CN101035897A - 用于预防和治疗hiv感染的疫苗 - Google Patents

用于预防和治疗hiv感染的疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN101035897A
CN101035897A CNA2005800340055A CN200580034005A CN101035897A CN 101035897 A CN101035897 A CN 101035897A CN A2005800340055 A CNA2005800340055 A CN A2005800340055A CN 200580034005 A CN200580034005 A CN 200580034005A CN 101035897 A CN101035897 A CN 101035897A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nef
polypeptide
gag
immunogenic fragments
derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005800340055A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101035897B (zh
Inventor
H·阿布勒希特
M·德尔钱布尔
M·马尚
N·L·马蒂
P·J·G·G·佩尔曼纳
G·H·沃斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Publication of CN101035897A publication Critical patent/CN101035897A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101035897B publication Critical patent/CN101035897B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及用于免疫原性组合物和疫苗中的Gag、Pol和Nef的HIV多肽和多核苷酸融合体。本发明具体涉及包含Nef或其免疫原性片段，和p17 Gag和/或p24 Gag或其免疫原性片段的多肽，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段。该多肽还可包含Pol或RT或其免疫原性片段。

Description

用于预防和治疗HIV感染的疫苗
发明领域
本发明涉及新的HIV多肽构建体、它们在医药中的用途、含有它们的药物组合物和它们的制备方法。本发明还涉及编码该多肽的多核苷酸。具体而言，本发明涉及包含HIV-1 Nef和HIV-1 Gag或其片段的融合蛋白，和编码它们的多核苷酸。更具体而言，本发明涉及包含HIV-1 Nef、HIV-1 Pol和HIV-1 Gag蛋白或其片段的融合蛋白和编码它们的多核苷酸。
HIV-1是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要原因，AIDS被认为是世界主要健康问题中的一种。因此需要能够用于HIV感染的预防和/或治疗的疫苗。
发明背景
HIV-1是逆转录病毒科的RNA病毒。HIV基因组编码至少9种蛋白，它们分成三类：主要的结构蛋白Gag、Pol和Env、调节蛋白Tat和Rev及辅助蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因组显示所有逆转录病毒的5′LTR-gag-pol-env-LTR3′组构。
HIV包膜糖蛋白gp120是用于附着宿主细胞的病毒蛋白。这种附着通过与称作CD4的辅助T细胞和巨噬细胞的两种表面分子和两种趋化因子受体CCR-5或CXCR-4之一结合而介导产生。gp120蛋白首先表达为较大的前体分子(gp160)，然后翻译后裂解产生gp120和gp41。gp120蛋白通过与插入到病毒膜中的gp41分子连接而保留在病毒体表面上。
gp120蛋白是中和抗体的主要靶，但遗憾的是，该蛋白最具免疫原性的区(V3环)也是该蛋白变异性最大的部分。因此，认为gp120(或其前体gp160)用作引发中和抗体的疫苗抗原对于广泛的保护性疫苗仅具有有限的作用。gp120蛋白还含有被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位。这些效应细胞能够消除病毒-感染的细胞，且因此构成第二种主要抗病毒免疫机制。与中和抗体的目标区相反，某些CTL表位似乎在不同HIV株中相对保守。为此，认为gp120和gp160是疫苗中的有效抗原性组分，目的在于引发细胞-介导的免疫反应(特别是CTL)。
HIV-1的非包膜蛋白包括，例如内部结构蛋白如gag和pol基因产物和其它非结构蛋白如Rev、Nef、Vif和Tat(Green等人，New EnglandJ.Med，324，5，308 et seq(1991)和Bryant等人(Ed.Pizzo)，Pediatr.Infect.Dis.J.，11，5，390 et seq(1992)。
HIV Nef是早期蛋白，即它们在感染早期及没有结构蛋白的情况下表达。
Nef基因编码早期辅助HIV蛋白，其已经显示出具有若干活性。例如，Nef蛋白已知可引起CD4、HIV受体、和细胞表面的I类MHC分子的下调，但还没有讨论过这些功能的生物学重要性。此外，Nef与T细胞信号途径相互作用并诱导活性状态，其依次可促进更有效的基因表达。某些HIV分离物在该区具有突变，其引起它们不编码功能性蛋白且严重危害它们的体内复制和发病。
Gag基因作为前体糖蛋白被翻译，其被蛋白酶裂解产生产物，该产物包括基质蛋白(p17)、衣壳(p24)、核衣壳(p9)、p6和两个间隔肽，p2和p1。
Gag基因导致产生55-千道尔顿(kD)Gag前体蛋白，也称作p55，其自未剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中，p55的N末端被肉豆蔻酰化，引起它与细胞膜的胞质方面相关联。膜相关的Gag糖蛋白募集病毒基因组RNA的两个拷贝连同引起病毒颗粒从感染细胞表面出芽的其它病毒蛋白和细胞蛋白。出芽后，在病毒成熟为4个被称作MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])、和p6的较小蛋白的过程中，p55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)裂解。
除了3种主要的Gag蛋白外，所有Gag前体均含有若干其它区，它们被裂解并作为各种大小的肽保留在病毒体中。这些蛋白具有不同作用，例如，p2蛋白在蛋白酶的调节活性中具有预期的作用并对蛋白分解处理的正确时间控制作出贡献。
p17(MA)多肽来源于p55的N-末端的肉豆蔻酰化末端。绝大多数MA分子保持附着于病毒体脂双层的内表面，从而使颗粒稳定。MA的一个亚群在病毒体深层募集，它在那里变成复合物的一部分，其运送病毒DNA到细胞核。这些MA分子可帮助病毒基因组的核转运，这是因为MA上的亲核信号可由细胞核输入机械识别。这一现象使得HIV感染未-分裂的细胞，这是逆转录病毒与众不同的性质。
p24(CA)蛋白形成病毒颗粒的圆锥形核心。亲环蛋白A已被证实可与p55的p24区相互作用，导致其掺入到HIV颗粒中。Gag与亲环蛋白A之间的相互作用很重要，因为亲环蛋白A所致该相互作用的破坏可抑制病毒复制。
Gag的NC区负责特异性识别HIV所谓的包装信号。该包装信号由位于病毒RNA 5’末端附近的4个茎环结构组成，且足以介导异源RNA插入到HIV-1病毒体中。NC通过由两个锌-指基序介导的相互作用与包装信号结合。NC也促进逆转录。
p6多肽区介导p55 Gag与辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr掺入到组装中的病毒体中。p6区还含有所谓的晚期结构域，其是从感染细胞出芽的病毒体有效释放所需的。
Pol基因编码含有早期感染中病毒所需的两种活性的两种蛋白，即RT和病毒DNA整合到细胞DNA中所需的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒体蛋白酶裂解产生氨基末端RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA-依赖性DNA聚合酶活性以及RNA酶H功能)并产生羧基末端整合酶蛋白。HIV RT是全长RT(p66)和缺少羧基末端RNA酶H结构域的裂解产物(p51)的异二聚物。
RT是由逆转录基因组编码的保守性最高的蛋白之一。RT的两种主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可交换地利用RNA和DNA作为模板且与所有已知的DNA聚合酶一样，不能开始从头DNA合成，但需要预先存在的分子作为引物(RNA)。
所有RT蛋白固有的RNA酶H活性在除去作为DNA合成继续的RNA基因组的复制早期起重要作用。它选择性地使所有RNA-DNA杂交分子的RNA降解。结构上，聚合酶和核糖核酸H占据分开的、不重叠的结构域，其中Pol覆盖Pol三分之二的氨基。
p66催化亚单位折叠成5个不同的亚结构域。它们的氨基末端23具有RT活性部分。这些的羧基末端是RNA酶H结构域。
WO 03/025003描述了编码HIV-1 p17/24Gag、Nef和RT的DNA构建体，其中该DNA序列可被密码子优化，从而类似高水平表达的人类基因。这些构建体用于DNA疫苗中。
含多种HIV抗原的融合蛋白已被建议作为HIV的疫苗候选者，例如WO 99/16884中描述的Nef-Tat融合体。然而，融合蛋白不会直接产生；表达它们有困难是因为它们与天然蛋白不相应。在转录水平、或其它下游可能有困难。且，它们不能被直接配制成药学上可接受的组合物。特别是，包括融合在一起的多种抗原的绝大多数HIV疫苗形式是DNA或活的载体形式，而不是多肽融合蛋白。
发明概述
本发明提供用于HIV感染和AIDS的预防和治疗的疫苗中的新的构建体。
一方面，本发明提供一种多肽，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17 Gag和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段。
在此处所述本发明的构建体和组合物中，Nef优选是全长Nef。
在本发明的构建体中，p17 Gag和p24 Gag优选分别是全长p17和p24。
在其中一个实施方案中，该多肽同时包含p17和p24 Gag或其免疫原性片段。在这类构建体中，p24 Gag组分和p17 Gag组分被至少一个其它HIV抗原或免疫原性片段，如Nef和/或RT或其免疫原性片段或衍生物分开。
可选择性地，p17或p24 Gag可分开提供。因此，本发明还提供一种组合物，它包括(i)包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和p17 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物；或(i)包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)p17 Gag或其免疫原性片段或衍生物。
在另一实施方案中，本发明的多肽构建体还包括Pol或Pol的衍生物如RT或其免疫原性片段或衍生物。适用于本发明的RT的特定片段是其中RT在C末端被截短，优选使得它们缺少羧基末端RNA酶H结构域的片段。一个缺少羧基末端RNA酶H结构域的这类片段是此处所述p51片段。
优选，此处所述融合蛋白中的RT或免疫原性片段是p66 RT或p51 RT。
本发明融合蛋白或组合物的RT组分任选在第592位包括突变，或在除了HXB2的株中包括等同突变，这样一来甲硫氨酸通过突变成另一残基，例如赖氨酸而被除去。该突变的目的是除去起原核生物表达系统中内部起始位点作用的位点。
RT组分还，或可选择性地，包括突变以除去酶活性(逆转录酶)。因此K231可以代替W存在。
在本发明包含p24和RT的融合蛋白中，可优选在该构建体中p24在RT之前，这是因为当抗原在大肠杆菌中单独表达时，观察到p24的表达较之RT的表达更好。
本发明的优选构建体包括下列：
1.p24-RT-Nef-p17
2.p24-RT*-Nef-p17
3.p24-p51RT-Nef-p17
4.p24-p51RT*-Nef-p17
5.p17-p51RT-Nef
6.p17-p51RT*-Nef
7.Nef-p17
8.具有接头的Nef-p17
9.p17-Nef
10.具有接头的p17-Nef
*代表RT甲硫氨酸592突变成赖氨酸
上面所列构建体中包括的接头可以是任意较短的氨基酸序列，用于降低与它连接在一起的两个融合配偶体之间潜在的相互作用。该接头可以是例如4-10个氨基酸长。例如，它可以是6个氨基酸的序列，如此处实施例所述GSGGGP序列。
另一方面，本发明提供一种HIV抗原的融合蛋白，它包括至少4种HIV抗原或免疫原性片段，其中这4种抗原或片段是或来自Nef、Pol和Gag。优选Gag作为两个分开的组分存在，其被融合体中的至少一个其它抗原分开。优选，Nef是全长Nef。优选Pol是p66或p51RT。优选，Gag是p17和p24 Gag。本发明这一方面中融合体的抗原组分的其它优选特征和性质在此处描述。
本发明这一方面的优选实施方案是上面已经列出的4种组分的融合体：
1.p24-RT-Nef-p17
2.p24-RT*-Nef-p17
3.p24-p51RT-Nef-p17
4.p24-p51RT*-Nef-p17
包括在本发明中的与HIV抗原有关的术语“来源于”或“衍生物”是指与天然对应物相比，抗原已经以有限的方式被改变。这包括点突变，其可改变蛋白的性质，例如通过提高在原核系统中表达或除去不希望的活性包括不希望的酶活性。此处对于RT所描述的点突变被设计用于实现这些情况。然而，该抗原必须保持与天然抗原足够相似，这样它们可保留疫苗中所希望的抗原性质且因此它们保持能够引起对天然抗原的免疫反应。具体的衍生物是否引起这类免疫反应可通过适宜的免疫学测定法如ELISA(对于抗体反应)或使用细胞标记和细胞因子的适宜染色的流式细胞术(对于细胞反应)测量。
本发明HIV抗原的多肽构建体能够在体外系统包括原核生物系统如大肠杆菌中表达。有利地，它们可通过常规纯化方法纯化。
当在所选择的表达系统中表达时，此处所述融合体优选可溶，就是它们大量存在于表达系统粗提物的上清液中。粗提物中融合蛋白的存在可通过常规方法测量，如在SDS凝胶上电泳、考马斯染色和通过密度测量而检查适宜的带。本发明的融合蛋白优选至少50％可溶，更优选至少70％可溶，且最优选90％或更多可溶，这是通过实施例中所述技术测量的。提高重组表达蛋白溶解度的技术是已知的，例如，在原核生物表达系统中，溶解度通过降低诱导基因表达时的温度而提高。
可纯化此处所述融合蛋白。具体而言，当保持可溶或显著可溶时可纯化它们。
此处所述免疫原性片段将含有该抗原的至少一个表位并显示出HIV抗原性，且当以适宜构建体存在时，能够提高免疫反应，例如当与其它HIV抗原融合或在载体上存在时，免疫反应针对天然抗原。通常，免疫原性片段含有至少20、优选50、更优选100个来自HIV抗原的连续氨基酸。
本发明另一方面提供编码本发明多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可用作多核苷酸疫苗。该多核苷酸可存在于本领域普通技术人员已知的任意递送系统内，包括核酸表达系统如质粒DNA、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术都是本领域熟知的，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15：143-198，1998和其中引用的参考文献描述的那些。适宜的核酸表达系统含有在患者中表达的必需DNA序列(如适宜的启动子和终止信号)。当表达系统是重组活微生物，如病毒或细菌时，目标基因可被插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。使用该活的载体进行接种和体内感染将导致抗原的体内表达和免疫反应的诱导。用于该目的的病毒和细菌是，例如：痘病毒(例如牛痘、禽痘、金丝雀痘、修饰痘病毒，例如修饰的病毒Ankara(MVA))、甲病毒(新培斯病毒、Semliki Forest病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)、黄病毒(黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)、麻疹病毒(例如，麻疹)、李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、奈瑟氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是有毒的，或以各种方式减毒以获得活疫苗。这种活疫苗形成本发明的一部分。
用作本发明活载体的优选麻疹载体是施瓦茨氏株或从其衍生的株系。
用作活载体的优选腺病毒是低血清阳性率人腺病毒如Ad5或Ad35或非人来源的腺病毒如非人灵长类动物腺病毒如猿腺病毒。这种低血清阳性率人腺病毒或类似的腺病毒在人群中具有低于60，通常低于50％的血清阳性率。优选，载体是复制缺陷的。通常，这些病毒含有E1缺失且可在用E1基因转化的细胞系上生长。优选的猿腺病毒是从黑猩猩中分离出来的病毒。具体而言，C68(也称作Pan 9)(见美国专利No6083 716)和Pan 5、6和Pan 7(WO 03/046124)优选用于本发明中。这些载体可被操纵插入本发明的异源多核苷酸，这样一来就可表达本发明的多肽。这类重组腺病毒载体的应用、配制和制造在WO 03/046142中详细描述。
因此，本发明优选疫苗的Nef、p17和p24 Gag和RT可以编码所需多肽的多核苷酸形式提供。
本发明的多核苷酸可用于在所选择表达系统中表达编码的多肽。至少一个HIV抗原，例如，RT，可被多核苷酸中的密码子优化序列编码，也就是说该序列已被优化以便在所选择的重组表达系统如大肠杆菌中表达。
另一方面，本发明提供一种p51 RT多肽或其衍生物或编码它的多核苷酸，优选为在适宜的表达系统，特别是原核生物系统如大肠杆菌中表达而被密码子优化。
p51 RT多肽或多核苷酸可单独使用，或与本发明的多肽或多核苷酸构建体组合使用。因此，另一方面，本发明提供一种组合物，它包括(i)含有Nef或含Nef表位的片段和p17 Gag和/或p24 Gag的多肽，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段，和(ii)p51 RT多肽。本发明还提供编码这些的多核苷酸。
根据该实施方案，(i)可选自，例如：
1.Nef-p17
2.具有接头的Nef-p17
3.p17-Nef
4.具有接头的p17-Nef
优选Nef是全长Nef。优选p17是全长p17。
本发明的多肽和多核苷酸可与其它抗原或编码其它抗原的多核苷酸组合。具体而言，这可包括HIV env蛋白或其片段或衍生物。env的优选形式是gp120、gp140和gp160。env可以是，例如，WO 00/07631中描述的包膜蛋白，其来源于被称作R2的HIV-1进化枝B包膜克隆，或其片段或衍生物。因此，本发明还提供一种组合物，它包含本发明的任意多肽或多肽组合物，以及HIV env蛋白或其片段或衍生物。类似地，本发明提供一种组合物，它包含编码本发明多肽的多核苷酸和编码HIV env蛋白或其片段或衍生物的多核苷酸。
本发明还提供制备此处所述多肽的方法，该方法包括在适宜的表达系统，特别是原核生物系统如大肠杆菌中表达编码多肽的多核苷酸，并回收表达的多肽。优选在低温，即低于37°的温度下诱导表达，从而促进多肽的溶解。
本发明还提供一种纯化此处所述多肽的方法，该方法包括：
i).提供含未纯化多肽的组合物；
ii).使该组合物经过至少两个色谱步骤；
iii).任选地使该多肽羧基酰胺化；
iv)进行缓冲液更换步骤以提供用于药物制剂的适宜缓冲液中的蛋白。
羧基酰胺化可在两个色谱步骤之间进行。羧基酰胺化步骤可使用碘乙酰亚胺进行。
在其中一个实施例中，本发明方法使用至多两个色谱步骤。
本发明还提供含本发明多肽和多核苷酸以及药学上可接受的佐剂或载体的药物组合物和免疫原性组合物和疫苗。
本发明的疫苗可用于HIV的预防或治疗性免疫。
本发明还提供此处所述多肽和多肽组合物以及多核苷酸和多核苷酸组合物在制备用于HIV的预防或治疗性免疫的疫苗中的应用。
本发明的疫苗含有免疫保护或免疫治疗量的多肽和/或多核苷酸抗原且可通过常规技术制备。
疫苗的制备通常在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中描述。在脂质体内的包囊化由Fullerton，U.S.Patent 4,235,877描述。蛋白与大分子的缀合由Likhite，U.S.Patent 4,372,945和Armor等人，美国专利4,474,757公开。
疫苗剂量中蛋白的量可选择为在一般疫苗接种者中诱导免疫保护反应，而没有显著的不利副作用的量。这种用量将根据所用具体的免疫原和所选择的接种方案而变化。通常，预期各剂含有1-1000μg每种蛋白，优选2-200μg，最优选4-40μg多肽融合体。具体疫苗的最佳用量可通过标准研究确定，包括受治疗者中抗体滴度和其它免疫反应的观察。最初接种后，受治疗者可在约4周内接受加强免疫，和随后第二次加强免疫。
本发明的蛋白优选与佐剂一起用于本发明的疫苗制剂中。佐剂一般在Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant Approach，edited byPowell and Newman，Plenum Press，New York，1995中描述。
适宜的佐剂包括铝盐如氢氧化铝或磷酸铝，但还可以是钙、铁或锌盐，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖的不溶性混悬液，阳离子或阴离子衍生的多糖，或含聚磷腈。
在本发明的制剂中，优选佐剂组合物诱导优先的Th1反应。然而，应了解其它反应，包括其它体液反应也不排除。
通过抗原与免疫系统细胞的相互作用，对抗原产生免疫反应。所得免疫反应可广义区别为两个极端的种类，即体液或细胞介导的免疫反应(常规分别由保护的抗体和细胞效应机制鉴别)。这些类的反应被称作Th1-型反应(细胞-介导的反应)，和Th2-型免疫反应(体液反应)。
极端的Th1-型免疫反应可通过抗原特异性的、单倍型限制的细胞毒性T淋巴细胞、和天然杀伤细胞反应的产生鉴别。在小鼠中，Th1-型反应常常通过IgG2a亚型抗体的产生鉴别，而在人类中，这些相当于IgG1型抗体。Th2-型免疫反应的特征在于较宽范围免疫球蛋白同种型，包括小鼠中IgG1、IgA和IgM。
可认为这两种类型免疫反应发展背后的驱动力是细胞因子，即许多已经确定的蛋白信使，其可帮助免疫系统的细胞并引导最后的免疫反应向着Th1或Th2反应的方向。因此，高水平的Th1-型细胞因子倾向有利于对已知抗原诱导细胞介导的免疫反应，而高水平的Th2-型细胞因子倾向有利于对抗原诱导体液免疫反应。
重要的是应记住Th1和Th2-型免疫反应的区别不是绝对的。事实上，个体将支持免疫反应，其被描述为占优的Th1或占优的Th2。然而，常常方便地认为是Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中描述的细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1and TH2 cells：different patterns of lymphokine secretion lead todifferent functional properties.Annual Review of Immunology，7，p145-173)。通常，Th1-型反应与T-淋巴细胞所致INF-γ和IL-2细胞因子的产生有关。常常直接与Th1-型免疫反应的诱导有关的其它细胞因子不是由T-细胞，如IL-12。相反，Th2-型反应与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)的分泌有关。
已知特定的疫苗佐剂特别适合于Th1或Th2-型细胞因子反应的刺激。通常，接种或感染后，免疫反应的Th1∶Th2平衡的最佳指示剂包括测量使用抗原再次刺激之后，T淋巴细胞体外所致Th1或Th2细胞因子的产生，和/或测量抗原特异性抗体反应的IgG1∶IgG2a比。
因此，Th1-型佐剂是当体外使用抗原再次刺激时，刺激分离的T-细胞群产生高水平Th1-型细胞因子，并诱导与Th1-型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白反应的佐剂。
可配制生产适用于本发明的佐剂的优选Th1-型免疫刺激剂包括且不限于下列。
单磷酰脂A，特别是3-脱氧-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)是用于本发明的优选Th1-型免疫刺激剂。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的熟知佐剂。化学上，常常以3-脱氧-酰化单磷酰脂A与4，5，或6酰化链混合物的形式提供。它可通过GB 2122204B中教导的方法纯化并制备，该文献还公开了二磷酰脂A，及其3-O-脱酰化变体的制备。已经描述过其它纯化且合成的脂多糖(US 6,005,099和EP 0 729473 B1；Hilgers等人，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)：392-6；Hilgers等人，1987，Immunology，60(1)：141-6；和EP 0 549 074 B1)。3D-MPL的优选形式是具有直径小于0.2μm的较小粒度的颗粒制剂形式，且其制备方法在EP 0 689 454中公开。
皂苷也是本发明的优选Th1免疫刺激剂。皂苷是熟知的佐剂且在Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.A review of the biological andpharmacological activities of saponins.Phytomedicine vol 2 pp 363-386)中教导。例如，Quil A(来源于南美树木Quillaja Saponaria Molina的树皮)及其级分在US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；和EP 0 362279 B1中描述。溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化的级分)已被描述为有效的系统佐剂，且它们的生产方法在US Patent No.5,057,540和EP 0 362 279 B1中公开。在这些文献中还描述了QS7(Quil-A的非-溶血级分)的用途，其可作为系统疫苗的有效佐剂。QS21的用途在Kensil等人(1991.J.Immunology vol 146，431-437)中进一步描述。QS21和吐温或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。包含QuilA级分，如QS21和QS7的颗粒佐剂系统在WO 96/33739和WO 96/11711中描述。其中一个这类系统被称作Iscorn且可含有一种或多种皂苷。
另一优选的免疫刺激剂是含未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写词。当通过全身和粘膜途径给药时，CpG在本领域中已知可作为佐剂(WO 96/02555，EP 468520，Davis等人，J.Immunol，1998，160(2)：870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)：4463-6)。历史上，观察到BCG的DNA级分可发挥抗-肿瘤作用。在进一步的研究中，来源于BCG基因序列的合成寡核苷酸显示出能够诱导免疫刺激作用(不论体外还是体内)。这些研究的作者推断出特定的回文序列，包括中心的CG基序，具有该活性。CG基序在免疫刺激中的重要作用随后在Krieg，Nature 374，p546 1995的出版物中说明。详细分析显示CG基序必须位于特定的序列背景中，且这类序列在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物DNA中却是稀有的。免疫刺激序列常常是：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序没有甲基化；但其它未甲基化的CpG序列已知是免疫刺激性的且可用于本发明中。
在六个核苷酸的特定组合中，存在回文序列。一些这样的基序，或者作为其中一个基序的重复单位，或者作为不同基序的组合，可存在于同一寡核苷酸中。一个或多个这些含寡核苷酸的免疫刺激序列的存在可激活各种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素γ并具有细胞溶解活性)和巨噬细胞(Wooldrige等人，Vol 89(no.8)，1977)。其它不含该共有序列、含未甲基化CpG的序列现也显示出是免疫调节的。
当配制成疫苗时，CpG通常以游离溶液连同游离抗原(WO96/02555；McCluskie and Davis，supra)或与抗原共价缀合(WO98/16247)或使用载体如氢氧化铝配制的形式给药((Hepatitis surfaceantigen)Davis等人supra；Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。
可将上述这类免疫刺激剂连同载体一起配制，如脂质体、水包油乳液，和/或金属盐，包括铝盐(如氢氧化铝)。例如，3D-MPL可使用氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳液(WO 95/17210)配制；QS21可有利地使用含胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳液(WO 95/17210)或明矾(WO 98/15287)配制；CpG可使用明矾(Davis等人，supra；Brazolot-Millan supra)或其它阳离子载体配制。
免疫刺激剂的组合也是优选的，特别是单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合(WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO99/12565；WO 99/11241)，更特别是WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合。可选择性地，CpG加皂苷如QS21的组合也可形成用于本发明的有效佐剂。可选择性地，可在脂质体或Iscorn中配制皂苷并与免疫刺激性寡核苷酸组合。
因此，适宜的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂A，优选3D-MPL，连同铝盐的组合。增强的系统包括单磷酰脂A和皂苷衍生物的组合，特别是WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或WO96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中QS21在含胆固醇的脂质体(DQ)中被猝灭。此外，该组合还含有免疫刺激性寡核苷酸。
水包油乳液形式的、含QS21，3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂在WO 95/17210中描述，且是用于本发明的另一优选制剂。
另一优选制剂包含单独的CpG寡核苷酸或连同铝盐。
本发明又一方面提供一种制备此处所述疫苗制剂的方法，其中该方法包括将本发明的多肽与适宜佐剂混合。
用于本发明制剂的特别优选的佐剂组合如下：
i)3D-MPL+QS21，在脂质体中
ii)Alum+3D-MPL
iii)Alum+QS21，在脂质体中+3D-MPL
iv)Alum+CpG
