用这些分子的意图是在生理情况下减少补体介导的损伤,特别是CR1(看起来是最有效的)[10,18]。
因子H以高浓度(典型地0.3-0.5mg/ml[15])内源地存在血浆中,因此即使提高抑制剂的水平确实阻抑液相反应,那么它们的潜力很弱,于是在体内应施用大量的纯化蛋白质(例如可能超过可溶性CR1的5mg/Kg体量)。此外,通过表面已经抑制因子H的影响来活化可选择的途径。当没有必要伴随减少其它抑制剂的活性时,相同的因子表明它们不可能完全或者普遍有效。
眼镜蛇毒液因子(CVF)具有产生一种稳定C3转化酶的性质,实验上该性质在动物体内中以及在其它样品的体外(例如人类血浆)可以用来减少补体。CVF是有效的(例如40μg/Kg可以破坏小鼠的补体活性[16])。然而在人类治疗上利用它却是不合适的。
首先,从眼镜蛇毒液中获得以便处理(一个获得的困难来源和并且是危险的),因此必须细心地从毒液神经毒素进行纯化。显然获得供给也是困难的。这个问题不能通过克隆和表达来自体内的基因容易地克服,因为具有后翻译修饰发生在蛇中(特异性蛋白水解加工),这在体外产生可能是困难的(或者不可能的)。此外,要求这种加工的酶和消化条件是当前未知的。其次,蛋白质(对于人类)是外源的,因此是免疫的。这排除它的重复治疗的利用,正如要求将患者进行去补体许多周(例如使得可以异种移植存活)。
虽然CVF与人类C3具有一些结构和功能的同源性[17],但是在这两方面都具有主要的区别(例如链结构,生物合成位点,补体调节物的非灵敏性,稳定C3转化酶的形成)。它不是来自已知的C3的眼镜蛇等同物,它已进行克隆与测序,并且它在总体结构和功能上比CVF更加类似人类C3[8]。
CVF是一种来自人类的大的进化距离的动物毒液特异性产物。因此利用基因操作将这种蛋白质修饰为在人类中可以用于非免疫原性的产物是不可以实施的。
现在我们已设计一种可供选择的策略,该策略依赖于旁支生理调节;同时代替抑制补体活化,它导致超活化系统。这具有两项应用。首先,直到耗尽一个或多个组分时它在体内可以用于激活补体,导致丧失对任何随后攻击产生局部应答的能力(如异种移植)。其次,可以将非调节超活化故意地局限为一个特定的靶(例如病毒或者病毒感染的细胞)以增加那种靶对补体介导破坏性应答的灵敏度。
这里所使用的术语“补体活化调节物”包括所有抑制C3转化扩增的蛋白质,并且不是指由于方法所限制的那些蛋白质,其基因位于RCA的基因座上。然而它不包括诸如备解素一类的“正调节物”。将“C3转化”定义为进入C3b和C3a的C3蛋白水解转化,除非另外提到的,并且将“C3转化酶”(或者简化为“转化酶”)定义为一种催化这种反应的酶(典型地两个或者更多个蛋白质组分的复合物;例如C3bBb、C3iBb、CVFBb或C4b2a)。
这样,在第一个方面本发明提供了修饰(以便该蛋白质能够形成负调节抗性C3转化酶)的天然补体途径蛋白质。
“天然的”意味着天然产生的,也就是说天然可以获得的。这样,该定义包括如上文所定义的任何已修饰的天然产生的补体途径蛋白质。它不被限定在物种特异性蛋白质。换句话说,例如一种修饰的人类蛋白质在其它哺乳动物中可以用作负调节抗性C3转化酶。典型地,将利用来自相同物种的修饰的补体途径蛋白质。
C3 DNA编码序列的修饰(例如利用定点诱变)可以产生不同抗补体调节蛋白质的C3的变体,而保持正功能特性(通过C3酶对C3b的切割)和结构完整性特征(正确链结构,以及硫酯键的存在)。在这里所描述的本发明涉及天然补体蛋白质的基因修饰型,例如人类C3,它的C3b片段获得抗生理补体调节的性质。由于这种抗性,在生理环境(例如在体内)下这些分子可以产生对应的C3转化酶的稳定形式,该酶产生C3向C3b以及后者的降解产物的扩增转化。
在更优选的实施方案中,本发明提供一种修饰的人类C3蛋白质,该蛋白质对因子I切割有抗性。
这可以通过在蛋白水解位点上修饰蛋白质残基完成。
本发明更优选的实施方案涉及一种修饰的人类C3蛋白质,其中该蛋白质是通过用其它氨基酸取代Arg-1303、Arg-1320之一或两者修饰的。其它氨基酸可以是酪氨酸、胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或甘氨酸。优选地,用谷氨酸或者甘氨酸取代Arg-1303(不太优选地用谷氨酰胺)。优选地,用谷氨酰胺取代Arg-1320。
本发明产生合适的修饰的蛋白质的其它策略包括:
ⅰ)对因子H和相关蛋白质(例如MCP、DAF、CR1)的抑制活性的降低的敏感性。例如,在人类中,C3残基767-776和1209-1271已经牵涉到因子H结合中[20,24],也与这些蛋白质活性相联系的一个或多个这些残基或其它残基的取代可能降低一个或多个这些调节蛋白质的结合。
ⅱ)解离C3bBb的降低的速率。引入的突变可以加强C3b和Bb之间的相互作用。这将导致在酶的自发分解上的还原作用,以及在从C3b取代Bb中减小因子H(和相关调节物)的效能。
这些突变对于减少C3bBb的自发的和因子H-介导的分解作用速率是必需的。即使在缺少因子H的情况下,在备解素的存在下,37℃下液相C3bBb复合物具有仅仅约10min的半衰期[6]。
ⅲ)将人类C3残基752-761牵涉结合的因子B。在C3中它是高度保守区域,并且在C4中发现密切相关的序列。由于C4结合因子B同系物C2,在C3与C4之间这个区域的强相似性,在C3中与它的高度保守性一起,进一步支持它在C3中作为因子B结合位点。于是,在这个区域的改变可能影响C3bBb的B亲和性和稳定性。
ⅳ)对补体活化的其它调节物的抗性,如CR1、DAF和MCP也是必需的。这些调节物活性方式全部类似于因子H,因此没有必要要求附加诱变。同样地,一些致病有机体表达它们自己补体活化的抑制剂,它经常在结构上和功能上与因子H具有同源性(例如牛痘病毒分泌肽[])。这些分子使侵入物免受免疫应答,并且能够用对这些防御具有抗性的目标C3转化酶攻击它们,这将是有利的。
ⅴ)通过备解素提高C3转化酶的稳定性的突变。备解素的活性在于稳定C3bBb复合物,抑制自发的和因子H-介导的解离。这种稳定在液相中是无效的,但是一旦它在合适的激活表面上已经开始,它似乎在扩增该过程中更重要[5]。提高它的活性(通过提高它的亲和性)在液相中可能打破平衡,以及由此促进自发的C3转化。这与上述的其它修饰结合起来是特另有用的。
ⅵ)抑制C3bBb具有C5转化酶活性的突变。当用于减少来自循环的活性C3时,一种不受欢迎的副反应可能产生大量过敏性肽。这些最有效的是C5a,它是通过一些C3转化酶切开C5而得。这个反应有可能取决于C3b的另一个分子的转化酶的亲和性[11],并且它可能通过抑制C3的突变以除去这种相互作用。
ⅶ)C3转化酶的改善的活性。C3bBb C3转化酶的活性位点位于Bb位置。C3b组分可能对于利用Bb的一种活性构象和/或结合以及调整与Bb反应的底物起作用。这一点是未知的,但是不论哪一种情况下,在C3中可能通过突变提高转化酶的活性范围。
ⅷ)以功能形式表达。野生型C3要求它在结合新的C3转化酶复合物之前可以转化成C3b。当用于体内时,要求转化成C3b(或者C3i)将延迟改善的C3活性。因此,以可能的立即转化酶形式或者以预形成的转化酶形式施用该蛋白质是有利的。因此,对于产生来自体外的功能性C3b-样药剂是有利的。这在体外可以完成(例如通过蛋白质水解)。
ⅸ)修饰成天然蛋白质,该修饰引入新的切割位点以便保持因子B结合所要求的肽区域,但是可以特别除去因子H结合所专门要求的那些。例如,可以引入位点以便将修饰的C3的C3b能够进一步切割成仍然结合因子B但是对因子H和I的灭活更敏感的形式。
ⅹ)在其它区域的修饰可以影响所说的C3b与因子B和/或因子H的相互作用。
本发明基于通过促进C3转化成缺失C3翻转传统的方法,同时由此使系统丧失能力。本发明一项附加的应用是在一个特定的位点促进C3转化的潜力,以及由此恢复攻击特异性靶的补体依赖的效应子机制。
因此,当将修饰蛋白质施用到包含补体活化调节物的生理培养基(例如血液)中时,最终效应将提高C3转化量。于是,这种活性可以用来耗尽天然C3的那种培养基,或者用于在所要求的靶上将C3转化局限化。
C3类似物的C3b-片段具有抗因子I(例如实施例1所描述的衍生物)活性,该因子结合因子B,然后由因子D切开,并且最终解离为失活形式。在缺少通过因子I灭活的情况下,修饰的C3b将能够重复结合B的新分子,同时由此促进它的失活。因此,本发明所描述的修饰的其它潜在应用将是通过消耗因子B的活性对可选择途径进行灭活。类似方法也可以用来修饰C4以促进对C2的消耗,并且由此丧失补体活化典型途径的能力。
本发明包括以C3bBb酶类似的方式所利用的任何其它蛋白酶,不论补体活化的调节物存在与否,该C3bBb酶导致C3切割为C3b。
本发明也包括编码本发明的蛋白质的DNA序列以及包含这样的DNA序列的DNA构建体。
“DNA序列”包括所有其它核酸序列,该序列借助于遗传密码的简并性,也编码所给定的氨基酸序列,或者该序列实质上与这条序列是同源的。于是,这些序列也包括在本发明范围之内。
“实质上同源的”核酸序列也在本发明的范围之内。在核酸水平或氨基酸水平上可以估计“实质上同源性”。在核酸水平上,具有实质同源性的序列可以认为是在严格条件下(例如在大约0.9M的盐溶液中在35到65℃下)杂交到本发明的核酸序列上的那些。如果许多组成型氨基酸显示同源性,那么在氨基酸水平,某种蛋白质序列可以认为与其它蛋白质序列具有实质上同源的。以增加的优选顺序,至少55%、60%、70%、80%、90%、95%或者甚至99%的氨基酸可以是同源的。
如上文所讨论的,本发明的蛋白质可以用来完成局限化的补体活化作用。确保这点的一种方式是将蛋白质缀合到在所要求的靶上结合的部分上。于是,在其它方面本发明提供包含本发明的连接到特异性结合部分上的蛋白质的缀合物,所说的部分例如特异性结合蛋白质。这些蛋白质的一个实例是抗体或者其抗原结合片段。
施用本发明的蛋白质以便得到一种所需的治疗效果。因此最后本发明也提供了:
a)用于治疗的本发明的蛋白质;
b)在药物制造上本发明的蛋白质或缀合物的用途,该药物用于减少补体途径蛋白质水平,并且特别是用于预防异物的排斥作用;
c)包含一种或多种本发明的蛋白质或缀合物和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物制剂;以及
d)在哺乳动物中减少补体途径蛋白质的方法,该方法包括向哺乳动物施用本发明的蛋白质,优选地,以药物制剂的形式施用。
药物制剂可以以每剂量包含预定量活性成分的单位剂量形式存在。这样单位可以作为最小量包含,例如,1mg活性成分,以及优选地2-3mg。这样的单位剂量可能包含的上限将取决于许多因素,如处理条件、施用途径和患者年龄、体重和状况以及经济条件。作为实施例,单位剂量形式可以包含多达10mg或者甚至100mg活性成分。
本发明的蛋白质可以用于体内使补体系统丧失能力。理想环境可以包括下列:
(a)为预防对移植的补体介导的破坏或损伤,特别是对异种移植(从不同物种动物所移植的材料),以及尤其是相异的异种移植(其中在供体与受体物种是不相关的)。在这种状态中,在操作之前将受体进行去补体,并且保持这一状态直到移植完成或者被更相容的器官代替。
在移植前几天内进行起始处理。排斥作用骤退时要求附加的去补体。通过利用抗组胺剂可以完成该处理以便控制普通的炎症反应(例如血管舒张),该炎症反应可能导致产生C3a和/或C5a。
去补体在利用人工器官或组织(例如人工肾透析膜)中也可能是有益的,该去补体激活补体系统(如上文所描述的)可以以失活形式、功能性C3形式或者初步加工的活性C3转化酶(如C3bBb)形式给出所说的蛋白质。这些可以依靠活性转化酶通过任何途径施用,该活性转化酶将遇到循环的C3(例如静脉内,皮下组织等等)。
另一个可选择的将是来自体外的处理,例如,通过基质产生的活性转化酶转运到循环系统。可能在返回患者去补体的血液(或者血浆)之前,这对允许除去(例如通过透析)过敏性肽(C3a和C5a)和其它低分子量炎症介质来说是有利的。
(b)为抑制主要由手术导致的补体介导的损伤。因为已经减少补体依赖的免疫发病,因此,将患者如上进行去补体,优选地在操作之前,并且将其保持在这种状态下直到脱离附加的内伤危险为止。
(C)为减少由非外科伤害导致的补体介导的损伤。在这些情况下,必须在初始伤害后完成去补体化,但是另外施用的制剂与方法可能与上述的那些类似。当恢复包括通过循环系统局部缺血的组织进行消肿时(例如心肌的、局部缺血的、冻伤的、烧伤的等等),这可能是特别有用的。
(d)为减少由抗体-抗原导致的补体介导的损伤。补体介导的防御应答在自身免疫疾病中是特别不受欢迎的,它可能包括肾小球性炎症、溶血性贫血、重症肌无力、Ⅰ型糖尿病、风湿性关节炎和多发性硬化。在疾病严重期间,丧失能力的补体系统能减轻病情,例如在风湿性关节炎中通过局部施用给关节。
(e)为使特异性致病靶对补体介导免疫机制更敏感。在这种方法中,目的不在于利用超活性C3转化酶产生C3的全身性耗竭,但是代替局部利用转化酶向一个所要求的目标集中C3转化。该目标可能是致病有机体,如细菌、病毒或者其它寄生虫,或者有害宿主细胞或组织,如肿瘤细胞或者病毒感染的细胞。将C3转化酶通过局部施用(例如定向注射,有可能在介质中阻碍它分散到一般的循环系统中)或者通过与目标部分(例如抗体)结合局限到该靶上。于是,修饰蛋白质可以通过蛋白质的化学交联或者通过加入DNA编码序列并且表达(和纯化)融合蛋白质(例如,在IgG下,将重链或轻链连接到C3并将与C3进行共表达,或者将两条链结合成一条完全的融合多肽),或者通过将特异性编码的序列(例如“亮氨酸拉链”-样结构域)掺入到两个融合配偶体的DNA(例如修饰的C3和特异性抗体)连接到特异性免疫球蛋白上以便当共同混合时,表达的产物自我缔合以形成稳定的缀合物。然后将融合蛋白质进行局部或者全身施用。
脂质体(在脂质体表面或内部修饰的蛋白质在表面产生抗体)和/或病毒颗粒(例如设计的以在它们表面上表达蛋白质)的脂质体也可以用于抗体和修饰蛋白质的共分送。本策略可以在疾病的任何阶段直接地、单独地以及与其它治疗结合起来进行利用。它可以特别适合于在对肿瘤的外科切除之后,除去任何留在循环系统中的癌细胞。也可能利用来自体内的抗体修饰蛋白质缀合物除去致病的组织。例如,杀死从骨髓提取的白血病细胞,然后将余下的健康细胞归还给患者。
将不与MHC型受体匹配的可选择的淋巴细胞在移植之前从骨髓中除去。同时,将修饰蛋白质与抗原连接,并且将这种结合在体内或来自体内用于侵袭不受欢迎的反应的淋巴细胞(例如与移植体或自身的组织)。
将同样的技术应用于处理其它物种,利用人类修饰的衍生物,或者为那种物种特制的类似物。
本发明每方面优选的特性已进行了必要的描述。
现在将通过下列实施例来描述本发明,但这些实施例不构成对本发明的任何限制。在实施例涉及的附图中:
图1:显示如在PC3中编码的人类C3的预测的蛋白质序列;(使用标准单字母氨基酸代码)
图2:显示在PC3中的cDNA序列;(使用标准单字母有义链的脱氧核酸代码,5′-3′书写)。
图3:显示本发明修饰蛋白质。
图4:显示各种突变对人类C3影响,该突变在这些位点上通过因子I-介导的切割取代Arg1303或Arg1320。N.B.
