CN1688607A - 包含支架,佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产物，其包括：第一组分，其为支架；第二组分，其为佐剂，优选为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和第三组分，其为抗原。

Description

包含支架，佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途
技术领域
本发明涉及大分子聚集体(macromolecular assembly)诸如融合蛋白等，其包括佐剂和抗原，所述聚集体与单独的抗原相比可激发针对该抗原的增强的免疫反应。
背景技术
佐剂增强对抗原的免疫反应，并由此可用于疫苗中。然而，仅许可有限数量的佐剂用于人体，由于从动物研究中得知了更强的佐剂，明显地需要可安全用于人的更强的免疫佐剂。最近的综述见“Advances in vaccineadjuvants”(nature Biotechnology，1999，第17卷，1075-1081页)。任何可广泛应用于人的佐剂的重要特征是所述佐剂应非常安全，这一点在将它用于大量健康人的常规疾病预防时尤其重要。
补体系统由一系列血清蛋白组成，所述血清蛋白在免疫系统对外来抗原的应答中很重要。补体系统的初始组分(primary component)被切割时该系统被活化，且所得产物单独或与其它蛋白一起可活化其它补体蛋白，从而导致蛋白水解级联反应。所述补体系统的活化导致各种应答，包括血管通透性增加，对吞噬细胞的趋化作用，炎性细胞的活化，对外来颗粒的调理作用，直接杀死细胞以及组织损伤。
补体系统的活化可通过抗原-抗体复合物(经典途径)激发，或者正常的慢速活化可在诸如细菌或病毒等的入侵微生物的细胞壁存在的条件下扩大(旁路途径)。补体系统与细胞免疫系统通过涉及C3的具体途径而发生相互作用，所述C3为经典和旁路途径中的重要蛋白。C3的蛋白水解活化产生了大的片段(C3b)，并暴露了具有化学反应性的内部硫羟酸酯键，其可以与诸如入侵微生物或外源细胞的细胞表面蛋白等外部亲核物质共价结合。结果，所述潜在的抗原由C3b“标记”，并在C3b经过进一步蛋白水解变为iC3b和C3d，g的过程中保持与其相结合。后两种片段分别是补体受体CR3和CR2的配体；(CR2也称为CD21)。因此，C3b对抗原进行标记可导致对携带这些受体的免疫系统细胞的靶向机制。
这种靶向对于放大免疫应答的重要性首先通过实验显示，所述实验中，消耗小鼠的循环C3并随后用抗原(绵羊红细胞)进行攻击。去除C3可减轻抗体对该抗原的应答(M.B.Pepys，J.Exp.Med.，140,126-145，1974)。C3的作用通过动物研究证实，所述动物的C3或可产生C3b的补体级联反应上游组分(即C2和C4)是遗传缺陷的(J.M.Ahearn and D.T.Fearon，Adv.Immunol.，46，183-219，1989)。最近发现，与未修饰的抗原对照相比，模型抗原与两个以上拷贝的小鼠C3d片段序列的线性结合导致的小鼠体内抗体应答大大增强(1000-10000-倍)(P.W.Dempsey等，Science，271,348-350，1996；W096/17625，PCT/GB95/02851)。所述增强可不使用传统佐剂诸如Freud’s完全佐剂等而产生，所述佐剂对用于人体而言毒性太大。这一显著效应的机制被证实是多价C3d构建体与B细胞上的CR2的高亲和力结合，然后CR2与另一B细胞膜蛋白CD19以及膜结合的免疫球蛋白共-连接(co-ligation)，以对B细胞的细胞核发出信号。
然而，证明难以产生大量含有三个拷贝的C3d的同源重组蛋白。主要的问题是：
i)    含有(三个)重复序列的构建体的遗传不稳定性和
ii)   重组蛋白的折叠(或溶解和重折叠)，所述重组蛋白来自大肠杆菌中形成的包涵体。
最小化含有C3d基因重复拷贝的构建体的遗传不稳定性的一种方法描述于W099/35260和W001/77324中。这些应用中所述的技术是利用编码C3d重复的DNA的非-同一性序列。
WO00/69907和WO00/69886(所述文献的内容包含在本文中作为参考)描述了能够组装成多聚体形式的多肽单体。所述单体来自伴侣分子蛋白，具体是GroES或Cpn10家族的成员。
利用补体4结合蛋白(C4bp)的多聚化系统描述于WO 91/11461中。人C4b-结合蛋白(C4BP)是高分子量(570kDa)的血浆糖蛋白，其具有蜘蛛样结构(spider like structure)，所述结构由7条相同的α链和单个β链组成。所述C4bpα链具有负责将该分子组装成多聚体的C-末端核心区。根据标准模型，一个C4bp单体+498位的半胱氨酸与另一单体+510位的半胱氨酸形成二硫键。在人血浆中还发现了只包含7个α链的较小形式(minor form)。这种血浆糖蛋白的天然功能是抑制补体活化的经典途径。
WO91/11461提出C4bp蛋白的多聚化能力可以用来制备包含全部或部分C4bp和目的(interested)生物蛋白的融合蛋白。这个融合蛋白将形成多聚体，该多聚体为目的蛋白提供平台，其中所述蛋白有更长的血浆半衰期并且对其靶的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)更强。在WO91/11461中，C4bp融合蛋白成为治疗性产品的新的递送和载体系统的焦点。
C4bp的大多数α链由8个长度约为60个氨基酸的结构域串联排列组成，该结构称为补体控制蛋白(complement control protein)(CCP)重复。WO91/11461中描述的融合蛋白中，优选包含一个或多个这样的结构域。但是现已证实，所有的CCP都能缺失(只留下C-末端的57个氨基酸)，而不会抑制多聚化(Libyh M.T.等，(1997)Blood 90，3978)。C4bp的这个C-末端区域称为C4bp核心。
Libyh等(1997)描述了基于C4bpα链C-末端部分的蛋白多聚化系统。C4bp的C-末端部分缺乏生物功能，但是它负责使产生C4bp的CHO细胞胞浆中的C4bp发生多聚化。Libyh等能够用C4bp片段诱导相关抗体片段的自发多聚化，从而产生ScFv片段的同源多聚体。所用C4bp的C-末端部分被置于ScFv序列的C-末端，可选由MYC标记隔开(space)。
C4bp的用途还描述于Oudin等(2000，Journal of Immunology，164，1505)和Christiansen等(2000，Journal of Virology，74，4672)中。自我装配型多聚体可溶性CD4-C4bp融合蛋白在Shinya等(1999，Biomed & Pharmacother，53，471)中也已经得到了证实，所述融合蛋白可在人293细胞系中表达。
发明概述
本发明提供了包含以下组分的产物：
第一组分，其为支架；
第二组分，其为佐剂，优选是多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；知
第三组分，其为抗原。
第一组分提供了多拷贝的第二组分在多组分产物中的聚集，使得所述多拷贝的第二组分与一或多个拷贝的抗原结合。
在优选的方面，本发明提供了：
第一组分，其为多肽支架；
第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和
第三组分，其为抗原。
所述第一和第二组分可以是融合蛋白。当第三组分为多肽时，所述三组分作为融合蛋白存在。可选，所述第三组分与前两种组分的融合物共价连接。
一些情况下，当第一组分本身就是抗原时，所述第一和第三组分可以是同样的分子。
为了避免有疑问，“第一”，“第二”和“第三”组分的命名不表示或表明所述三种组分在产物中的具体线性顺序。所述三种组分可以以任何次序互相连接。
因此，当所有三种组分是多肽并且所述产物是融合蛋白时，这三种组分的N-到C-末端的顺序可以是任何排列方式。此外，如下所述，一些情况下，所述第一组分可包括环区，所述环区可以由第二和第三组分之一取代。
本发明的产物提供了免疫刺激性第二组分，所述第二组分用于形成多组分产物，并可利用重组DNA技术进行表达而无需利用具有串联重复序列的DNA序列。
本发明还提供了编码所述第一和第二组分的融合蛋白的核酸，且当第三组分为多肽时，所述核酸编码所有三种组分。本发明还提供了包含所述核酸的载体以及携带所述载体的宿主细胞。
另一实施方案中，本发明提供了制备产物的方法，其中所述产物包含：
第一组分，其为多肽支架；
第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和
第三组分，其为多肽抗原，
所述方法包括表达编码三种组分的融合蛋白的核酸，以及回收所述产物。
另一实施方案中，本发明提供了制备产物的方法，其中所述产物包含：
第一组分，其为多肽支架；
第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞、T细胞、滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和
第三组分，其为非-多肽抗原，
所述方法包括表达编码第一和第二组分的融合蛋白的核酸，将所述融合蛋白与第三组分连接，以及回收所述产物。
制备所述产物的方法可以在真核或原核细胞中进行。
本发明还提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的本发明的产物给药受体。
本发明还提供了本发明的产物在人或动物体的治疗方法，尤其是诱导免疫应答的方法中的用途。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的产物和可药用的载体或稀释剂。