v)3D-MPL+QS21+水包油乳液
vi)CpG
药物组合物的给药可采用一个或超过一个的单独给药形式，例如含有相同多肽组合物的重复给药，或异质性“激发-加强”接种方案。异质性激发-加强方案在激发和加强时，使用不同形式疫苗的给药，其各自本身可包括两次或多次给药。激发组合物和加强组合物将共有至少一个抗原，虽然无需相同形式的抗原，它可以是不同形式的相同抗原。
本发明的激发加强免疫可使用蛋白和基于DNA的制剂的组合进行。这种策略被认为可有效诱导广泛的免疫反应。含佐剂的蛋白疫苗主要包括抗体和T辅助细胞免疫反应，而DNA作为质粒或活载体的递送可诱导较强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。因此，蛋白和DNA接种的组合可提供广泛的免疫反应。这在HIV背景下是特别合适的，因为同时中和抗体和CTL被认为对HIV的免疫防御很重要。
根据本发明，接种方案可包括多肽抗原和编码该多肽的DNA的顺序(“激发-加强”)或同时给药。该DNA可以裸DNA如质粒DNA或重组活载体，如痘病毒载体、腺病毒载体、麻疹病毒载体或任何其它适宜活载体的形式递送。蛋白抗原可注射一次或若干次，接着是一次或多次DNA给药，或可首先一次或多次给予DNA，接着进行一次或多次蛋白免疫。
本发明激发-加强免疫的具体例子包括使用重组活载体形式的DNA，如修饰的痘病毒载体，例如修饰的病毒Ankara(MVA)或甲病毒，例如委内瑞拉马脑亚病毒载体，或腺病毒载体或麻疹病毒载体激发，接着使用蛋白，优选配有佐剂的蛋白加强。
因此，本发明还提供一种药物试剂盒，它包含：
a)一种组合物，包括含Nef或其免疫原性片段或衍生物和p17和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽连同药学上可接受的赋形剂，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段或衍生物；和
b)一种组合物，包括多核苷酸连同药学上可接受的赋形剂，该多核苷酸编码Nef和Gag中的一个或多个或含有存在于a)的多肽中的Nef或Gag表位的Nef或Gag的免疫原性片段或衍生物。优选a)的多肽还含有RT或其免疫原性片段或衍生物如p51RT。在可选择的实施方案中，该药物试剂盒包含：
a)一种组合物，它包括多核苷酸连同药学上可接受的赋型剂，所述多核苷酸编码多肽，该多肽含有Nef或其免疫原性片段或衍生物和p17和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段或衍生物；和
b)一种组合物，它包含多肽连同药学上可接受的赋形剂，其中该多肽含有Nef和Gag中的一个或多个或含有存在于a)的多肽中的Nef或Gag表位的Nef或Gag的免疫原性片段或衍生物。
优选，a)的多核苷酸编码多肽，其进一步包含RT或其免疫原性片段或衍生物如p51RT。
用于本发明激发/加强试剂盒中的优选多肽和多核苷酸是此处所述的多肽和多核苷酸。因此，蛋白/DNA型激发加强方法的蛋白组分可以是此处所述任何优选的融合蛋白。同样，DNA组分可以是编码任何优选蛋白的多核苷酸。
因此，例如，此处所述p24-RT-Nef-p17，p24-RT*-Nef-p17，p24-p51RT-Nef-p17，p24-p51RT*-Nef-p17，p17-p51RT-Nef或p17-p51RT*-Nef融合体或任何p17-Nef融合体可在激发加强试剂盒中提供，其中激发组合物包含融合蛋白而加强组合物包含编码该融合蛋白的多核苷酸，或激发组合物包含多核苷酸而加强组合物包含融合蛋白。
激发组合物和加强组合物均可以超过一剂的形式递送。此外，初始的激发和加强给药之后，可进一步给药，其可交替得到，例如DNA质粒激发/蛋白加强/进一步DNA质粒给药/进一步蛋白给药。
密码子优化是指多核苷酸序列被优化从而类似所需表达系统，例如原核生物系统如大肠杆菌中基因的密码子选择。具体而言，序列中的密码子选择被优化，从而类似高水平表达的大肠杆菌基因。
为在本发明重组系统中表达而优化密码子的目的有两重：提高重组产物的表达水平并使表达产物更均匀(获得更均匀的表达模式)。均匀性提高意味着无关的表达产物如截短物更少。适于大肠杆菌表达的密码子选择还可消除推断的“移码”序列以及过早终止和/或内部起始位点。
DNA代码有4个字母(A，T，C和G)且使用这些拼成三个字母的“密码子”，其代表生物基因中编码的蛋白的氨基酸。沿着DNA分子的密码子线性序列被翻译成由那些基因编码的蛋白中的氨基酸线性序列。代码是高度简并的，61个密码子编码20种天然氨基酸，3个密码子代表“终止”信号。因此，绝大多数氨基酸由不止一个密码子编码-事实上许多由4个或更多不同的密码子编码。
当使用不止一个密码子编码已知氨基酸时，观察到生物的密码子选择模式是高度非随机的。不同物种显示它们密码子选择的不同偏好且，此外，密码子的利用在单一物种的以高水平和低水平表达的基因之间显著不同。这种偏好在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中是不同的，且某些物种显示出较之其它物种，远离随机密码子选择的更强偏好。例如，人和其它哺乳动物与某些细菌或病毒相比，偏好不太强。由于这些原因，源于在大肠杆菌中表达的哺乳动物病毒的病毒基因，或在哺乳动物细胞中表达的外源或重组基因对于有效表达具有不适当的密码子分布存在显著可能性。据信在密码子簇异源DNA序列中的存在或密码子的富足，很少在存在表达的宿主中观察到，它是该宿主中较低异源表达水平的预兆。
在本发明的多核苷酸中，密码子选择模式因此可根据典型的人免疫缺陷病毒而改变，从而更接近代表靶生物，例如大肠杆菌的密码子偏好。
用于密码子优化的可公开得到的程序有很多，例如，″CalcGene″(Hale and Thompson，Protein Expression and Purification 12：185-189(1998)。
                           实施例
实施例1：HIV-1 p24-RT-Nef-p17融合体F4和密码子优化的(co)F4的构建和表达
1.未密码子优化的F4
HIV-1 gag p24(衣壳蛋白)和p17(基质蛋白)、逆转录酶和Nef蛋白在嗜菌体T7启动子(pET表达系统)的控制下，在大肠杆菌B834株(B834(DE3)是BL21(DE3)的甲硫氨酸营养缺陷型亲代)中表达。
它们表达为含有4种蛋白的完整序列的单一融合蛋白。成熟的p24编码序列来自HIV-1 BH10分子克隆，成熟的p17序列和RT基因来自HXB2且Nef基因来自BRU分离物。
诱导后，重组细胞表达占总蛋白10％的显著水平的p24-RT-Nef-p17融合体。
当细胞在22℃下生长并诱导时，p24-RT-Nef-p17融合蛋白主要被限制到细菌裂解产物的可溶性级分(甚至冻/融之后)。当在30℃下生长时，约30％的重组蛋白与不溶性级分有关。
融合蛋白p24-RT-Nef-p17由1136个氨基酸组成，分子量约为129kDa。全长蛋白在SDS凝胶上迁移约130kDa。该蛋白基于其氨基酸序列具有7.96的理论等电点(pI)，这是通过2D-凝胶电泳加以证实的。
重组质粒的详细描述：
名称：pRIT15436(或实验室名称pET28b/p24-RT-Nef-p17)
宿主载体：pET28b
复制子：colE1
选择：卡那霉素
启动子：T7
插入：p24-RT-Nef-p17融合基因
重组蛋白的详细描述：
p24-RT-Nef-p17融合蛋白：1136个氨基酸
N-末端-p24：232a.a.-铰链区：2a.a.-RT：562a.a.-铰链区：2a.a.-Nef.206a.a.--P17：132a.a.-C-末端
核苷酸和氨基酸序列：
核苷酸序列
Figure A20058003400500211
Figure A20058003400500212
tgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggcc
attgacagaagaaaaaataaaageattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagg
qaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaa
aaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactca
agacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatc
agtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttccettagatgaagaettcag
gaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatca
gtacaatgtgcttccaCagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgac
aaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatgga
tgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagct
gagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaceagacaaaaaacatcagaaagaacc
tccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagt
gctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaa
ttgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagagg
aaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcaga
aaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt
aatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagcc
atttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggtgcccacactaatgatgt
aaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaa
gactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagta
ttggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaatt
atggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggc
agctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaa
agttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagc
tttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaat
cattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagtt
aataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaa
Figure A20058003400500221
a gtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctg
agccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatca
caagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggagg
aggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact
tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta
attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac
ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga
tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag
aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg
ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg
Figure A20058003400500222
attagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaa
acatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttaga
aacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatc
agaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggat
agagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaa
gaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaatta
ctaa[SEQ ID NO：1]
p24序列以粗体表示
Nef序列加了下划线
方框：通过基因构建引入的核苷酸
氨基酸序列
Figure A20058003400500231
Figure A20058003400500232
MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK                                        300
KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY                                        350
FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT                                        400
KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT                                        450
Figure A20058003400500233
WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH                                        550
GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV                                        600
KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE                                        650
FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK                                        700
VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES                                        750
Figure A20058003400500234
WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA                                        850
CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ                                        900
RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE                                        950
EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK                                        1000
NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD                                        1100
TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY                                                      1136
[SEQ ID NO：2]
P24序列：氨基酸1-232(粗体)
RT序列：氨基酸235-795
Nef序列：氨基酸798-1002
P17序列：氨基酸1005-1136
方框：通过基因构建引入的氨基酸
K(赖氨酸)：代替色氨酸(W).引入突变除去酶活性
重组蛋白的表达：
在pET质粒中，靶基因(p24-RT-Nef-p17)受到强嗜菌体T7启动子的控制。该启动子不能由大肠杆菌RNA聚合酶识别且依赖于宿主细胞中T7 RNA聚合酶的来源。B834(DE3)宿主细胞含有在lacUV5控制之下的T7 RNA聚合酶的染色体拷贝且表达通过向细菌培养物中加入IPTG而诱导。
使预培养物在37℃下，在摇瓶中生长至中-对数期(A620：0.6)然后在4℃下过夜(以避免静止期培养物)贮存。使培养物在补充了1％葡萄糖和50pg/ml卡那霉素的LBT培养基中生长。将葡萄糖加入到生长培养基中具有减少基础重组蛋白表达(避免cAMP介导的lacUV5启动子的脱抑制)的优点。
4℃过夜贮存的10ml培养物用于接种200ml含卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在30℃和22℃下生长且当O.D.620达到0.6时，加入IPTG(1mM终浓度)。使培养物再培养3、5和18小时(过夜)。在3、5和18小时诱导之前和之后采集样品。
提取物制备如下：
将细胞沉淀混悬于断裂缓冲液*(理论O.D.为10)中并通过在弗氏压碎器(20.000psi或1250巴)中传代4次而破裂。20.000g离心粗提物(T)30分钟，分离可溶性(S)和不溶性(P)级分。
*断裂缓冲液：50mM Tris-HCL pH 8.0，1mM EDTA，1mM DTT+蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Complete/Boerhinger)
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：
与不溶性沉淀(P)、上清液(S)和粗提物(T)相应的级分在10％还原SDS-PAGE上电泳。p24-RT-Nef-p17重组体是通过考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹(WB)检测的。
考马斯染色：p24-RT-Nef-p17蛋白显现为：
其中一个带在±130kDa(使用计算的MW拟合)
MW理论值：128.970道尔顿
MW近似值：130kDa
蛋白质印迹分析：
试剂＝RT的单克隆抗体(p66/p51)
购自ABI(Advanced Biotechnologies)
稀释：1/5000
-碱性磷酸酶缀合的抗-小鼠抗体
稀释：1/7500
表达水平：22℃下诱导20小时后，
非常强的p24-RT-Nef-p17特异性带，
占总蛋白的最多10％(见图1A)
重组蛋白“溶解度”：
“新鲜的”细胞提取物(T，S，P级分)：22℃/20h生长/诱导，在细胞提取物的可溶性级分中回收到几乎所有的p24-RT-Nef-p17融合蛋白(图1A)。30℃/20h生长/诱导，约30％的p24-RT-Nef-p17蛋白与不溶性级分有关(图1A)
“冻/融”(S2，P2级分)：
-20℃保存可溶性(S1)级分(22℃诱导20h)。融化并20.000g/30分钟离心：S2和P2(重混悬于1/10vol中)
含DTT的断裂缓冲液：几乎所有p24-RT-Nef-p17融合蛋白仍然可溶(仅1-5％沉淀)(见图1B)
不含DTT的断裂缓冲液：85-90％的p24-RT-Nef-p17仍然可溶(图1B)图：
图1A-考马斯染色和蛋白质印迹
图1B-p24-RT-Nef-p17溶解度测定法
F4蛋白使用实施例7中的方法I纯化。
除非指定了其它条件(例如，温度、断裂缓冲液组成)，下面实施例的细胞生长和诱导条件及细胞提取物的制备如实施例1中所述。
2.密码子-优化的F4
下列多核苷酸序列被密码子优化，这样密码子选择类似在大肠杆菌中高水平表达的基因的密码子选择。氨基酸序列与上面未密码子优化的F4所给出的相同。
F4co的核苷酸序列：
Figure A20058003400500262
agaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatggatggtccaaaggtcaagcagtggcc
gctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagagatttgtactgaaatggagaaggaagg
caagataagcaagatcgggccagagaacccgtacaatacaccggtatttgcaataaagaa
aaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagattttagggaactaaacaagcgaaccca
agacttttgggaagtccaactagggatcccacatccagccggtctaaagaagaagaaatc
ggtcacagtcctggatgtaggagacgcatattttagtgtaccgcttgatgaggacttccg
aaagtatactgcgtttactataccgagcataaaeaatgaaacgccaggcattcgctatca
gtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtctceggcgatatttcagagctgtatgac
aaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccggatattgtaatttaccaatacatgga
cgatctctatgtgggctcggatctagaaattgggcagcatcgcactaagattgaggaact
gaggcaacatctgcttcgatggggcctcactactcccgacaagaagcaccagaaggagcc
gccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccggacaagtggacagtacagccgatagt
gctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgatattcagaaactagtcggcaagcttaa
ctgggcctctcagatttacccaggcattaaggtccgacagctttgcaagctactgagggg
aactaaggctctaacagaggtcatcccattaacggaggaagcagagcttgagctggcaga
gaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggggtatactacgacccctccaaggacct
tatagccgagatccagaagcaggggcagggccaatggacgtaccagatatatcaagaacc
gtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgcatgcgaggggctcatactaatgatgt
aaagcaacttacggaagcagtacaaaagattactactgagtctattgtgatatggggcaa
gaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaaacatgggaaacatggtggactgaata
ttggcaagctacctggattccagaatgggaatttgtcaacacgccgccacttgttaagct
ttggtaccagcttgaaaaggagccgatagtaggggcagagaccttctatgtcgatggcgc
cgcgaatcgcgaaacgaagctaggcaaggcgggatacgtgactaataggggccgccaaaa
ggtcgtaacccttacggataccaccaatcagaagactgaactacaagcgatttaccttgc
acttcaggatagtggcctagaggtcaacatagtcacggactctcaatatgcgcttggcat
tattcaagcgcagccagatcaaagcgaaagcgagcttgtaaaccaaataatagaacagct
tataaagaaagagaaggtatatctggcctgggtccccgctcacaagggaattggcggcaa
Figure A20058003400500271
agtggtctaagtctagcgtagtcggctggccgacagtccgcgagcgcatgcgacgcgccg
aaccagccgcagatggcgtgggggcagcgtctagggatctggagaagcacggggctataa
cttccagtaacacggcggcgacgaacgccgcatgcgcatggttagaagcccaagaagagg
aagaagtagggtttccggtaactccccaggtgccgttaaggccgatgacc
tataaggcagcggtggatctttctcacttccttaaggagaaaggggggctggagggctta
attcacagccagaggcgacaggatattcttgatctgtggatttaccatacccaggggtac
tttccggactggcagaattacaccccggggccaggcgtgcgctatcccctgactttcggg
tggtgctacaaactagtcccagtggaacccgacaaggtcgaagaggctaataagggcgag
aacacttctcttcttcacccggtaagcctgcacgggatggatgacccagaacgagaggtt
ctagaatggaggttcgactctcgacttgcgttccatcacgtagcacgcgagctgcatcca
Figure A20058003400500272
actagatcgatgggaaaagatacgcctacgcccggggggcaagaagaagtacaagcttaa
gcacattgtgtgggcctctcgcgaacttgagcgattcgcagtgaatccaggcctgcttga
gacgagtgaaggctgtaggcaaattctggggcagctacagccgagcctacagactggcag
cgaggagcttcgtagtctttataataccgtcgcgactctctactgcgttcatcaacgaat
tgaaataaaggatactaaagaggcccttgataaaattgaggaggaacagaataagtcgaa
aaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccgggcacagcaaccaggtgtcccaaaacta
ctaa
[SEQ ID NO：3]
p24序列以粗体表示
Nef序列加了下划线
方框：通过基因构建引入的核苷酸
将未密码子优化的F4所用的过程用于密码子优化的序列。
重组质粒的详细描述：
名称：pRIT15513(实验室名称：pET28b/p24-RT-Nef-p17)
宿主载体：pET28b
复制子：colE1
选择：卡那霉素
启动子：T7
插入片段：p24-RT-Nef-p17融合基因，密码子-优化的
F4密码子-优化的基因在大肠杆菌BLR(DE3)细胞，即B834(DE3)株的recA-衍生物中表达。RecA突变防止λ嗜菌体的推断产生。
预培养物在37℃摇瓶中生长至中-对数期(A620：0.6)，然后4℃(以避免静止期培养物)过夜贮存。
培养物在补充了1％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的LBT培养基中生长。将葡萄糖加入到生长培养基中具有减少基础重组蛋白表达(避免cAMP介导的lacUV5启动子的脱抑制)的优点。
4℃过夜贮存的10ml培养物用于接种200ml含卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在37℃下生长且当O.D.620达到0.6时，加入IPTG(1mM终浓度)。使培养物22℃再培养19小时(过夜)。在19小时诱导之前和之后采集样品。
提取物制备如下：
将细胞沉淀重混悬于样品缓冲液(理论O.D.为10)中，煮沸并直接在SDS-PAGE上样。
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：
使粗提物在10％还原SDS-PAGE上电泳。
p24-RT-Nef-p17重组蛋白是通过考马斯亮蓝染色(图2)和蛋白质印迹检测的。
考马斯染色：p24-RT-Nef-p17蛋白显现为：
其中一个带在±130kDa(使用计算的MW拟合)
MW理论值：128.967道尔顿
MW近似值：130kDa
蛋白质印迹分析：
试剂＝-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)
稀释：1/10.000
-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)
稀释1/10.000
-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体.
稀释：1/7500
22℃诱导19小时后，重组BLR(DE3)细胞以占总蛋白10-15％的非常高的水平表达F4融合体。
与源于天然基因的F4相比，源于密码子-优化基因的F4重组产物分布稍稍简化。60kDa处的主要F4-相关带，以及下面的次要带没有显现(见图2)。与表达F4的B834(DE3)重组株相比，产生F4co的BLR(DE3)株具有下列优点：产生较高水平的F4全长蛋白，重组产物的复合带模式较少。
实施例2：P51 RT(截短的、密码子-优化的RT)的构建和表达
氨基酸428-448之间的RT/p66区对大肠杆菌蛋白酶敏感。P51构建体终止于Leu 427，导致RNA酶H结构域除去(见图3中的RT序列比对)。
还除去了RT天然基因序列中鉴定的推断大肠杆菌“移码”序列(通过p51基因的密码子优化)。
p51合成基因的设计/构建体：
根据大肠杆菌密码子选择设计合成p51基因的序列。因此，它被密码子优化，这样一来密码子选择类似大肠杆菌中高水平表达基因的密码子选择。合成基因如下构建：以一步PCR组装32个寡核苷酸。在第二步PCR中，使用末端引物扩增全长组装体，且所得PCR产物克隆到pGEM-T中间质粒中。校正在基因合成过程中引入的点误差后，p51合成基因克隆到pET29a表达质粒中。该重组质粒用于转化B834(DE3)细胞。