1.[35S]-生物合成标记样品。
2.在正常离子强度下完成的反应。
3.用抗-C3免疫沉淀。
4.在还原条件下的SDS-PAGE。
5.放射自显影。
图5:显示掺入Arg1303->Gln1300突变成为由因子I和H的灭活的人类C3的提高的抗性。
图6:显示在氨基酸残基752-754和758-760上所突变的C3转化酶的切割分析。
这是从7.5%聚丙烯酰SDS-PAGE凝胶显影的蛋白质印迹的照片(还原条件),在用电泳转移到硝酸纤维素上后,用绵羊抗人类C3抗体进行探针分析,以及用辣根过氧化物酶偶联的抗绵羊免疫球蛋白抗体和记录在X-射线胶卷上的增强化学发光(来自Amersham,U.K.的方法和检测试剂)进行展开。如实施例4描述完成切割反应和检测,参考如图3所显示的结果。结果:泳道1-4:野生型C3(在COS细胞中所表达的)泳道5-8:突变体C3(改变为Gly-Ser-Gly的残基752-754和也改变为Gly-Ser-Gly的残基758-760)(在COS细胞中所表达的)泳道1,5:没有添加泳道2,6:+CVFBb泳道3,7:+因子H+I泳道4,8:+CVFBb+因子H+I
箭头所表明的区带是:
A:C3α-链
B:C3α′-链
C:C3β链
D:C3α′-链的68kDa切割产物
E:IgG重链
图7:显示由因子D在C3(C3i)野生型和突变体存在下对放射性标记因子B的切割的分析。
显示SEE-PAGE凝胶的放射自显影图的照片。所有样品包含因子D和125I-标记因子B,并且在37℃下温育3小时。
在编号的泳道中的样品也包括:
1.仅有缓冲液
2.1/125野生型C3
3.1/25野生型C3
4.1/5野生型C3
5.1/25突变体C3(残基1427Gln、1431Asp和1433Gln)
6.1/5突变体C3
7.没有稀释的突变体C3
箭头所表明的带是:
A.未切割的125I-标记因子B(93kDa)
B.60kDa切割产物(“Bb”)
C.33kDa切割产物(“Ba”)
图8:显示说明形成C3I与IgG之间的缀合物的SDS-PAGE研究。这是在非还原条件下进行4%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。编号的泳道含有样品:
1.PDP-IgG
2.C3i
3.PDP-IgG+C3i反应混合物
用箭头表明的是:
A.可能是C3i-IgG缀合物(350 kDa)
B.C3i(200kDa)
C.IgG(150kDa)
图9:显示缀合物将绵羊红细胞的C3转化酶活性作为目标。(如方法所描述的,本图显示在用通过洗涤的C3i-IgG缀合物、PDP-IgG或C3I稀释液包被,用备解素和因子B和D产生C3转化酶,最后利用在CFD/EDTA中的NGPS溶胞作用进行显影后%裂解的绵羊红细胞。只有缀合物产生溶胞作用,并且这种溶胞作用是剂量依赖性的。)
图10和11:显示DV-1AM突变体C3的切割性质(参见实施例12-14)。
就图10来说,如实施例4所描述的,将包含表达的野生型(A)和DV-1AM突变体(B)C3的COS细胞上清液利用1)-;2)CVFBb;3)10μg/ml因子I和50μg/ml因子H;或者4)CVFBb加10μg/ml因子I和50μg/ml因子H进行处理、免疫沉淀、通过SDS-PAGE的分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纤维素膜上进行电印迹。在这种情况下,利用大鼠单克隆抗体、克隆-3和克隆-9组合进行展开,将其与C3的C3dg区域和它的断裂产物(Lachmann,P.J.等,免疫学杂志41:503(1980))通过与辣根过氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白质(来自Sigma)反应并且利用ECL试剂和Amersham供给的方法进行检测。
就图11来说,如实施例4所描述的,将包含表达的DV-1B突变体(A)、野生型(B)和DV-6突变体(C)C3的COS细胞上清液利用1)-;2)10μg/ml因子I和50μg/ml因子H;3)CVFBb;4)CVFBb+10μg/ml因子I和2μg/ml因子H;5)CVFBb+10μg/ml因子I和10μg/ml因子H;6)CVFBb+10μg/ml因子I和50μg/ml因子H进行处理、免疫沉淀、通过SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)、在硝酸纤维素膜上进行电印迹以及利用多克隆绵羊抗-C3抗体进行检测。
图12显示从读框变换突变导致的C3相关产物的分析。将这种产物称作HDV-3X。将HDV-3X的结果与DV-3的结果相比较,如同HDV-3X一样包括突变T1031G、E1032N、Q1033H、E1035N和K1036I,但是不同于HDV-3X在C-末端不进行修饰。
如实施例4所描述的,将包含表达的DV-3(A)和HDV-3X突变体(B)C3的COS细胞上清液利用1)-;2)CVFBb+10μg/ml因子I;3)CVFBb+10μg/ml因子I+1μg/ml因子H;或者4)CVFBb加10μg/ml因子H进行处理、免疫沉淀、通过SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纤维素膜上进行电印迹。在这种情况下,利用大鼠单克隆抗体、克隆-3和克隆-9组合进行展开,其与C3的C3dg区域和它的断裂产物(Lachmann,P.J.等,免疫学杂志41:503(1980))反应,接着与辣根过氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白质(来自Sigma)反应并且利用ECL试剂和Amersham供给的方法进行检测。
图13是就实验来说,其中COS细胞上清液包含表达的E1QZ(A)、E1Q2QG3(B)和E1Q2E3(C)突变体C3,如实施例4所描述的,将上清液利用1)CVFBb+10μg/ml因子I;2)CVFBb+10μg/ml因子I+50μg/ml因子H;3)CVFBb+10μg/ml因子I+25μg/ml sCR1进行处理(37℃,2.5hr)、免疫沉淀、通过SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纤维素膜上进行电印迹。在这种情况下,如实施例12所描述的,利用大鼠单克隆抗体、克隆-3和克隆-9组合进行展开,接着与辣根过氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白(来自Sigma)反应,并且用ECL试剂和Amersham供给的方法进行检测。
图14是就实验来说,其中COS细胞上清液包含表达的NC3(A)、FT-1(B)、FT-2(C)、FT-3(D)、PT-4(E)和FT-5(F)突变体C3,如实施例4所描述的,将上清液利用1)-;2)CVFBb+10μg/ml因子I+50μg/ml因子H进行处理(37℃,2.75hr)、免疫沉淀、通过SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纤维素膜上进行电印迹。在这种情况下,如实施例12所描述的,利用大鼠单克隆抗体、克隆-3和克隆-9组合进行展开,接着与辣根过氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白(来自Sigma)反应并且利用ECL试剂和Amersham供给的方法进行检测。
图15是就实验来说,其中COS细胞上清液包含表达的NC3(A)、FR-1(B)、FR-2(C)、FR-3(D)、FR-4(E)和FT-2(F)突变体C3,如实施例4所描述的,将上清液利用1)-;2)CVFBb+10μg/ml因子I+50μg/ml因子H进行处理(37℃,2.5hr)、免疫沉淀、通过SDS-PAGE分析(在所表明的泳道中)以及在硝酸纤维素膜上进行电印迹。在这种情况下,如实施例12所描述的,利用大鼠单克隆抗体、克隆-3和克隆-9组合进行展开,接着与辣根过氧化物酶抗大鼠免疫球蛋白(来自Sigma)反应,并且利用ECL试剂和Amersham供给的方法进行检测。
为了便于参考,将涉及能够充分作为负调节抗性C3转化酶的特定蛋白质的权利要求和实施例以及此后提供的表的关系提供如下:表A
权利要求 | 认为对负调节抗性重要的氨基酸区域(相对人类C3转化酶而言) | 实施例 | 表 |
5-8 | 1303/1320 | 1-6,11 | |
9-11 | 758-780/752-754 | 7 | |
12 | 1427,1431,1433 | 8 | Ⅰ |
13-15 | 992-1005 | 12,13 | Ⅱ |
16-19 | 1152-1155 | 14 | Ⅱ |
20-29 | 1546-1663 | 15,17 | Ⅲ |
30-34 | 954-955 | 16 |
下列的标准方法和定义适用于所有实施例:
提到的所有补体组分都来源于人类,除非特别规定,对于所有蛋白质及它们的衍生片段都使用标准术语。另外,术语“C3i”意指涉及到任何没有完整的硫酯键,但是在α链上保持C3a多肽C3的任何分子形式。
如图2所显示的,利用EMBL核苷酸数据库(参考文献[2]来源的)的数据,将人类C3 cDNA和编码序列进行编号。所显示的序列是我们的构建体(“PC3”)的序列,在参考文献[2]中报道它缺乏5′非翻译区的头11个核苷酸,因而将第一个碱基标为12。公认的起始密码子核苷酸编号是61-63,β-链的氨基末端丝氨酸残基的密码子核苷酸编号是127-129,并且α-链的氨基末端丝氨酸残基的密码子核苷酸编号是2074-2076。
如图1所显示的,按照前体序列将蛋白质序列进行编号,这在附录1中是DNA序列的一种预测翻译(人们预料,氨基酸1-22包含在生物合成期间除去的信号序列,并且在将前体切开成α-和β-链时,将氨基酸668-671切除)。
下列缩写具有下列意义:CVF眼镜蛇毒因子;ELISA,酶联免疫吸附测定;E.coli,大肠杆菌;Kb,千个碱基;HSV-1,单纯疱疹病毒1型;PBS,磷酸缓冲盐溶液。COS-1是来自猴肾细胞的细胞系。下列是限制性内切酶:-AflⅡ、DraⅠ、DraⅢ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、NaeⅠ、NheⅠ、XbaⅠ。标准方法
在参考文献[21]中可以找到标准分子生物程序的方法,如质粒分离、琼脂糖凝胶电泳以及DNA接合。利用由“美国生物化学制品”供给的测序酶版本2.0试剂盒对DNA双链进行测序。利用由亲活纯化的多克隆绵羊抗人类C3预包被的塑料平板通过ELISA分析测量C3表达,将培养上清液的样品添加到该C3中。用C3的单克隆大鼠抗体检测结合的C3,例如碱性磷酸酶以及显色底物,对硝基苯磷酸。以纯化人类质粒C3校准。
在参考文献[28]中可以找到补体蛋白质和CVF纯化分析方法以及亲和性纯化的抗-C3抗体的制备方法。从Sigma化学有限公司也可以购买等效试剂。C3 cDNA编码序列
我们的C3 cDNA编码序列由两条随机提供的人肝cDNA文库分离的片段构建而得,载体pGEM4(Promega)携带该cDNA文库。在人类C3编码序列中,将对应于已知片段的5个寡聚脱氧核苷酸用T4聚核苷酸激酶和[γ-32P]ATP进行放射性标记,并且将它用来探测来自琼脂糖平板的文库的滤膜转移。分离两个包含大约4kb插入物的克隆。对特异性寡聚脱氧核苷酸探针限制性内切核酸酶进行消化、杂交以及部分序列分析,显示这些中的一个(“A13”)包括5.1kb信号的5′-末端,而另一个(“B44”)延伸至3′-末端。
因此,这些大约3kb重叠的插入物包括一个唯一的EcoRⅠ限制酶位点。用EcoRⅠ和NheⅠ切除A13的5′不完全部分,并且用由EcoRⅠ和XbaⅠ消化从B44分离的完全片段予以代替。在与T4 DNA连接酶连接以产生包含5.1 kb的编码全C3前体蛋白质的DNA的载体(“PGC3”)之前,将两条片段通过低熔点琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
对于C3编码区而言,连接子序列5′包含两个潜在的假翻译ATG的起始位点。因此,如实施例1所描述的方法,利用寡聚脱氧核苷酸PL-ATC-3(tagggagaccggaagcttgccctctccctctgtccctctg t)通过隔离质粒诱变可以将其除去,该PL-ATC-3不用改变C3编码序列可以缺失大约50个连接子/结合体DNA。这种突变载体(7.7kb)包含5.1kb的C3 cDNA序列+2.6kb来自PGEM4载体(Promega)的序列,该突变载体称作PC3。
将PGC3质粒的C3编码区进行完全测序,并且揭示出与以前所公开的人类C3(“S”等位基因)cDNA序列仅有四点区别[2]
(ⅰ)改变C2481→G以及C2805→T不改变编码;
(ⅱ)T1001→C编码以前所描述的HAV 4-1-(亮氨酸314→脯氨酸)多形形式[20];以及
(ⅲ)G2716→A编码结氨酸→异亮氨酸,这在人类C3中以前还没有报道过,虽然Ile在小鼠和大鼠中这个位置上已发现。
我们的序列具有一条完全信号序列,它包括起始和终止密码子,因此,它可以编码功能性C3。
在COS-1细胞(利用脂质转染胺和pcDNA3(Invitrogen))的培养物上清液中,多达1.7μg/ml水平表达的野生型C3通过ELISA已经进行检测。通过仅用pcDNA3载体转化的细胞产生不可检测的C3。进而,采用免疫沉淀法、SDS-PAGE和免疫印迹法进行切割反应,通过该切割反应分析显示:
(ⅰ)将初级翻译产物正确地加工成成熟双-链形式;
(ⅱ)这种产物,如同天然C3一样,可以由C3转化酶(CVFBb)切割成C3b;以及
(ⅲ)象天然的C3,所表达的蛋白质由因子H+I不可切开,但是由C3转化酶转化成为C3b后变得可以切开。这证实可以将我们的开始质粒翻译成为功能性C3。C3编码序列的构建与表达的另一种描述参见参考文献[25]。
实施例1:在两个因子I的切割位点(氨基酸位置1303和1320)具有转化为谷氨酰胺残基(以抑制由因子I对C3b片段的切割)的精氨酸残基的C3的产生。a)诱变
所利用的诱变寡聚脱氧核苷酸是QRI1(caactgcccagccaaagctccaagatcacc)、QRI2(gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag)和AFL4149(taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac)以及对应的反义寡聚脱氧核苷酸-QRIln(ggtgatcttggagctttggctgggcagttg)、QRI2n(cttggtctcttctgattgcaggaggctggc)和AFL4149n(gttttatcgtgaccttaaggtcgaatttatta)。
在C3前体序列中氨基酸残基1303的因子I切割位点上,QRI1和QRIln指定谷氨酰胺取代精氨酸(在cDNA序列中把通过将G39968C3969改变为AA),以及QRI2和QRI2n在氨基酸残基1320的因子I切割位点实现相同的取代(通过将核苷酸G4019改变为A)。