附图说明
图1显示了C4bp核心蛋白的比对。
图2显示了表位-C3d-C4bp融合蛋白及C3d7(1)与CR2(已知为CD21)的结合相对于单体C3d和线性三聚体C3d即C3d3的比较。
图3图示了CR2结合实验的模式。
图4显示了C3d7(1)与CR2(CD21)的结合相对于单体C3d和线性三聚体C3d即C3d3的比较。
图5显示了C3d7(1)，(2)和(3)与CR2(CD21)的结合相对于单体C3d和线性三聚体C3d即C3d3的比较。
图6显示了C3d7(1)，C3d7(2)和C3d7(3)与Raji和Jurkat细胞结合的流式细胞分析。
发明内容
支架
支架指任何大分子聚集体，其能够作为连接第二和第三组分的支架。所述支架可以是蛋白、其它聚合分子(例如由糖组成)、原核或真核细胞壁、或者病毒。所述细胞壁或病毒或蛋白可以是不完整的，即缺乏通常存在于其所在生物体中的组分；本发明的重要特征是所述支架能够使一个以上的佐剂分子以及一个以上的抗原包含在单个聚集体中。
如本文具体描述的，涉及两种主要类型的支架。第一种是复合大分子产物，包括病毒或细胞，其上附着了多拷贝的第二组分，并在有利情况下还可附着第三组分，所述第二和第三组分可以是分离的或者是融合物。可选，所述支架与第二组分的比例为1∶1。当所述产物为融合蛋白时，第三组分与第二和第一组分的比例也为1∶1∶1。
细胞壁或病毒支架在本领域已知用于其它目的。已经描述了蛋白的表面展示，所述展示可以在原核细胞壁((Samuelson等，2002，J.Biotechnol96，129-154；Lang H.，2001，Nat.Biotechnol.，19，75-78)或真核细胞壁(Shusta E.V.等，1999，J.Mol.Biol.292,949-956)或病毒诸如细菌噬菌体(Sidhu S.S.，2001，Biomol.Eng.，18，57-63)上。本发明该方面的不同特征是细胞壁上展示的对象包括与抗原同时存在的一个以上拷贝的佐剂分子。所述抗原可直接与佐剂(诸如C3d等)融合，但无需这样。
因此在一个实施方案中，诸如细菌等细胞的表面，可作为支架。当所述佐剂与通常在该细菌表面表达的第二组分发生基因融合时，该佐剂的多个拷贝可展示在该细菌的表面。当所述细菌感染宿主时，上述结构可激发抗该细菌的、增强的免疫应答。所述抗原可以是细菌的细胞壁，或者分开但同时在该细菌表面表达的抗原。所述感染可以通过将修饰的细菌给药宿主而有目的地产生。所述细菌可在被杀死之后给药，或者以减毒活细菌的方式给药。
类似地，真核细胞也可用作所述支架。在这种情况下，展示所述佐剂的一个以上拷贝的细胞表面可用来激发对其它(正常或异常)细胞表面组分的免疫应答。
与W096/17625(PCT/GB95/02851)中所述的融合蛋白相反，在所述抗原和佐剂之间可根本无需共价连接，或者所述共价连接可以仅仅是间接的，可由支架介导。此外，W096/17625教导了单拷贝的C3d蛋白与抗原的融合降低了对该抗原的免疫应答。在本发明中，通过直接比较，所述佐剂的多个单(单体)拷贝的展示，或者单拷贝的所述抗原与单拷贝佐剂的融合(其中所述佐剂随后与支架融合)，均导致对所述抗原的免疫应答增强。
所述抗原可以是细胞壁本身或第二蛋白或糖蛋白。如果生物体的被膜(capsule)是保护性抗原(如肺炎球菌)，展示一个以上拷贝的佐剂将增强对所述被膜抗原的免疫应答。
对于病毒，所述抗原可以是病毒本身，因此病毒可同时作为抗原和支架。所述病毒的实例为乙肝病毒表面抗原。制备重组HBsAg疫苗的方法在美国专利4,769,238中描述。尽管重组HBsAg是非常成功的疫苗，仍存在大量“反应较差的(poor responder)”疫苗受体。将新的佐剂加入已有的疫苗使得对这种反应较差的受体的接种以及对长期携带病毒者的感染后接种成为可能。一种将佐剂加入该疫苗的方法是对佐剂蛋白(诸如并优选人C3d蛋白)的编码序列与编码226个氨基酸残基的蛋白(即乙肝病毒S蛋白)的基因的C末端进行基因融合。可在框内(in-frame)将佐剂的编码序列和上述美国专利4,769,238所述质粒中的S蛋白编码序列相连接，所述佐剂的编码序列最好具有在酵母中优选以高水平表达的密码子。所述S蛋白的序列可被修饰成包含已知为“逃跑突变体(escape mutants)”的变体序列(Cooreman M.P.等，2001，J.Biomed.Sci.8,237-247)，或者包含通常不存在于乙肝病毒疫苗中的抗原(Fomsgaard A.等1998，Scand.J.Immunol.，47,289-295)。如本文所述，含有C3d佐剂的修饰的疫苗可作为DNA给药以便获得免疫应答。
因此，在另一实施方案中，所述多肽支架本身可以是抗原。因此，乙肝病毒的表面抗原(其组装成寡聚物结构)可同时是本发明的第一和第三组分。如1956年首次提到的(FHC Crick，JD Watson，Nature，177,473)，病毒的有限核酸含量严重限制了病毒所编码氨基酸的数目。结果，所述蛋白外壳不能由大量不同蛋白分子构建。反之，所述病毒外壳必须由以规则方式排列的许多相同的小亚基构建。因此，大多数病毒能够同时作为本发明的第一和第三组分。
多肽支架为蛋白或其一部分，其功能为确定所述蛋白本身或者一组相关蛋白或其它分子的结构。因此，多肽支架在聚集时具有确定的三维结构，并且具有在所述结构内或所述结构上支持分子或多肽的能力。有利地，支架可呈现各种可行的几何结构，所述几何结构与所述支架的三维结构和/或所述多肽的插入位点有关。
另一实施方案中，所述支架可以作为佐剂，即第一和第二组分是相同的。作为佐剂的支架是C4bp核心蛋白或者C4bpα链的片段，其将在下文详述。
一个实施方案中，所述支架是cochaperonin Cpn10/HsplO支架。Cpn10是Cpn60/Cpn10chaperonin系统的普遍组分。Cpn10的实例包括人线粒体Cpn10，细菌GroES和噬菌体T4Gp31。Cpn10家族的其它成员是本领域技术人员已知的。
本发明还包含天然存在的支架的衍生物的用途。支架(包括Cpn10和Cpn60家族的支架)的衍生物包括其含有氨基酸缺失，添加或取代(尤其是取代Gp31中的Cys残基)的突变体，Cpn10或Cpn60家族不同成员融合形成的杂合子和/或环形的、完全突变的蛋白支架，所述衍生物保持本文所述的“寡聚化”性质。
多肽支架聚集形成多聚体产物。本发明中，所述多聚体产物可以是任何形状，并可包含任何数量的单独支架亚基。
优选，所述多聚体产物包含2-20个支架单位，有利地为5-15个单位，并理想为约10个单位。Cpn10家族成员的支架包含7个蛋白单位，其形状为七元环或环带(annulus)。因此有利地，所述多聚体产物是七元环。
已知Cpn10亚基的结构内具有“可动环(mobile loop)”。所述可动环位于大肠杆菌GroES序列的氨基酸15和34之间，优选位于氨基酸16-33之间，以及Cpn10家族其它成员的等同位置上。T4Gp31的可动环位于残基22-45之间，有利地位于残基23-44之间。第二或第三组分的多肽序列可通过置换Cpn10家族多肽的可动环的全部或部分而被插入。
当所述多肽支架是Cpn10家族多肽时，第二或第三组分多肽还可掺入其N或C末端(所述末端可以是天然的或者修饰的N或C末端)，或者掺入等同于Cpn10家族肽的顶端(roof)β发夹结构的位置。该位置位于噬菌体T4Gp31的位置54和67之间，有利地为位置55-66之间，并有选为位置59-61之间，或者位于大肠杆菌GroES的位置43-63之间，优选位于位置44-62之间，有利地位于位置56-57之间。
另一实施方案中，所述多肽支架可以是C4bp蛋白或其保持C4bp核心蛋白区的部分。
人C4结合蛋白(hC4bp)是具有多种有吸引力的性质的分子，其为生物活性分子的递送载体。人C4bp参与人补体系统-一组免疫系统蛋白，其功能包括溶解入侵的细胞，活化吞噬细胞和促进外来物质从该系统的清除。人C4bp调节该系统中蛋白尤其是C4蛋白的活性。结构上，hC4bp是柔性、通过二硫键结合的分子，预期其具有长血清半寿期，以及使生物活性分子靶向淋巴结的能力。hC4bp的血清形式的分子量为约590 kD。在还原性SDS凝胶上，hC4bp在约70kD产生强的条带，指示二硫键结合的多聚体蛋白。
编码C4bp单体的cDNA已经被克隆并表征[L.P.Chung等，(1985)″Molecular Cloning and Characterization of thecDNA Coding for C4b-BingdingProtein of the Classical Pathway ofthe human ComplementSystem″，Biochem.J.，230，133-141]。Chung等称hC4bp为549个氨基酸的多肽。从该DNA序列预测的多肽具有的分子量为约61.5kD，而不是在还原性SDS凝胶上实际测定的分子量即70kD。分子量的差异是由于所述多肽血清形式的糖基化。从Chung等所述序列的N末端起的前491个氨基酸可分为8个结构域，所述结构域称为短共有序列重复区(SCR)，每个SeR都含有约60个氨基酸。这些区按从N末端到C末端的顺序命名为SCR8-SCRl。所述SCR结构域可如下限定：SCR8-+1到+61；SCR7-+62到+123；SCR6-+124到+187；SCR5-+188到+247；SCR4-+248到+313；SCR3-+314到+374；SCR2-+375到+432；SCR1-+433到+491。