重组蛋白特征：
P51 RT核苷酸序列
Figure A20058003400500301
gatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagag                                      120
atttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtac                                      180
aatacaccggtatttgcaataaagaagaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagat                                      240
tttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactaggtatcccacat                                      300
ccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatatttt                                      360
agtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaac                                      420
aatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtct                                      480
ccggcgatatttcagagctctatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccg                                      540
gatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattggg                                      600
cagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactact                                      660
cccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccg                                      720
gacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgat                                      780
attcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtc                                      840
cgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacg                                      900
gaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggg                                      960
gtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaa                                      1020
tggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgc                                      1080
atgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattact                                      1140
actgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaa                                      1200
acatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaattt                                      1260
Figure A20058003400500302
[SEQ ID NO：4]
方框：通过基因构建引入的氨基酸
氨基酸序列：
NTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYF                                      120
SVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNP                                      180
Figure A20058003400500304
DKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLT                                      300
EEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR                                      360
MRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEF                                      420
Figure A20058003400500305
[SEQ ID NO：5]
方框：通过基因构建引入的氨基酸
K(赖氨酸)：代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性长度、分子量、等电点(IP)：433AA，MW：50.3kDa，，IP：9.08p51在B834(DE3)细胞中的表达：
与RT/p66生产株平行评价P51表达水平和重组蛋白溶解度。
p51表达水平：
诱导条件：5小时内，37℃下细胞生长/诱导(+1mM IPTG)
断裂缓冲液：50mM Tris/HCl，pH：7.5，1mM EDTA，+/-1mM DTT.
蛋白质印迹分析：
试剂：-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释：1/10,000)
-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释：1/7500)
使与粗提物(T)、不溶沉淀(P)和上清液(S)相应的细胞级分在10％还原SDS-PAGE上电泳。
正如在考马斯染色的凝胶和蛋白质印迹(图4)说明的，观察到非常高表达水平的P51(占总蛋白的15-20％)，高于对P66所观察到的。
p51和p66蛋白(37℃诱导5小时后)，在细胞提取物的可溶级分(S1)中回收到80％重组产物(见图4)。当在30℃下表达时，99％重组蛋白与可溶级分有关(没有给出数据)。
p51蛋白质印迹模式为多带，但较之相对P66观察到的，复杂程度较低。
溶解度测定法
溶解度测定法：在还原(含DTT的断裂缓冲液)和非-还原条件下制备的可溶(S1)级分的冻/融(5h诱导，37℃)。融化后，20.000g/30分钟离心S1样品，产生S2和P2(p2再次混悬于1/10vol.)。
在还原以及非-还原条件下制备的可溶级分(S1)冻/融后，在可溶(S2)部分中仍然回收到99％的p51和p66。在沉淀(P2)中仅发现1％。这在图5中示出。
实施例3：有或没有接头的p17-Nef和Nef-p17的构建和表达
使用或不使用接头构建双融合蛋白。接头目的在于降低两个融合配偶体之间潜在的相互作用且如下所示：
Figure A20058003400500321
重组质粒的构建：
·pET29a/Nef-p17表达载体：
通过PCR从F4重组质粒扩增Nef-p17融合基因。将PCR产物克隆到中间pGEM-T克隆载体中，并随后克隆到pET29a表达载体中。
·pET28b/p17-Nef表达载体：
通过PCR从F4重组质粒扩增Nef基因。将PCR产物克隆到中间pGEM-T克隆载体中，随后克隆到pET28b/p17表达载体中，作为与p17基因框内融合的C-末端。
·pET29a/Nef-接头-p17和pET28b/p17-接头-Nef表达载体：
通过定点诱变(使用″GeneTailor Site-Directed MutagenesisSystem″，Invitrogen)将编码六肽接头(GSGGGP)的18bp DNA片段插入到Nef和p17融合配偶体之间。
重组蛋白特征：
·长度、分子量、等电点(IP)
Nef-p17(称作NP)：340AA，MW：38.5kDa，IP：7.48
Figure A20058003400500322
p17-Nef(称作PN)：342AA，MW：38.7kDa，IP：7.19
Figure A20058003400500331
·氨基酸序列和多核苷酸序列：
Nef-p17核苷酸序列
Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg                                     60
Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat                                     120
Ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca                                     180
Caagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact                                     240
Tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta                                     300
Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac                                     360
Ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga                                     420
Tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag                                     480
Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg                                     540
Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg                                     600
Gagtacttcaagaactgcaggcctatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaa                                     660
Ttagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaa                                     720
Catatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaa                                     780
Acatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatca                                     840
Gaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata                                     900
Gagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaag                                     960
Aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattac                                     1020
Taa                                                                                              1023
[SEQ ID NO：6]
Nef-p17(NP)
Figure A20058003400500332
Figure A20058003400500333
HIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRI                                     300
EIKDTKEALDKIEEEQNKSKXKAQQAAADTGHSNQVSQNY                                                         340
[SEQ ID NO：7]
方框：通过基因构建引入的氨基酸
Nef序列以粗体表示
P17-Nef核苷酸序列：
Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg                                     60
Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag                                     120
Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata                                     180
Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat                                     240
Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct                                     300
Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct                                     360
Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctatgggtggcaag                                     420
Tggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgag                                     480
Ccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcaca                                     540
Agtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggag                                     600
Gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagct                                     660
Gtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa                                     720
Cgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattgg                                     780
Cagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaag                                     840
Ctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttg                                     900
Ttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggagg                                     960
Tttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaag                                     1020
Aactgctaa                                                                                        1029
[SEQ ID NO：8]
P17-Nef(PN)
Figure A20058003400500341
Figure A20058003400500342
SSNTAATNAACAWLBAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ                                     240
RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSL                                     300
LHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC                                                       342
[SEQ ID NO：9]
方框：通过基因构建引入的氨基酸
p17序列以粗体表示
Nef-接头-p17核苷酸序列：
Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg                                     60
Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat                                     120
Ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca                                     180
Caagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact                                     240
Tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta                                     300
Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac                                     360
Ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga                                     420
Tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag                                     480
Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg                                     540
Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg                                     600
Gagtacttcaagaactgcaggcctggatccggtggcggccctatgggtgcgagagcgtca                                     660
Gtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaag                                     720
Aaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagtt                                     780
Aatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaacca                                     840
Tcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctat                                     900
Tgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaa                                     960
Gagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaat                                     1020
Caggtcagccaaaattactaa                                                                            1041
[SEQ ID NO：10]
Nef-接头-p17(NLP)
MGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA                                     60
QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY                                     120
FPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREV                                     180
KKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLY                                     300
CVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY                                                   346
[SEQ ID NO：11]
六肽接头
方框：通过基因构建引入的氨基酸
P17-接头-Nef核苷酸序列：
Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg                                     60
Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag                                     120
Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata                                     180
Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat                                     240
Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct                                     300
Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct                                     360
Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctggatccggtggc                                     420
Ggtcctatgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaa                                     480
Agaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaa                                     540
Aaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggcta                                     600
Gaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagacca                                     660
Atgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaa                                     720
Gggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaa                                     780
Ggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacc                                     840
Tttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaa                                     900
Ggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagaga                                     960
Gaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctg                                     1020
Catccggagtacttcaagaactgctaa                                                                      1047
[SEQ ID NO：12]
P17-接头-Nef(PLN)
MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQI                                     60
LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAA                                     120
Figure A20058003400500361
KHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLE                                     240
GLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANK                                     300
GENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC                                                 348
[SEQ ID NO：13]
六肽接头
方框：通过基因构建引入的氨基酸
有或没有接头的Nef-p17，p17-Nef融合体的比较表达：
与F4和Nef产生株平行，30℃诱导4种重组株3小时。制备粗提物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹分析：
试剂：-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释：1/10,000)
-碱性磷酸酶缀合的-抗-兔抗体(稀释：1/7500)
如图6中举例说明的，有或没有接头的Nef-p17和p17-Nef融合体以高水平(占总蛋白10％)表达。
在蛋白质印迹中：四个双融合构建体呈现多带模式，但较之相对F4观察到的，复杂性较低。当单独表达时，Nef和p17蛋白呈现单带模式。
进一步分析(溶解度测定法，见下文)表达Nef-p17(NP)和p17-Nef(PN)融合体、没有接头肽的株。
Nef-p17和p17-Nef溶解度测定法：
与F4和Nef产生株平行，诱导Nef-p17和p17-Nef蛋白。
诱导条件：3小时内，30℃下细胞生长/诱导(+1mM IPTG)
断裂缓冲液：50mM Tris/HCl pH：8，50mM NaCl，1mM EDTA
新鲜的细胞提取物：
制备细胞提取物(在非还原条件下)并按照考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析与粗提物(T)、不溶沉淀(P)、和上清液(S1)相对应的部分。
如图7中考马斯染色凝胶和蛋白质印迹举例说明的，在细胞提取物的可溶级分(S)中回收到几乎所有Nef-p17、p17-Nef以及Nef蛋白。对于F4构建体：在沉淀级分中已经回收了5-10％的重组蛋白。
结论：