在cDNA序列中的位置4149上,AFL4149和AFL4149n引入限制性内切核酸酶AflⅡ的切割位点(通过将C4149改变为T)而不改变所编码的氨基酸序列。将这两个引物用作标记,使得以由AflⅡ切割DNA产物为基础确定成功的诱变。
利用间隙质粒方法实现诱变。通过在0.25μg/ml尿苷存在下大肠杆菌菌株C5236的生长来制备一批在尿苷代替胸苷中富集的PGC3(“UPGC3”)。将这种质粒用SmaⅠ消化,并且将7.2kb产物通过(“US1”)琼脂糖凝胶纯化以除去C3序列的0.5kb片段(残基1463-1947)。通过DraⅢ+NaeⅠ消化PGC3,并且通过两次琼脂糖凝胶电泳纯化5.1kb片段来制备间隙质粒的其它组分(“DN2”)。在50μ1H2O中将200ngDN2用大约500ng US1混合,并且将它加热100℃,并且在添加20μl至25μl的2XT7缓冲液(100mM Tris/HCl/pH7.4/14mM MgCl2,100mM NaCl,2mM二硫苏糖醇,以及每种1mM的dATP、dCTT、dTTP和dGTP)+10nmol每种5′-磷酸化诱变引物(一个反应使用QRI1、QRI2+AFL4149,另一个反应使用QRIln、QRI2n+AFL4149n)之前慢慢地冷却到50℃以下。将混合物重新加热到70℃保持5min,并且慢慢地冷却到20℃(在30-60min期间)。在0℃,添加10个单位的T7 DNA聚合酶+80个单位的T4 DNA连接酶。首先将混合物(总量50μl)在0℃温育5min,然后在室温下温育5min,并且最后在37℃下温育3小时。按照按照制造商的说明书,将1μl每种混合物用来转化100μl超感受态X L1大肠杆菌(Stratagene)
筛选AflⅠ切割的氨苄青霉素抗性菌落,并且将成功的突变体在100ml分离和测序(利用测序引物C3pa-3876,cttcatggtgttccaagcct,C3 cDNA的配对核苷酸3876-3895)质粒的培养物中培育以确定在因子I切割位点的突变的特征。
对于“间隙质粒”诱变的另一个方案参见参考文献[26,27]。
b)突变体DNA转移到真核表达载体中
通过用HindⅢ和NaeⅠ的双重消化除去来自突变体质粒的C3编码片段。也包括DraⅠ以便除去残余质粒。C3编码序列是由琼脂糖凝胶纯化的,并且将它结合到pcDNA3载体(Invitrogen)中,已经用HindⅢ和EcoRⅤ酶将它线性化以及用牛小肠磷酸化酶去磷酸化。将连接混合物用于转化超感受态XL1大肠杆菌,然后平板接种到包含氨苄青霉素的培养平板上。
将氨苄青霉素抗性菌落的随机选择(三或四个)在2-3ml培养物和小规模分离的质粒DNA中进行培育。通过用限制内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和AflⅡ消化质粒DNA来确定包含正确插入的质粒。对应的菌落生长在100ml培养物上并且通过标准方法纯化该质粒。这些突变体最初从PGC3构建而得,于是编码区保持两个ATG的5′。因此,用EcoRⅠ的HindⅢ将这区域(加3kb编码序列的C3的5′)除去,并且通过切出的PC3相同的片段的连接将其代替。由标准方法制备这些重构建的载体,并且用于COS细胞的感染。c)野生型和突变体C3的表达
按照制造商的说明书,利用lipofectamine(GIBCO)由转化到COS-1细胞的质粒短暂地表达突变体和野生型C3。典型地,利用9μl脂质转染试剂用2-4μl质粒转染标准6孔培养平板的每孔1-1.5X105个细胞。检验C3分泌的上清液,并且转染3-6天后获得每ml上清液0.3-1.7μg典型产量。结果
a)突变体的生长
按照已经掺入的诱变寡聚脱氧核苷酸命名的下列突变体迄今已得到分离:-
(ⅰ)3种具有QRI1和QRI2加AFL4149的突变体:C3M-26、C3M-58和C3M-61的突变体;
(ⅱ)1种具有QRI1和QRIZ但是没有AFL4149的突变体:C3M-8的突变体;以及
(ⅲ)1种具有QRI2和AFL4149但是没有QRI1:C3M-51的突变体(用于实施例3)。
b)证实功能性作用是因为在因子I切割位点特异性引入的突变
在每个突变体所突变的区域周围,测序已经确认不存在于178-350碱基上的其它改变。通过用于诱变的整个“间隙”(碱基2463-5067),已经分析一个由这种方法产生的突变体(C3M-51)的序列(参见实施例3),并且发现与野生型序列的其它差异。
此外,来自所有突变体的总共2922个碱基的各自的测序还没有揭示任何能够由合成酶介导的错误造成的单点突变。所有表达的突变体都显示双链结构和由代表天然C3特征的C3转化酶的切割。总之,虽然没有将它们完全进行重新测序,但是所利用的突变体不可能包含有任何不需要的改变。实施例2.在一个因子I切割位点(氨基酸位置1303)上具有转化为谷氨酰胺残基的精氨酸残基的C3的产生。
仅仅除了诱变寡聚脱氧核苷酸AFL4149+QRI1或AFL4149n+QRIln(即没有QRI2或QRI2n)之外,将实施例1的方法用于诱变。结论
a)获得的突变体
2种具有QRI1和AFL4149但是没有QRI2的突变体被分离:-C3M-I23,27。如实施例1的描述,表达突变体C3M-I23。
这种蛋白质通过CVFBb是可切开的。C3b-样产物(与野生型相比)对位置1303由因子I和H的切割更具有抗性,但是在位置1320上仍然能够切开。因此,这种C3b衍生物对因子I具有部分抗性。
实施例3.在一个因子I切割位点(氨基酸位置1320)上具有转化为谷氨酰胺残基的精氨酸残基的C3的产生。
仅仅除了诱变寡聚脱氧核苷酸AFL4149+QRI2或AFL4149n+QRI2n(即没有QRI1或QRI1n)之外,将实施例1的方法用于诱变。结论
a)获得的突变体
3种具有QRI2和AFL4149但是没有QRI1的突变体被分离:-C3M-51,C3M-Q2,C3M-Q13。如实施例1所述,表达突变体C3M-51。
这种蛋白质通过CVFBb是可切开的。C3b-样产物(与野生型相比)在位置1320上不易由因子I和H切割,但是在位置1303上仍然能够切开。因此,这种C3b衍生物对因子I具有部分抗性。实施例4.突变的功能性作用分析。
将来自转染的COS细胞的上清液(100-400μl)在37℃下温育2h。将COS细胞用pcDNA3进行转染,pcDNA3携带插入物:-
1)没有突变的C3序列;
2)突变体C3M-I23(编码Arg1303 →Gln);
3)突变体C3M-26(编码Arg1303→Gln,Arg1320→Gln);以及
4)突变体C3M-51(编码Arg1320→Gln)。
将200μl培养物上清液(转染3天之后)用2mM苯甲基磺酰氟预处理,然后在37℃下温育2h,如下:
A)没有添加;
B)预形成的C3转化酶,CVFBb(从200μl包含6.6μgCVF、100μg因子B和1.4μg因子D中取出的10μl,在370C在包含10mM MgCl2的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中37℃下预温育15min);
C)因子H(5μg)和I(1μg);以及
D)CVFBb+因子H和I。
然后,通过在室温下添加0.6μg亲活性纯化的绵羊抗人类C3免疫球蛋白将这些进行免疫沉淀,并且在1小时之后添加20μl 5%的洗涤的福尔马林固定的Group C Streptococcus sp细胞(蛋白质G)(Sigma)的悬浮液。在1%SDS/2%2-巯基乙醇中进行(90-100℃,5min)之前,在室温下45min之后,在PBS,5mM NaN3中将微粒洗涤一次,并且在20mMTris/HCl、137mM NaCl、0.1%吐温20(v/v)(pH7.6)中洗涤一次。通过SDS-DAGE分离这些洗脱液,将其在硝酸纤维素膜上进行电印迹,并且通过采用辣根过氧化酶偶联的驴抗绵羊免疫球蛋白(Sigma),利用亲活纯化的绵羊抗人类C3免疫球蛋白的探查来检测C3区带,以及利用由Amersham提供的“增强的发光化学”底物进行检测。显示了对X-射线胶卷暴光2分钟的照片。标记的箭头表明可见的C3-产生的区带,并且个体样品(1-4,A-D)是刚刚所描述的那些。存在于所有样品中的约50 kDa的显著的区带(在46与68kDa之间的区带)是用于免疫沉淀的IgG的重链,并且通过辣根过氧化酶偶联的驴抗绵羊免疫球蛋白进行检测。结果(参见图3)
1.所有未处理的样品(1-A、2-A、3-A、4-A)包含C3的α链和β链的正确迁移的区带,这表明将所有突变体进行表达,以及正确地将其进行后翻译加工。在这些样品中存在的43或46kDa区带表明在培养基中存在一些因子H+因子I-样活性。在3天生物合成期间,C3的自发水解产生由这种活性切开的C3i。在未突变的C3中,产生43kDa和75kDa的区带(该75kDa区带是不可见的,因为(ⅰ)它被75kDaβ链掩藏,以及(ⅱ)用于对蛋白质印迹进行显影的抗体对这部分C3的α链具有非常小的活性:通过用大鼠单克隆抗体(“克隆-3”)重新探测随后确定它的存在,该抗体对这区域具有特异性)。添加因子H和I(不添加CVFBb)(1-C、2-C、3-C、4-C)没有切开余下的C3,表明这代表活性C3(完整的硫酯)。
2.(1)通过CVFBb切开未处理的C3,并且将C3b产物在l-B中或在1-D中添加因子H和I进一步用内源性酶切开。43kDa的区带表明在Arg1320的切割,以及68kDa的区带表明在Arg1303的切割(在更长暴光中可以见到)。
3.突变体C3M-I23(Arg1303→Gln)由CVFBb是可切开的,并且产物对内源性因子H和I-样活性(2-B)相对地具有抗性,具有明显量持续的α′链(C3b),但是添加额外的因子H和I(2-D)时,它仍然可以切开。43kDa的产物表明在Arg1320上的切割(在71kDa上的模糊条带表示α′链的其它片段,它在更长时间的暴光下是可见的),但是没有68kDa区带存在,这显示这个突变体在突变的Gln1303上对切割具有抗性。
4.突变体C3M-26(Arg1303→Gln,Arg1320→Gln)由CVFBb是可切开的,并且C3b-样产物(α′)对内源性因子H和I-样活性(3-B)具有抗性。与未突变的C3(1)和其它突变体(2和4)相比较,它对附加因子H和I(3-D)也十分具有抗性。有少量的kDa产物表明在突变的Gln1303上的一些切割(伴随68kDa的片段在更长暴光后也是可以见到的)。有极少甚至没有可见的43kDa在Gln1320上对应任何切割。
因此,在位置1303的Arg→Gln突变比在位置1320的突变在抑制由因子I的切割方面效果较差。(这种缓慢的残余切割也可以在突变体C3M-I23(Arg1303→Gln)中产生,但是46kDa的中间体通过在未突变的Arg1320上进一步切割有可能迅速加工成43kDa)。
5.突变体C3M-51(Arg1320→Gln)由CVFBb是可切开的,并且产物对内源性因子H和I-样活性(4-B)以及附加因子H和I(4-D)的切割具有抗性。46kDa的产物(和模糊的68kDa的区带)表明Arg1320的切割。然而,缺乏43kDa的区带表明在突变的Gln1320上是不能切开的。实施例5.在位置1303上各种氨基酸取代的比较1.概论
以前实施例描述了arg1303和arg1320向谷氨酰胺残基的突变。两种突变赋予在那些位置上对由因子I切割的抗性。然而,在arg1303上有小的但可检测的切割程度。因此,在这个位置上产生和检验一些其它氨基酸的取代。当残基1303是:Arg>Tyr>[Cys或Trp]>Gln>[Glu或Gly]时,切割以降低的效力顺序出现。这些结果是意外的,因为(ⅰ)所有已知天然产生的人类因子I-介导的切割产生精氨酸残基的C端,于是我们推定,该酶需要精氨酸;以及(ⅱ)如果切割发生在其它残基上,人们预料它们将不得不静电上类似于arg,即一种碱性残基(lys或his),(例如胰蛋白酶有选择地切开arg、lys或his的C端),因此人们不能预言酪氨酸取代的切割。
因此,为了产生对因子I的灭活有抗性的C3的衍生物,用甘氨酸或谷氨酸取代arg1303是优选的。2.方法2.1诱变:所利用的简并诱变引物是:caactgcccagc(gt)(ag)(cg)agctccaagatcacc(括弧中的字母表明在那个位置的碱基混合物)。突变体通过间隔质粒方法(如以前的实施例所描述的)或者通过“大引物方法”(V.Picard等,核酸研究22:2587-91,(1994))进行构建,其中上游引物是caccaggaactaaatctagatgtgtccctc,并且下游引物是gttttatagtgaccttaaggtcgaatttatta。所有突变都在模板上完成,其中已经将C3-编码的DNA进行突变以便氨基酸残基1320是谷氨酰胺,在位置4149上已经引入了AflⅡ的限制酶切位点(如以前实施例所描述的)并且通过DNA测序来确定。2.2表达:如以前实施例所描述的,将突变体利用pcDNA3载体在COS细胞中进行表达,在无血清培养基中用[35S]甲硫氨酸进行标记。2.3测定:将上清液用CVFBb(在包含镁的缓冲液中通过CVF与因子B和D因子反应形成的)和H和I因子处理,接着以抗-C3的免疫沉淀,并且在还原条件(如以前实施例所描述的)下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳完成分离。将凝胶固定,用Amersham的“扩增”试剂处理,干燥并且对放射自显影胶卷进行暴光,获得图中所显示的结果。3.结果
在位置1303(位点1)的因子I-介导的切割(在位置1320(位点2)(在这里已经突变成谷氨酰胺)没有切割)产生46和68kDa的区带。可以看出,切割发生的秩序:arg(R)>tyr(Y)>cys(C)和trp(W)>gln(Q)>gly(G)和glu(E)。将野生型(在这两个位置的精氨酸)在这两个位置切开,产生(在凝胶中太小不能见到)43和68kDa的片段。4.附图
图4显示结果。上述泳道各自表明在位点1(位置1303)和位点2(位置1320)的残基。实施例6.在arg130突变成gln后对因子I和H灭活的提高的抗性的说明1.概论
以前实施例显示arg1303或arg1320向谷氨酰胺的转化使那个位点形成对由因子I引起的切割的抗性。两个位点的突变使在任何一个位点上形成对切割具有抗性的分子。在这里,我们进一步显示对于由因子I和H引起的功能灭活而言,与野生型相比仅有arg1303向gln的突变(没有arg1320的改变)导致更大的抗性。2.方法
2.1表达:arg1303→gln突变的制备如以前的实施例所描述的。用磷酸钙方法将其转染进CHO(来源于中国仓鼠卵巢细胞的一种普通的实验室细胞)中并基于G418抗性(由Sigma提供的“遗传霉素”)选择稳定的转化体。收集培养物上清液,并且通过硫酸钠沉淀(10-20%(w/v)组分)以及在Q-琼脂糖和单-Q琼脂糖凝胶上通过离子交换层析部分纯化所表达的C3(A.W.Dodds方法酶学223:46(1993))。