这些结构域具有很高的序列同源性，每个结构域都含有4个位置相似的半胱氨酸残基。这些半胱氨酸残基形成规则模式的结构域内(intra-domain)二硫键[J.Janatova等，(1989)″Disulfide Bonds Are Localized Within the ShortConsensus Repeat Units of Complement Regulatory Proteins：C4b-BindingProtein″，Biochemistry，28，4754-4761]。在每个SCR结构域中，第一个半胱氨酸残基与第三个半胱氨酸残基结合，第二个半胱氨酸残基与第四个半胱氨酸残基结合，形成双环氨基酸序列。因此，SCR的连接就好像线上的珠(beadson a string)。这种模式的结构域内二硫键结合负责所述C4bp单体的构象可变性。除了所述8个SCR结构域以外，hC4bp在C末端还具有57个氨基酸即C4bp核心，其与所述蛋白的其它区没有同源性。该区负责将所述分子组装成多聚体。
因此，所述多肽支架可以是C4bp核心，并且可选地，一或多个SCR与所述核心融合。
在具体优选的实施方案中，所述多肽支架是C4bpα链的核心蛋白。
多肽支架还可包含N或C末端延伸，诸如柔性接头例如(Glym-Ser)n(其中m和n-为1-4)。这些在本领域中可用于使蛋白结构域(尤其是抗体V结构域)相互连接。因此，所述第一组分可通过所述接头与第二和/或第三组分相连。
优选当C4bpα链的核心蛋白是支架的时候，第一组分在所述产物的C末端。
C4bpα链的核心蛋白
C4bpα链的核心蛋白在本文称为“C4bp核心蛋白”或“核心蛋白”，或“C4bp支架”。这些术语可互换使用。该蛋白可以是哺乳动物C4bp核心蛋白或者其能形成多聚体的片段，或其能形成多聚体的合成变体。
多种哺乳动物C4bp蛋白的序列是本领域可得的，其包括人C4bp核心蛋白(SEQ ID NO：1)。人C4bp核心蛋白的同源物是本领域可得的。共有两种同源物：直向同源物(orthologues)和共生同源物(paralogues)。直向同源物被定义为不同生物体中的同源基因，即所述基因与产生它们的物种形成事件(speciation event)有共同祖先。共生同源物被定义为源自基因、染色体或基因组复制品的相同生物体中的同源基因，即从最近的一次物种形成事件起出现的基因的共同祖先。
例如一项关于Genbank的搜索表明物种中的哺乳动物C4bp核心同源蛋白包括兔，大鼠，小鼠和牛来源(分别为SEQ ID NO：2-5)。平行同源物已在猪(ApoR)，豚鼠(AM67)，和小鼠(ZP3)中鉴定，分别显示为SEQ ID NO：6-8。
SEQ ID No：1-8的比对如图1所示。可以看出尽管在C-末端有很大程度的变异，但所有的8个序列还是有高度的相似性。还可使用通常可得的搜索程序如BLAST，通过搜索DNA或蛋白序列的数据库，鉴定C4bp核心蛋白。
当所需哺乳动物来源的C4bp蛋白在数据库中不能获得时，则该蛋白可以通过本领域已建立的常规克隆方法获得。本质上，这种技术包括使用编码可得的C4bp核心蛋白之一的核酸作为探针，来回收并确定来自其它目的物种的C4bp核心蛋白序列。大量的技术都可用于该目的，比如PCR扩增和采用适当的mRNA源(例如：由胚胎，或活跃分裂的分化的细胞或肿瘤细胞)克隆所述基因，或者通过包括如下步骤的方法：从哺乳动物获得cDNA文库，例如来自上述来源之一的cDNA文库，在中到高严谨度条件下(如：0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，在约50-约60℃)用已知的C4bp核酸检测所述的文库，以及回收编码全部或部分该哺乳动物C4bp蛋白的cDNA。如果获得部分cDNA，那么可通过引物延长技术测定编码序列的全长。
能形成多聚体的C4bp核心蛋白的片段包括至少47个氨基酸，优选至少50个氨基酸。所述片段形成多聚体的能力的检测可以通过如下方法进行：在本发明原核宿主细胞中表达该片段，在导致共57个氨基酸的C4bp核心发生多聚化的条件下回收所述C4bp片段，以及确定该片段是否也形成多聚体。可取地，C4bp核心片段包含SEQ ID NO：1的至少6-52位残基，或其同源物的相应残基。
人SEQ ID NO：1的C4bp核心蛋白对应全长C4bp蛋白序列的氨基酸+493至+549。本领域中已知形成多聚体的片段相当于C4bp核心蛋白的氨基酸+498至+549。
也可用C4bp核心的变体和能形成多聚体片段，所述变体保留形成多聚体的能力(可如上文对所述片段的描述那样来确定)。所述变体与野生型哺乳动物C4bp核心或其多聚体形成片段优选具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，如至少95％或最优选至少98％的序列同一性。一方面，C4bp核心包含出现在SEQ ID No：1-3和5-8的位置6和18的两个半胱氨酸残基。可取地，该变体能保留这2个残基间的部分(relative spacing)。
上述具体程度的同一性是与SEQ ID No：1-8之一或其复合物形成片段的同一性。
最优选上述具体程度的同一性是与SEQ ID NO：1或其多聚体形成片段的同一性。
序列同一性程度由GAP算法决定，该算法是在本领域广泛应用的“Wisconsin包(package)”的一部分，由Accelrys(formerly Genetics ComputerGroup，Madison，WI)提供。GAP使用Needleman和Wunsch算法对2个完整的序列进行比对，以使匹配的数量最大而缺口的数量最小。GAP可用于比对长度相似的密切相关的短序列，因此适合用来确定序列是否符合上述同一性水平。GAP可以使用默认参数。
哺乳动物C4bp核心蛋白的合成变体包括在C或N-末端有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的变体。其中取代是具体所考虑的。取代包括保守取代。保守取代的例子包括下表所列出的取代，其中第二栏同一区的氨基酸和第3栏完全同一行的氨基酸可以互相取代。
脂肪族 非极性 G    A   P
I    L   V
极性-不带电的 C    S   T  M
N    Q
极性-带电的 D    E
K    R
芳香族 H    F   W  Y
其它 N    Q   D  E
可以制备并检测其形成多聚体的能力的C4bp核心蛋白的片段和变体的例子，包括SEQ ID No：9至16，如下表1所示：
  A     B   C
  9   -----CEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL   100
  10   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   98
  11   -----CEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   98
  12   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL   98
  13   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   96.5
  14   ---EGCEQALTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIKQLELQRDSARQSTL----   94
  15   ETPEGSEQVLTGKRLMQSLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   94
  16   ---EGSEQALTGKRLMQSLPNPEDVKMALEIYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDK--   92.3
A＝SEQ ID NO：；B＝序列，C＝％同一性，参照同样长度的SEQ ID NO：1片段计算。
除了N或C-末端平截外，在序列中进行缺失时，所述缺失优选被限定为不多于1、2或3个相邻或不相邻的缺失。
对核心蛋白序列进行插入或N-末端或C-末端延长时，所述延长可取地限定在一定数目以内，以使得核心蛋白的大小超过野生序列的长度不多于20，优选不多于15，最优选不多于10个氨基酸。因此，对于SEQ ID NO：1，通过插入或延长来进行修饰的核心蛋白的长度可取地不超过77个氨基酸。
第二组分
本发明的产物将包含如上述与第二组分直接或间接相连的支架，以及第三组分。
所述第二组分可以是CD21或CD19的配体，如US-A-6,238,670，和W099/35260所述，所述文献的内容包含在本文中作为参考。所述第二组分也可以是B细胞或T细胞或滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体。
优选，所述第二组分是C3d，尤其是人C3d。
小鼠C3d的核苷酸和预测的氨基酸序列公开于Domdey等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7619-7623和Fey等(1983)Ann.N.Y.Acad.Sci.421：307-312)。人C3d的核苷酸和预测的氨基酸序列公开于de Bruijn和Fey(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：708-712。编码其它物种的C3d的核酸可利用人和小鼠序列的信息进行分离，从而制备一或多种用于标准杂交技术的探针。当C3d用于本发明并给药受体时，C3d可以和待免疫的物种相配(例如，小鼠C3d用于小鼠，人C3d用于人等诸如此类)。此外，所选密码子可根据待免疫的物种而优化，例如使用在哺乳动物宿主中有效翻译的密码子。
当第二组分通过肽接头与第一和/或第三组分相连时，所述接头可以为上述柔性接头。
在优选的实施方案中，当所述支架是C4bp核心蛋白时，所述第二组分位于第一组分的N末端，且位于所述抗原(当该抗原是多肽时)的C末端。当所述抗原不是多肽时，其可以和第一或第二组分共价连接。
抗原
抗原可以是任何有预防疾病的价值的产物；它们可以用于预防接种。本发明允许由核苷酸序列快速进展为产生附着于佐剂的多价形式的重组抗原。
细菌免疫原，寄生虫免疫原，和病毒免疫原可用作多肽部分以产生多聚或异源-多聚C4bp融合蛋白，所述融合蛋白可用作疫苗。
这些免疫原的细菌来源包括那些导致细菌性肺炎，肺囊性肺炎(pneumocystis pneumonia)，脑膜炎，霍乱、破伤风，肺结核和麻风病的细菌。
寄生虫来源包括疟疾寄生虫，如疟原虫(plasmodium)。
病毒来源包括痘病毒(poxviruses)，如牛痘病毒和orf病毒(orf virus)；疱疹病毒(herpes viruses)，如1和2型单纯疱疹病毒，B-病毒，天花病毒(varicellazoster viruses)，巨细胞病毒和EB病毒；腺病毒(adenoviruses)，如哺乳动物腺病毒(mastadenovirus)；乳多空病毒(papovaviruses)，如乳头瘤病毒如HPV-16，以及多瘤病毒(polyomaviruses)，如BK和JC病毒；细小病毒(parvoviruses)，如腺伴随病毒；呼肠病毒(reoviruses)，如呼肠病毒1、2，和3；环状病毒(orbiviruses)，如科罗拉多壁虱热病毒(Colorado tick fever)；轮状病毒(rotaviruses)，如人轮状病毒；甲病毒属(alphavirases)，如东方脑炎病毒(Eastern encephalitis virus)和委内瑞拉脑炎病毒(Venezuelanencephalitisvirus)；风疹病毒(rubiviruses)，如风疹病毒(rubella)；黄病毒(flaviviruses)，如黄热病病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，蜱传脑炎病毒(Tiek-borne encephalitis)和丙肝病毒；冠状病毒(coronaviruses)如人冠状病毒；副粘病毒(paramyxoviruses)，如副流感病毒1、2、3和4以及腮腺炎病毒；麻疹病毒(morbilliviruses)，如麻疹病毒(measles virus)；肺病毒(pneumovirus)，如呼吸道合胞病毒；水泡病毒(vesiculovirus)，如水泡性口炎病毒；狂犬病毒(lyssaviruses)，如狂犬病毒；正粘病毒(orthomyxoviruses)，如流感病毒A和B；布尼亚病毒(bunyaviruses)，如LaCrosse病毒；白蛉热病毒(phlebovirus)，如立夫特谷热病毒(Rift valley fever virus)；内罗病毒(nairovirus)，如刚果出血热病毒；嗜肝DNA病毒属(hepadnaviridae)，如，乙肝病毒；沙粒病毒(arenaviruses)，如1em病毒，Lasso病毒和Junin病毒；逆转录病毒(retroviruses)，如HTLV I，HTLV II，HIV-1和HIV-2；肠病毒(Enterouirus)，例如脊髓灰质炎病毒1，2和3，柯萨奇病毒(coxackie virus)，埃可病毒(echovirus)，人肠病毒，甲肝病毒，戊肝病毒和诺沃克病毒(Norwalk-virus)；鼻病毒(rhinoviruses)，如人鼻病毒；和丝状病毒属(filoviridae)，如马尔堡(病)病毒(Marburg(disease)virus)和埃鲍拉(Ebola)病毒。
来自这些细菌、病毒和寄生虫来源的抗原可用于制备用作疫苗的多聚蛋白。所述多聚体可以包含携带不同抗原的单体的混合物。
可以制备用于研究或治疗目的的人蛋白的免疫原。这些物质不仅可用于预防接种中，而且也可用于研究。例如：由人类基因组工程产生的人类基因序列数据使得产生与新的多肽反应的抗血清成为迫切的需要。同样的需要适用于原核细胞(如细菌)和其它真核细胞(包括真菌)的基因产物。
非多肽免疫原可以是，例如碳水化合物或核酸。奈瑟氏球菌(Neisseria)或肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖外壳是可用于本发明的碳水化合物的实例。
所述抗原可以是本领域中疫苗的任何常规大小，包括小的多肽到较大的蛋白。由于本发明的性质，抗原可达100kDa，更优选50kDa，诸如优选30kDa。
当非多肽免疫原是本发明的部分产物时，所述免疫原可用常规合成法与产物的第一和第二组分共价连接。通常，免疫原可附着于包含第一和第二组分的融合蛋白的N或C末端和/或附着于氨基酸侧链基团(例如赖氨酸的ε-氨基)。每种融合蛋白可附加一种以上免疫原。为了促进偶联，可将赖氨酸残基加入融合蛋白，例如作为C末端。
本发明在产生免疫应答方面有很多优势。例如，利用多聚体可允许同时将多个抗原呈递给免疫系统。这允许制备多价疫苗，所述疫苗能激发对一种以上的表位的免疫应答，所述表位可存在于单个生物体上或多个不同生物体上。因此，根据本发明形成的疫苗可用于同时对一种以上的疾病进行免疫接种，或用于同时靶向给定病原体上的数个表位。所述表位可存在于单个的单体单位或不同的单体单位上，所述不同的单体单位相互结合以提供异源多聚体(heteropolymer)。
人C4bp核心融合蛋白或人Cpn10融合蛋白在免疫中是特别有用的，因为该核心蛋白和人Cpn10不仅通常不存在于免疫受体的血清或血浆中，而且它本身不诱发免疫应答。C4bp蛋白已知存在于许多哺乳动物种类中，并且本领域的熟练技术人员可使用标准基因克隆技术发现哺乳动物种类的适当同源物。
核酸
本发明的产物可用编码包含至少第一和第二组分的融合蛋白的核酸构建体，在原核或真核宿主细胞中表达所述融合蛋白来制备。当第三种组分是多肽时，可利用所有三种组分从核酸序列的表达来制备本发明的产物。
因此，本发明提供了核酸构建体，通常为DNA或RNA，其编码本发明的产物。
所述构建体通常是可复制的载体，其中编码所述蛋白的序列可操作地连接于适合在所需宿主细胞中表达该蛋白的启动子。
所述载体可包含复制起点，并可选地包含启动子的调节物。所述载体可含有一或多个选择标记基因。本领域已知多种原核和真核表达载体，且本发明可依据本领域内熟练技术人员的个人偏好而利用任何载体。
多种原核宿主细胞可用于本发明的方法中。这些宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，嗜热菌属(Thermophilus)，沙门氏菌属(Salmonella)，肠杆菌属(Enterobacteriacae)或链霉菌属(Streptomyces)的菌株。例如，埃希氏菌属的大肠杆菌(E.coli)用于本发明方法时，该细菌的优选菌株包括BL21(DE3)和它们的衍生物包括C41(DE3)，C43(DE3)或CO214(DE3)，其在WO98/02559中描述并且可得。
甚至更优选，当启动子不是T7启动子时，可利用缺少原噬菌体DE3的这些菌株的衍生物。
原核载体包括细菌质粒载体，例如源自大肠杆菌的载体，包括ColEI，pCRl，pBR322，pMB9及其衍生物，宿主范围广泛的载体，例如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体A的多种衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌体，例如M13和丝状单链DNA噬菌体。这些和其它载体可用标准重组DNA法进行操作，以导入与启动子可操作地连接的本发明的核酸。
所述启动子可以是诱导型启动子。适合的启动子包括T7启动子，tac启动子，trp启动子，λ启动子PL或PR以及本领域熟练技术人员所熟知的其它启动子。
可使用多种真核宿主细胞，包括例如酵母菌，昆虫和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞包括CHO和小鼠细胞，非洲绿猴细胞诸如COS-1等，以及人细胞。
已知许多适合用于表达蛋白的真核载体。这些载体可以设计为其染色体掺入真核细胞基因组或保持在染色体外，或者仅在真核细胞中短暂地保存。所述核酸可以与适宜的启动子可操作地连接，所述启动子诸如强病毒启动子，包括CMV启动子，和SV40T-抗原启动子或逆转录病毒LTR。
为获得本发明的产物，携带本发明载体的宿主细胞可在适合表达所述蛋白的条件下培养，并且从培养基中的细胞回收所述蛋白。
组合物
根据本发明的产物可以制备为药物组合物的形式，所述产物可与一种或多种可药用的载体或稀释剂一起存在。该组合物根据目的用途和给药产物的途径来制备。因此本发明提供了一种组合物以及其在治疗或预防人或动物受体疾病的免疫治疗法中的用途，所述组合物包含多聚体形式的本发明的产物以及一种或多种可药用的载体或稀释剂。
可药用的载体或稀释剂包括适合经口服，经直肠，经鼻，经局部(包括经颊和舌下)，经阴道或胃肠外(包括经皮下、经肌肉内、经静脉内、经皮内、经鞘内和经硬膜外)给药的配制剂中所用载体和稀释剂。所述配制剂可以方便地作为单位剂量形式存在并由任何药学领域已知的方法制备。
可药用的液体组合物可以例如通过在载体中对本发明的融合蛋白以及可选的药物佐剂进行溶解、分散等以形成溶液或悬液来制备，所述载体例如水，右旋糖盐水溶液，甘油，乙醇等等。如需要，待给药的组合物也可以是辅助物质例如pH缓冲剂等等。对那些本领域熟练技术人员来说，制备这种制剂形式的实际方法是已知的，或者显而易见的，见Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Com泛y，Easton，Pennsylvania，19th Edition，1995。
在任何情况下，所给药的组合物或制剂包含一定量的活性化合物，所述量能够有效减轻治疗对象的症状。可以制备这样的剂量形式或组合物，其包含的活性成分在0.25-95％范围内，其余部分由非毒性载体平衡。
经胃肠外给药的特征通常为注射，如经皮下、肌肉内、或静脉内注射。注射剂可以制备成传统形式，如液体溶液或悬液，适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或乳剂。适当的赋形剂为，例如水、盐水、右旋糖、甘油，乙醇等。更新的经胃肠外给药方法设计为植入缓释或持续释放系统，以便维持恒定的剂量水平。见例如：美国专利3,710,795。
所述产物的剂量可有赖于所述抗原的性质，并可根据目前在传统疫苗配制剂中给药该抗原的实践来确定。
DNA疫苗
另一方面，本发明提供用于人体或动物体的治疗的真核表达载体，所述载体包含编码重组融合蛋白的核酸序列，所述重组融合蛋白包含本发明的三种组分的产物。
这种治疗可通过引入编码用于激发免疫应答的抗原的核酸序列来实现其治疗作用。核酸的递送可利用质粒载体(“裸露的”或配制剂形式)或重组表达载体来实现。为显示本发明如何用质粒载体实施，Green T.D，等，2001，在Vaccine 20，242-248中公开的内容可作为实例。这些作者显示了使用表达麻疹血凝素蛋白和三个拷贝的C3d的融合物的DNA疫苗，可提高中和抗体的滴度。本发明中，C3d的第二和第三个拷贝可用编码C4bpα链核心的序列取代，产生寡聚的抗原-佐剂融合蛋白。该质粒可较小(由于核心编码序列比编码C3d的两个拷贝的序列短得多)，并且由于缺失重复序列而更稳定。
各种可用于基因递送的病毒载体包括腺病毒，疱疹病毒，痘病毒或RNA病毒如逆转录病毒。所述逆转录病毒载体可以是鼠或鸟逆转录病毒的衍生物。可插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，和劳斯肉瘤病毒(RSV)。当对象是人类时，可利用载体如长臂猿(gibbon ape)白血病病毒(GaLV)。
所述载体将包括转录调节序列，特别是足以指导RNA合成开始启动子区域。适合的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等1982 J.Molec.Appl.Genet.1，273)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，1982Cell 31，355)；SV40早期启动子(Benoist等1981 Nature 290，304)；劳斯肉瘤病毒启动子(Gorman等1982 Proc.NatlAcad.Sci USA 79，6777)；和巨细胞病毒启动子(Foecking等1980 Gene 45，101)。
将本发明这一方面的载体作为质粒载体或作为部分病毒载体给药受试者，可受许多不同途径的影响。质粒DNA可用于直接或间接给药，其可以是“裸露的”或与阳离子和中性脂质(脂质体)配制在一起或微囊化的。所述DNA序列也可以包含于病毒(如，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，痘病毒)载体中，所述载体用于直接或间接递送。递送途径包括但不仅限于经肌肉内，皮内(Sato，Y.等1996 Science 273，352)，静脉内，动脉内，鞘内，肝内，吸入，阴道内滴注(Bagarazzi等1997 J Med.Primatol.26，27)，直肠内，肿瘤内或腹膜内。
因此本发明包括本文所述作为药物组合物的载体，其可用于允许用DNA载体转染一些细胞，从而使治疗性多肽得以表达并产生治疗效果(即诱导对所述抗原的免疫反应)。本发明的药物化合物可通过使本发明的构建体成为适合利用溶剂，载体，递送系统，赋形剂和添加剂或辅助剂并给药受试者的形式来制备。经常使用的溶剂包括无菌水和盐水(缓冲的或非缓冲的)。载体包括金微粒，其通过基因枪(biolistically)递送(如在气压(gas pressure)下)。其它常用的载体或递送系统包括阳离子脂质体，螺旋物(cochleate)和微囊，所述载体或递送系统可以为液体溶液，包含在递送胶囊中或者或掺入食物中。
给药基因递送载体的另一可选配制剂包括脂质体。脂质体的被囊化(encapsulation)为给药多核苷酸和表达载体提供了可选配方。脂质体是由含水区室周围的一个或多个脂质双分子层组成的微观小泡。通常参见，Bakker-Woudenberg等1993 Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12，Suppl.1，S61，和Kim，1993 Drugs 46，618。脂质体的成分和细胞膜相似，所以脂质体可被安全地给药，并且是可生物降解的。依赖这种制备方法，脂质体可以是单层的或多层的，并且脂质体的大小可不同，直径范围从0.02μM到大于10μM。参见，例如，Machy等1987 LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY ANDPHARMACOLOGY(John Libbey)，和Ostro等1989 American J.Hosp.Phann.46，1576。
利用标准技术可将表达载体包入脂质体中。许多不同的脂质体组合物和合成方法为本领域熟练技术人员所熟知。参见，例如，美国专利4,844,904，美国专利5,000,959，美国专利4,863,740，美国专利5,589,466，美国专利5,580,859，和美国专利4,975,282，以上全部文献包含在本文中作为参考。
通常，脂质体-被囊化的载体的给药剂量根据以下因素变化，如病人的年龄，体重，身高，性别，总体医学情况和既往医学记录。具体配制剂的剂量范围可通过利用适合的动物模型确定。
细胞培养
本发明编码融合蛋白的质粒可利用常规转化技术引入宿主细胞，并且在促进该融合蛋白产生的情况下培养所述细胞。在利用诱导型启动子时，细胞最初在缺乏诱导物的条件下培养，所述诱导物可在细胞生长到较高密度时加入以使蛋白回收最大化。
细胞培养条件是本领域内所熟知的，并且可根据已知方法使用。
在一个具体的方面，当第一组分是C4bp核心蛋白时，至少前两种组分的融合物或在有利时所有三种组分的融合物，可在原核表达系统中表达。目前，基于C4bp核心蛋白的融合蛋白已经可在真核细胞中表达。真核细胞的融合蛋白产量很少达到2mg/每毫升培养基上清液，(Oudin等ibid)，并且只有在基因扩增进行数个循环后才能达到这样的水平。这个水平对于许多治疗用融合蛋白的经济化大量生产来说太低了。
尽管WO 91/00567建议原核宿主细胞可以用于制备基于C4bp的蛋白，这种生产还未得到实验证实。然而大量的考虑都提示使用原核系统是不利的。尤其是许多真核蛋白在诸如大肠杆菌等细胞中表达时，将失去它们的一些或全部有活性的折叠结构。其它真核蛋白在原核细胞中表达时会变性或完全失活。
C4bp是哺乳动物的分泌蛋白，且本领域已知在原核细胞中制备折叠形式的所述蛋白尤其困难。有二硫桥的蛋白和需要寡聚化的蛋白更麻烦。在细菌胞浆的还原性环境中二硫键无法正常产生，且它们一旦形成则会稳定所述蛋白的错误折叠或聚集形式。
通常在原核细胞内表达的重组蛋白会在宿主原核细胞内的内含体中聚集。所述内含体是与细胞的其它成分分离的离散颗粒或小球，其包含通常是聚集或失活形式的表达的蛋白。表达的蛋白在包含体中的存在使得回收活性可溶形式的蛋白非常困难，因为重折叠技术是无效而且费用高昂的。从内含体纯化蛋白必须消耗大量劳动来操作，变性并重折叠才能获得相对低产量的活性、有功能的蛋白。
对于在原核细胞中表达C4bp核心融合蛋白，还必须考虑其它问题。首先，每个核心单体都保留两个半胱氨酸残基，根据本领域所接受的C4bp多聚体模型，这些半胱氨酸是在多聚体装配过程中形成分子间二硫键所必需的。期望原核细胞胞质(例如细菌的胞质)的还原环境能通过减少这些二硫键来阻止C4bp核心多聚体的形成。
第二，多聚体通过真核细胞的分泌装置(secretion apparatus)时被组装，这些分泌装置已知能辅助蛋白以原核细胞不能提供的方式(例如，存在蛋白质二硫化物异构酶和独定的陪伴分子的条件下)进行折叠，第三，即使在使真核细胞中获得的产量相对较低(mg/dl)时，这个分泌路径仍不能产生同源蛋白。
此外，本发明人发现了在原核表达系统中所产生的与C4bp核心融合的蛋白可保持其功能活性。本发明因此提供了获得重组融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含C4bpα链的C末端核心蛋白支架和第二组分以及可选的第三组分，并能在原核宿主细胞的胞质中形成可溶的多聚体，所述方法包括以下步骤：
(i)提供携带编码所述重组蛋白的核酸的原核宿主细胞，所述核酸与在该原核细胞中有功能的启动子可操作地连接；
(ii)在所述重组蛋白被表达的条件下培养该宿主细胞；和
(iii)回收所述重组蛋白，其中所述蛋白以多聚体形式被回收。
我们发现本发明细胞培养物中蛋白的产量可相对较高，例如大于2mg/l培养物，如大于5mg/l培养基，优选大于10mg/l培养物，如大于20mg/l培养基，甚至更优选大于100mg/l培养物。
本发明的C4bp核心融合蛋白包含在N或C末端融合于本发明其它组分之一的C4bp核心蛋白序列。在优选的排列中，所述组分自融合蛋白的N到C末端的顺序是N-第三组分-第二组分-第一组分-C。