所试验的所有双融合构建体均高水平表达(＞10％总蛋白)。P17-Nef和Nef-p17融合蛋白较之F4更易溶解。两者均呈现复杂性较低的WB模式。
实施例4：p24-RT*-Nef-p17(F4*)的构建和表达
F4*是F4(p24-RT/p66-Nef-p17)融合体的突变形式，其中592位的甲硫氨酸被赖氨酸取代。该甲硫氨酸是推断的内部转录“起始”位点，如在F4纯化实验的Q琼脂糖洗脱物样品上进行的N-末端测序所支持的。实际上，Q洗脱物样品中存在的62kDa的主要F4-相关小带在592位的甲硫氨酸处开始。
甲硫氨酸被赖氨酸取代：RMR→RKR。RKR基序天然存在于分化枝A RT序列中。
评价该突变对CD4-CD8表位的影响：
-其中一个HLA-A3 CTL表位(A*3002)丢失，但另外9个HLA-A3表位存在于RT序列中。
-在该区中没有鉴定到辅助表位。
重组蛋白特性：
Figure A20058003400500381
·长度、分子量、等电点(IP)：
1136AA，129kDa，IP：8.07
·核苷酸序列：
Figure A20058003400500382
Figure A20058003400500391
Figure A20058003400500392
tgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcecaaaagttaaacaatggcc
attgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagg
gaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaa
aaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactca
agacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatc
agtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcag
gaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatca
gtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgac
aaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatgga
tgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagct
gagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacc
tccattccttaaaatgggttatgaactecatcctgataaatggacagtacagcctatagt
gctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaa
ttgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagagg
aaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcaga
aaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt
aatagcagaaatacagaagcaggggeaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagcc
atttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcacgtaaacgcggtgcccacactaatgatgt
aaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaa
gactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggaeagagta
ttggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaatt
atggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggc
agctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaa
agttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagc
tttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaat
cattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagtt
aataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaa
Figure A20058003400500393
agtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctg
agccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatca
caagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggagg
aggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact
tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta
attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac
ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga
tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag
aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg
ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagcttcatccg
Figure A20058003400500401
attagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaa
acatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttaga
aacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatc
agaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggat
agagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaa
gaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaatta
ctaa
[SEQ ID NO：14]
p24序列以粗体表示
Nef序列加了下划线
方框：通过基因构建引入的核苷酸
·氨基酸序列
Figure A20058003400500402
Figure A20058003400500403
MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK                                 300
KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY                                 350
FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT                                 400
KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT                                 450
WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH                                 550
Figure A20058003400500405
KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE                                 650
FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK                                 700
VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES                                 750
Figure A20058003400500406
WSXSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA                                 850
CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ                                 900
RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE                                 950
EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK                                 1000
Figure A20058003400500411
NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD                               1100
TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY                                             1136
[SEQ ID NO：15]
P24序列：氨基酸1-232(粗体)
RT序列：氨基酸235-795
Nef序列：氨基酸798-1002
P17序列：氨基酸1005-1136
方框：通过基因构建体引入的氨基酸
Figure A20058003400500412
F4*在B834(DE3)细胞中的表达：
与F4未突变构建体平行，18小时内22℃诱导F4*重组株。制备粗提物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。
如图8所示，F4*高水平表达(10％总蛋白)，稍高于F4且小62kDa带消失。
蛋白质印迹分析：
试剂：-合并3种Mabs抗p24(JC13.1，JC16.1，IG8.1.1)(稀释1/5000)
-兔多克隆抗RT(兔P03L16)(稀释：1/10000)
-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)(稀释1/10000)
-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释：1/7500)
-碱性磷酸酶缀合的抗-小鼠抗体(稀释：1/7500)
实施例5：F3和F3*(突变F3)的构建和表达
F3(p17-p51-Nef)和F3*(p17-p51*Nef)，其中推断的内部甲硫氨酸起始位点被赖氨酸取代。
F3和F3*融合体可与p24组合使用。
重组质粒的构建：
F3：从pET29a/p51表达质粒切下编码p51的序列(ScaI和StuI DNA片段)并在StuI位点处(位于p17和Nef基因之间)连接到pET28b/p17-Nef质粒中，作为与p17和Nef序列的框内融合体。所得融合构建体p17-p51-Nef被称作F3。
F3*：使用“Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis system”(Invitrogen)获得推断的内部甲硫氨酸起始位点的突变，产生F3*构建体。
F3和F3*质粒用于转化B834(DE3)细胞。
重组蛋白特性：
Figure A20058003400500421
·长度、分子量、等电点(IP)
770AA，88.5kDa，IP：8.58
·核苷酸序列(F3*)
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg     60
ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag    120
ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata    180
ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat    240
Figure A20058003400500431
Figure A20058003400500432
CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG                                     480
TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG                                     540
GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA                                     600
AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA                                     660
ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG                                     720
AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC                                     780
TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC                                     840
TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT                                     900
ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC                                     960
ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG                                     1020
GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG                                     1080
GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG                                     1140
ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAAACTAGTCGGCAAG                                     1200
CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG                                     1260
AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG                                     1320
GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG                                     1380
GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA                                     1440
GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT                                     1500
GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG                                     1560
GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT                                     1620
GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA                                     1680
Figure A20058003400500433
agggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagac                                     1800
ctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcc                                     1860
tggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtaccttta                                     1920
agaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggga                                     1980
ctggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccac                                     2040
acacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatcca                                     2100
ctgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggcc                                     2160
aataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccct                                     2220
gagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccga                                     2280
gagctgcatccggagtacttcaagaactgctaa                                                                2213
[SEQ ID NO：16]
P17：以粗体表示的序列
P51：以大写字母表示的序列
Nef：以小写字母表示的序列
方框：通过基因构建引入的核苷酸
·氨基酸序列(F3)
Figure A20058003400500441
Figure A20058003400500442
EGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKK                            240
KSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSS                            300
MTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQK                            360
Figure A20058003400500443
RGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQ                            480
Figure A20058003400500444
Figure A20058003400500445
LEKHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGG                            660
LEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEA                            720
NKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC                                      770
[SEQ ID NO：17]
P17序列：氨基酸1-134(粗体)
P51序列：氨基酸137-562
Nef序列：氨基酸565-770
方框：通过基因构建引入的氨基酸
K(赖氨酸)K：代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性
F3在B834(DE3)细胞中的表达：
与F4(p24-p66-Nef-p17)和p17-Nef(F2)生产株平行，评价F3表达水平和重组蛋白溶解度。
诱导条件：3小时内，细胞37℃下生长/30℃下诱导(+1mM IPTG)
断裂缓冲液：F4：50mMTris/HCl pH：8.0，50mM NaCl，1mM EDTA，+/-1mM DTT
F2：50mMTris/HCl pH：8.0，50mM NaCl，1mM EDTA，不含DTT
F3：50mMTris/HCl pH：7.5，50mM NaCl，1mM EDTA，+/-1mM DTT
蛋白质印迹分析：
试剂-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释：1/10000)
-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)(稀释1/10000)
-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释：1/7500)
“新鲜的”细胞提取物
在10％还原SDS-PAGE上分析与粗提物(T)、不溶沉淀(P)和上清液(S)相对应的细胞级分。如图9所示，F3融合蛋白以高水平表达(10％总蛋白)。在细胞提取物的可溶级分(S)回收到几乎全部F3，虽然5-10％的F4产物已经与沉淀级分有关。与F4相比，WB模式被简化。
F3*在B834(DE3)细胞中的表达：
37℃诱导F3*重组株3小时，与F3未突变构建体平行。制备粗细胞提取物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。如图10所示，F3*融合蛋白以高水平(10-20％总蛋白)表达。与F3相比，WB模式简化；+/-32kDa(仅在WB上检测到)处非常弱的带消失。
实施例6：F4(p51)和F4(p51)*的构建和表达
RT/p51用于F4融合构建体(代替RT/p66)中。
F4(p51)＝p24-p51-Nef-p17
F4(p51)*＝p24-p51*-Nef-p17-突变的F4(p51)：推断的内部甲硫氨酸起始位点(存在于RT部分中)被赖氨酸取代，从而进一步简化了抗原模式。
重组质粒的构建：
F4(p51)：通过PCR从pET29a/p51表达质粒扩增编码p51的序列。将限制位点掺入到PCR引物中(NdeI和StuI位于编码序列的5′末端，AvrII位于编码序列的3′末端)。将PCR产物克隆到pGem-T中间质粒中并测序。pGem-T/p51中间质粒被NdeI和AvrII限制且p51片段连接到由NdeI和NheI限制的pET28b/p24-RT/p66-Nef-p17表达质粒中(导致RT/p66序列的切除)。连接是在有T4DNA连接酶存在的条件下，通过适宜浓度下的组合消化反应进行的。连接产物用于转化DH5α大肠杆菌细胞。p51向正确翻译读框中的插入(代替f4融合体中的RT/p66)是通过DNA测序加以证实的。所得融合构建体p24-RT/p51-Nef-p17被称作F4(p51)。
F4(p51)*：推断的内部甲硫氨酸起始位点(存在于RT/p51中)的突变使用“GeneTailor Site-Directed Mutagenesis system”(Invitrogen)实现，产生F4(p51)*构建体。
F4(p51)和F4(p51)*表达质粒用于转化B834(DE3)细胞。
重组蛋白特性：
Figure A20058003400500461
·长度、分子量、等电点(IP)：
1005AA，114.5kDa，IP：8.47
·核苷酸序列(F4(p51)*)
Atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact    60
Ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg   120
Ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg   180
Gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa   240
Tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca   300
Aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca   360
Aataatccacc tatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat  420
Figure A20058003400500471
CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG                                     780
TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG                                     840
GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA                                     900
AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA                                     960
ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG                                     1020
AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC                                     1080
TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC                                     1140
TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT                                     1200
ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC                                     1260
ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG                                     1320
GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG                                     1380
GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG                                     1440
ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAAACTAGTCGGCAAG                                     1500
CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG                                     1560
AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG                                     1620
GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG                                     1680
GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA                                     1740
GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT                                     1800
GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG                                     1860
GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT                                     1920
GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA                                     1980
Figure A20058003400500473
Gtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcga                                     2100
Gacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgt                                     2160
Gcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct                                     2220
Ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg                                     2280
Ggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctac                                     2340
Cacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatat                                     2400
Ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag                                     2460
Gccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgac                                     2520
Cctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc                                     2580
Figure A20058003400500474
TTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAA                                    2700
AAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAAT                                    2760
CCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCC                                    2820
CTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGT                                    2880
GTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG                                    2940
CAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAG                                    3000
GTCAGCCAAAATTACtaa                                                                     3018
[SEQ ID NO：18]
P24：以粗体表示的序列
P51：以大写字母表示的序列
Nef：以小写字母表示的序列
P17：加下划线的序列
方框：通过基因构建引入的核苷酸
·氨基酸序列(F4(p51)*)
Figure A20058003400500482
PIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAI                            300
KKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDED                            360
FRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY                            420
Figure A20058003400500483
IVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELEL                            540
Figure A20058003400500484
DVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLV                            660
Figure A20058003400500485
AWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY                            780
HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDD                            840
Figure A20058003400500486
KYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYC                            960
VHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY                                           1005
[SEQ ID NO：19]
P24：氨基酸1-232
P51：氨基酸237-662
Nef：氨基酸666-871
P17：氨基酸874-1005
K(赖氨酸)K：代替色氨酸(W).引入突变以除去酶活性
F4(p51)在B834(DE3)细胞中的表达：
与F4表达株平行，评价F4(p51)表达水平和重组蛋白溶解度。
诱导条件：19小时内，细胞在37℃下生长/22℃下诱导(+1mM IPTG)
断裂缓冲液：50mMTris/HCl pH：7.5，1mM EDTA，1mM DTT
蛋白质印迹分析：
试剂  -兔多克隆抗RT(兔PO3L16)(稀释：1/10000)
-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)(稀释1/10000)
-碱性磷酸酶缀合的抗-兔抗体(稀释：1/7500)
在10％还原SDS-PAGE上分析与粗提物(T)、不溶沉淀(P)和上清液(S)相对应的细胞级分。
如图11所示，F4(p51)以高水平(10％总蛋白)表达，类似F4。在细胞提取物的可溶级分(S)中回收到几乎所有的F4(p51)。用抗-Nef-tat试剂检测后，F4(p51)WB模式显示被简化(+/-60kDa以下的截短产物减少)。
F4(p51)*在B834(DE3)细胞中的表达：
与F4(p51)未突变构建体F4和F4*平行，22℃诱导F4(p51)*重组株18小时。制备粗细胞提取物并通过考马斯染色凝胶和蛋白质印迹分析。如图12所示，观察到F4(p51)和F4(p51)*融合体的高水平表达，占至少10％的总蛋白。WB模式：低于+/-60kDa的截短产物减少。此外，就F4(p51)*构建体而言，47kDa带(由于内部起始位点)消失。
实施例7：F4、F4(p51)*和F4*的纯化-纯化方法I
含4HIV抗原p24-RT-Nef-p17的融合蛋白F4是按照纯化方法I从大肠杆菌细胞匀浆纯化的，该方法包括下列主要步骤：
■F4的硫酸铵沉淀
■SO3 Fractogel阳离子-交换色谱(正电模式)
■辛基琼脂糖疏水相互作用色谱(正电模式)
■Q琼脂糖FF阴离子-交换色谱(正电模式)
■有SDS存在条件下的Superdex 200凝胶过滤色谱
■透析和浓缩
此外，F4(p51)*融合蛋白(RT被携带附加突变Met592Lys的、密码子优化的p51取代)和F4*蛋白(携带附加Met592Lys突变的F4)是用同一纯化方法I纯化的。
蛋白定量
■使用Lowry测定法测定总蛋白。测量蛋白浓度之前，针对PBS，0.1％SDS透析所有样品过夜，从而除去干扰物质(脲，DTT)。BSA(Pierce)用作标准品。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
■在还原或非还原SDS-PAGE样品缓冲液(+/-β-巯基乙醇)中制备样品并95℃加热5分钟。
■200V下，在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，使用1mm厚的预制Novex Tris-甘氨酸凝胶或Criterion凝胶(Bio-Rad)，分离蛋白75分钟。
■使用考马斯亮蓝R250目测观察蛋白。
■进行蛋白质印迹(WB)时，4℃100V下将蛋白从SDS-凝胶转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上共1.5小时或30V下过夜。
■F4是使用不同抗原的单克隆抗体，抗-p24、抗-Nef-Tat、抗-RT检测的(有时，抗-p24和抗Nef-Tat的混合物用于检测最大数目的蛋白带)。
■碱性-磷酸酶缀合的抗-小鼠或抗-兔抗体与第一抗体结合，并使用BCIP和NBT作为底物观察蛋白带。
抗-大肠杆菌蛋白质印迹
■通过SDS-PAGE分离5μg蛋白(Lowry)并转移到上述硝酸纤维素膜上。
■使用多克隆抗-大肠杆菌抗体检测残余的宿主细胞蛋白。使用上述碱性-磷酸酶反应观察蛋白带。
纯化方法I
方法I包括利用硫酸铵沉淀和4个色谱步骤：
■在含10mM DTT、1mM PMSF、1mM EDTA的pH 8.050mM Tris缓冲液中，在OD50(约360ml)对大肠杆菌细胞进行匀浆。1000巴下进行2次Rannie传代。
■14400×g离心20分钟除去细胞碎片和不溶物质。
■将硫酸铵(AS)从3.8M原液加入到澄清的上清液中至1.2M终浓度。使蛋白室温(RT)沉淀约2小时并通过离心(10min，14400×g)沉淀。将沉淀重混悬于溶解了8M脲、10mM DTT的pH 7.0的10mM磷酸盐缓冲液。
■在有溶解了8M脲和10mM DTT的pH 7.0的磷酸盐缓冲液存在条件下，在SO3 Fractogel柱(Merck)上捕获抗原。洗涤柱子，从而洗脱下未结合的蛋白，接着通过使用170mM NaCl进行预洗脱步骤而除去结合的宿主细胞蛋白(HCP)。然后用溶解了460mMNaCl、8M脲、10mM DTT的pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗脱F4。
■使用pH 7的10mM磷酸盐缓冲液2倍稀释SO3洗脱液，并在有溶解了4M脲、1mM DTT、230mM NaCl的pH 7.0的磷酸盐缓冲液存在的条件下，上样到辛基琼脂糖柱(AmershamBiosciences)。洗涤步骤(平衡缓冲液)之后，用溶解了8M脲、1mMDTT的pH 8.0的25mM Tris缓冲液洗脱结合的F4。
■稀释辛基洗脱液并调节至pH 9.0，然后在有pH 9.0的8M脲(25mM Tris)存在的条件下，F4与Q琼脂糖柱(AmershamBioscience)结合。洗掉(8M脲、25mM Tris，pH 9.0)未结合的蛋白并通过预洗脱步骤(90mM NaCl，溶于8M脲、25mM Tris中，pH 9.0)除去HCP和F4-降解产物。使用溶解了200mM NaCl、8M脲的pH 9.0的Tris缓冲液使F4从柱子上解吸。
■将1％SDS加入Q洗脱液的等分试样并针对含0.1％SDS和1mMDTT的PBS缓冲液透析，从而在将样品注射到凝胶过滤柱上之前除去脲(制备级Superdex 200，成行连接的两个16×60cm柱)。过程中的SDS-PAGE分析之后合并相关级分。
■RT下，在透析膜(12-14kDa截留分子量)中，针对1l 0.5M精氨酸、10mM Tris、5mM谷胱甘肽，pH 8.5过夜透析样品两次。
连续纯化步骤在下面的流程图中表示。
纯化流程图
                     360ml匀浆OD50(Rannie)
        50mM Tris pH 8.0，1mM PMSF，10mM DTT，2mM EDTA
                               ↓
                              澄清
                       14400×g离心20分钟
                               ↓
                           硫酸铵沉淀
              1.2M AS，2h，RT，14400×g离心，10min
                               ↓
         将沉淀重混悬于8M脲、10mM PO4、10mM DTT中，pH 7.0
                               ↓
                 (+)SO3Fractogel EMD 650(M)色谱
    pH 7.0，8M脲，10mM DTT，170mM NaCl预洗脱，460mM NaCl洗脱
                               ↓
           2×稀释至pH 7.0，4M脲，5mM DTT，230mM NaCl
                               ↓
                        (+)辛基琼脂糖色谱
        pH 7.0，4M脲230mM NaCl，8M脲，20mM Tris pH 8.0洗脱
                               ↓
                 约2×稀释，调节至pH 9.0(Na0H)
                               ↓
                       (+)Q琼脂糖FF色谱
      Tris pH 9.0，8M脲，90mM NaCl预洗脱，200mM NaCl洗脱
                               ↓
                          加入1％SDS
                               ↓
                              透析
                     →TBS，0.1％SDS，pH 8.5
                               ↓
               Superdex 200凝胶过滤色谱16×120cm
                     TBS，0.1％ SDS，pH 8.5
                               ↓
                             IPA SDS-PAGE
                                  ↓
                            合并/浓缩/透析
                          →配制相容的缓冲液
IPA-过程中的分析
如果没有特别说明，所有缓冲液均含有1mM DTT。
F4纯化结果
纯化过程后的SDS-PAGE/蛋白质印迹
图13表示在F4纯化过程中含F4级分的SDS凝胶和抗-p24/抗-Nef-Tat蛋白质印迹。
大肠杆菌匀浆在图13第2道中表示，据估计F4占总蛋白的约10％(考马斯蓝染色的SDS-凝胶的密度扫描)。离心后，在澄清的上清液中回收到F4的可溶级分(第3道)。硫酸铵沉淀步骤除去了许多杂质(第4道)并减少了随后色谱步骤的蛋白电荷。此外，8M脲用于重混悬含HCP的F4的解离复合物沉淀，并通过从SO3树脂定量洗脱而完全捕获F4。第5道中所示SO3洗脱液被认为富含于F4中，但不均一模式大部分保持未变。疏水性辛基琼脂糖柱主要除去低分子量(LMW)HCP和F4-降解产物(第6道)，由此简化F4模式。Q琼脂糖色谱可进一步简化F4模式并除去许多杂质(第7道)。大肠杆菌杂质的最终纯化是在该步骤之后获得的。事实上，通过抗-大肠杆菌蛋白质印迹分析，在Q洗脱液中没有检测到宿主细胞蛋白。由此产生的纯化的F4被称作F4Q。Superdex 200柱可将LMW F4-降解产物从全长F4中分离出来，提高Superdex 200洗脱液中F4的均匀性(第8道)。术语F4S可用于指代按照方法I的完整流程纯化的F4。
对在F4纯化过程中收集的相同级分进行抗-大肠杆菌蛋白质印迹。在抗-大肠杆菌蛋白质印迹上没有可见带，这表示Q洗脱液和Superdex洗脱液中的HCP污染低于1％。
F4和蛋白回收
通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评价纯化过程各步骤的F4回收。为了通过SDS-凝胶评价F4回收，上样到SDS-凝胶上的样品体积与纯化过程中收集的不同级分的体积相对应。
表1表示含F4级分中的蛋白回收
    表1：纯化过程中收集的F4-阳性级分的
      蛋白回收(360ml匀浆)。使用Lowry
            测定法测定蛋白浓度。
  纯化步骤   蛋白(mg)   步骤回收(％)   累积回收(％)
  匀浆   6500   100   100
  澄清的匀浆   4641   71   71
  重混悬的AS沉淀   728   16   11
  SO3洗脱液   247   34   3.8
  辛基琼脂糖洗脱液   129   52   2.0
  Q琼脂糖洗脱液   74   57   1.1
  Superdex 200   36   49   0.6
该表表示匀浆和可溶物质中蛋白的含量，包括澄清步骤之后上清液中回收的F4的量。AS-沉淀步骤除去了大量HCP且在SDS-凝胶上仅观察到F4的轻微损失。此外SO3色谱还除去了许多杂质，且SDS-凝胶显示F4的大量回收。相反，使用辛基琼脂糖和Q琼脂糖柱测量到的约50％蛋白回收还伴有F4损失。凝胶过滤色谱后的蛋白回收约为50％。SDS-凝胶显示除去了许多LMW-蛋白带(F4-降解带)，同时减少了F4回收。
F4产率
上面表1表示从360ml匀浆，在OD50可得到约36mg纯化F4。因此，在OD50的1升匀浆应产生约100mg纯化F4。因为在发酵过程中获得70-90的OD，因此每升发酵罐的产率应为140-180mg。
F4(p51)*纯化结果
F4(p51)*融合构建体是使用上述纯化方法I，在没有改变的情况下纯化的。
纯化过程后的SDS-PAGE/蛋白质印迹
图14表示在F4(p51*)纯化过程中收集的含F4(p51)*级分的SDS凝胶和抗-p24/抗-Nef-Tat蛋白质印迹。
SDS-凝胶和蛋白质印迹证实了F4(p51)*融合蛋白在硫酸铵沉淀步骤以及色谱步骤过程中，总体表现出与F4类似。纯化的F4(p51)*具有与纯化F4类似的不均一模式。
抗大肠杆菌蛋白质印迹表明在Q洗脱液和Superdex洗脱液中，HCP污染低于1％。
产率
在匀浆的不溶级分中失去约25％的F4(p51)*。此外，因为该纯化方法不适于该蛋白，因此在色谱步骤观察到损失。因此，F4(p51)*的总回收降至约25mg/升匀浆(OD50)。外推到1升培养物，OD 177，产率因此应为85mg F4(p51)*。
F4*的纯化结果
F4*融合构建体是使用上述纯化方法I，在没有改变的情况下纯化的。
纯化过程后的SDS-PAGE/蛋白质印迹
图15表示F4*纯化过程中收集的含F4*级分的SDS凝胶和抗-p24/抗-Nef-Tat蛋白质印迹。
关于F4(p51)*，还可注意到在纯化过程中，F4*总体表现出与F4十分相似。通过SDS-凝胶和蛋白质印迹所示可知，在预期级分中回收到蛋白。抗-大肠杆菌蛋白质印迹还证实了Q琼脂糖柱后，已经除去绝大多数。
产率
从465ml匀浆OD50获得的总回收约为17mg纯化F4*。外推到1升培养物，OD 140，产率因此应为100mg F4*。
总之，三种融合蛋白F4、F4(p51)*和F4*都是使用纯化方法I纯化的。图16中的SDS凝胶比较了三种纯化蛋白，显示Q琼脂糖步骤之后和通过Superdex 200柱除去LMW带之后，各构建体不同水平的不均一性。
实施例8：F4和F4co(密码子优化的)的纯化-纯化方法II
纯化方法II
还开发了与方法I相比更简化的纯化过程，方法II。方法II仅包括2个色谱步骤和最终缓冲液交换的透析/渗滤。尤其是，引入CMhyperZ色谱柱(BioSepra)替代方法I的澄清步骤、硫酸铵沉淀和SO3色谱(实施例7)。方法II用于纯化F4和完全密码子优化的F4(“F4co”)。对于F4co而言，进行了两种不同形式的方法II，其中一种包括羧基酰胺化，另一个则不包括。羧基酰胺化的目的是防止蛋白的氧化聚集。该羧基酰胺化在第一次色谱步骤之后进行(CM hyperZ)。
■在含10mM DTT的pH 8.050mM Tris缓冲液中，OD90，对大肠杆菌细胞进行匀浆(表达F4或F4co)。1000巴下进行2次Rannie传代。
■在用于CM hyperZ树脂(BioSepra)前，将8M脲加入到匀浆中，该树脂使用含8M脲的pH 7的磷酸盐缓冲液平衡。抗原捕获分批进行。然后将树脂填装到柱子中，使用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白，通过使用120mM NaCl预洗脱而除去结合的宿主细胞蛋白(HCP)。然后使用含360mM NaCl，8M脲，10mM DTT的pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗脱F4co。
■为了控制融合蛋白的氧化聚集，F4co的半胱氨酸基团可使用碘乙酰胺羧基酰胺化。因此，任选地，将50mM碘乙酰胺加入到CMhyperZ洗脱液中并在室温黑暗条件下进行30分钟羧基酰胺化。
■然后充分稀释(约5-8倍)CM hyperZ洗脱液并调节至pH 9.0。然后在含8M脲的pH 9.0的Tris缓冲液存在时，F4co或F4coca与Q琼脂糖柱(Amersham Bioscience)结合。使用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白并使用含90mM NaCl(仅含未羧基酰胺化的蛋白)的相同缓冲液预洗脱而除去结合的HCP。使用含200mM NaCl，8M脲的pH 9.0的Tris缓冲液使F4co从柱子上解吸。
■RT下，在透析膜(12-14kDa，截留分子量)中，针对1升0.5M精氨酸、10mM Tris缓冲液、10mM谷胱甘肽(仅加入到未-羧基酰胺化的蛋白中)，pH 8.5过夜透析样品两次。可选择性地，缓冲液交换通过使用具有30或50kDa截留分子量的切向-流动膜，针对10个样品体积的相同缓冲液渗透而完成。
■最后，通过0.22μm膜无菌过滤透析产品。
连续纯化步骤在下面的流程图中表示。
纯化流程图
                     匀浆OD90(Rannie)
               50mM Tris pH 8.0，10mM DTT
                           ↓
                  加入8M脲，调节至pH 7.0
                           ↓
                    (+)CM hyperZ色谱
pH 7.0，8M脲，10mM DTT，120mM NaCl预洗脱，360mM NaCl洗脱
                           ↓
     任选的羧基酰胺化：加入50mM碘乙酰胺，30min，RT
                           ↓
                稀释并调节至pH 9.0，8M脲
                           ↓
                   (+)Q琼脂糖FF色谱
        Tris pH 9.0，8M脲，预洗脱，使用NaCl*洗脱
                           ↓
                       透析/渗滤
     →磷酸盐缓冲液，0.5M精氨酸，pH 8.5(10mM谷胱甘肽)
                           ↓
                        无菌过滤
如果F4co没有被羧基酰胺化并且谷胱甘肽是纯化的，则所有缓冲液均含DTT。一旦蛋白被羧基酰胺化，则省略还原剂。*NaCl-就F4co而言，是200mM NaCl，F4coca洗脱是通过NaCl梯度进行的。对于F4coca，该步骤可通过用60mM预洗脱并使用100mM NaCl洗脱而被进一步优化；且对于F4co，通过100mM NaCl洗脱(无需预洗脱步骤)。
结果：F4co的纯化
图17表示在F4co纯化和羧基酰胺化的F4co(“F4coca”)纯化过程中收集的含F4级分的SDS凝胶。
在有8M脲存在条件下，CM hyperZ树脂从粗匀浆中完全捕获F4co(第1道)并使用360mM NaCl实现定量洗脱。第2道中所示CMhyperZ洗脱液被认为富含F4co中。适当稀释并将样品调节至pH 9后，F4co或F4coca与Q琼脂糖柱结合。然后如第3道所示，使用200mMNaCl特异性洗脱F4co或F4coca。该色谱不仅除去剩余的宿主细胞蛋白，而且还除去DNA和内毒素。为了得到制剂相容性缓冲液中的纯化物质，针对10mM Tris缓冲液、0.5M精氨酸、10mM谷胱甘肽，pH 8.5，在具有12-14kDa截留分子量的透析膜中透析Q琼脂糖洗脱液。对于羧基酰胺化蛋白省略谷胱甘肽。
F4co和F4coca的纯化均产生约500mg纯化物质/L培养物OD130。该范围与使用未密码子优化的F4之前观察到的相似。
如上所述，已经开发了两种不同的纯化方法(I和II)来纯化不同的F4构建体。图18比较所得不同的纯化批次。
图18中的SDS凝胶清楚地举例说明两种不同蛋白，即F4和F4co的不同模式。而F4呈现许多较强的低分子量(LMW)带，密码子-优化的F4co仅可见到较弱的带。方法I和方法II产生非常相似的F4co模式。抗-大肠杆菌蛋白质印迹分析证实了纯化蛋白的纯度，表明所有制剂中宿主细胞蛋白污染低于1％。
实施例9：小鼠中F4的免疫原性
制剂：
含佐剂的制剂1B：
为制备含佐剂的制剂1B，真空(或可选地在惰性气流下)干燥脂类(如源于卵黄或合成的磷脂酰胆碱)和胆固醇及3D-MPL在有机溶剂中的混合物。然后加入水溶液(如磷酸盐缓冲的盐水)，并搅拌容器，直到所有脂类成为混悬液。然后将该混悬液微流化，直到脂质体大小减至约100nm，然后通过0.2μm滤器无菌过滤。挤压或超声处理可替代该步骤。
通常，胆固醇∶磷脂酰胆碱比为1∶4(w/w)，并加入水溶液，产生5-50mg/ml终胆固醇浓度。
脂质体具有100nm规定大小且被称作SUV(对于较小的单层小泡)。如果该溶液被反复冻融，则小泡融合形成500nm-15μm大小的较大多层结构(MLV)。脂质体本身随时间是稳定的且没有致融合能力。将QS21水溶液加入到脂质体中，得到最终100μg/ml的3D-MPL和QS21浓度。
制剂2A：3脱酰化单磷酰脂A和QS21的水包油乳液；
水包油乳液的制备可通过WO 95/17210中提供的方案制备。具体而言，乳液含有：5％角鲨烯5％生育酚2.0％吐温80；粒径为180nm。水包油乳液的制备(2倍浓缩)
将吐温80溶于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中，得到溶于PBS的2％溶液。为了提供100ml两倍浓缩的乳液，使5g DL α-生育酚和5ml角鲨烯涡旋以充分混合。加入90ml PBS/吐温溶液并充分混合。然后使所得乳液通过注射器并使用M110S微流化器最终微流化。所得油滴具有约180nm的大小。
将无菌大量乳液加入到PBS中达到500μl乳液/ml(v/v)的终浓度。然后加入3D-MPL达到100μg终浓度。然后加入QS21达到100μg/ml的终浓度。组分的每次加入之间，搅拌中间产物5分钟。
将没有密码子优化、按照纯化方法I纯化的F4Q在磷酸盐/精氨酸缓冲液，pH 6.8中稀释。将稀释物与两种不同的浓佐剂(佐剂2A和1B)混合，以便获得40μg/剂500μl F4的最终制剂，其中含有290(佐剂2A)-300(佐剂1B)mM精氨酸、50μg MPL和50μg QS21。在小鼠中注射100μl每种制剂。
进行小鼠免疫原性研究以评价对在F4内发现的4种抗原(p24、p17、RT和Nef)的细胞和体液免疫反应。
由于F4抗原的复杂性，在第0天和第21天，使用8μg按上述制备的配有佐剂的F4蛋白，以100μl体积，给具有不同基因背景的8株小鼠免疫两次。最后一次免疫后14天(第35天)，收集血清和脾样品，用于分析对F4(p24、p17、RT和Nef)的4种组分以及F4的体液和细胞反应。
总抗体反应通过对p24、p17、RT、Nef和F4特异性的ELISA表征。下表，即表2，概括了在各株中观察到的抗原特异性体液反应。结果表示与使用单独的佐剂免疫的对照动物相比，抗体的存在或缺失。给出的结果是两组独立但相同的实验的汇编。在表中，2A是指使用3D-MPL和QS21的水包油乳液配制的抗原，1B是指使用3D-MPL、QS21及含胆固醇的脂质体配制的抗原。
表2
  小鼠株   p17   p24   Nef   RT   F4
  CB6F1   +/-+2A-1B   +   +   +   +
  Balb/c   -+/-2A-1B   +   +   +   +
  C3H   -   -   -   -   -
  DBA   -   +   +   +   +
  CBA   -   -   +/-+2A-1B   ++2A+/-B   +
  129Sv   -   +   +   +   +
  B6D2F1   +/-+2A-1B   +   +   +   +
  OF1   +   +   +   +   +
           +＝存在抗体       -＝不存在抗体
OF1小鼠对所有4种组分的抗体反应。所观察到的反应在图19中表示。+/-是指所观察到的反应较弱或是仅使用两种佐剂之一观察到的。例如，B6D2F1小鼠反应：+/-总体以及+2A和-1B，是指使用2A(不弱)有反应，且使用1B没有反应。Balb/c小鼠p17反应：-总体，及+/-2A和-1B，这里+/-是指使用佐剂2A的反应较弱。
细胞反应通过使用p24、p17、RT或Nef特异性肽再次刺激脾细胞后，对于CD4和CD8、IFNγ和IL-2表达进行流式细胞术染色(对于IFNγ和IL-2表达进行胞内细胞因子染色)表征，其中使用具有11聚体重叠的15聚体的肽文库合并物。CD4反应是所观察到的主要细胞反应。下表，即，表3，概括了对于各小鼠株观察到的抗原特异性CD4+IL-2+反应。再次表示为反应的存在或缺乏。
表3
  小鼠株   p17   p24   Nef   RT
  CB6F1   -+/-2A-1B   +   +   +
  Balb/c   -   +/-弱   +/-弱   +
  C3H   +   +   -   +
  DBA   +   +   +   +
  CBA   +   +-2A+1B   -   +
  129Sv   +   +   -   +
  B6D2F1   -   +   +   +
  OF1   -   -   -   +
            +＝存在CD+IL-2+      -＝不存在CD4+IL-2+
DBA小鼠对所有4种F4组分的CD4反应。对该小鼠株观察到的CD4+IL-2+和CD4+IFNγ+反应在图20中表示。
总之，使用两种辅助制剂配制的F4都能够促进对p24、p17、RT和Nef的体液和细胞反应。这表明F4的各区在体内状态下是免疫原性的。