2.2测定:将绵羊红细胞涂上一层S016单克隆抗体(RA Harrison和PJ Lachmann实验免疫学手册第四版39章(1986)),然后将4.4ml 5%(v/v)的悬浮液用约10μg C2、24μgC4和1μgCl(纯化的人类组分)在37℃下在CFD中温育10min(R A Harrison和P J Lachman同上)。然后用0.25ml包含半纯化的突变体或野生型C3和EDTA(终浓度12.5 mM)的溶液将0.8ml这种温合物温育105min。然后在CFD中洗涤这些细胞,并且所用的CFD包含0.1%(w/v)的明胶(CFD-凝胶)。将与[125I]-标记的克隆4单克隆抗-C3抗体结合的放射配体用来确认类似量的野生型或突变体C3b被沉淀。
对于测定来说,将40μl 5%的细胞悬浮液在250μl CFD-凝胶中稀释,并且将50μl的等份试样在37℃下用50μl包含因子I和H的稀释液的CFD-凝胶(终浓度为100、10、1、0μg/ml)温育30min。然后添加0.9ml的CFD,通过离心使细胞形成小球,并且洗涤两次以上(每次用1mlCFD)。然后,细胞在100μl包含100μg/ml因子B、100μg/ml备解素、1μg/ml因子D和0.3mM NiCl2的CFD-凝胶中进行悬浮。在37℃下10分钟之后,添加0.9ml包含10mM EDTA和2%(v/v)正常的豚鼠血清的CFD。在37℃下另外30分钟之后,通过离心使未溶胞的细胞形成小球,并且通过在412nm处测量上清液的吸光度来确定溶胞作用程度。从在水中溶胞作用的细胞等份试样确定等同于100%溶胞作用的吸光度,因而可以计算百分溶胞作用。
这种分析测定沉淀的C3b形成功能性C3bBbP转化酶的能力。向iC3b的转化在血清/EDTA中抑制转化酶的形成和尔后的溶胞作用。3.结果
图中显示的结果表明当与野生型相比时,要求超过因子I和因子H十倍以除去arg1303→Gln突变体的溶血活性。因此,这种突变对于产生C3的衍生物是有利的,其C3b产物对由因子H和I的灭活具有抗性。该作用可能是由于在位置1303对切割具有更大的抗性(当将arg突变成gln时),或者当切割首先发生在位置1303时,在位置1320对切割具有更大的抗性。4.附图
图5显示了结果。x-轴表明因子H和I的浓度。Q1表示arg1303→Gln突变,如方法所描述的检测%溶胞作用。讨论
在这里描述的关于修饰的变体,人类C3的重要特性如下:-
(ⅰ)该分子具有一种功能性C3b-样衍生物,因为它可以结合功能性活性人类因子B,于是它能够由人类因子D切开以形成能够切开人类C3的酶。
(ⅱ)衍生物的氨基酸序列与来自人类的C3比与来自其它物种的C3(其序列目前是已知的)或者是目前已知的任何其它蛋白质序列具有更大的同源性。在野生型但不在修饰的衍生物中显示的C3的结构特性,包括下列:-
(a)在图2和1分别给出用于在这里描述的本发明实施例的人类C3的变体的DNA编码序列和翻译的蛋白质序列。这种蛋白质序列在刚才的两个氨基酸(实施例给出了细节)上与公开的序列[2]不同。我们假定,更多变体与C3功能相适应,尽管在种群中大多数将不存在。
(b)初级翻译产物通过蛋白水解加工成两条二硫链的链,α(残基672-1663)和β(残基23-667),以及切除的信号序列(残基1-22)。
(c)成熟蛋白质在残基Cys1010与Gln1013之间包含一个硫酯键。
(d)C3转化酶切开C3以除去C3a(残基672-748)。通过硫酯键的断裂进行这种反应。
(e)在因子H的存在下,因子H在残基Arg1303与Ser1304以及Arg1320与Ser1321之间切开C3b。对天然C3分子的修饰由Gln取代Arg1303
这种修饰是由因子I在C3b切割的一个位点上进行的。这种作用将减少在这一位置上由因子I切割的速率。选择向谷氨酰胺的改变以便夺取精氨酸的阳电荷,这很有可能对因子I的丝氨酸蛋白酶活性来说是重要的,并且保持亲水特性和类似的侧链大小,将减少对蛋白质三级结构的任何破坏。支持这种推定的证据是不抑制加工到双链结构中的突变,硫酯的形成或者由C3转化酶对C3的切割。如实施例5所显示的,Arg1303向另一个氨基酸的突变可以达到类似的或甚至更大的效果。
也可以通过使Ser1304(切割位点的其它方面)或者与酶-底物相互作用相关的其它残基发生突变以减少这种切割。由Gln取代Arg1320
这种修饰是由因子I在C3b切割的其它位点上进行的。这种作用将大幅度地减少(实际上是取消)在这一位置上由因子I切割的速率。以上述的相同的标准进行向谷氨酰胺的改变,并且这种突变也抑制双链结构的加工,硫酯的形成或由C3转化酶对C3的切割。再者,向其它氨基酸的突变也可以达到相同的效果,如与酶-底物相互作用相关的Ser1321或其它残基的突变。
当组合两种突变时,Arg1303-Gln和Arg1320-Gln抑制与C3b相互作用,因此,保护使之免受灭活因而保持它形成部分活性C3bBb转化酶的能力。也可利用其它取消切割反应的突变(包括突变组合)(例如Arg1303Glu或者Arg1303 Gly可用于与Arg1320 Gln组合)。实施例7.减少C3b/C3I与因子H相互作用的各种突变7.1概论
其它实验室已获得以合成肽效应(Ganu,V.S.和Muller-Eberhard,H.J.,1985,补体2:27;Becherer,J.D.等,1992,生物化学31:1787-1794)或者以限制性的诱变(Taniguchi-Sidle,A.和Isenman,D.E.,1994免疫学杂志153:5285-5302)为基础的证据,说明在C3转录物初级结构的残基752-761(参见图1)可能与因子H的相互作用有关。然而,其它公开的证据表明,仅仅只有残基767-776与H的相互作用有关。因而残基752-761对于与因子B相互作用来说是重要的(Fishelson,1991,分子免疫学28:545-552)。我们推测,这区域更广泛的突变可能减少因子H的亲和性。因此它对为了生成C3衍生物来说是必需的,该衍生物对因子H具有抗性,进而我们猜测突变重要的残基可能是脯氨酸的残基(谷氨酸和天冬氨酸),并且将它们变成不太可能介导强相互作用的中性残基是满足需要的。在本实施例中,我们将残基752-754由Asp-Glu-Asp变成Gly-Ser-Gly,并且将残基758-760由Glu-Glu-Asn变成Gly-Ser-Gly。显示的产物减少对因子H敏感一致的切割特征。这证明可以将C3修饰以减少因子H的结合。由此减少对因子H和I的敏感性。这些修饰对于产生C3转化酶来说是必需的,所说的转化酶在生理条件下是稳定的。7.2方法
诱变、表达和分析的方法在以前的实施例中已经描述过,合成的诱变寡聚核苷酸具有序列:agtaacctgggttcgggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc。7.3结果
图6显示切割反应的结果,它们表明:
1.添加CVFB6到野生型C3中将导致α链的损耗(泳道2),因为形成的C3b在培养物悬浮液中对低浓度的因子I和H敏感。在表达和随后的温育期内形成的C3i将以同样的方式断裂形成iC3i。因此分别添加外源因子I和H(泳道3和4)与泳道1和2没有什么不同。因为培养基自身包含充足的对完全切割起作用的因子H和I活性。
2.相反,以CVFBb处理突变体C3(泳道6)不导致α链的消失。相对于C3b,这里有一些α′链的生成,但是也有一些或全部残余物,这表明α链的持久性不只是由CVFBb的切割失败的结果。因此,在泳道2中,余下的未切割的α链可能代表C3i,它通过因子H和I的内源活性还没有切开,虽然如果突变体需要对CVFBb的部分抗性,也可能某些代表天然的C3。添加高浓度的外源因子H和I(泳道7和8)确实产生α链和α′链的缺失,这表明(ⅰ)突变体对这些因子不完全具有抗性,以及(ⅱ)在泳道2中由CVFBb未切开的α链明显地来自C3i(由CVFBb而不由因子H和I切开的)而不是天然C3(由因子H和I而不由CVFBb切开的)。即使在泳道8中,仍然并非切开所有的α链,这有可能是由于对因子H和I的抗性。
因此,残基752-754以及残基758-760的突变可以产生C3分子,该分子一直由C3转化酶切开,但是对因子H和I的活性部分地具有抗性。鉴于其它公开的数据,这最有可能是因为该突变已经修饰与因子H相互作用相关的区域,因而导致减少对因子H的亲和性。实施例8.在C3中可以突变以修饰C3i与因子B的相互作用的位点8.1概论
以前的实施例已经显示突变为C3可以调节与因子H和I的相互作用。为了在C3中揭示可能与因子B相互作用的其它位点,我们比较来自不同的物种C3分子的已知序列,以及比较C4可供使用的序列和其它同源的蛋白质。我们已确定与人C3的残基1427-1433对应的区域,该区域可能牵涉到C3和C4特异性功能,这可能包括与因子B(或它的同系物,C2,在C4的情况下)相互作用,但不是必需的,因为其它潜在功能包括硫酯的形成,转化成C3b(或者C4b形式),与转化酶活性中与底物C3和/或C5相互作用,以及与因子I和它的辅因子相互作用。因此发现在其它同源蛋白质中,在这种人类C5情况下,将选择的残基突变成对应的残基(以序列对比为基础)。于是,残基1427由Arg变成Gln,残基1431从Lys变成Asp,残基1433从Glu变成Gln。形成的突变体对由C3转化酶(CVFBb)的切割敏感,C3b产物可由因子H和I切开。然而,这一突变体不支持因子B向Bb加Ba的转变,其依赖于因子B对C3i(或者C3b)的结合。因此,我们证明,这一区域的突变已缩小与因子B的相互作用。虽然这对于产生超活性C3转化酶来说是不必需的,但它提供了C3这个区域的其它修饰也将改变与因子B的相互作用,并且某些将可能增加亲和性。因此,这样的突变也可以增加双分子转化酶C3bBb(或C3iBb)的稳定性与活性。8.2方法
表1另一面所显示的序列对比说明为什么我们认为这个区域是诱变的候选者。我们猜测特定残基的特征在C3和C4上是高度保守的,但是在其它蛋白质中明显地不同。选择残基1427、1431和1432,因为它们所改变的性质可能是与蛋白质-蛋白质相互作用的基团的指示。在人类C5中使所说的改变成为对应的残基,因为它们显示出十分不同的静电性质,但是本文一些其它保守残基可以表明一种类似的局部结构。
表1对于人类C3残基1427-1435区域的C3和相关分子的序列对比
残基(人类)蛋白质 物种 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435C3 人 R Y I S K Y E L D
小鼠 R Y I S K Y E M N
大鼠 R Y I S K Y E M D
豚鼠 R Y I S K Y E L D
兔 R Y I S K Y E L N
眼镜蛇 R Y I S K F E I D
爪蟾 K Y I S K Y E V N
鲑鱼 R Y I E K F E M DC4 人 R Y V S H F E T E
小鼠 R Y V S H F E T DSlp 小鼠 R Y V S H F E T DC3/C4样 八目鳗 N Y I V Q Y E I R
七鳃鳗 K Y I S N Y E I TC5 人 Q L F T D Y Q I K
小鼠 Q L L T D Y Q I KA2M 人 P T V K M L E R S
小鼠 P S V K R L Q D Q
大鼠 P T V K M L E R SPZP 人 P T V K M L E R S鼠球蛋白小鼠 P T V K K L E R LA1M 大鼠 P S V K K L Q D QA1M 仓鼠 P T V K K L E R SA1I3 大鼠 P T V K K L E R L
C3切割反应的诱变、表达以及分析的方法如以上实施例(实施例1-4)所描述的。将诱变寡核苷酸用下列序列合成:tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa 。因子B的转化分析
如实施例所描述的,通过在克隆-3-琼脂糖层析柱上的亲和性纯化从COS细胞培养基中纯化表达的产物。这种方法将导致硫酯断裂形式(C3I)的相当大的转化。用相同的方法分离野生型C3。将野生型C3的稀释液(1/5、1/25和1/125)与突变体C3一起进行SDS-PAGE凝胶电泳(还原条件)并且进行银染,这表明该突变体以浓度稍微少于1/25但多于1/125的野生型稀释液存在。将相同的稀释液用于因子B的转化分析。将5μl这种C3稀释液用25μl包含5μg/ml因子D和约1.6μg/ml125I标记的因子B(约1000-2000dpm/μl)CFD-G在37℃下温育3h。然后用于凝胶的放射自显影,通过SDS-PAGE(还原条件)分析样品。其结果在图7中显示。8.3结果
如图7所显示的,在1/125的野生型C3(C3 i)的稀释液中产生因子B的明显切割。相对地,当突变体C3存在(即使不溶)时,没有观察到任何明显的切割,它的浓度可能比野生型的1/125样品更高。
因此,这种突变体看来似乎具有削弱支持因子B的切割能力,很有可能因为它减弱对因子B的结合亲和性。因此,可以将C3的这个区域突变以调节C3i(或者C3b)与因子B之间的相互作用,并且也可以调节转化酶(C3iBb或C3bBb)的稳定性。实施例9表达突变体C3分子的纯化9.1概论
本实施例将阐明怎样从表达培养基(如转化的真核细胞的培养基)中分离出突变体C3分子。通过样品亲和纯化,将获得对于功能检测和如实施例10所述的方法接合抗体来说充足浓度的C3分子。虽然相当大部分的内硫酯的水解伴随从抗体的洗脱,但是C3i产物一直是产生活性C3转化酶以及产生C3I抗体缀合物的合适前体。这种方法作为部分体内利用所需的制备可能是有用的。9.2方法在克隆-3-琼脂糖上进行亲和纯化
克隆-3是小鼠单克隆抗体,它对C3和它的衍生物具有特异性,并且包括C3b和C3i(Lachmann,P.J等,1980,免疫学杂志41:503-515)。其它C3的单克隆抗体是可利用的,并且在某些情况下,它已经成功地用于从低质量的人血浆中分离出C3(Dodds,A.w.,1993,方法酶学223:46-61),因此它也可能用于分离来自体外所表达的分子。将IgG碎粒用溴化氰偶联到琼脂糖CL-4B上(可以在Harrison和Lachamann,1986,实验免疫学手册,第四版,Ed.s Weir,Herzenberg,Blackwell和Herzenberg;Blackwell,牛津大学出版社中找到)。将培养物上清液直接通过这一树脂柱(再循环的)或者用25%(W/V)Na2SO4沉淀首先浓缩,重新溶解以及在PBS,5mMNaN3中透析进行。然后用(Ⅰ)PBS,5mMNaN3和(ⅱ)包含1MNaCl的PBS连续地冲洗层析柱,用50mM硼酸钠缓冲液(PH10.5)洗脱结合的C3,并且立即收集0.9ml的组分到0.1ml 1MTris/HCl(PH7)中进行中和。然后将该物质对PBS,5mMNaN3进行透析。制备携带“His-尾”的C3