我们发现包含在上述定义中的蛋白可以以多聚体形式在细菌表达系统中表达并被回收，而无需支架的重折叠。我们表达了包括C4bp核心的蛋白和能携带抗原和第二组分的蛋白，其单体重量达约30kDa。本发明因此可用于表达该大小范围内的蛋白，且更常用于表达约100kDa，更优选约50kDa的蛋白。
该系统允许在大肠杆菌中制备可溶蛋白的事实，使得可利用该系统将由于缺少C-末端和/或N-末端的限制(constraint)因而在其独自表达时不折叠的蛋白制备为例如折叠的可溶蛋白、结构域或片段。改造具体的切割位点能产生目的游离结构域。类似地，在重折叠过程中限制目的肽的N-末端和/或C-末端是有益的。此外，由于寡聚化结构对于变性和分解(disassembly)有很强的抵抗力，在插入的蛋白发生变性的过程中所述结构将保持稳定。因此，在重折叠过程中，对于等量的目的蛋白，游离蛋白的实际浓度可通过与寡聚化数目等同的因素而降低。寡聚化反应对于纯化也是有益的，因为蛋白技术中许多方法对于蛋白，且特别是低分子量的肽而言不是最佳的。
从培养物中回收蛋白
当细胞生长到允许产生所述蛋白时，可从该细胞中回收所述蛋白。我们惊奇地发现所述蛋白保持可溶状态，因此进一步高速(如15rpm，000进行1小时)离心之后，细胞通常例如经旋转沉下(spun down)并通过超声处理而溶解，此过程中使蛋白级分保持可溶状态并允许所述级分保留于上清液中。
上清液蛋白级分中的融合蛋白可通过标准蛋白层析技术的任意适合组合而进一步纯化。我们采用离子交换层析，之后用凝胶过滤层析。其它层析技术，如亲和层析，也可被应用。
在一个实施方案中，我们发现在溶解产物离心后或在任何其它纯化步骤后加热上清液样品，将有助于所述蛋白的回收。所述样品可被加热到约70-80℃、持续大约10到30分钟，但该实施方案在第二组分是C3d时不是优选的。
依据蛋白的目的用途，可对所述蛋白进行进一步的纯化步骤，例如透析，或浓缩步骤，例如冷冻干燥。
以下实例将说明本发明。
实施例1表位-C3d-C4bp融合蛋白
该实施例显示了表位(包含人Cpn10的氨基酸8-22)与人C3d的融合，所述人C3d本身与人C4bp核心蛋白的N末端融合。所述融合蛋白可在细菌菌株C41(DE3)中表达并从中纯化。所述蛋白在凝胶过滤中的表现与寡聚物相似。
本实施例中所示的方法可被扩展到提供本发明的三种组分的产物，例如用下述构建体中其它抗原-编码DNA取代Cpn10表位来进行。可选，回收的蛋白可与其它方法提供的抗原共价连接。
克隆
来自pAVD 95(下文实施例2中用于C3d7(1)的表达构建体)的975bp的XbaI-BamHI片段(编码T7核糖体结合位点，人Cpn10的残基8-22(所述表位)和人C3d的残基995-1287)被连入pAVD 77(pRSETa-Db-C4bp)，所述pAVD 77已经用XbaI和BamHI消化过。该过程将人Cpn10和C3d蛋白片段与人C4bpα链C末端的57个残基融合。所述构建体称为pAVD94，其可通过PCR和双重消化检验。
所述构建体的融合蛋白的氨基酸如下：
MKFLPLFDRV LVERSAGSVD AERLKHLIVT PSGSGEQNMI GMTPTVIAVH
YLDETEQWEK FGLEKRQGAL ELIKKGYTQQ LAFRQPSSAF AAFVKRAPST
WLTAYVVKVF SLAVNLIAID SQVLCGAVKW LILEKQKPDG VFQEDAPVIH
QEMIGGLRNN NEKDMALTAF VLISLQEARD ICEEQVNSLP GSITKAGDFL
EANYMNLQRS YTVAIAGYAL AQMGRLKGPL LNKFLTTAKD KNRWEDPGKQ
LYNVEATSYA LLALLQLKDF DFVPPVVRWL NEQRYYGGGY GSTQATFMVF
QALAQYQKDA PGSETPEGCE QVLTGKRLMQ CLPNPEDVKM ALEVYKLSLE
IEQLELQRDS ARQSTLDKEL(SEQ ID NO：17).
SEQ ID NO：17的残基2-16对应人Cpn10(所述表位)的残基8-22，SEQID NO：17的残基19-311对应人C3d残基995-1287，且SEQ ID NO：17的残基314-370对应人C4bp核心蛋白的57个残基。上述序列中以粗体显示的GS接头序列位于三种组分之间。
所述蛋白的估计分子量为41,485道尔顿，理论上pI为5.51，且估计消光系数为45090M-1cm-1。以此为基础，计算我们所用的浓度Abs 0,1％(＝1g/l)＝1.087。
表达
编码表位-C3d-C4bp核心蛋白的质粒pAVD94在大肠杆菌菌株C41(DE3)中表达。在没有诱导的条件下在25℃生长过夜后，所述蛋白表达良好。在20mM Tris-HCl缓冲液pH8/100mM NaCl中，利用弗氏压滤器(Frenchpress)，几乎一半蛋白见于上清液中。
C3d-C4bp的纯化
表位-C3d-C4bp的可溶级分利用三个纯化步骤从1L培养物纯化：阴离子交换柱，阳离子交换柱和凝胶过滤柱。
阴离子柱(Mono Q HR16/10)
该柱在20mM Tris-HCl缓冲液pH 8/100mM NaCl中平衡。所述蛋白用20倍柱体积的梯度溶液即20mM Tris-HCl缓冲液pH 8/100mM NaCl(缓冲液A)到20mM Tris-HCl缓冲液pH8/1M NaCl(缓冲液B)洗脱。所述蛋白在约350mM NaCl洗脱。
含有表位-C3d-C4bp的MonoQ级分用20mM Tris-HCl缓冲液pH 7/100mM NaCl透析，然后加样在阳离子柱上。
阳离子柱(Mono SHR10/10)
经过Mono Q柱的级分含有表位-C3d-C4bp，将所述级分上样于用20mM Tris-HCl缓冲液pH 7/100mM NaCl平衡的阳离子柱(Mono S HR 10/10)上。所述蛋白用20倍柱体积的梯度溶液即20mM Tris-HCl缓冲液pH 7/100mM NaCl(缓冲液A)到20mM Tris-HCl缓冲液pH7/1M NaCl(缓冲液B)洗脱。所述蛋白在约350mM NaCl洗脱。
收集没有主要污染物(＞66Kda)的、含表位-C3d-C4bp的级分，对所述级分进行浓缩并上样于凝胶过滤柱。
凝胶过滤柱(Superdex 20026/60制备级(prep grade))
将来自Mono S柱的含表位-C3d-C4bp的级分上样于用50mM磷酸钠pH 7.4/150mM NaCl平衡的凝胶过滤柱(Superdex 200 26/60 prep grade)。所述蛋白用152.69ml缓冲液洗脱，其洗脱峰非常对称。该洗脱体积显示，所述蛋白是寡聚物。经过该柱以后，所述蛋白的浓度为0.45mg/ml。所述蛋白被浓缩到1.5mg/ml并与10％甘油一起储存在-70℃。所述蛋白为至少90％纯。
实施例2 将人C3d分子插入人Cpn10(C3d7)的可动环
本实施例描述了三种类似的C3d7构建体的可溶部分的纯化以及其在25℃的表达
C3d7(1)
42.85kDa三裂体融合蛋白在25℃、自大肠杆菌菌株C41(DE3)中的质粒pAVD 59表达，所述融合蛋白包含取代人Cpn10(在其N末端被截短)可动环的人C3d以及C末端myc标记表位，其氨基酸序列为SEQ ID NO：18。
MKFLPLFDRV LVERSAGSVD AERLKHLIVT PSGSGEQNMI GMTPTVIAVH
YLDETEQWEK FGLEKRQGAL ELIKKGYTQQ LAFRQPSSAF AAFVKRAPST
WLTAYVVKVF SLAVNLIAID SQVLCGAVKW LILEKQKPDG VFQEDAPVIH
QEMIGGLRNN NEKDMALTAF VLISLQEAKD ICEEQVNSLP GSITKAGDFL
EANYMNLQRS YTVAIAGYAL AQMGRLKGPL LNKFLTTAKD KNRWEDPGKQ
LYNVEATSYA LLALLQLKDF DFVPPVVRWL NEQRYYGGGY GSTQATFMVF
QALAQYQKDA PGSGKVLQAT VVAVGSGSKG KGGEIQPVSV KVGDKVLLPE
YGGTKVVLDD KDYFLFRDGD ILGKYVDeqk liseedl  (SEQ ID NO：18)
SEQ ID NO：18的人Cpn10氨基酸序列是残基1-16和311-377。人C3d氨基酸序列是SEQ ID NO：18的17-310，且myc-标记表位氨基酸序列为SEQ ID NO：18的378-387。
编码该融合蛋白的DNA序列(NdeI-HindIII限制酶切片段)克隆在pRSET来源的质粒的NdeI-HindIII位点之间，使得所述编码序列在T7启动子的控制下。
C3d7(2)
类似地构建第二融合蛋白，其仅在插入人C3d以取代人Cpn10的可动环的位置上有所不同。其序列为SEQ ID NO：19：
MKFLPLFDRV LVERSAGETV TVDAERLKHL IVTPSGSGEQ NMIGMTPTVI
AVHYLDETEQ WEKFGLEKRQ GALELIKKGY TQQLAFRQPS SAFAAFVKRA
PSTWLTAYVV KVFSLAVNLI AIDSQVLCGA VKWLILEKQK PDGVFQEDAP
VIHQEMIGGL RNNNEKDMAL TAFVLISLQE AKDICEEQVN SLPGSITKAG
DFLEANYMNL QRSYTVAIAG YALAQMGRLK GPLLNKFLTT AKDKNRWEDP
GKQLYNVEAT SYALLALLQL KDFDFVPPVV RWLNEQRYYG GGYGSTQATF
MVFQALAQYQ KDAPGKVLQA TVVAVGSGSK GKGGEIQPVS VKVGDKVLLP
EYGGTKVVLD DKDYFLFRDG DILGKYVDeq kliseedl (SEQ ID NO：19)
氨基酸残基1-20和315-378源自人Cpn10，所述残基位于人C3d氨基酸序列侧翼。myc-标记表位氨基酸序列为379-388。
C3d7(3)
同样制备第三种融合蛋白C3d7(3)，其氨基酸序列为：
MKFLPIFDRV LVERSAGETV DAERLKHLIV TPSGSGEQNM IGMTPTVIAV
HYLDETEQWE KFGLEKRQGA LELIKKGYTQ QLAFRQpSSA FAAFVKRAPS
TWLTAYVVKV FSLAVNLIAI DSQVLCGAVK WLILEKQKPD GVFQEDApVI
HQEMIGGLRN NNEKDMALTA FVLISLQEAK DICEEQVNSL PGSITKAGDF
LEANYMNLQR SYTVAIAGYA LAQMGRLKGP LLNKFLTTAK DKNRWEDPGK
QLYNVEATSY ALLALLQLKD FDFVPPVVRW LNEQRYYGGG YGSTQATFMV
FQALAQYQKD APLQATVVAV GSGSKGKGGE IQPVSVKVGD KVLLPEYGGT
KVVLDDKDYF LFRDGDILGK YVDeqklise edl  (SEQ ID NO：20)
人Cpn10氨基酸序列是1-18和313-373(与人C3d氨基酸序列侧接)，且myc-标记表位的氨基酸序列是374-383。
C3d7(1)的表达
为了使所述蛋白可溶，我们在25℃于大肠杆菌菌株C41(DE3)中表达pAVD95。在25℃用0.5mM IPTG诱导过夜后，所述蛋白被表达并且几乎一半的所述蛋白见于上清液中。
纯化
C3d7(1)的可溶级分可利用两个纯化步骤来纯化，即阴离子柱，然后使凝胶过滤柱。
阴离子柱(Mono Q HR16/10)
所述柱可在20mM Tris pH 8中平衡。所述蛋白可用20倍柱体积的梯度溶液即20mM Tris pH 8到20mM Tris pH 8，1M NaCl来洗脱。所述蛋白用大约350mM NaCl在一个5ml的级分(E3)中洗脱。
凝胶过滤柱(Superdex 20026/60 prep grade)
将柱Mono Q的级分E3加样于用50mM磷酸钠pH 7.4，150mM NaCl平衡的凝胶过滤柱(Superdex 200 26/60 prep grade)。所述蛋白用150ml缓冲液洗脱。在所述柱上卵清蛋白(MW＝43Kd)的洗脱体积为167ml。这表明本发明所述蛋白是寡聚物。
圆二色性
通过远UV(Far UV)圆二色性分析蛋白表明存在二级结构。所述光谱的去褶合(deconvolution)显示α-螺旋的百分比为约49％。该百分比与通过模拟(modeling)测定的百分比(48％的α-螺旋)一致。这表明所述蛋白是正确折叠的。
所述蛋白在50mM磷酸钠，pH7.4，150mM NaCl中浓缩至1.2mg/ml。
实施例3-C3d7(1)和表位-C3d-C4bp的CR2结合活性
ELISA分析法
如实施例1中制备的表位-C3d-C4bp分子和如实施例2中制备的C3d7(1)在500nM-0.01nM的浓度范围内进行分析，并相对于人C3d(Calbiochem)和人C3d的线性三体(称为C3d3或APT2029)进行比较，所述人C3d的线性三体如W099/35260中所述构建和制备。结果显示于图2和4。
简言之，所述分析法如下：
表达IgG恒定区-CD21融合蛋白并在组织培养细胞中进行纯化，并用纯化的蛋白包被ELISA板的孔。将一定范围浓度的各种C3d分子加入这些孔并进行保温。保温后，彻底洗涤这些孔，然后加入生物素化的抗-C3d单克隆抗体。保温并洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)-标记的抗生物素抗体。进一步保温和洗涤后，加入HRP的底物并在450nm测定通过HRP从所述底物产生的有色产物。所述分析图示在图3中。
明显地，在数个浓度条件下，表位-C3d-C4bp分子与C3d受体CD21的结合比单体C3d与所述C3d受体CD21的结合要好得多，甚至比线性三体C3d3还要好，如图2所示。
所述实验用C3d7(1)重复三次，并且对每次应答的梯度进行平均和比较。图4显示了这些分析之一的结果。
比较C3d7(1)和Calbiochem C3d(其为单体形式)的结果时，C3d7(1)的Abs 450开始增加时的浓度低于单体C3d。这表明C3d为多聚体形式。
实施例4-C3d7(1)，(2)&(3)的CR2结合活性
如实施例3中所述，用C3d7(1)，(2)和(3)重复实施例3的结合实验，其中C3d7(1)，(2)和(3)都如上述实施例2中所述来制备。
在ELISA分析中，这三种蛋白的结合如图5所示。数据显示，C3d7(1)，C3d7(2)和C3d7(3)都确实与CR2结合。所述结合曲线线性部分的斜率表明所述蛋白发生了多聚化，表现为C3d3的线性三体(称为APT2029)的斜率比单体C3d(由Calbiochem提供)的增加3.4倍。三种C3d7构建体的线性部分斜率提示，它们都是多聚化的。
实施例5 通过免疫荧光流式细胞术进行分析
检测了人C3d7构建体在无限繁殖化的CD21+Raji类淋巴母细胞系以及人CD20+/CD4-/CD8-外周血淋巴细胞上的CR2结合活性。流式细胞分析用Becton Dickenson FACSCalibur进行；获得了10,000事件(events)。
无限繁殖化的Raji(B细胞)和Jurkat(T细胞)细胞在PBS中洗涤，并与FITC偶联的抗人，CD3(泛-T细胞标记物)、CD20(泛-B细胞标记物)和CD21(CR2标记物)(DAKO)单克隆抗体(Mabs)的优化稀释液一同保温。这证实了Raji细胞是CD21+，CD20+的，而Jurkat细胞为CD21dim，CD3+。
在Raji(CD21+/CD20+)而不是Jurkat(CD3+/CD21dim)上检测到C3d7(1-3)的结合
利用单染色免疫荧光分析模式，将洗涤后的Raji和Jurkat细胞(1×106/ml)与各100nM(终稀释度)C3d7(1)、C3d7(2)、C3d7(3)、人单体C3d(Calbiochem)以及人线性三体C3d3(APT2029)一同在室温保温30分钟，在冰冷的PBS终洗涤后，与Cys(粉色荧光团)偶联的抗-人C3d单克隆抗体的优化稀释液一起在4℃于暗处保温30分钟，再次洗涤并重悬于0.5ml冰冷的PBS中。图6显示了该分析的结果。
C3d7(1)和C3d7(2)确实与CD21+细胞结合，而不与CD3+/CD21dim细胞结合。信号强度的增加提示多聚化，表现为相对于C3d(Calbiochem)而言，C3d7(1)和C3d7(2)的信号强度之间分别增加了7和9倍，而C3d3(APT2029)增加了6.4倍。
C3d7(1)在CD20+/CD4-/CD8-人外周血淋巴细胞(PBL)表面的结合
该实验利用复染免疫荧光分析模式进行。人PBL用Ficoll通过密度梯度离心而从血液中分离。通过裂解去除污染性红细胞。1×106/ml经过洗涤的PBL与200nM(终稀释度)C3d7(1)或人线性三体C3d3(APT2029)一同在室温保温30分钟，在冰冷的PBS中洗涤，随后与Cy3-抗-人C3d Mab和FITC-抗CD4(Th细胞标记物)、抗CD8(CTL标记物)、抗-CD20(B细胞标记物)Mabs(DAKO)的优化稀释液在4℃于暗处一同保温30分钟，洗涤并重悬于0.3ml冰冷的PBS中用于流式细胞分析，获得了5,000事件。
数据的分析表明C3d7(1)确实和PBL B(CD20+)细胞群(推定为CD21+)结合，所述结合的方式与对线性三体人C3d3(称为APT2029)所观察到的相似。
序列表
<110>阿维迪斯公司(AVIDIS SA)
<120>包含支架，佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途
<130>AHB/FP6164701
<140>
<141>
<150>EP 02292042.5
<151>2002-08-14
<160>20
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>57
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>2
<211>57
<212>PRT
<213>穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>2
Glu Val Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Gln Ala Gly Arg Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Ala Asp Pro Tyr Glu Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Leu Leu Glu Leu Gln Arg Asp Lys Ala
         35                  40                  45
Arg Lys Ser Ser Val Leu Arg Gln Leu
    50                   55
<210>3
<211>55
<212>PRT
<213>家鼠(Rattus sp.)
<400>3
Glu Val Pro Lys Asp Cys Glu His Val Phe Ala Gly Lys Lys Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Ser Asn Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Thr Leu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Leu Gln Ile Asp Lys Ala
         35                  40                  45
Lys His Val Asp Arg Glu Leu
     50                  55
<210>4
<211>54
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus sp.)
<400>4
Glu Ala Ser Glu Asp Leu Lys Pro Ala Leu Thr Gly Asn Lys Thr Met
  1               5                  10                  15
Gln Tyr Val Pro Asn Ser His Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Thr Leu Glu Val Glu Leu Leu Gln Leu Gln Ile Gln Lys Glu
         35                  40                  45
Lys His Thr Glu Ala His
     50
<210>5
<211>67
<212>PRT
<213>牛(Bos sp.)
<400>5
Glu Tyr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Val Thr Gly Arg Lys Leu Leu
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Ser Arg Pro Glu Glu Val Lys Leu Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Ile Leu Gln Thr Asn Lys Leu Lys Lys
         35                  40                  45
Glu Ala Phe Leu Leu Arg Glu Arg Glu Lys Asn Val Thr Cys Asp Phe
     50                  55                  60
Asn Pro Glu
  65
<210>6
<211>57
<212>PRT
<213>野猪(Sus scrofa)
<400>6
Glu Tyr Pro Glu Asp Cys Glu Gln Val His Glu Gly Lys Lys Leu Met
  1               5                  10                  15
Glu Cys Leu Pro Thr Leu Glu Glu Ile Lys Leu Ala Leu Ala Leu Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Thr Asn Leu Leu Glu Leu Gln Ile Asp Lys Glu
         35                  40                  45
Lys Lys Ala Lys Ala Lys Tyr Ser Thr
     50                  55
<210>7
<211>56
<212>PRT
<213>豚鼠(Cavia porcellus)
<400>7
Glu Val Pro Glu Glu Cys Lys Gln Val Ala Ala Gly Arg Lys Leu Leu
  1               5                  10                  15
Glu Cys Leu Pro Asn Pro Ser Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Val Lys
     35                  40                  45
Ile Gln Glu Lys Phe Ser Lys Glu
     50                  55
<210>8
<211>59
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus sp.)
<400>8
Glu Val Leu Glu Asp Cys Arg Ile Val Ser Arg Gly Ala Gln Leu Leu
  1               5                  10                  15
His Cys Leu Ser Ser Pro Glu Asp Val His Arg Ala Leu Lys Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Phe Leu Glu Ile Glu Arg Leu Glu His Gln Lys Glu Lys Trp
         35                  40                  45
Ile Gln Leu His Arg Lys Pro Gln Ser Met Lys
     50                  55
<210>9
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>9
Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn
  1               5                  10                  15
Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu
             20                  25                  30
Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu
         35                  40                  45
Asp Lys Glu Leu
     50
<210>10
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>10
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>11
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>11
Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn
  1               5                  10                  15
Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu
             20                  25                  30
Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu
         35                  40                  45
Asp Lys Glu Leu
    50
<210>12
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>12
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>13
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>13
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>14
<211>50
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>14
Glu Gly Cys Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu
  1               5                  10                  15
Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser
             20                  25                  30
Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser
         35                  40                  45
Thr Leu
     50
<210>15
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>15
Glu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Ser Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>16
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白变体
<400>16
Glu Gly Ser Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Ser Leu
  1               5                  10                  15
Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser
             20                  25                  30
Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser
         35                  40                  45
Thr Leu Asp Lys
     50
<210>17
<211>370
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：融合蛋白
<400>17
Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala
  1               5                  10                  15
Gly Ser Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser
             20                  25                  30
Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala
         35                  40                  45
Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu
     50                  55                  60
Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln
 65                  70                  75                  80
Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg
                 85                  90                  95
Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val
        115                 120                 125
Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu
    130                 135                 140
Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn
145                 150                 155                 160
Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln
                165                 170                 175
Glu Ala Arg Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser
            180                 185                 190
Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln
        195                 200                 205
Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly
    210                 215                 220
Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp
225                 230                 235                 240
Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala
                245                 250                 255
Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe
            260                 265                 270
Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly
        275                 280                 285
Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala
    290                 295                 300
Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Gly Ser Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu
305                 310                 315                 320
Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu
                325                 330                 335
Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu
            340                 345                 350
Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys
        355                 360                 365
Glu Leu
    370
<210>18
<211>387
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：融合蛋白
<400>18
Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala
  1               5                  10                  15
Gly Ser Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser
             20                  25                  30
Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala
         35                  40                  45
Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu
     50                  55                  60
Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln
 65                  70                  75                  80
Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg
                 85                  90                  95
Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val
        115                 120                 125
Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu
    130                 135                 140
Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn
145                 150                 155                 160
Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln
                165                 170                 175
Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser
            180                 185                 190
Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln
        195                 200                 205
Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly
    210                 215                 220
Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp
225                 230                 235                 240
Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala
                245                 250                 255
Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe
            260                 265                 270
Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly
        275                 280                 285
Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala
    290                 295                 300
Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Gly Ser Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr
305                 310                 315                 320
Val Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln
                325                 330                 335
Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly
            340                 345                 350
Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp
        355                 360                 365
Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
    370                 375                 380
Glu Asp Leu
385
<210>19
<211>388
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：融合蛋白
<400>19
Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala
  1               5                  10                  15
Gly Glu Thr Val Thr Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val
             20                  25                  30
Thr Pro Ser Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr
         35                  40                  45
Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe
     50                  55                  60
Gly Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr
 65                  70                  75                  80
Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe
                 85                  90                  95
Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val
            100                 105                 110
Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys
        115                 120                 125
Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val
    130                 135                 140
Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu
145                 150                 155                 160
Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu
            180                 185                 190
Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met
        195                 200                 205
Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Gln Met Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr
225                 230                 235                 240
Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn
                245                 250                 255
Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp
            260                 265                 270
Phe Asp Phe Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr
        275                 280                 285
Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln
    290                 295                 300
Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Gly Lys Val Leu Gln Ala
305                 310                 315                 320
Thr Val Val Ala Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile
                325                 330                 335
Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr
            340                 345                 350
Gly Gly Thr Lys Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg
        355                 360                 365
Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser
    370                 375                 380
Glu Glu Asp Leu
385
<210>20
<211>383
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：融合蛋白
<400>20
Met Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg Ser Ala
  1               5                  10                  15
Gly Glu Thr Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro
             20                  25                  30
Ser Gly Ser Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile
         35                  40                  45
Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln
 65                  70                  75                  80
Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys
                 85                  90                  95
Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser
            100                 105                 110
Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala
        115                 120                 125
Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln
    130                 135                 140
Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn
145                 150                 155                 160
Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu
                165                 170                 175
Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly
            180                 185                 190
Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu
        195                 200                 205
Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met
    210                 215                 220
Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys
225                 230                 235                 240
Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu
                245                 250                 255
Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp
            260                 265                 270
Phe Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly
        275                 280                 285
Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu
    290                 295                 300
Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val
305                 310                 315                 320
Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser Val
                325                 330                 335
Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val
            340                 345                 350
Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu
        355                 360                 365
Gly Lys Tyr Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
    370                 375                 380

Claims (21)

1.一种产物，其包括
第一组分，其为支架
第二组分，其为佐剂；和
第三组分，其为抗原。
2.权利要求1的产物，其中所述第二组分是多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞或T细胞或滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体。
3.权利要求1或2的产物，其中所述第三组分是多肽抗原。
4.权利要求1或2的产物，其中所述第三组分是非多肽抗原。
5.权利要求1-3之一的产物，其中所述支架和抗原是相同的。
6.权利要求5的产物，其中所述支架和抗原是病毒外壳蛋白。
7.权利要求6的产物，其中所述病毒外壳蛋白是乙肝表面抗原。
8.权利要求1-3之一的产物，其中所述支架和佐剂相同。
9.权利要求8的产物，其中所述支架和佐剂是C4bp核心蛋白。
10.药物组合物，其包含权利要求1-9之一的产物以及可药用的载体或稀释剂。
11.诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-10之一的产物给药受试者。
12.制备产物的方法，所述产物包括：
第一组分，其为多肽支架；
第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞或T细胞或滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和
第三组分，其为多肽抗原，
所述方法包括表达编码这三种组分的融合蛋白的核酸，以及回收所述产物。
13.制备产物的方法，所述产物包含：
第一组分，其为多肽支架；
第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞或T细胞或滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和
第三组分，其为非多肽抗原，
所述方法包括表达编码第一组分和第二组分的融合蛋白的核酸，将所述融合蛋白与该第三组分相连，以及回收所述产物。
14.权利要求12或13的方法，其中所述核酸在原核宿主细胞中表达。
15.权利要求14的方法，其中所述融合蛋白以多聚体的形式被回收。
16.权利要求15的方法，其中所述重组蛋白的浓度为至少2mg/l细胞培养物。
17.权利要求15或16的方法，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌。
18.一种表达载体，其包含编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白为以下组分的融合蛋白：
第一组分，其为多肽支架；
第二组分，其为多肽，所述多肽是CD21的配体或者是B细胞或T细胞或滤泡树突细胞或其它抗原呈递细胞的细胞表面分子的配体；和可选地
第三组分，其为多肽抗原，
所述核酸序列可操作地连接于在宿主细胞中有功能的启动子。
19.细菌宿主细胞，其由权利要求18的表达载体转化。
20.真核宿主细胞，其由权利要求18的载体转化。
21.权利要求20的表达载体在人或动物体的治疗方法中的用途。
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