Claims (28)

1.一种多肽，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17 Gag和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段。
2.根据权利要求1所述的多肽，进一步包含Pol或RT或其免疫原性片段或衍生物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中RT或免疫原性片段是其中RT在C末端被截短，使得它缺少羧基末端RNA酶H结构域的片段。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中RT片段是p51片段。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的多肽，其中RT在第592位包含突变，使得由另一个残基，例如赖氨酸取代甲硫氨酸。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的多肽，其中Nef是全长Nef。
7.一种选自下列之一的多肽：
1.p24-RT-Nef-p17
2.p24-RT*-Nef-p17
3.p24-p51RT-Nef-p17
4.p24-p51RT*-Nef-p17
5.p17-p51RT-Nef
6.p17-p51RT*-Nef
7.Nef-p17
8.具有接头的Nef-p17
9.p17-Nef
10.具有接头的p17-Nef
*代表RT甲硫氨酸592突变成赖氨酸。
8.一种用于纯化权利要求1-7任意一项所述的多肽的方法，该方法包括：
i).提供含未纯化多肽的组合物；
ii).使该组合物经过至少两个色谱步骤；
iii).任选地使该多肽羧基酰胺化；
iv)进行缓冲液更换步骤以提供用于药物制剂的适宜缓冲液中的蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中有至多两个色谱步骤。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中羧基酰胺化在两个色谱步骤之间进行。
11.一种组合物，包括(i)含有Nef或其免疫原性片段或衍生物和p17 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)p24 Gag或免疫原性片段或衍生物；或(i)含有Nef或其免疫原性片段或衍生物和p24Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)p17 Gag或其免疫原性片段或衍生物。
12.根据权利要求11所述的组合物，进一步包括RT或其免疫原性片段或衍生物。
13.一种组合物，包括(i)含有Nef或其免疫原性片段或衍生物和p17 Gag和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，其中当p17和p24 Gag同时存在时，它们之间有至少一个HIV抗原或免疫原性片段和(ii)p51 RT多肽。
14.根据权利要求11-13任意一项所述的组合物，其中(i)选自
1.Nef-p17
2.具有接头的Nef-p17
3.p17-Nef
4.具有接头的p17-Nef。
15.根据权利要求12-14任意一项所述的组合物，其中RT或其免疫原性片段是其中RT在C末端被截短，使得它缺少羧基末端RNA酶H结构域的片段。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中RT片段是p51片段。
17.根据权利要求11-16任意一项所述的组合物，其中RT在第592位包含突变，使得由另一个残基，例如赖氨酸取代甲硫氨酸。
18.根据权利要求11-17任意一项所述的组合物，其中Nef是全长Nef。
19.一种多肽，其是HIV抗原的融合体，包含至少4个HIV抗原或免疫原性片段或衍生物，其中4个抗原或片段是或来源于Nef、Pol和Gag。
20.根据权利要求19所述的多肽，其中Gag作为两个分离组分存在，其被融合体中的至少一个其它抗原分开。
21.根据权利要求19或20所述的多肽，其中Nef是全长Nef。
22.根据权利要求19-21任意一项所述的多肽，其中Pol是p66或p51RT。
23.根据权利要求19-22任意一项所述的多肽，其中Gag是p17和p24Gag。
24.一种编码权利要求1-23任意一项所述的多肽或多肽组合物或融合蛋白的多核苷酸。
25.一种p51RT多肽或其衍生物或编码它的多核苷酸，优选为在大肠杆菌中表达而进行了密码子优化。
26.一种由权利要求25所述的多核苷酸编码的多肽。
27.一种包含前面任意权利要求所述的多肽或多核苷酸或多肽或多核苷酸的组合物或前面任意权利要求所述的纯化多肽，以及药学上可接受的载体或佐剂的药物组合物。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中佐剂为Th1诱导佐剂QS21或3D-MPL或QS21和3D-MPL的组合。
CN2005800340055A 2004-08-05 2005-08-03 用于预防和治疗hiv感染的疫苗 Expired - Fee Related CN101035897B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0417494.2 2004-08-05
GBGB0417494.2A GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-08-05 Vaccine
PCT/EP2005/008434 WO2006013106A2 (en) 2004-08-05 2005-08-03 Vaccine for prevention and treatment of hiv-infection