“His-尾”是一列组氨酸残基,它显示对具有镍离子的层析柱的亲和性。这种方法已经用来帮助分离表达的蛋白质。我们认为这对于分离表达的突变体C3分子上有用的,于是我们已经用于在碳末端插入6个组氨酸残基的尾以产生编码C3的质粒(碳末端直接到残基1663)。选择这种his-尾的定位是为了使对新生C3的合成、折叠、加工和二硫键的形成的影响减少到最小。残基1661是与早期在序列中的残基的二硫键有关的残基(可能是Cys 1537;Dolmer,K.和Sottrup-Jensen,L.,1993,FEBS-Lett315:85-90),因此,它看起来使在这种结构特征之外的插入是慎重的,利用如实施例1所使用的“缺口质粒”方法,利用用序列tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacac合成的寡聚核苷酸引入突变。
通过DNA测序进行正确序列的掺入。现在将这条DNA序列转移到表达载体中。转化真核细胞后,可能通过具有镍离子的柱的亲和性或者通过任何其它对“His-尾”具有特异亲和性的基质分离表达的C3。9.3结论
在克隆-3-琼脂糖上已经纯化出大量突变体C3,该突变体C3包含如实施例1和2在CHO细胞中表达的那些。该产物保持了通过因子B的切割能力。将同样的方法用于分离如实施例B2所述的在COS细胞中表达的突变体。SDS-PAGE凝胶的银染指出分离的产物不是100%纯的,但是有时出现高于或者等于50%纯的。这来自通常含有在10%(V/V)胎牛血清中的少于10μg/mlC3其它细胞蛋白的起始物质。另外,在分离期间不降解C3,并且内源性因子H和I活性看起来已经被除去。
利用“His-尾”纯化牵涉从镍离子的层析柱中更温和的洗脱条件。例如,利用EDTA。因此,这种对C3的方法的应用在不破裂内硫酯键下使得可以分离。实施例10.C3i与抗体的缀合和用于靶向针对特定细胞的C3转化酶活性10.1概论
本发明的一个方面是由突变体C3分子产生的稳定C3转化酶将导致C3转化,如果将它局限在特定的目标位点内,它将促进那个目标的补体依赖的侵染。作为应答目标有利的方法将突变体C3分子(如C3i或C3b的衍生物)连接到所需目标的特异性抗体上。在本实验中,我们阐明一种形成这样的缀合物的实施方法,它对于突变体C3i或者C3b分子来说是可以运用的,并且可以用于从表达系统亲和性纯化的物质,即使C3的硫酯在这种工艺中已经被阻断。通过将C3i偶联到特异结合绵羊红细胞的抗体上,我们进一步显示缀合物将C3i固定在红细胞表面以便可形成的转化酶(C3iBbp)起始这些细胞的降解。当其它补体组成以正常豚鼠血清形成应用时(EDTA中以阻止C3转化酶从头形成)。因此,对抗体的缀合作用可以用于把C3i分子作为目标以起始特定细胞型补体依赖性攻击。本实施例利用来自人血浆的野生型C3i,它在体外形成C3转化酶。在体外,通过因子H和I降低野生型C3i和C3b。因此,突变体C3在生理上是有利的,它按照本专利的方案构建成对因子H和I具有抗性,因而形成稳定的C3转化酶。10.2方法
所用的抗体是从多克隆兔抗绵羊红细胞抗血清分离的IgG组分。将1.1mg用75nmol SPDP在缀合缓冲液(20mMKH2PO4,60mMNa2HPO4,0.12MNaCl,pH7.5)中室温下温育2小时。在琼脂糖-6层析柱(Pharmacia)上通过凝胶过滤纯化PDP-IgG(在磷酸缓冲液中,PH7.4,包含0.5MNaCl)将用二硫苏糖醇还原的样品用于估计每个IgG分子偶联的4PDP基团。用0.1MPH7.2的甲胺处理纯化的C3制备C3i。通过在缀合缓冲液中透析所采用的凝胶过滤除去过量的甲胺。在1.26ml接合缓冲液中用1.7nmolPDP-IgG混合18nmol的C3i,并且在室温下温育一天(4℃下温育1.5天)。图8显示接合反应混合物的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶,它显示了不存在于PDP-IgG的物种的外观。在包含0.5MNaCl的磷酸缓冲液(PH7.4)中,在琼脂糖-6-层析柱上通过凝胶过滤将这种物种进行部分纯化,然后对PBS透析。在层析中用球状分子量标准通过校准可以估计出C3的分子量在300-400之间,然后进行洗脱。从考马斯染色的SDS-PAGE染色的凝胶(非还原条件)估计出缀合物、游离抗体和非偶联C3的浓度。双向SDS-PAGE(第一相非还原的、第二相还原的)揭示在IgG和C3i之间于1∶1缀合物可比较的模式。(ⅱ)C3-抗体缀合物可以用于靶向抗特定细胞的转化酶活性的说明
将20μl缀合物的稀释液(0(无缀合物)、1/100、1/50、1/10)用100μl大约1%(V/V)绵羊红细胞(用CFD预冲洗)在37℃下温育1小时。用等量的POP-PAGE(无C3)和仅有C3进行平行温育。然后将细胞用CFD冲洗4次并且用CFD-G重悬浮成100μl。将50μl重悬浮液用150μl进行溶解,接着添加800μl包含10mMEDTA和2%(V/V)NGPS的CFD。将另50μl缀合物包被的细胞用50μl包含190μg/ml因子B、因子D、20μg/ml备解素和0.6mM NiCl2的CFD-G在37℃下温育15min,接着用900μl包含10mM EDTA和2%(v/v)NGPS的CFD进行溶胞。在37℃下,30min之后,通过离心(2000Xg,约min)沉淀出细胞,并且在412nm处测量上清液的吸光度。利用H2O-处理的样品作为100%溶胞,并且空白对照缓冲液中没有细胞,如图9所显示的,计算出%溶胞。该缀合物产生剂量依赖性溶胞,因而在缺乏任何处理的条件下,观察不到PDP-IgG和仅有C3i产生的任何显著溶胞作用。10.3结果总结
所利用的方法已成功地证明将C3i偶联到IgG上,如下显示的:
1.在图8中SDS-PAGE显示适合的1∶1的C3:IgG缀合物的大小(约350 kDa)的键的形成。
2.二维SES-PAGE(第一维非还原的,第二维还原的)表明这一物种包含IgG和C3i。
3.这一物种在凝胶过滤上的洗脱特征再次与约350kDa的分子相一致。
4.缀合物显示不由PDP-IgG或C3i显示的溶血活性(图9)。
溶血分析(图9)进一步说明:
1.特异性抗绵羊红细胞抗体将C3i局限到靶细胞(绵羊红细胞)膜上,抑制它由冲洗而被除去(与自由的C3i相对比)。
2.缀合物保持C3i活性,因此它通过与备解素和因子B和D反应仍然能够形成C3转化酶。
3.这种转化酶可以起始靶的补体依赖性攻击,在这种情况下通过激活溶胞作用途径(C5-9)以溶解红细胞。来自其它实验室的附加数据显示可以将眼镜蛇毒因子连接到抗体上,并且这些缀合物可以将一种特定细胞型的补体活性作为目标(Vogel,1988,Targeted.Diaon.Ther.,1:191-224;Muller,B.和Muller-Ruchholtz,W.,1987,Leuk.Res.11:461-468;Park,C.J.,White,V.F.和Falk,R.J.,1986,补体3:223-235;Petrella,E.C.等,1987,免疫学方法杂志104:159-172)。如本发明中所概述的,这些数据支持C3修饰以便它能够形成稳定的C3转化酶,如眼镜蛇毒毒因子一样,能够用于靶向补体介导反应。实施例11.在正常的人血清中突变体C3分子诱导因子B转化的说明11.1概论
这里描述的本发明的一个主要目的是来自生物液的补体活性的消耗缺失。本发明描述用于制造C3分子的方法,该分子对因子H和I的负调节具有抗性。在这种情况下它们将结合因子B,并且产生活性C3转化酶。通过用于实施例6的溶血分析证实这些转化酶的活性。因此需要消耗C3转化酶。如果转化酶不稳定,它将不用C3进行分离。然而,这将结合新鲜因子B,并且转化为Bb和Ba。这样,突变体C3将促进因子B的消耗,这将导致最终丧失可选择途径的能力,并且它不能扩增标准途径的能力。如果形成稳定的C3转化酶,将减少因子B的转化,但是将增加C的消耗。因此,两种情况可以是所需的。在本实施例中,我们证实修饰的突变体C3分子使它们对因子I具有抗性,但是没有任何修饰去修饰转化酶的稳定性,在人血清中促进因子B的加速转化。相反,野生型C3不引起任何重要的转化,可能因为通过因子H和I迅速降解为野生型C3i。11.2方法
突变体的制备如下:
将Q1R2 Arg1303转变为Gln(实施例2)
将Q1Q2 Arg1303转变为Gln,将正Arg1320转变为Gln(实施例1)
将E1Q2 Arg1303转变为Glu,将正Arg1320转变为Gln(实施例5)这些突变体都将在CHO细胞中表达,然后用Na2SO4沉淀进行纯化,其后采用如实施例B3所描述的在克隆-3-琼脂糖凝胶上进行亲和性纯化。同样地分离野生型C3(R1R2)。通过带有银染的SDS-PAGE,Q1的浓度在野生型的1/5到1/25之间,而E1Q2的浓度大约是野生型的1/5,并且E1Q2的浓度在野生型的1/25到1/125之间。所有制剂可能包含大多数不完整的硫酯分子(C3i)。
将10μl这些C3制剂用10μl的20%(v/v)正常人血清溶液在包含1mMMgCl2和大约300ng 125I-标记的因子B(大约2-300,000dpm)的PBS中在37℃下温育1小时。然后通过SDS-PAGE分析5μl(还原条件)。将干燥凝胶经过放射自显影说明与完整因子B和它的切割产物对应的区带位置。然后经过切除和计算以便精确地确定出切割程度。减去在只有缓冲液中获得的值作为背景(不仅包含背景切割,而且包含在放射性配体制剂中的降解产物和其它杂物)。11.3结果
因子B切割的形成的程度显示如下:1/25野生型1.49%1/5野生型 2.74%Q1R2 6.19%Q1Q2 7.41%E1Q2 6.42%
因此,所有的因子I抗性突变体比等量的野生型C3(C3i)都产生更高水平的因子B切割。更大剂量或者更长时间的温育,将导致可选择途径的完全失效。
用于上述实施例的缩写包括:CFD,补体固定稀释剂(Harrison和Lachmann,1986,实验免疫手册,第四版,Ed.s Weir,Herzenberg,Blackwell和Herzenberg,Blackwell,牛津大学所定义的);CFD-G,包含0.1%(w/v)明胶的CFD;P9S,磷酸缓冲盐溶液;NGPS,正常豚鼠血清;SDS-PAGE,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;SPDP,N-琥珀酰亚胺-3-[2-吡啶二硫代]-丙酸酯。实施例12.残基992-1000的突变
1.概论
其它实验室已获得以合成肽(Ganu,V.S.和Muller-Eberhard,H.J.,1985,补体2:27;Becherer,J.D.等,1992,生物化学31:1787-1794;Fishelson,Z.,1991,分子免疫学28:545-552;Lambris,J.D.,Ganu,V.S.,Hirani,S.和Muller-Eberhard,1988,生物化学杂志263:12147-12150)作用为基础的证据,说明在人类C3b中的各种残基,该残基可能与因子H的相互作用有关。我们已利用不同序列比较的方法来预测与C3-特异性功能有关的残基。已进行的定点诱变表明大多数这些突变对因子H的功能敏感性具有极少甚至没有影响。然而,一些突变确实对因子H减少了敏感性。这些突变在分子的部分上进行,这些部分以前没有确定为与因子H相互作用或调节它的结合。因此,这些定义的残基诱变可以用来产生C3突变体衍生物,该衍生物在生理环境之内部分或者完全对因子H抑制作用具有抗性,并且将形成复合物C3转化酶(C3bBb等),该酶同样地通过因子H对失活具有抗性。
因子H与其它补体抑制蛋白质在结构上具有同源性,该蛋白质包括CR1、MCP和DAF。鉴于这种明显的进化关系以及结合的互相竞争,很有可能它们在与因子H结构类似的方式下与C3b相互作用(Farries等,1990,补体炎症7:30-41)。因此,所描述的敏感性的突变也可能对于调节与这些其它蛋白质相互作用来说是有用的,该突变调节对因子H,尤其是为了逃避它们补体的负调节活性。它们也可能发现应用于在因子B中与SCR结构域(和在C2中与结合C4b相关的同源结构域)相互作用的修饰。C4和C5对应的区域的突变对于在Clr和Cls(C4)、C4b-结合蛋白质(C4b)以及C6和C7(C5b)中修饰它们与SCR结构域的相互作用也可能是有用的。2.方法2.1寻找与C3-特异性功能有关的残基。
通过对人类C3与所有同源蛋白质的序列对比得出这些预测,该蛋白质的序列通过公开的数据库是可供使用的。这些包括在小鼠、大鼠、豚鼠、野兔、眼镜蛇、非洲爪蟾、小鸡和鳟鱼中的功能性等同分子、人类和小鼠C4、人类和小鼠C5、来自七鳃鳗和八目鳗类鱼的C3-样蛋白质、眼镜蛇毒液因子(CVF)以及人类α-2-巨球蛋白和它的同源物。然后进行有利于残基的寻找,该残基在不同C3s中是保守的,但是在同源性(显著地C5和CVF)方面没有明显的不同,它们缺乏感兴趣的C3-特异性功能。将某些突变为在C5或CVF中编码对应的残基(在COS细胞中表达),在CVFBb和因子H和I存在下检验为切割所分泌的产物。所有方法是在标准方法与实施例1中所描述的方法。总结的结果在表Ⅱ中显示。2.2突变体DV-1AM的构建和分析
以与其它突变体的相同方法制造这种突变体,利用如V.Picard等描述的“大引物方法”(V.Picard等,1994,核酸22:2587-2591)。诱变引物具有编码突变体E992S、D993A、D996S、A997Q、E998S和R999G的序列ccagatgacaagtgctgccgtcagccagtcagggctgaagcacc。上游引物具有序列tgtcatcgtgccgctaaaga(与脱氧核苷酸2754-2773对应),以及下游引物具有序列gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta(与脱氧核苷酸互补4130-4165,在位置4149具有引入对于限制酶AflⅡ的切割位点)。通过切割都具有AflⅡ和EcoRⅠ的片段(在位置2997切割)纯化所需的产物以及利用T4 DNA连接酶共同连接,将突变的DNA片段连接在载体上,该载体在位置4149包含C3的编码序列,也具有AflⅡ的引入位点。从转化的细菌克隆分离质粒DNA,并且通过DNA测序确定真正的突变体。在这一点上人们发现将DNA序列另外突变编码突变体L1000M。将形成的表达载体转化到COS细胞中,以及如前文所述分析切割反应的分泌表达产物。3.突变体DV-1AM的性质
图10显示DV-1AM突变表达产物的分析。注意的是:
(ⅰ)利用C3的C3dg区域的单克隆抗体对蛋白质印迹进行显影以检测前体、α、α′、77和68kDa的片段,但是没有检测β、43或46kDa的片段。
(ⅱ)所有区带的DV-LAM产物(泳道B1-4)不明显地出现在等同野生型区带(泳道Al-4)下。在迁移率方面的改变是突变造成的结果。
(ⅲ)用CVFBb切割野生型C3将由C3b产生一些α′链,但是更大量的68kDa片段通过内源性因子H和I活性(泳道A3)将导致切割C3b为iC3b。添加外源性H和I将完成C3b转化为iC3b(泳道A4)。相反,通过CVFBb切割DV-1AM产物将产生更大量的α′链和仅仅小量的68 kDa的片段(泳道B3)。然后,添加外源性H和I将这种C3b转化为iC3b(泳道B4)。因此,虽然通过高浓度的外源添加的H和I对切割的敏感性不完全表明抗性,但是突变体C3b对内源性和外源性H和I比野生型更具有抗性。4.结论
DV-lAM突变产生对因子I的因子H-依赖的切割的抗性。该机理不能确定,虽然因为修饰的残基(一级结构)离因子I的切割位点远,但是很有可能它与因子H的相互作用将受到削弱。在这种情况下,突变也将赋予对其它的因子H的抑制活性的抗性,也就是说:-(Ⅰ)与结合C3b(或C3i)的因子B竞争,以及(ⅱ)加速C3bBb与C3bBbP转化酶的解离。DV-1AM突变具有直接或者间接地与因子H保持亲和性相关的修饰残基。相同残基的许多不同的突变将可能具有类似的作用,并且仅仅在这里修饰的一些残基的突变以及其它具有一级结构片段的残基也可能实现这样的作用。实施例13.残基1001-1005的突变1.概论
如上述实施例所描述的,也将残基1001、1002和1005确定为对C3-特异性功能来说十分重要的候选者。突变证实那些残基的修饰可以用来赋予对因子H的抗性。2.方法2.1突变体DV-1B的构建和分析
所利用的方法如前面实施例所描述的,除了诱导引物具有编码突变体K1001N、H1002I和V10059的序列aacggctgaacatattaattcataccccctcgggc外。分离的质粒DNA的序列分析证实已经引入正确的突变。没有检测到其它突变。3.突变体DV-1B的性质
图11显示由DV-1B突变所表达的产物的分析。注意的是:
(ⅰ)利用C3的多克隆抗体对蛋白质印迹进行显影以强烈地检测前体、α、α′、β、43和46kDa的片段,但是仅仅微弱地检测77和68kDa的片段。注意不能将α和α′进行转化以及100%的效率检测,于是这些区带的强度比所预料的更少并且对存在的实际量缺乏指导。
(ⅱ)用CVFBb切割野生型C3将从C3b产生少量的α′链,但是由于68kDa片段通过内源性因子H和I活性(泳道B3)将C3b切割为iC3b,更大的量将丢失。虽然少量的46 kDa的中间体是可见的,但是这通常作为43 kDa片段出现。添加2μg/ml外源性H与因子I将导致进一步标记的切割和10-50μg/ml外源H(泳道B5,B6)完成C3b转化成不充分切开(没有α′和46kDa的区带)的iC3b。由CVFBb切割DV-1B产物也将产生少量的α链(泳道A3;存在C3的总量更少,并且α与α′区带同时带十分微弱)。明显地,在缺少因子H和I的情况下所产生的43kDa链的总量比在野生型中更少,并且46kDa的中间体片段的出现更多,这表明是更无效的切割。当46kDa的中间体仍然明显时,添加外源H和I(泳道A4-6)将实现这种C3b转化成iC3b,但是发现43kDa的产物提高了剂量依赖达到50μg/ml(泳道A6)。因此,虽然通过高浓度的外源添加的H和I对切割的敏感性不完全表明抗性,但是突变体C3b对内源性和外源性H和I比野生型更具有抗性。4.结论
DV-lB突变产生对因子I的因子H-依赖性切割的抗性。该机理不能确定,虽然因为修饰的残基(一级结构)离因子I的切割位点很远,但是很有可能它与因子H的相互作用将受到削弱。在这种情况下,突变也将赋予对其它的因子H的抑制活性的抗性,也就是说:-(ⅰ)与结合C3b(或C3i)的因子B竞争,以及(ⅱ)加速C3bBb与C3bBbP转化酶的解离。DV-1B突变具有直接或者间接地与因子H保持亲和性相关的修饰残基。相同残基的许多不同的突变将可能具有类似的作用,并且仅仅在这里修饰的一些残基的突变以及其它具有一级结构片段的残基也可能实现这样的作用。实施例14.残基1152-1155的突变1.概论
如上述实施例所描述的,也将残基1152、1153和1155确定为对C3-特异性功能来说十分重要的候补者。突变证实这些残基的修饰可以用来赋予对因子H的抗性。2.方法2.1突变体DV-6的构建和分析
所利用的方法如前面实施例所描述的,除了诱导引物具有编码突变体Q1152R、E1153K和K1155F的序列atctcgctgcgcaaggctttcgatatttgcgag外。分离的质粒DNA的序列分析证实已经引入正确的突变。没有检测到其它突变。3.突变体DV-1B的性质
图11显示由DV-6突变所表达的产物的分析。注意的是:
(ⅰ)如上述实施例所描述的,利用C3的多克隆抗体对蛋白质印迹进行显影以强烈地检测前体、α、α′、β、43和46kDa的片段,但是仅仅微弱地检测77和68kDa的片段。注意不能将α和α′进行转化以及100%的效率检测,于是这些区带的强度比所预料的更少并且对存在的实际量缺乏指导。
(ⅱ)用CVFBb切割野生型C3将从C3b产生少量的α′链,但是由于68kDa片段通过内源性因子H和I活性(泳道B3)将C3b切割为iC3b,更大的量将丢失。虽然少量的46 kDa的中间体是可见的,但是它通常作为43 kDa片段出现。添加2μg/ml外源性H与因子I将导致进一步标记的切割和10-50μg/ml外源H(泳道B5,B6)完成C3b转化成不充分切开(没有α′和46kDa的区带)的iC3b。由CVFBb切割DV-6产物也将产生少量的α链(泳道C3)。明显地,在缺少因子H和I的情况下所产生的43kDa链的总量比在野生型中更少,并且46kDa的中间体片段的出现更多,这表明是更无效的切割。当46kDa的中间体仍然明显时,添加外源H和I(泳道C4-6)将实现这种C3b转化成iC3b,然而,通过10μg/ml的H将除去野生型的46kDa的中间体(泳道B5),这表明完全切割,这种物种仍然在这一浓度下保持H的突变体,并且完全切割仅仅利用50μg/ml的H时才明显。因此,虽然通过高浓度的外源添加的H和I对切割的敏感性不完全表明抗性,但是突变体C3b对内源性和外源性H和I比野生型更具有抗性。4.结论
DV-6突变产生对因子I的因子H-依赖性切割的抗性。该机理不能确定,虽然因为修饰的残基(一级结构)离因子I的切割位点很远,但是很有可能它与因子H的相互作用将受到削弱。在这种情况下,突变也将赋予对其它的因子H的抑制活性的抗性,也就是说:-(ⅰ)与结合C3b(或C3i)的因子B竞争,以及(ⅱ)加速C3bBb与C3bBbP转化酶的解离。DV-6突变具有直接或者间接地与因子H保持亲和性相关的修饰残基。相同残基的许多不同的突变将可能具有类似的作用,并且仅仅在这里修饰的一些残基的突变以及其它具有一级结构片段的残基也可能实现这样的作用。
实施例15.残基1546-1663的改变1.概论
表1:对因子H敏感的突变作用的总结 | ||
突变 | 氨基酸改变 | 因子I的H-依赖性切割的抑制 |
CV-2 | E776K | - |
CV-1 | P963K,P964A,A965R,D966K | - |
DV-1AM | E992S,D993A,D996S,D997S,A997Q,E998S,R999G,L1000M | ++ |
DV-1B | K1001N,H1002I,V1005H | + |
DV-3 | T1031G,E1032N,Q1033H,E1035N,K1036I | - |
DV-4 | V1070K,K1071G,R1072G,A1073S,P1074A | - |
CV-5 | R1134Q | - |
DV-6 | Q1152R,E1153K,K1155F | + |
DV-7N | D1174N | - |
DV-9 | D1216G,K1217E,N1218D,R1219H | - |
CV-4 | R1260N,G1264E | - |
RY-1 | R1427Q,K1431D,E1433Q | - |
图解:-,没有检测到抑制;+,小抑制;++,较大的抑制作用 |
不同于以前的实施例(12-14),残基1546-1663的修饰不是以考虑在C3和相关蛋白质之间的序列比较为基础。代替偶然产生所描述的修饰,一种非故意核苷酸缺失的结果将导致在C端残基翻译中移码。形成的产物显示对因子I的因子H-依赖性切割非常大的抗性。因此,通过设计所产生的类似的修饰很有可能对于赋予因子H和/或因子I调节活性的抗性来说是有用的。2.方法
将一个NC3的载体等效物(但是携带3151g、3152g、3154a、3156c、3159c、3163a、3165t、3167t、3168t的附加突变)翻译成氨基酸改变T1031G、E1032N、Q1033H、E1035N和R1036I,将其用限制性酶PvuⅠ(切开载体序列)和BsrGⅠ(在核苷酸4692上切开)消化,并且通过琼脂糖凝胶电泳分离6.1 kb区带。将另一个NC3的载体等效物同样地用PvuⅠ和BsrGⅠ和分离的4.4 kb片段进行消化,但是为了在C-末端编码氨基酸HHHHHH的插入物,它在核苷酸5049后携带catcatcatcatcatcat的插入物。将这两条DNA片段结合在一起,并且分离一个完全的质粒。DNA测序发现单核苷酸(4696或4697)已经丢失。所预料的序列在读框中不能翻译氨基酸1546-1663的序列。直到达到终止密码子时,将读出正常框的48个残基。
将产物“HDV-3X”在COS细胞中表达,并且如前面的实施例所描述的进行检验。3.突变体HDV-3X的性质
图12显示HDV-3X突变表达产物的分析。注意的是:
(ⅰ)利用C3的C3dg区域的单克隆抗体对蛋白质印迹进行显影以检测前体、α、α′、77和68kDa的片段,但是不检测β、43或46kDa的片段。
(ⅱ)将HDV-3X与突变体DV-3(如没有附加C-末端修饰的等同产物)相比较。HDV-3X显示一条更小的α链,但是正常大小的68 kDa和77kDa的产物与在C-末端的平截相一致。
(ⅲ)在因子I存在下利用CVFBb的DV-3 C3的切割将从C3b产生一些α链,但是更大量的68kDa片段将导致C3b依赖性内源性因子H切割成iC3b(泳道A2)。外源H的添加完成C3b转化为iC3b(泳道A3-5)。实际上,仅仅用1μg/ml因子H完成转化(泳道A3)。相反,由CVFBb切割HDV-3X产物将产生更大量的α链和仅仅少量的68 kDa片段(泳道B2)。在这种C3b转化为iC3b中,添加外源H是无效的(泳道B3-5)。即使用25μg/ml的H,仅仅轻微的68kDa和77kDa产物的形成也是可检测的(泳道A5)。因此,HDV-3X C3b比野生型对内源性H和I具有更多的抗性。更高量的因子H部分地克服抗性,这个事实表明可以大大地减少因子H的亲和性。4.结论
HDV-3X修饰产生对因子I的因子H-依赖性切割的抗性。该机理不能确定,虽然因为修饰的残基(一级结构)离因子I的切割位点远,但是很有可能它与因子H的相互作用将受到削弱。在这种情况下,突变也将赋予对其它的因子H的抑制活性的抗性,也就是说:-(Ⅰ)与结合C3b(或C3i)的因子B竞争,以及(ⅱ)加速C3bBb与C3bBbP转化酶的解离。DV-lAM突变具有直接或者间接地与因子H保持亲和性相关的修饰残基。相同残基的许多不同的缺失或突变将可能具有类似的作用,并且仅仅在这里修饰的一些残基的缺失或突变以及其它具有一级结构片段的残基也可能实现这样的作用。
通过设计不产生HDV-3X修饰。但是,选择这种和相关修饰的方法很有可能是特异性定点诱变的方法,包括前面的实施例所描述的那些方法。实施例16.修饰残基954和955以抑制在这一位点上因子I介导的切割1.概论
在以前的P1残基(1303和1320)预诱变在前两个位点提供由因子I切割的抗性(实施例1-6)。不知道在这两个位点上切割的抑制是否也将在对C3c从C3dg释放起作用的第三位点上抑制切割。这第三种切割通常依赖CR1(一种设计成可溶性形式的膜结合受体,sCRl)作为辅因子,它相对较慢,并且以前仅仅在iC3b(或者iC3i)(即在位点1和2切割之后)而没有在C3i或者C3b上观察到。为了检验这一点,利用E1Q2突变体(如实施例11所描述的),它在位点1和2上具有对切割的高抗性。如果这一突变体在位点3对切割仍然敏感,那么将表明在生理液中将这一位点突变以抑制分子的降解,这将是满足需要的。然而,这将与文献中报道的关于是否只在954-955键发生切割(Davis,A.E.3d.Harrison,R.A.和Lachmann,P.J.,1984,免疫学杂志132:1960-6),或者是否也可以在其它位置发生切割相冲突,如959-960(Harrison,RA.等,1996,分子免疫学,Suppl.1,59,摘要235;Ekdahl,K.N.,Nilsson,U.R.和Nilsson,B.,1990,免疫学杂志144:4269-74)。最初,我们将残基954由精氨酸向谷氨酸突变以生产E1Q2E3,因为(ⅰ)这从上文的公开看出是一种切割位点的P1残基,以及(ⅱ)从实施例的位点1,其中突变成谷氨酸将赋予比其它取代更高的切割抗性。此外,其它哺乳动物物种(小鼠、大鼠、豚鼠、兔)的C3在与954和955相同的残基上具有谷氨酰胺和甘氨酸代替人类C3的精氨酸与谷氨酸(例如Mavroidis,M.,Sunyer,J.O.和Lambris,J.D.,1995,免疫学杂志154:2164-2174)。这些数据表明这一位点(954-955)在其它物种中不能充分地切开,并且表明其它位点(如959-960)可能更重要(Harrison,RA.,等,1996,分子免疫学33,Suppl.1,59,摘要235)。因此,arg954向Gln以及Glu955向Gly的等同的突变使得人类C3成为EIQ2QG3突变体。2.方法
除了E1Q2E3突变体的诱变引物具有编码突变R954E的序列gaacgcctgggcgaagaaggagtgcag,以及E1Q2QG3突变体的诱变引物具有编码突变R954Q和E955G的序列aacgcctgggccaaggaggagtgcagaa外,利用如前面的实施例所描述的用于突变体构建的方法。将产物连接到包含编码E1Q2(E1303、Q1320,如实施例5和11所描述的)的突变的构建体中,分离质粒DNA的序列分析确认已引入正确的突变。没有检测到其它突变。将形成的表达载体转染进COS细胞中,并且如以前描述的,分析分泌的表达产物的切割反应。3.E1Q2、E1Q2E3和E1Q2G3突变体的因子I-介导的切割
图13显示所表达的产物的分析。注意的是:
(ⅰ)将蛋白质印迹用单克隆抗体对C3的C3dg区域进行显影,该蛋白质印迹用于检测前体、α、α′、77和68kDa片段,但不能检测β、43或46kDa片段。此外,检测出在位点3的切割的86kDa产物,没有检测在位点1或者2的切割。
(ⅱ)该图显示在sCR1的存在下通过E1Q2的因子I-介导的切割确实形成86 kDa产物(泳道A3),但是当H因子是辅因子时不能形成(泳道A2)。
(ⅲ)在E1Q2E3(C)或者E1Q2QG3(B)突变体中不形成86kDa产物,即使sCRl(C3和B3)存在。4.结论
(ⅰ)当已阻断位点1和2的切割时,在位点3可能仍然产生因子I-介导的切割。因此,当用于生理环境时在位点3的切割的附加阻断对于抑制任何突变体产物的降解是必需的,另外,这种产物仅仅在位点1和2具有抗性。
(ⅱ)位点3的切割可以通过残基954向Glu突变,以及通过954和955向Gln和Gly突变进行阻断。因此,残基954和/或955的其它突变也可能赋予位点切割抗性。
(ⅲ)所显示的突变不允许在第三位点(如959-960)切割的其它推定的位置切割,尽管这些位点没有突变。这将表明954-955是唯一重要的切割位点,或者其它切割要求在954-955进行预切割,或者这些残基的突变在任何情况下通过不同的机理(如构象扭变)在其它位置抑制切割。在任何情况下,954和/或955的突变是抑制C3b或C3i-样产物的降解的有效手段。实施例17.修饰C3羧基端区以抑制因子I的切割1.概论