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110406267.7A Division CN102633866B (zh) 2004-08-05 2005-08-03 用于预防和治疗hiv感染的疫苗

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101035897A true CN101035897A (zh) 2007-09-12
CN101035897B CN101035897B (zh) 2012-02-01

Family

ID=32982606

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800340055A Expired - Fee Related CN101035897B (zh) 2004-08-05 2005-08-03 用于预防和治疗hiv感染的疫苗
CN201110406267.7A Expired - Fee Related CN102633866B (zh) 2004-08-05 2005-08-03 用于预防和治疗hiv感染的疫苗

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110406267.7A Expired - Fee Related CN102633866B (zh) 2004-08-05 2005-08-03 用于预防和治疗hiv感染的疫苗

Country Status (32)

Country Link
US (2) US7612173B2 (zh)
EP (3) EP2280073B1 (zh)
JP (3) JP2008507987A (zh)
KR (1) KR101501495B1 (zh)
CN (2) CN101035897B (zh)
AR (2) AR050102A1 (zh)
AT (1) ATE443769T1 (zh)
AU (1) AU2005268856B2 (zh)
BR (1) BRPI0514108A (zh)
CA (1) CA2575898C (zh)
CY (1) CY1109667T1 (zh)
DE (1) DE602005016810D1 (zh)
DK (1) DK1773999T3 (zh)
ES (3) ES2486669T3 (zh)
GB (1) GB0417494D0 (zh)
HK (1) HK1108168A1 (zh)
HR (1) HRP20090678T1 (zh)
IL (2) IL180947A0 (zh)
MA (1) MA28983B1 (zh)
MX (1) MX2007001515A (zh)
MY (1) MY145614A (zh)
NO (1) NO20070988L (zh)
NZ (1) NZ552976A (zh)
PE (1) PE20060577A1 (zh)
PL (1) PL1773999T3 (zh)
PT (1) PT1773999E (zh)
RU (1) RU2441878C2 (zh)
SG (1) SG155206A1 (zh)
SI (1) SI1773999T1 (zh)
TW (1) TWI365191B (zh)
WO (1) WO2006013106A2 (zh)
ZA (1) ZA200700771B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103221065A (zh) * 2010-03-26 2013-07-24 葛兰素史密斯克莱生物公司 Hiv疫苗