实施例15提供证据表明,残基1546-1663的突变或者缺失赋予对因子I切割的抗性。本实施例进一步提供更小的规模的也赋予这种抗性的突变体,该突变体不进行各种突变。2.方法
除诱变引物具有表Ⅲ显示的编码所表示的突变的序列外,利用如前面实施例所描述的用于突变体构建所使用的方法。分离质粒DNA的序列分析已证实引入正确的突变。没有检测其它突变。将形成的表达载体转染进COS细胞中,并且如上所述分析分泌表达产物的切割反应。3.各种突变体对因子I切割的抗性
图14和15显示因子I和H对这些突变体进行切割分析的结果。注意将用单克隆抗体对C3的C3dg区域的蛋白质印迹进行显影以检测前体、α、α′、77和68kDa片段,但不检测β、43和46kDa片段。图14显示由因子切割的野生型(NC3,A)、FT-4(E)和FT-5(F)产物,如通过77kDa和/或78kDa区带的出现和α链的消失所表明的。相反,没有切开FT-1和FT-2。
图15显示当FT-2产物再次切开时,将切开野生型(NC3,A)、FR-1(B)、FR-2(C)、FR-3(D)和FR-4(E)产物。4.结论
(ⅰ)即使FT-2小的截短也足以赋予对因子I切割的抗性。因此,该抗性可以通过一些或所有残基1636-1663的缺失而获得。FT-1显示的抗性支持这一结论,这包括残基1636-1663的缺失,以及附加的残基1591-1635的缺失/修饰。
(ⅱ)由于因子I-介导的切割需要残基1636-1663,所以这些残基的许多其它修饰很可能产生抗性。
(ⅲ)并非所有的这些残基的修饰都赋予抗性。低效的修饰包括由FT-5、FR-1、FR-2、FR-3和FR-4所定义的那些,以及由FT-3和FT-4所定义的修饰(修饰除1636-1663残基外的残基)。
(ⅳ)这些数据意味着切割所需的在1636-1663之内的残基是没有由FT-5、FR-1、FR-2、FR-3和FR-4所修饰的那些残基。因此,1649-1660中的一些可能是关键性的。
表Ⅲ:实施例17所使用的突变体 | ||||
突变体 | 诱变引物的序列 | 取代的序列 | 残基 | 取代基 |
FT-1 | REA | 1591-1593 | TN终止 | |
FT-2 | E | 1636 | 终止 | |
FT-3 | LSSDFWGE | 1607-1614 | KEALQI | |
FT-4 | IIGKD | 1621-1625 | RYIYPLDSL | |
FT-5 | C | 1661 | S | |
FR-1 | EEDE | 1633-1636 | RDTT | |
FR-2 | QDEENQKQ | 1638-1645 | SS | |
FR-3 | QDEENQKQ | 1638-1645 | RSTRQRAA | |
FR-4 | D | 1648 | AFLAN |
参考文献
1.Bergmann,M.和Fruton,J.S.(1941)高级酶学1:63-98。
2.Bruijn,M.H.和Fey,G.H.(1985),美国国家科学院院报82:708-712。
3.Crawford-MH等(1988)循环78:1449-58。
4.Daha,M.R和van Es,L.A.(1982)免疫学43:33-38。
5.Farries,TC;Lachmann,PJ和Harrison,RA(1988)生物化学杂志252:47-54。
6.Farries,TC;Lachmann,PJ和Harrison,RA(1988)生物化学杂志253:667-75。
7.Forty,J;Hasan,R;Cary,N;White,DJ和Wallwork,J(1992)移植汇编24:488-9。
8.Fritzinger,D.C.等(1992)免疫学杂志149:3554-3562。
9.Harrison,R.A.和Lactrmann,P.J.(1980)分子免疫学17:9-20。
10.Kalli,K.R.,Hsu,P.和Fearon,D.T.(1994)Springer Semin.免疫病理学15:417-431。
11.Kinoshita,T;Takata,Y;Kozono,H;Takeda,I;Hong,KS和Inoue,K(1988)免疫学杂志141:3895-901。
12.McNearney,TA;Odell,C;Holers,VM;Spear,PG;Atkinson,JP(1987)实验医学杂志166:1525-35。
13.Nicol,P.A.E.和Lachmann,P.J.(1973)免疫学24:259-275。
14.Pancrburn,MK和Muller-Eberhard,HJ(1984)Springer Semin.免疫病理学7:163-92。
15.Rother,K和Till,G.O.(eds)(1988)″补体系统″(Springer-Verlag柏林Heidelberg,德国)。
16.van den Berg,C.W.,Aerts,P.C.和van Dijk,H.(1991)免疫学方法杂志136:287-294。
17.Voael,CW;Smith,CA和Muller-Eberhard,HJ(1984)免疫学杂志133:3235-41。
18.Weisnan,HF等(1990)科学249:146-51。
19.Wu,R.(ed.)(1993)酶学方法:ch.s12-14(学院出版社),San Diego,美国。
20.Botto,M,Fong,K.Y.,So,A.K.,Koch,C.和Walport,M.J.(1990)实验医学杂志172:1011-7。
21.Sambrook,J.,Fritscb,E.F.和Maniatis,T.(1989)"分子克隆,实验室手册″第二版(冷泉港实验室出版社)。
22.Fishelson,Z.(1991)分子免疫学28:545-52。
23.Taniguchi-Sidle,A和Isenman,D.E.(1993)分子免疫学30:54。
24.Lambris,J.D.,Avila,D.,Becherer,J.D.和Muller,Eberhard,H.J.(1988)生物化学杂志263:12147-50。
25.Taniguchi-Sidle,A和Isenman,D.E.(1992)生物化学杂志267:635-643。
26.Hofer,B.和Kuhlein,B.(1993)酶学方法217:173-189。
27.Morinaga,Y.,Franceschini,T.,Inouye,S.和Inouye,M.(1984)生物工程2:636-639。
28.Harrlson,RA.和Lachmann,P.J.(1986)“实验免疫学手册”(edsWeir,Herzenberg,Blackwell和Herzenberg;Blackwell,牛津大学出版社)第四版。
29.Kotwal,G.,J.,和Moss,B.,自然(1988)335(6186)176-8。
Claims (50)
1.一种天然补体途径蛋白质,该蛋白质被修饰得能够形成负调节抗性C3转化酶。
2.如权利要求1所要求的蛋白质,该蛋白质是一种修饰的人类蛋白质。
3.如权利要求1或权利要求2所要求的蛋白质,该蛋白质比天然蛋白质对因子I的切割具有更强的抗性。
4.如权利要求1到3之任一所要求的蛋白质,该蛋白质是一种修饰的C3蛋白质。
5.如权利要求4所要求的蛋白质,其中所说的蛋白质是通过用其它氨基酸取代Arg-1303,Arg-1320之一或两者修饰的。
6.如权利要求5所要求的蛋白质,其中Arg-1303,Arg-1320或者两者由谷氨酰胺,酪氨酸,胱氨酸,色氨酸,谷氨酸或甘氨酸取代。
7.如权利要求6所要求的蛋白质,其中Arg-1320由谷氨酰胺取代。
8.如权利要求6或7所要求的蛋白质,其中Arg-1303由谷氨酸,甘氨酸和谷氨酰胺取代。
9.按照前面权利要求之任一的蛋白质,相对于天然人类C3而言,该蛋白质具有对因子H和/或因子I的降低的敏感性,相对于天然人类C3而言,所说的蛋白质在天然人类C3的相应于氨基残基752-754和/或残基758-780的区域中具有一个或多个氨基酸改变。
10.按照权利要求9的蛋白质,其中所说的一个或多个氨基酸改变是从酸性氨基酸残基向中性氨基酸残基改变。
11.按照权利要求9或权利要求10的蛋白质,其中所说的氨基酸残基改变是从Asp-Glu-Asp向Gly-Ser-Gly改变。
12.按照前面权利要求之任一的蛋白质,相对于天然人类C3而言,该蛋白质在天然人类C3的相应于残基1427,1431和/或1433的氨基酸残基上具有氨基酸改变。
13.按照前面权利要求之任一的蛋白质,该蛋白质包含一个或多个与人类C3氨基酸残基992-1005(EDAVDAERLKHLIV)相关的突变,其使得C3b和C3i产物或者它们衍生的C3转化酶对因子H的补体抑制活性有抗性。
14.按照权利要求13的蛋白质,其中该蛋白质包含一个或多个与人类C3氨基酸残基992(E),993(D),996(D),997(A),998(E),999(R),1000(L),1001(K),1002(H),1005(V)相关的突变。
15.按照权利要求14的蛋白质,其中该蛋白质包含突变E992S、D993A、D996S、A997Q、E998S、R999G、L1000M、K1001N、H1002I和V1005H的一个或多个。
16.按照前面权利要求之任一的蛋白质,该蛋白质包含一个或多个与人类C3氨基酸残基1152-1155(QEAK)相关的突变,其使得C3b和C3i产物或者它们衍生的C3转化酶对因子H的补体抑制活性有抗性。
17.按照权利要求16的蛋白质,该蛋白质包含一个或多个与C3的氨基酸残基1152(Q)、1153(E)和1155(K)相关的突变。
18.按照权利要求17的蛋白质,该蛋白质包含突变Q1152R、E1153K和K1155F的一个或多个。
19.按照权利要求13到18之任一的蛋白质,该蛋白质对CR1、MCP和/或DAF的补体抑制活性有抗性。
20.按照前面权利要求之任一的蛋白质,该蛋白质具有与天然人类C3的氨基酸1546-1663相关的一个或多个氨基酸缺失、取代或者插入;其中所说的蛋白质相对于天然人类C3而言,具有对因子H和/或因子I的降低的敏感性。
21.按照权利要求20的蛋白质,该蛋白质包含与天然人类C3氨基酸1546-1663相关的一个或多个氨基酸缺失。
22.按照权利要求20或21的蛋白质,该蛋白质包含相应于天然人类C3的氨基酸1546-1663所有氨基酸的缺失。
23.按照权利要求20的蛋白质,相对于天然人类C3而言,该蛋白质在与天然人类C3的氨基酸残基1546-1663对应的区域包含一个或多个不同的氨基酸。
24.按照权利要求23的蛋白质,其中在与天然人类C3的氨基酸残基1546-1663对应的区域上的氨基酸在编码所说的天然人类C3的DNA上可以产生移码突变。
25.按照权利要求20到24之任一的蛋白质,该蛋白质具有与天然人类C3氨基酸1636-1663相关的一个或多个氨基酸缺失、取代或者插入;其中所说的蛋白质相对于天然人类C3而言,具有对因子H和/或因子I的降低的敏感性。
26.按照权利要求25的蛋白质,该蛋白质包含与天然人类C3的氨基酸1636-1663相关的一个或多个氨基酸缺失。
27.按照权利要求25或26的蛋白质,该蛋白质包含与天然C3的氨基酸1636-1663对应的所有氨基酸的缺失。
28.按照权利要求25的蛋白质,相对于天然人类C3而言,该蛋白质在与天然人类C3氨基酸残基1636-1663对应的区域包含一个或多个不同的氨基酸。
29.按照权利要求25的蛋白质,该蛋白质包含一个或多个与天然人类C3的氨基酸1636-1663相关的氨基酸缺失、取代或者插入;其中所说的蛋白质相对于天然人类C3而言,具有对因子H和/或因子I的降低的敏感性。
30.按照前面权利要求之任一的蛋白质,该蛋白质具有与天然人类C3的氨基酸残基954和/或955相关的一个或多个氨基酸缺失、取代或者插入,并且具有对辅因子(例如CR1或者因子H)依赖性H因子I-介导的在这一位置的切割的降低的敏感性。
31.按照权利要求30的蛋白质,其中对应人类C3的残基954位置上的氨基酸残基不同于人类C3的残基954,该蛋白质具有对辅因子(例如CR1或者因子H)依赖性H因子I-介导的在所说位置的切割的降低的敏感性。
32.按照权利要求31的蛋白质,其中所说的氨基酸残基是谷氨酸,并且其具有对辅因子(例如CR1或者因子H)依赖性H因子I-介导的在所说位置的切割的降低的敏感性。
33.按照权利要求30的蛋白质,其中在对应人类C3残基954和残基955的位置上的氨基酸残基分另是谷氨酰胺和甘氨酸,该蛋白质具有对辅因子(例如CR1或者因子H)依赖性H因子I-介导的在所说位置的切割的降低的敏感性。
34.按照权利要求30的蛋白质,其中在对应人类C3残基955位置上的氨基酸残基不同于人类C3的残基955,该蛋白质具有对辅因子(例如CR1或者因子H)依赖性H因子I-介导的在所说位置的切割的降低的敏感性。
35.一种按照前面权利要求之任一的蛋白质的片段或变体,所说的片段或变体具有C3转化酶活性,并且也对因子H、因子I、CR1、MCP和/或DAF的补体抑制活性有抗性。
36.一种DNA序列,该序列编码如权利要求1到34之任一所要求的蛋白质或如权利要求35所要求的片段或变体。
37.一种DNA构建体(例如载体),该构建体包含权利要求36所限定的DNA序列。
38.一种用于治疗的如权利要求1到34之任一所限定的蛋白质或如权利要求35所要求的片段或变体。
39.一种缀合物,该缀合物包含与特异性结合部分连接的如权利要求1到34之任一所要求的蛋白质或如权利要求35所要求的片段或变体。
40.如权利要求39所要求的缀合物,其中所说的特异性结合部分是特异性结合蛋白质。
41.如权利要求39所要求的缀合物,其中所说的特异性结合部分是抗体或者其抗原结合片段。
42.如权利要求1到34之任一所限定的蛋白质或者如权利要求35所限定的片段或变体或者如权利要求39到41之任一所限定的缀合物在制造用于减少补体途径蛋白质水平之药物上的用途。
43.如权利要求42所要求的用途,其中所说的药物用于预防异物排斥。
44.如权利要求42所要求的用途,其中所说的药物用于在特定位点上定位和/或扩增内源性补体蛋白质转变和沉积。
45.一种药物制剂,该制剂包含如权利要求1到34之任一所限定的一种或多种蛋白质,或者如权利要求35所限定的一种片段或变体,或者如权利要求39所限定的一种缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
46.如权利要求45所要求的药物制剂,该制剂用于减少补体途径蛋白质水平。
47.如权利要求45所要求的药物制剂,该制剂用于预防异物排斥。
48.如权利要求45所要求的药物制剂,该制剂用于在特定位点上定位和/或扩增补体蛋白质转化和沉积。
49.一种在哺乳动物中减少补体途径蛋白质的方法,该方法包含对哺乳动物施用如权利要求1到34之任一所限定的蛋白质,或者权利要求35所限定的片段或变体,或者权利要求39到41之任一所限定的缀合物。
50.如权利要求49所要求的方法,其中施用权利要求45所限定的药物制剂。
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9604865.7A GB9604865D0 (en) | 1996-03-07 | 1996-03-07 | Modified proteins |
GB9604865.7 | 1996-03-07 | ||
GB9611896.3 | 1996-06-07 | ||
GBGB9611896.3A GB9611896D0 (en) | 1996-06-07 | 1996-06-07 | Modified proteins |
GB9614293.0 | 1996-07-08 | ||
GBGB9614293.0A GB9614293D0 (en) | 1996-07-08 | 1996-07-08 | Modified proteins |
GB9624028.8 | 1996-11-19 | ||
GBGB9624028.8A GB9624028D0 (en) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | Modified proteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1214733A true CN1214733A (zh) | 1999-04-21 |
CN1227359C CN1227359C (zh) | 2005-11-16 |
Family
ID=27451421
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB971933189A Expired - Fee Related CN1227359C (zh) | 1996-03-07 | 1997-03-04 | 负调节抗性c3转化酶 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6268485B1 (zh) |
EP (1) | EP0885301A1 (zh) |
JP (1) | JP2000515001A (zh) |
KR (1) | KR19990087571A (zh) |
CN (1) | CN1227359C (zh) |
AR (1) | AR006150A1 (zh) |
AU (1) | AU726187B2 (zh) |
BR (1) | BR9708005A (zh) |
CA (1) | CA2247615A1 (zh) |
CZ (1) | CZ283598A3 (zh) |
HU (1) | HUP9900789A3 (zh) |
IL (1) | IL125862A0 (zh) |
NO (1) | NO984073L (zh) |
NZ (1) | NZ331595A (zh) |
PL (1) | PL328706A1 (zh) |
SK (1) | SK121798A3 (zh) |
TR (1) | TR199801769T2 (zh) |
WO (1) | WO1997032981A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101809034B (zh) * | 2007-06-07 | 2015-07-08 | 健泰科生物技术公司 | C3b抗体及用于预防和治疗补体相关病症的方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040023874A1 (en) * | 2002-03-15 | 2004-02-05 | Burgess Catherine E. | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
US6756476B2 (en) * | 2001-04-30 | 2004-06-29 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2021 daltons |
US6998243B2 (en) * | 2001-04-30 | 2006-02-14 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1793 daltons |
US7314717B2 (en) * | 2001-04-30 | 2008-01-01 | Nanogen Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1562 daltons |
GB0204154D0 (en) * | 2002-02-22 | 2002-04-10 | Adprotech Ltd | Cat immunisation vectors |
US20110159018A1 (en) * | 2007-05-03 | 2011-06-30 | Medizinische Universitat Innsbruck | Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs |
RU2549468C2 (ru) * | 2013-08-09 | 2015-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИНФ им. П.К. Анохина" РАМН") | Способ определения стабилизации с3-конвертазы классического пути активации комплемента человека |
US11903996B2 (en) * | 2015-10-07 | 2024-02-20 | David C. Fritzinger | Modulators of complement function |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4661347A (en) * | 1982-11-12 | 1987-04-28 | Scripps Clinic | Cytotoxic compositions |
ES2224133T3 (es) | 1994-09-08 | 2005-03-01 | Imutran Limited | Proteinas c3 humanas modificadas. |
-
1997
- 1997-03-04 NZ NZ331595A patent/NZ331595A/en unknown
- 1997-03-04 JP JP09531570A patent/JP2000515001A/ja not_active Ceased
- 1997-03-04 US US09/142,334 patent/US6268485B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-04 CZ CZ982835A patent/CZ283598A3/cs unknown
- 1997-03-04 EP EP97905334A patent/EP0885301A1/en not_active Withdrawn
- 1997-03-04 BR BR9708005-5A patent/BR9708005A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-03-04 AU AU22257/97A patent/AU726187B2/en not_active Ceased
- 1997-03-04 SK SK1217-98A patent/SK121798A3/sk unknown
- 1997-03-04 CN CNB971933189A patent/CN1227359C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-04 KR KR1019980707010A patent/KR19990087571A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-03-04 IL IL12586297A patent/IL125862A0/xx unknown
- 1997-03-04 WO PCT/GB1997/000603 patent/WO1997032981A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-03-04 CA CA002247615A patent/CA2247615A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-04 PL PL97328706A patent/PL328706A1/xx unknown
- 1997-03-04 HU HU9900789A patent/HUP9900789A3/hu unknown
- 1997-03-04 TR TR1998/01769T patent/TR199801769T2/xx unknown
- 1997-03-07 AR ARP970100921A patent/AR006150A1/es unknown
-
1998
- 1998-09-04 NO NO984073A patent/NO984073L/no not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-06-06 US US09/875,519 patent/US7002001B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101809034B (zh) * | 2007-06-07 | 2015-07-08 | 健泰科生物技术公司 | C3b抗体及用于预防和治疗补体相关病症的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20020068059A1 (en) | 2002-06-06 |
WO1997032981A1 (en) | 1997-09-12 |
IL125862A0 (en) | 1999-04-11 |
US6268485B1 (en) | 2001-07-31 |
KR19990087571A (ko) | 1999-12-27 |
TR199801769T2 (xx) | 1998-11-23 |
NO984073D0 (no) | 1998-09-04 |
EP0885301A1 (en) | 1998-12-23 |
HUP9900789A3 (en) | 2001-10-29 |
PL328706A1 (en) | 1999-02-15 |
AU2225797A (en) | 1997-09-22 |
CZ283598A3 (cs) | 1999-02-17 |
BR9708005A (pt) | 2000-01-04 |
US7002001B2 (en) | 2006-02-21 |
CA2247615A1 (en) | 1997-09-12 |
SK121798A3 (en) | 1999-04-13 |
AR006150A1 (es) | 1999-08-11 |
NO984073L (no) | 1998-11-02 |
CN1227359C (zh) | 2005-11-16 |
JP2000515001A (ja) | 2000-11-14 |
NZ331595A (en) | 2000-02-28 |
HUP9900789A2 (hu) | 1999-07-28 |
AU726187B2 (en) | 2000-11-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1104501C (zh) | 修饰的人c3蛋白质 | |
CN1708512A (zh) | 嵌合mhc蛋白及其寡聚物 | |
CN1110323A (zh) | 新多肽和编码它们的脱氧核糖核酸 | |
CN1136778A (zh) | 与一种精子区带结合蛋白的自身抗原性抗原决定基相对应的精子抗原 | |
CN1433466A (zh) | Masp-3,一种固定补体的酶,及其应用 | |
CN1214733A (zh) | 负调节抗性c3转化酶 | |
CN1526072A (zh) | 埃-巴二氏病毒(ebv)肿瘤相关潜伏膜蛋白的胞外结构域的鉴定方法和与之反应的抗体试剂的选择方法 | |
CN1452634A (zh) | Hla结合肽及其用途 | |
CN1039441A (zh) | 毒蛇毒液多肽及基因表达 | |
CN1197876C (zh) | 含有分子内伴侣样序列的嵌合蛋白及其在胰岛素生产中的应用 | |
CN1688607A (zh) | 包含支架,佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途 | |
CN1324404A (zh) | 新型肿瘤抗原蛋白sart-3及其肿瘤抗原肽 | |
CN1745094A (zh) | 肽,其抗体,以及它们在中枢神经系统损伤的治疗中的用途 | |
CN1867588A (zh) | 包含c4bp核心蛋白质和单体抗原的产品及其用途 | |
CN1020923C (zh) | 利用dna重组技术生产抑制素的方法 | |
CN1257271C (zh) | 丝氨酸蛋白酶及其编码序列 | |
CN1616491A (zh) | 具有防治流感作用的融合蛋白及其编码基因与应用 | |
CN1267727A (zh) | 一种新的人丙酮酸脱氢酶磷酸化酶蛋白及其编码序列 | |
CN1876684A (zh) | 一系列可阻断il-6的创新多肽及其医疗应用 | |
CN1948490A (zh) | 人hRAB-14基因序列、其编码蛋白及制备方法 | |
CN1271007A (zh) | 一种新的人几丁质酶蛋白及其编码序列 | |
CN1272540A (zh) | 一种人免疫因子相关蛋白及其编码序列 | |
CN1721528A (zh) | 新型人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物,其编码序列及用途 | |
CN1271011A (zh) | 一种新的人磷酸三酯酶相关蛋白及其编码序列 | |
CN1278006A (zh) | 一种人g蛋白偶联的受体蛋白异构体及其编码序列 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20051116 Termination date: 20100304 |