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020048596A1 (en) * 1994-12-30 2002-04-25 Gregor Cevc Preparation for the transport of an active substance across barriers
BR9814415A (pt) * 1998-10-23 2000-10-10 Idea Innovat Dermale Appl Gmbh "método para desenvolver, testar e utilizar associados de macromoléculas e agregados de complexos para carga útil aumentada e velocidades de desassociação controláveis"
DK1031346T3 (da) 1999-01-27 2002-08-12 Idea Ag Ikke-invasiv vaccination gennem huden
SI1031347T1 (en) 1999-01-27 2002-10-31 Idea Ag Transnasal transport/immunisation with highly adaptable carriers
AU5409699A (en) * 1999-07-05 2001-01-22 Idea Ag A method for the improvement of transport across adaptable semi-permeable barriers
US20040105881A1 (en) * 2002-10-11 2004-06-03 Gregor Cevc Aggregates with increased deformability, comprising at least three amphipats, for improved transport through semi-permeable barriers and for the non-invasive drug application in vivo, especially through the skin
TW200510425A (en) * 2003-08-13 2005-03-16 Japan Tobacco Inc Nitrogen-containing fused ring compound and use thereof as HIV integrase inhibitor
WO2006050926A2 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Idea Ag Extended surface aggregates in the treatment of skin conditions
SG182173A1 (en) * 2005-05-12 2012-07-30 Glaxo Group Ltd Vaccine composition
US20070020238A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-25 David Baltimore Method of targeted gene delivery using viral vectors
EP2013227A4 (en) * 2006-05-09 2010-07-28 Jackson H M Found Military Med ANTI-HIV-1 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS
PT2520168E (pt) * 2006-07-21 2014-04-29 California Inst Of Techn Administração de gene alvo para vacinação de células dendríticas
US9717788B2 (en) * 2007-03-02 2017-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant
DK2137210T3 (en) * 2007-03-02 2017-01-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hitherto unknown method and compositions
WO2008109785A2 (en) * 2007-03-06 2008-09-12 Rutgers, The State University Hiv reverse transcriptase compositions and methods
JP2010522761A (ja) * 2007-03-26 2010-07-08 インターナショナル エイズ バクシーン イニシアティブ 改変ｍｖａウイルスｈｉｖ−１ベクターを用いて免疫応答を誘発する方法
CL2008001491A1 (es) 2007-05-24 2008-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion liofilizada que comprende uno o mas antigenos y un agonista del receptor de tipo toll 9 (tlr9); y procedimiento de preparacion.
JP2011506565A (ja) * 2007-12-21 2011-03-03 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
EP2307048A4 (en) * 2008-07-16 2012-02-29 Baylor Res Inst HIV VACCINE BASED ON TARGETING OF MAXIMIZED GAG AND NEF ON DENDRITIC CELLS
GB0815872D0 (en) * 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
US8431153B2 (en) 2008-09-09 2013-04-30 Celebrity Biogens, Llc Bioactive composition for the treatment of the HIV/AIDS, method for manufacturing and using the same
DK2770061T3 (en) 2009-07-24 2019-01-07 Immune Design Corp NON-INTEGRATING LENTIVIRUS VECTORS
CA2798331C (en) 2010-05-14 2022-03-15 Baxter International Inc. Ospa chimeras and use thereof in vaccines
CA2812893A1 (en) * 2010-09-27 2012-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
JP2012120506A (ja) * 2010-12-10 2012-06-28 Tosoh Corp Ａｍｖ逆転写酵素遺伝子、該遺伝子によりコードされるａｍｖ逆転写酵素及び該遺伝子を用いるａｍｖ逆転写酵素の製造方法
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
JP2013146235A (ja) * 2012-01-20 2013-08-01 Tosoh Corp トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
US9713635B2 (en) 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
MX362699B (es) 2012-03-30 2019-02-01 Immune Design Corp Partículas de vectores lentivirales teniendo eficiencia de transducción mejorada para células que expresan dc-sign.
US9782473B2 (en) 2013-03-26 2017-10-10 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection
TWI733652B (zh) 2014-07-11 2021-07-21 美商基利科學股份有限公司 用於治療ＨＩＶ之ｔｏｌｌ樣受體調節劑
KR102014518B1 (ko) 2017-01-05 2019-08-26 서울대학교산학협력단 HIV 1의 p24 단백질을 발현하는 벡터가 도입된 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이를 포함하는 백신
GB201812647D0 (en) 2018-08-03 2018-09-19 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Viral vectors and methods for the prevention or treatment of cancer
EP3999107A1 (en) 2019-07-16 2022-05-25 Gilead Sciences, Inc. Hiv vaccines and methods of making and using
AU2020384323A1 (en) 2019-11-14 2022-06-02 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
EP4126028A1 (en) 2020-03-27 2023-02-08 Svenska Vaccinfabriken Produktion AB Compositions and methods for treating and preventing coronaviruses
TW202330575A (zh) 2021-09-29 2023-08-01 瑞典商斯文斯卡疫苗生產股份有限公司 用於治療及預防冠狀病毒之組成物及方法

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
DE3300234A1 (de) 1983-01-05 1984-07-05 Display-Design GmbH für moderne Verkaufsförderungsmittel und Raumaussstattung, 6233 Kelkheim Etagenturm zur warenausstellung
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
DK643188A (da) * 1987-11-24 1989-05-25 Smithkline Biolog Ekspression af hiv-proteiner i e.coli og s.cerevisiae
US5221610A (en) 1988-05-26 1993-06-22 Institut Pasteur Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
ZA929870B (en) 1991-12-23 1993-08-18 Duphar Int Res Adjuvants
KR0172970B1 (ko) 1992-06-17 1999-02-01 김영길 Aids백신에 유용한 키메릭 단백 및 그의 제조방법
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
HU219056B (hu) 1993-03-23 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals Sa 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény
ATE283279T1 (de) 1993-05-18 2004-12-15 Macfarlane Burnet Ct For Medic Therapeutische inhaltsstoffe
DK0729473T3 (da) 1993-11-17 2000-10-30 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Glucosamin-disaccharider, fremgangsmåde til deres fremstilling farmaceutisk sammensætning deraf og deres anvendelse
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
WO1998010087A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6645495B1 (en) 1997-08-29 2003-11-11 Antigenics, Inc. Compositions of saponin adjuvants and excipients
DE69838992T2 (de) 1997-09-05 2008-12-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart Öl-in-Wasser Emulsionen mit Saponinen
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9720585D0 (en) 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1104310B1 (en) 1998-08-04 2009-07-01 The Henry M. Jackson Foundation for the advancement of Military Medicine, Inc. Expression and characterization of hiv-1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response
EP1242441A4 (en) 1999-12-17 2004-04-14 Merck & Co Inc POLYNUCLEOTIDE VACCINES EXPRESSING CODON-OPTIMIZED NEF HIV-1 PROTEIN AND MODIFIED HIV-1 NEF PROTEIN
MXPA02006379A (es) * 1999-12-23 2004-06-21 Medical Res Council Mejoriasen o relacionadas con la respuesta inmune a vih.
US20020155127A1 (en) * 2000-06-02 2002-10-24 Danher Wang Genetic vaccine against human immunodeficiency virus
AU9456201A (en) 2000-09-15 2002-03-26 Merck & Co Inc Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications
CU23235A1 (es) 2001-02-28 2007-09-26 Ct Ingenieria Genetica Biotech POXVIRUS RECOMBINANTES PARA PROTEINAS QUIMéRICAS DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA Y SU APLICACION EN LA TERAPéUTICA Y LA PREVENCION DEL SIDA
WO2003009812A2 (en) * 2001-07-25 2003-02-06 New York University Use of glycosylceramides as adjuvants for vaccines against infections and cancer
PL207168B1 (pl) * 2001-09-20 2010-11-30 Glaxo Group Ltd Sekwencja nukleotydowa, wektor, białko, środek farmaceutyczny, urządzenie do podawania śródskórnego, zastosowanie sekwencji nukleotydowej i sposób wytwarzania nukleotydu
PL209133B1 (pl) 2001-11-21 2011-07-29 Univ Pennsylvania Rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie
US20030134404A1 (en) 2001-11-26 2003-07-17 Lochrie Michael A. Methods for producing stocks of recombinant AAV virions
AU2003216852B2 (en) * 2002-03-19 2008-09-11 Glaxo Group Limited Imidazoquinolineamines as adjuvants in HIV DNA vaccination
US20030190308A1 (en) * 2002-03-19 2003-10-09 Braun Ralph P. Adjuvant
DE60313163T2 (de) * 2002-06-11 2008-01-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogene zusammensetzungen
GB0225786D0 (en) 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
GB0225788D0 (en) 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
US7501503B2 (en) * 2002-12-31 2009-03-10 Mcgill University Compositions and methods for inhibiting RNase H activity of retroid reverse transcriptase
US20050175627A1 (en) 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
CA2539864A1 (en) 2003-09-24 2005-04-07 Oxxon Therapeutics Limited Hiv pharmaccines

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103221065A (zh) * 2010-03-26 2013-07-24 葛兰素史密斯克莱生物公司 Hiv疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
RU2007104088A (ru) 2008-09-10
JP2008507987A (ja) 2008-03-21
TW200621806A (en) 2006-07-01
CN102633866A (zh) 2012-08-15
SI1773999T1 (sl) 2010-01-29
IL207575A0 (en) 2011-07-31
CA2575898C (en) 2015-09-29
NO20070988L (no) 2007-05-04
DK1773999T3 (da) 2010-01-18
CY1109667T1 (el) 2014-08-13
JP5629647B2 (ja) 2014-11-26
TWI365191B (en) 2012-06-01
AR080216A2 (es) 2012-03-21
WO2006013106A2 (en) 2006-02-09
SG155206A1 (en) 2009-09-30
US20100184836A1 (en) 2010-07-22
JP2011234722A (ja) 2011-11-24
HRP20090678T1 (hr) 2010-01-31
EP1773999B1 (en) 2009-09-23
AU2005268856B2 (en) 2012-05-24
AR050102A1 (es) 2006-09-27
MA28983B1 (fr) 2007-11-01
PT1773999E (pt) 2009-12-16
EP2130921A3 (en) 2010-03-03
MX2007001515A (es) 2007-09-07
EP1773999A2 (en) 2007-04-18
DE602005016810D1 (de) 2009-11-05
JP2014239687A (ja) 2014-12-25
NZ552976A (en) 2010-01-29
CN101035897B (zh) 2012-02-01
CN102633866B (zh) 2015-04-15
EP2280073A3 (en) 2011-06-29
EP2130921B1 (en) 2013-11-20
KR101501495B1 (ko) 2015-03-11
AU2005268856A1 (en) 2006-02-09
HK1108168A1 (en) 2008-05-02
JP6007212B2 (ja) 2016-10-12
ES2445453T3 (es) 2014-03-03
ZA200700771B (en) 2009-04-29
KR20070041765A (ko) 2007-04-19
CA2575898A1 (en) 2006-02-09
WO2006013106A3 (en) 2006-08-17
EP2130921A2 (en) 2009-12-09
EP2280073A2 (en) 2011-02-02
RU2441878C2 (ru) 2012-02-10
MY145614A (en) 2012-03-15
IL180947A0 (en) 2007-07-04
EP2280073B1 (en) 2014-06-11
US7612173B2 (en) 2009-11-03
ES2334044T3 (es) 2010-03-04
US20070243203A1 (en) 2007-10-18
PE20060577A1 (es) 2006-08-07
ATE443769T1 (de) 2009-10-15
PL1773999T3 (pl) 2010-02-26
ES2486669T3 (es) 2014-08-19
GB0417494D0 (en) 2004-09-08
BRPI0514108A (pt) 2008-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101035897A (zh) 用于预防和治疗hiv感染的疫苗
CN1282656C (zh) 来自gagp17和p24保守区域的HIV肽以及它们在例如疫苗中的应用
CN1188519C (zh) 包含HIV－1Tat和/或Nef蛋白的融合蛋白
CN1213068C (zh) 对hiv免疫应答的改进或与其相关的改进
CN1093881C (zh) 免疫原或诊断剂的制备及其获得免疫原或诊断试剂的方法
CN1419456A (zh) 用于hiv预防或治疗性免疫的疫苗
CN1913920A (zh) 流感免疫原和疫苗
CN1346367A (zh) Hiv肽,抗原,疫苗组合物,检测hiv所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法
CN1276833A (zh) 疫苗
CN1845995A (zh) 用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原
CN1606624A (zh) 疫苗
CN101080239A (zh) 作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒
CN1929860A (zh) HIV gp41衍生肽的位点特异性化学修饰
CN1950106A (zh) 用作肿瘤特异性疫苗的合成蛋白质
CN1458936A (zh) 来自Tat、Rev和Nef保守区的HIV肽以及它们作为例如疫苗组分的应用
CN1741818A (zh) 线虫多肽佐剂
CN1899610A (zh) 幽门螺杆菌抗原重组疫苗
CN1956995A (zh) 抗肥胖免疫原性杂交多肽和包含该杂交多肽的抗肥胖疫苗组合物
CN1615316A (zh) 多聚体蛋白质的新免疫原性模拟物
CN1255548C (zh) gp41片段的乙酰化
CN1726283A (zh) 利用c4bp支架制备多聚体融合蛋白
CN1867588A (zh) 包含c4bp核心蛋白质和单体抗原的产品及其用途
CN1720326A (zh) 通过抑制tap活性增强mhcⅰ类分子对外来表位的展示的方法
CN1268392C (zh) 预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组蛋白疫苗及其用途
CN1864746A (zh) 幽门螺杆菌AhpC基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120201

Termination date: 20170803

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee