PL207168B1 - Sekwencja nukleotydowa, wektor, białko, środek farmaceutyczny, urządzenie do podawania śródskórnego, zastosowanie sekwencji nukleotydowej i sposób wytwarzania nukleotydu - Google Patents

Sekwencja nukleotydowa, wektor, białko, środek farmaceutyczny, urządzenie do podawania śródskórnego, zastosowanie sekwencji nukleotydowej i sposób wytwarzania nukleotydu

Info

Publication number
PL207168B1
PL207168B1 PL370359A PL37035902A PL207168B1 PL 207168 B1 PL207168 B1 PL 207168B1 PL 370359 A PL370359 A PL 370359A PL 37035902 A PL37035902 A PL 37035902A PL 207168 B1 PL207168 B1 PL 207168B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleotide sequence
gag
nef
protein
sequence
Prior art date
Application number
PL370359A
Other languages
English (en)
Other versions
PL370359A1 (pl
Inventor
Andrew Beaton
Peter Franz Ertl
Gerald Wayne Gough
Andrew Lear
John Philip Tite
Wely Catherine Ann Van
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/GB2001/004207 external-priority patent/WO2002024225A1/en
Priority claimed from GB0129604A external-priority patent/GB0129604D0/en
Priority claimed from GB0206462A external-priority patent/GB0206462D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of PL370359A1 publication Critical patent/PL370359A1/pl
Publication of PL207168B1 publication Critical patent/PL207168B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa, wektor, białko, środek farmaceutyczny, urządzenie do podawania śródskórnego, zastosowanie sekwencji nukleotydowej i sposób wytwarzania nukleotydu.
Wynalazek należy do dziedziny konstruktów kwasów nukleinowych, komórek gospodarzy zawierających takie konstrukty oraz ich zastosowania w szczepionkach zawierających kwas nukleinowy, a takż e preparatów szczepionek zawierają cych takie konstrukty oraz zastosowania takich preparatów w medycynie, a zwł aszcza szczepionek DNA, które znajdują zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń HIV, w szczególności przy podawaniu za pomocą cząstek biorących udział w dostarczaniu.
HIV-1 jest pierwotną przyczyną zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS), który uważa się za jeden z największych problemów zdrowotnych na świecie. Pomimo przeprowadzenia intensywnych badań na całym świecie w celu wyprodukowania szczepionki, wysiłki te jak dotychczas były bezskuteczne.
Opisano białka nieotoczkowe i obejmują one np. białka struktur wewnętrznych, takie jak produkty genów gag i pol oraz inne białka niestrukturalne, takie jak Rev, Nef, Vif i Tat (Green i in., New England J. Med, 324, 5, 308 i kolejne (1991) oraz Bryant i in. (red. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 i kolejne (1992).
Gen gag ulega translacji z pełnej długości RNA z wytworzeniem prekursorowej poliproteiny, która jest następnie cięta na 3-5 białek kapsydowych; białka macierzy, białka kapsydowego oraz białka wiążącego się z kwasem nukleinowym oraz proteazy. (1. Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM i Howley M 1996 2. Fields Virology tom 2 1996).
Gen gag koduje prekursorowe białko Gag o masie 55 kilodaltonów (kD), nazywane także p55, które jest eksprymowane z nieulegającego splicingowi wirusowego mRNA. Podczas translacji N-koniec p55 jest mirystoilowany, co kieruje jego wiązaniem z cytoplazmatyczną stroną błon komórkowych. Związana z błoną poliproteina Gag rekrutuje dwie kopie wirusowego RNA genomowego razem z innymi wirusowymi i komórkowymi białkami, które kierują pączkowaniem cząstki wirusa z powierzchni zakażonej komórki. Po wypączkowaniu p55 jest rozszczepiane przez proteazę kodowaną przez wirusa (produkt genu pol), podczas procesu dojrzewania wirusa, do czterech mniejszych białek nazwanych MA (macierzowe [p17]), CA (kapsydowe [p24]), NC (nukleokapsydowe [p9]) oraz p6.(4).
Oprócz trzech głównych białek Gag, wszystkie prekursory Gag zawierają kilka innych regionów, które są rozszczepiane i pozostają w wirionie w postaci peptydów o różnych wielkościach. Te białka odgrywają różne role, np. białko p2 ma proponowaną rolę w regulacji aktywności proteazy i uczestniczy w prawidłowej regulacji czasowej obróbki proteolitycznej.
Polipeptyd MA pochodzi z N-końcowego, mirystoilowanego końca p55. Większość cząsteczek MA pozostaje dołączonych do wewnętrznej powierzchni dwuwarstwy lipidowej wirionu, co stabilizuje cząstkę. Podzbiór MA jest rekrutowany do głębszych warstw wirionu, gdzie staje się on częścią kompleksu, który wprowadza wirusowy DNA do jądra (5). Te cząsteczki MA ułatwiają transport genomu wirusowego do jądra, gdyż sygnał kariofilowy na MA jest rozpoznawany przez komórkową maszynerię transportu do jądra. To zjawisko umożliwia HIV zakażenie nie-dzielących się komórek, co jest dla retrowirusa niezwykłą właściwością.
Białko p24 (CA) tworzy stożkowaty rdzeń cząstek wirusowych. Wykazano, że cyklofilina A oddziaływuje z regionem p24 białka p55, co prowadzi do jego włączenia do cząstek HIV. Oddziaływanie pomiędzy Gag a cyklofilina A jest niezbędne, gdyż przerwanie tego oddziaływania przez cyklosporynę A hamuje replikację wirusa.
Region NC Gag jest odpowiedzialny za specyficzne rozpoznawanie tzw. sygnału pakowania HIV. Sygnał pakowania składa się z czterech struktur typu łodygi i pętli umiejscowionych w pobliżu 5' końca wirusowego RNA i jest wystarczający do pokierowania inkorporacją heterologicznego RNA do wirionów HIV-1. NC wiąże się z sygnałem pakowania przez oddziaływania w których uczestniczą motywy palca cynkowego. NC także ułatwia odwrotną transkrypcję.
Region polipeptydu p6 kieruje oddziaływaniami pomiędzy p55 Gag oraz białkiem pomocniczym Vpr, co prowadzi do włączenia Vpr do składających się wirionów. Region p6 zawiera także tzw. późną domenę, która jest wymagana do wydajnego uwalniania pączkujących wirionów z zakażonej komórki.
Gen pol koduje dwa białka wykazujące dwie aktywności potrzebne wirusowi we wczesnym etapie zakażenia, RT oraz białko integrazy potrzebne do integracji wirusowego DNA do DNA komórki.
Pierwotny produkt Pol jest rozszczepiany przez proteazę wirionu z wytworzeniem N-końcowego pepPL 207 168 B1 tydu RT, który wykazuje aktywności niezbędne do syntezy DNA (RNA- i DNA-zależnej polimerazy DNA, rybonukleazy H) oraz C-końcowego białka integrazy. HIV RT jest heterodimerem pełnej długości RT (p66) oraz produktu rozszczepienia (p51) niezawierającego C-końcowej domeny RNazowo-integrazowej.
RT jest jednym z najlepiej konserwowanych białek kodowanych przez genom retrowirusa. Dwiema głównymi aktywnościami RT są DNA Pol i Rybonukleaza H. Aktywność DNA Pol RT wymiennie wykorzystuje RNA i DNA jako matryce oraz, jak wszystkie znane polimerazy DNA, nie jest w stanie zainicjować syntezy DNA de novo, ale wymaga istniejącej wcześniej cząsteczki, która służy jako starter (RNA).
Aktywność RNazy H, właściwa dla wszystkich białek RT, odgrywa istotną rolę wcześnie w replikacji usuwającej genom RNA wraz z postępem syntezy DNA. Selektywnie degraduje ona RNA ze wszystkich hybrydowych cząsteczek RNA - DNA. Strukturalnie polimeraza i rybo H zajmują osobne, niepokrywające się domeny, przy czym Pol pokrywa dwie trzecie sekwencji amino-kwasowej Pol.
Podjednostka katalityczna p66 jest zwinięta do 5 osobnych subdomen. Ich N-koniec 23 wykazuje aktywność RT. Ich C-koniec jest domeną RNazy H.
Po zakażeniu komórki gospodarza, retrowirusowy genom RNA jest kopiowany do liniowego dwuniciowego DNA przez odwrotną transkryptazę, która jest obecna w zakażającej cząstce. Integraza (publikacja przeglądowa Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52, 271-273) rozpoznaje końce wirusowego DNA, przycina je i towarzyszy wirusowemu DNA do miejsca chromosomu gospodarza w celu integracji przez katalazę. Wiele miejsc w DNA gospodarza może być celem integracji. Pomimo tego, że integraza jest wystarczająca do katalizowania integracji in vitro, nie jest ona jedynym białkiem związanym z wirusowym DNA in vivo - duży kompleks białek i wirusowego DNA wyizolowany z zakażonych komórek wskazano jako kompleks preintegracyjny. Ułatwia to zdobycie genów komórki gospodarza przez potomne genomy wirusowe.
Integraza składa się z trzech osobnych domen, domeny N-końcowej, katalitycznego rdzenia oraz domeny C-końcowej. Katalityczna domena rdzeniowa spełnia wszystkie wymogi niezbędne do reakcji transferu polinukleotydylowego.
Wiadomo, że białko Nef powoduje usuwanie CD4, receptora HIV, z powierzchni komórki, ale nadal rozważa się biologiczną istotność tej funkcji. Ponadto Nef oddziaływuje ze szlakiem sygnałowym komórek T i wywołuje stan aktywny, który z kolei może przyczyniać się do bardziej wydajnej ekspresji genów. Niektóre izolaty HIV zawierają mutacje w tym regionie, które powodują, że nie kodują one funkcjonalnego białka i są poważnie upośledzone w swojej replikacji i patogenezie in vivo.
Szczepionki DNA zazwyczaj składają się z bakteryjnego wektora plazmidowego do którego wstawiony jest silny promotor, interesującego genu, który koduje antygenowy peptyd oraz sekwencje poliadenylacji/terminacji transkrypcji. Interesujący gen może kodować pełnej długości białko lub po prostu sekwencję antygenowego peptydu pochodzącą z patogenu, nowotworu lub innego czynnika, przeciw któremu ma być skierowana ochrona. Plazmid może być hodowany w bakteriach, takich jak np. E. coli, a następnie izolowany i przygotowywany w odpowiednim podłożu, zależnie od zamierzonej drogi podawania, przed podaniem gospodarzowi. Po podaniu plazmid jest pobierany przez komórki gospodarza, gdzie wytwarzane jest kodowane białko. Korzystnie wektor plazmidowy przygotowuje się bez miejsca startu replikacji funkcjonującego w komórkach eukariotycznych, aby zapobiec replikacji plazmidu w ssaczym gospodarzu oraz integracji do chromosomalnego DNA danego zwierzęcia.
Istnieje kilka zalet szczepionek DNA w porównaniu z tradycyjnymi technikami szczepienia. Po pierwsze, przewiduje się, że ze względu na to, że białka, które są kodowane przez sekwencję DNA są syntetyzowane w gospodarzu, struktura i konformacja białka będą podobne do natywnego białka towarzyszącego stanowi chorobowemu. Możliwe jest także, że szczepienie DNA zapewni ochronę przeciw różnym szczepom wirusa, przez wytworzenie odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, które rozpoznają epitopy konserwowanych białek. Ponadto, ponieważ plazmidy są pobierane przez komórki gospodarze, w których może być wytwarzane antygenowe białko, wywołana będzie długotrwała odpowiedź immunologiczna. Technologia ta także stwarza możliwość połączenia różnych immunogenów w jednym preparacie w celu umoż liwienia równoczesnej immunizacji w odniesieniu do kilku stanów chorobowych.
Pomocną informację podstawową w odniesieniu do szczepienia DNA podano w publikacji Donnelly i in., „DNA vaccines Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648.
Wynalazek dotyczy sekwencji nukleotydowej, charakteryzującej się tym, że koduje białko gag HIV-1 lub fragment zawierający jego epitop gag, białko Nef HIV-1 lub fragment zawierający epitop Nef
PL 207 168 B1 oraz białko RT lub fragment zawierający epitop RT, funkcjonalnie połączonej z heterologicznym promotorem.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że białko gag zawiera p17.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że białko gag dodatkowo zawiera p24.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że sekwencja gag ma tak zoptymalizowane kodony aby przypominała wykorzystywanie kodonów w silnie eksprymowanym ludzkim genie, przy czym wartość RSCU sekwencji nukleotydowej jest większa niż 0,5.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że sekwencja RT lub jej fragment ma tak zoptymalizowane kodony aby przypominała silnie eksprymowany ludzki gen.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że kolejność sekwencji obejmuje RT, gag, Nef lub RT Nef gag.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku jest wybrana z grupy obejmującej:
- Gag (p17,p24) z optymalizacją kodonów, RT z optymalizacją kodonów, Nef skrócona
- RT (z optymalizacją kodonów). Gag (p17, p24) z optymalizacją kodonów, Nef skrócona
- RT (z optymalizacją kodonów), Nef skrócona, gag p17, p24 z optymalizacją kodonów.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że heterologicznym promotorem jest promotor genu lE HCMV.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że 5'-promotora zawiera egzon 1.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że RT koduje mutację tak, aby zasadniczo inaktywować jakąkolwiek aktywność odwrotnej transkryptazy.
Korzystna sekwencja nukleotydowa według wynalazku cechuje się tym, że RT ulega mutacji przez podstawienie tryptofanu 229 lizyną.
Wynalazek dotyczy również wektora, który zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej.
Korzystnie wektor według wynalazku stanowi wektor wirusowy.
Korzystniej wektor wirusowy stanowi wektor adenowirusowy z defektem replikacji.
Korzystnie wektor według wynalazku stanowi plazmid w postaci dwuniciowego DNA.
Wynalazek dotyczy także białka, które jest kodowane przez sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej.
Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego zawierającego składnik czynny oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, rozcieńczalnik, nośnik lub adiuwant, przy czym ten środek charakteryzuje się tym, że jako składnik czynny zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej lub wektor zdefiniowany powyżej.
Korzystnie środek farmaceutyczny jest przystosowany do podawania domięśniowego lub śródskórnego.
Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku jako nośnik zawiera złotą kulkę.
Wynalazek dotyczy również urządzenia do podawania śródskórnego, zwłaszcza postaci strzelby genowej, zawierającego środek farmaceutyczny zdefiniowany powyżej.
Wynalazek dotyczy też sekwencji nukleotydowej, wektora lub środka farmaceutycznego, zdefiniowanych powyżej, do stosowania w medycynie.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej powyżej, lub wektora zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania leku do leczenia choroby.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania nukleotydu zdefiniowanego powyżej, charakteryzującego się tym, że funkcjonalnie łączy się sekwencję nukleotydową kodującą białko gag HIV-1 lub jego fragment i drugie białko HIV lub jego fragment, z heterologiczną sekwencją promotora.
Fragment wspomnianej sekwencji nukleotydowej będzie kodować epitop HIV oraz zazwyczaj będzie kodować peptyd o długości co najmniej ośmiu aminokwasów. Sekwencją nukleotydową jest korzystnie sekwencja DNA i korzystnie jest ona zawarta w plazmidzie niezawierającym miejsca startu replikacji. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego formułuje się z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, nośnikami, rozcieńczalnikami lub adiuwantami, aby wytworzyć środek farmaceutyczny odpowiedni do leczenia i/lub profilaktyki zakażenia HIV i AIDS.
W korzystnej postaci sekwencje DNA formułuje się na powierzchni nieczynnych cząstek lub kulek odpowiednich do podawania leków za pomocą cząstek. Korzystnie kulki są ze złota.
PL 207 168 B1
W korzystnej postaci wynalazek dotyczy sekwencji DNA, która koduje białko Gag, którego sekwencja jest zoptymalizowana tak, aby przypominała wykorzystywanie kodonów genów komórek ssaczych. W szczególności białko Gag jest optymalizowane tak by przypominało silnie eksprymowane ludzkie geny.
Kod DNA składa się z 4 liter (A, T, C i G), które stosuje się do literowania trójliterowych „kodonów, które odpowiadają aminokwasom białek kodowanych w genach organizmu. Liniowa sekwencja kodonów wzdłuż cząsteczki DNA ulega translacji do liniowej sekwencji aminokwasów w białku (białkach) kodowanym przez te geny. Kod jest wysoce zdegenerowany, z 61 kodonami kodującymi 20 naturalnych aminokwasów oraz trzema kodonami stanowiącymi sygnały „stop. Tak więc większość aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon - w rzeczywistości kilka z nich jest kodowanych przez cztery lub większą liczbę różnych kodonów.
Zaobserwowano, że gdy dostępny jest więcej niż jeden kodon do kodowania danego aminokwasu, wzory wykorzystania kodonów w organizmach są w dużym stopniu nielosowe. Różne gatunki wykazują różne tendencje w swoim wyborze kodonów, a ponadto wykorzystanie tych kodonów może być znacząco różne w pojedynczych gatunkach pomiędzy genami, które są silnie i słabo eksprymowane. Te tendencje są różne w wirusach, roślinach, bakteriach i komórkach ssaczych, a niektóre gatunki wykazują silniejsze tendencje w kierunku losowego wyboru kodonów niż inne. Tak więc np. ludzie i inne ssaki są mniej silnie tendencyjne niż pewne bakterie i wirusy. Z tego względu istnieje znaczące prawdopodobieństwo, że ssaczy gen eksprymowany w E. coli lub obcy lub rekombinowany gen eksprymowany w komórkach ssaczych będzie miał nieprawidłowe rozmieszczenie kodonów dla wydajnej ekspresji. Uważa się, że przy obecności heterologicznej sekwencji DNA zawierającej zbiory lub duże ilości kodonów rzadko obserwowanych w tym gospodarzu, w którym ma wystąpić ekspresja, przewiduje się niskie poziomy heterologicznej ekspresji w tym gospodarzu.
Jedna z postaci wynalazku dotyczy sekwencji polinukleotydu gag, która koduje sekwencję aminokwasową, w której wzór wykorzystania kodonów sekwencji polinukleotydowej przypomina wzór występujący w silnie eksprymowanych genach ssaczych. Korzystnie sekwencją polinukleotydową jest sekwencja DNA. Korzystnie wzór wykorzystania kodonów sekwencji polinukleotydu jest typowy dla silnie eksprymowanych ludzkich genów.
W polinukleotydach wedł ug wynalazku wzór wykorzystania kodonów zmienia się , od typowego dla ludzkich wirusów niedoboru odporności do bliżej odpowiadającego tendencjom kodonów docelowego organizmu, np. ssaka, w szczególności człowieka. „Współczynnik wykorzystania kodonów jest miarą tego jak blisko wzór kodonów danej sekwencji polinukleotydu przypomina wzór docelowego organizmu. Częstości kodonów dla silnie eksprymowanych genów wielu gatunków można znaleźć w literaturze (patrz, np. Nakamura i in., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). Częstości kodonów dla każdego z 61 kodonów (wyrażone jako liczba wystąpienia na 1000 kodonów w wybranej klasie genów) normalizuje się dla każdego z dwudziestu naturalnych aminokwasów, tak że wartość dla najczęściej wykorzystywanego kodonu dla każdego aminokwasu ustala się jako 1, a częstości dla mniej powszechnych kodonów skaluje się, tak aby wynosiły od 0 do 1. Tak więc każdemu z 61 kodonów przypisuje się wartość 1 lub niższą dla silnie eksprymowanych genów docelowego gatunku. Tak więc aby obliczyć współczynnik wykorzystania kodonów dla specyficznego polinukleotydu, względem silnie eksprymowanych genów tego gatunku, notuje się wyskalowaną wartość dla każdego kodonu specyficznego polinukleotydu i wyprowadza się średnią geometryczną wszystkich tych wartości (przez podzielenie sumy naturalnych logarytmów tych wartości przez całkowitą liczbę kodonów oraz wyciągnięcie antylogarytmu). Współczynnik będzie miał wartość pomiędzy 0 a 1 oraz im wyższy będzie współczynnik tym więcej kodonów w polinukleotydzie będzie kodonami często wykorzystywanymi. Gdy sekwencja polinukleotydu ma współczynnik wykorzystania kodonów wynoszący 1, wszystkie kodony są „najczęstszymi kodonami dla silnie eksprymowanych genów docelowego gatunku.
Zgodnie z wynalazkiem wzór wykorzystania kodonów polinukleotydu korzystnie wyklucza kodony o wartości RSCU poniżej 0,2 w silnie eksprymowanych genach docelowego organizmu. Alternatywnie, wzór wykorzystania kodonów wyklucza kodony stanowiące <10% kodonów stosowanych dla konkretnego aminokwasu. Wartość względnego wykorzystania synonimicznych kodonów (RSCU) jest obserwowaną liczbą kodonów podzieloną przez liczbę oczekiwaną gdyby wszystkie kodony dla danego aminokwasu były wykorzystywane równie często. Polinukleotyd według wynalazku ogólnie będzie miał współczynnik wykorzystania kodonów (lub RSCU) dla silnie eksprymowanych ludzkich genów wyższy niż 0,3, korzystnie wyższy niż 0,4, najkorzystniej wyższy niż 0,5. Tabele wykorzystania kodonów dla człowieka można także znaleźć w Genebank.
PL 207 168 B1
Dla porównania, silnie eksprymowany gen β-aktyny ma RSCU 0,747. Tabelę wykorzystania kodonów dla Homo sapiens przedstawiono poniżej.
T a b e l a 1. Wykorzystanie kodonów
Homo sapiens [gbpri]: 27143 CDS (12816923 kodonów) pola: [trójka] [częstość: na tysiąc] ([liczba])
UUU 17,0(217684) UCU 14,8(189419) UAU 12,1(155645) UGU 10,0(127719)
UUC 20,5(262753) UCC 17,5(224470) UAC 15,8(202481) UGC 12,3(157257)
UUA 7,3(93924) UCA 11,9(152074) UAA 0,7(9195) UGA 1,3(16025)
UUG 12,5(159611) UCG 4,5(57572) UAG 0,5(6789) UGG 12,9(165930)
CUU 12,8(163707) CCU 17,3(222146) CAU 10,5(134186) CGU 4,6(59454)
CUC 19,3(247391) CCC 20,0(2256235) CAC 14,9(190928) CGC 10,8(137865)
CAU 7,0(89078) CCA 16,7(214583) CAA 12,0(153590) CGA 6,3(80709)
CUG 39,7(509096) CCG 7,0(89619) GAG 34,5(441727) CGG 11,6(148666)
AUU 15,8(202844) ACU 12,9(165392) AAU 17,0(218508) AGU 12,0(154442)
AUC 21,6(277066) AGA 19,3(247805) AAC 19,8(253475) AGC 19,3(247583)
AUA 7,2(92133) ACA 14,9(191518) AAC 24,0(308123) AGA 11,5(147264)
AUG 22,3(285776) ACG 6,3(80369) AAG 32,6(418141) AGG 11,3(145276)
GUU 10,9(139611) GCU 18,5(236639) GAU 22,4(286742) GGU 10,8(138606)
GUC 14,6(187333) GCC 28,3(362086) GAG 26,1(334158) GGC 22,7(290904)
GUA 7,0(89644) GCA 15,9(203310) GAA 29,1(373151) GGA 16,4(210643)
GUG 28,8(369006) GCG 7,5(96455) GAG 40,2(515485) GGG 16,4(209907)
Sekwencja kodująca GC 52,51%, pierwsza litera GC 56,04%, druga litera GC 42,35%, trzecia
litera GC 59,13%
T a b e l a 2. Wykorzystanie kodonów (korzystna)
Wykorzystanie kodonów dla ludzkich genów (silnie eksprymowanych) 1/24/91 (human_high.cod)
Aminokwas Kodon Liczba /1000 Ułamek
Gly GGG 905,00 18,76 0,24
Gly GGA 525,00 10,88 0,14
Gly GGT 441,00 9,14 0,12
Gly GGC 1867,00 38,70 0,50
Glu GAG 2420,00 50,16 0,75
Glu GAA 792,00 16,42 0,25
Asp GAT 592,00 12,27 0,25
Asp GAC 1821,00 37,75 0,75
Val GTG 1866,00 38,68 0,64
Val GTA 134,00 2,78 0,05
Val GTT 198,00 4,10 0,07
Val GTC 728,00 15,09 0,25
Ala GCG 652,00 13,51 0,17
Ala GCA 488,00 10,12 0,13
Ala GCT 654,00 13,56 0,17
Ala GCC 2057,00 42,64 0,53
PL 207 168 B1
Arg AGG 512,00 10,61 0,18
Arg AGA 298,00 6,18 0,10
Ser AGT 354,00 7,34 0,10
Ser AGC 1171,00 24,27 0,34
Lys AAG 2117,00 43,88 0,82
Lys AAA 471,00 9,76 0,18
Asn AAT 314,00 6,51 0,22
Asn AAC 1120,00 23,22 0,78
Met ATG 1077,00 22,32 1,00
Ile ATA 88,00 1,82 0,05
Ile ATT 315,00 6,53 0,18
Ile ATC 1369,00 28,38 0,77
Thr ACG 405,00 8,40 0,15
Thr ACA 373,00 7,73 0,14
Thr ACT 358,00 7,42 0,14
Thr ACC 1502,00 31,13 0,57
Trp TGG 652,00 13,51 1,00
End TGA 109,00 2,26 0,55
Cys TGT 325,00 6,74 0,32
Cys TGC 706,00 14,63 0,68
End TAG 42,00 0,87 0,21
End TAA 46,00 0,95 0,23
Tyr TAT 360,00 7,46 0,26
Tyr TAG 1042,00 21,60 0,74
Leu TTG 313,00 6,49 0,06
Leu TTA 76,00 1,58 0,02
Phe TTT 336,00 6,96 0,20
Phe TTC 1377,00 28,54 0,80
Ser TCG 325,00 6,74 0,09
Ser TCA 165,00 3,42 0,05
Ser TCT 450,00 9,33 0,13
Ser TCC 958,00 19,86 0,28
PL 207 168 B1
Arg CGG 611,00 12,67 0,21
Arg CGA 183,00 3,79 0,06
Arg CGT 210,00 4,35 0,07
Arg CGC 1086,00 22,51 0,37
Gln GAG 2020,00 41,87 0,88
Gln CAA 283,00 5,87 0,12
His CAT 234,00 4,85 0,21
His CAC 870,00 18,03 0,79
Leu . CTG 2884,00 59,78 0,58
Leu CTA 166,00 3,44 0,03
Leu CTT 238,00 4,93 0,05
Leu CTC 1276,00 26,45 0,26
Pro CCG 482,00 9,99 0,17
Pro CCA 456,00 9,45 0,16
Pro CCT 568,00 11,77 0,19
Pro CCC 1410,00 29,23 0,48
Zgodnie z kolejną postacią wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję polinukleotydu według pierwszej postaci wynalazku, zdolnego do kierowania jej ekspresją, w szczególności wzór wykorzystania kodonów sekwencji polinukleotydu gag jest typowy dla silnie eksprymowanych ssaczych genów, korzystnie silnie eksprymowanych ludzkich genów. Wektor może być odpowiedni do kierowania ekspresją heterologicznego DNA w komórkach bakteryjnych, owadzich lub ssaczych, w szczególności komórkach ludzkich. W jednej z postaci wektorem ekspresyjnym jest p7313 (patrz fig. 1).
Jak opisano, gen gag nie koduje peptydu gag p6. Korzystnie gen NEF jest skrócony w celu usunięcia sekwencji kodującej region N-końcowy, tj. usunięcia 30-85, korzystnie 60-85, zazwyczaj około 81, korzystnie 65 N-końcowych aminokwasów.
W kolejnej postaci gen RT jest takż e zoptymalizowany tak aby przypominał silnie eksprymowany ludzki gen. RT korzystnie koduje mutację tak, aby zasadniczo inaktywować jakąkolwiek aktywność odwrotnej transkryptazy. Korzystna mutacja inaktywująca obejmuje podstawienie W (tryptofanu) 229 przez K (lizynę).
Komórka gospodarza zawiera sekwencję polinukleotydu według wynalazku lub wektor ekspresyjny według wynalazku. Komórka gospodarz może być komórką bakteryjną, np. E. coli, ssaczą, np. ludzką lub może być komórką owadzią. Komórki ssacze zawierające wektor według wynalazku mogą być komórkami w hodowli transfekowanymi in vitro lub mogą być transfekowane in vivo przez podanie wektora ssakowi.
Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego zawierającego sekwencję polinukleotydu według wynalazku. Korzystnie ten środek zawiera wektor DNA. W korzystnych postaciach środek zawiera wiele cząstek, korzystnie cząstek złota, powlekanych DNA zawierającym wektor kodujący sekwencję polinukleotydu według wynalazku. Korzystnie sekwencja koduje sekwencję aminokwasową gag HIV, przy czym wzór wykorzystania kodonów sekwencji polinukleotydu jest typowy dla silnie eksprymowanych genów ssaczych, w szczególności genów ludzkich. W alternatywnych postaciach ten środek zawiera farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę oraz wektor DNA według drugiej postaci wynalazku. Środek ten może także zawierać adiuwant.
Tak więc zgodnie z tą postacią wynalazku wektory według wynalazku stosuje się ze środkami immunostymulującymi. Korzystnie środek immunostymulujący podaje się w tym samym momencie co wektor kwasu nukleinowego według wynalazku oraz, w korzystnych postaciach, formułuje się je raPL 207 168 B1 zem. Takie środki immunostymulujące obejmują, ale lista ta nie jest w żadnym stopniu wyczerpująca oraz nie wyklucza innych środków: syntetyczne imidazochinoliny, takie jak imikwimod [S-26308, R-837], (Harrison, i in. „Reduction of recurrent HSV disease using imiaquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine, Vaccine 19: 1820-1826, (2001)); oraz resikwimod [S-28463, R-848] (Vasilakos, i in. „Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN, Cellular immunology 204: 64-74 (2000)), zasady Schiffa związków karbonylowych oraz amin, które są konstytutywnie eksprymowane na powierzchniach komórki prezentującej antygen oraz komórki T, takie jak tukaresol (Rhodes J. i in. „Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs. Nature 377: 71-75 (1995)), cytokiny, chemokiny oraz cząsteczki współstymulujące w postaci białka albo peptydu, obejmuje to cytokiny prozapalne, takie jak GM-CSF, IL-1a, IL-1 β, TGF-α i TGF-β, induktory Th1, takie jak interferon γ, IL-2, IL-12, IL-15 i IL-18, induktory Th2, takie jak IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i IL-13 oraz inne geny chemokinowe i współstymulujące, takie jak MCP-1, MlP1α, MIP-1e, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 i CD40L, inne immunostymulujące ligandy skierowane, takie jak CTLA-4 i L-selektyna, białka i peptydy stymulujące apoptozę, takie jak Fas, (49), syntetyczne lipidy oparte na adiuwantach, takie jak vaxfectin, (Reyes i in., „Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization, Vaccine 19: 3778-3786), skwalen, α-tokoferol, polisorbat 80, DOPC i cholesterol, endotoksynę, [LPS], (Beutler B., „Endotoxin, „Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity, Current Opinion in Microbiology 3: 23-30 (2000)); oligo- i di-nukleotydy CpG (Sato Y. i in., „Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science 273 (5273): 352-354 (1996); Hemmi H. i in., „A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA, Nature 408: 740-745, (2000)) oraz inne potencjalne ligandy, które uruchamiają przez receptory Toll wytwarzanie cytokin indukujących Th1, takie jak syntetyczne lipoproteiny prątkowe, prątkowe białko p19, peptydoglikan, kwas teichowy i lipid A.
Pewne korzystne adiuwanty do wywoływania głównie odpowiedzi typu Th1 obejmują, np. pochodną Lipidu A, taką jak monofosforylolipid A lub korzystnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A. Adiuwanty MPL® są dostępne z Corixa Corporation (Seattle, WA; patrz, np. opisy patentowe US nr 4436727, 4877611, 4866034 i 4912094). Oligonukleotydy zawierające CpG (w których dinukleotyd CpG nie jest zmetylowany) także wywołują odpowiedź głównie Th1. Takie oligonukleotydy są dobrze znane i opisane, np. w WO 96/02555, WO 99/33488 oraz opisach patentowych US nr 6008200 i 5856462. Opisano także immunostymulujące sekwencje DNA, np. Sato i in.. Science 273:352, 1996. Inny korzystny adiuwant zawiera saponinę, taką jak Quil A lub jej pochodne, w tym QS21 i QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); escynę; digitoninę lub saponiny Gypsophila lub Chenopodium quinoa.
Polinukleotyd według wynalazku lub wektor według wynalazku jest użyteczny w leczeniu lub profilaktyce zakażenia HIV.
Umożliwiają one leczenie i profilaktykę zakażeń HIV, jakichkolwiek objawów lub chorób z nimi związanych, przez podawanie skutecznej ilości polinukleotydu, wektora lub środka farmaceutycznego według wynalazku. Podawanie środka farmaceutycznego można realizować w postaci jednej lub większej liczby pojedynczych dawek, np. w postaci powtarzanych dawek tego samego DNA plazmidowego lub w trybie „dawka początkowa-przypominająca szczepienia terapeutycznego. W pewnych przypadkach „początkowe szczepienie można przeprowadzić przez kierowane cząstkami dostarczanie DNA polinukleotydu według wynalazku, korzystnie wprowadzonego do wektora pochodzącego od plazmidu oraz „przypominające szczepienie przez podanie zrekombinowanego wektora wirusowego zawierającego tę samą sekwencję polinukleotydową lub podanie białka w adiuwancie. Na odwrót, w początkowej dawce można podać wektor wirusowy lub preparat białkowy, zazwyczaj białko formułowane w adiuwancie, a w dawce przypominającej podać szczepionkę DNA według wynalazku. Można stosować wiele dawek początkowych i/lub przypominających.
W postaciach wynalazku rozważa się fragmenty białek Gag, Nef lub RT. Tak więc np. polinukleotyd według wynalazku może kodować fragment białka Gag, Nef lub RT HIV. Polinukleotyd kodujący fragment o długości co najmniej 8, np. 8-10 aminokwasów lub aż do 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 lub 200 aminokwasów uważa się za objęty zakresem wynalazku tak długo jak kodowany oligo- lub polipeptyd wykazuje antygenowość HIV. W szczególności, ale nie wyłącznie, ta postać wynalazku obejmuje sytuację gdy polinukleotyd koduje fragment pełnej sekwencji białkowej HIV i może stanowić jeden lub większą liczbę osobnych epitopów białka. Takie fragmenty mogą mieć zoptymalizowane kodony, tak że fragment ma wzór wykorzystania kodonów przypominający silnie eksprymowany gen ssaczy.
PL 207 168 B1
Korzystne konstrukty według wynalazku obejmują:
1. p17, p24 (optymalizowane Gag), RT (optymalizowaną), skrócone NEF (pozbawione nukleotydów kodujących końcowe aminokwasy 1-85)
2. p17, p24, RT (optymalizowaną), skrócone NEF (pozbawione nukleotydów kodujących końcowe aminokwasy 1-65)
3. Szczególnie korzystne konstrukty według wynalazku obejmują potrójne fuzje RT-NEF-Gag oraz RT-Gag-Nef w szczególności:
4. Optymalizowaną RT, skrócone NEF oraz optymalizowane p17, p24 (gag) (RNG) oraz
5. Optymalizowaną RT, optymalizowane p17, 24 (gag), skrócone Nef (pozbawione aminokwasów 1-65) RGN
Korzystne jest aby konstrukty HIV pochodziły z HIV pod-typu B lub podtypu C, korzystnie podtypu B.
Jak omówiono powyżej, wynalazek obejmuje wektory ekspresyjne zawierające sekwencje nukleotydowe według wynalazku. Takie wektory ekspresyjne rutynowo konstruuje się w dziedzinie biologii molekularnej i mogą one np. zawierać plazmidowy DNA oraz odpowiednie inicjatory, promotory, wzmacniacze i inne elementy, takie jak np. sygnały poliadenylacji, które mogą być potrzebne, oraz które umiejscawia się w prawidłowej orientacji, tak aby umożliwić eksprymowanie białka. Inne odpowiednie wektory będą znane fachowcowi w dziedzinie wynalazku. W związku z tym przykładowo można powołać publikację Sambrook i in. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. wydanie, CSH Laboratory Press (1989).
Korzystnie polinukleotyd według wynalazku lub do stosowania zgodnie z wynalazkiem w wektorze, jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kontrolną, która jest w stanie umożliwić ekspresję sekwencji kodującej w komórce gospodarzu, tj. wektor jest wektorem ekspresyjnym. Określenie „funkcjonalnie połączony dotyczy zestawienia, w którym opisane składniki są ze sobą w związku umożliwiającym ich funkcjonowanie w zamierzony sposób. Sekwencję regulatorową, taką jak promotor, „funkcjonalnie połączoną z sekwencją kodującą umiejscawia się w taki sposób, że osiąga się ekspresję sekwencji kodującej w warunkach zgodnych z sekwencją regulatorową.
Wektorami mogą być np. plazmidy, sztuczne chromosomy (np. BAG, PAC, YAC), wektory wirusowe lub fagowe dostarczone z miejscem startu replikacji, dodatkowo promotorem do ekspresji polinukleotydu i dodatkowo regulatorem promotora. Wektory mogą zawierać jeden lub większą liczbę genów markerów selekcji, np. gen oporności na ampicylinę lub kanamycynę w przypadku plazmidu bakteryjnego lub gen oporności dla wektora grzybowego. Wektory można stosować in vitro, np. do wytwarzania DNA lub RNA albo stosować do transfekcji lub transformacji komórki gospodarza, np. ssaczej komórki gospodarza, np. do wytwarzania białka kodowanego przez wektor. Wektory można także przystosować do stosowania in vivo, np. w metodzie szczepienia DNA lub terapii genowej.
Promotory i inne sygnały regulacji ekspresji można wybrać tak, aby były zgodne z komórką gospodarzem, dla której zaprojektowana jest ekspresja. Tak więc np. promotory ssacze obejmują promotor metalotioneiny, który może być indukowany w odpowiedzi na metale ciężkie, takie jak kadm, oraz promotor β-aktyny. Można także stosować promotory wirusowe, takie jak promotor dużego antygenu T SV40, wczesny (lE) promotor ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV), promotor LTR wirusa mięsaka Rousa, promotor adenowirusowy lub promotor HPV, w szczególności górny region regulatorowy (URR) HPV. Wszystkie te promotory są dobrze opisane i łatwo dostępne w dziedzinie wynalazku.
Korzystnym elementem promotora jest najwcześniejszy promotor CMV pozbawiony intronu A, ale zawierający egzon 1. Element promotora może być minimalnym elementem promotora lub wzmocnionym promotorem, przy czym korzystny jest wzmocniony promotor. Zgodnie z tym dostarcza się wektor zawierający polinukleotyd według wynalazku pod kontrolą lE wczesnego promotora HCMV.
Przykłady odpowiednich wektorów wirusowych obejmują wektory wirusa opryszczki pospolitej, wektory wirusa ospy krowiej lub α-wirusa oraz retrowirusów, w tym lentiwirusów, adenowirusów i wirusów adenosatelitarnych. Techniki transferu genów za pomocą tych wirusów są znane fachowcom w dziedzinie wynalazku. Tak więc np. wektory retrowirusowe można stosować do stabilnej integracji polinukleotydu według wynalazku do genomu gospodarza, jednakże taka rekombinacja nie jest korzystna. W odróżnieniu od tego, wektory adenowirusowe z defektem replikacji pozostają episomalne, a zatem umożliwiają przejściową ekspresję. Wektory zdolne do kierowania ekspresją w komórkach owadzich (np. wektory bakulowirusowe), komórkach ludzkich, drożdżach lub bakteriach można stosować do wytworzenia dużych ilości białka HIV kodowanego przez polinukleotydy według wynalazku, np. do stosowania jako szczepionki podjednostkowe lub w testach immunologicznych.
PL 207 168 B1
Polinukleotydy według wynalazku znajdują zastosowanie w wytwarzaniu przez ekspresję kodowanych białek, których ekspresja może zachodzić in vitro, in vivo lub ex vivo. Zatem nukleotydy mogą brać udział w syntezie rekombinowanego białka, np. w celu zwiększenia wydajności lub faktycznie mogą same znaleźć zastosowanie jako środki terapeutyczne wykorzystywane w technikach szczepienia DNA. Gdy polinukleotydy według wynalazku stosuje się do wytwarzania kodowanych białek in vitro lub ex vivo, komórki, np. w hodowli komórkowej, będą modyfikowane tak, aby zawierały polinukleotyd, który ma być eksprymowany. Takie komórki obejmują przejściowe lub korzystnie stabilne ssacze linie komórkowe. Szczególne przykłady komórek, które mogą zostać zmodyfikowane przez wstawienie wektorów kodujących polipeptyd według wynalazku obejmują ssacze komórki HEK293T, CHO, HeLa, 293 i COS. Korzystnie wybraną linią komórkową będzie taka, która nie tylko jest stabilna, ale także umożliwia dojrzałą glikozylację i ekspresję polipeptydu na powierzchni. Ekspresję można uzyskać w transformowanych oocytach. Polipeptyd moż e być eksprymowany z polinukleotydu wedł ug wynalazku w komórkach zwierzęcia transgenicznego, z wyłączeniem człowieka, korzystnie myszy. Zatem bierze się pod uwagę zwierzę transgeniczne, z wyłączeniem człowieka, eksprymujące polipeptyd z polinukleotydu wedł ug wynalazku.
Szczepienie ssaka polega na podawaniu mu skutecznej ilości takiej szczepionki lub kompozycji szczepionkowej. Najkorzystniej wektory ekspresyjne do stosowania w szczepionkach DNA, kompozycjach szczepionkowych oraz immunoterapeutykach będą wektorami plazmidowymi.
Szczepionki DNA można podawać w postaci „nagiego DNA, np. w ciekłym preparacie podawanym za pomocą strzykawki lub dyszy pod wysokim ciśnieniem, albo DNA formułowanego z liposomami albo drażniącego wzmacniacza transfekcji albo przez dostarczanie DNA za pomocą cząstek (PMDD), Wszystkie te układy dostarczające są dobrze znane w dziedzinie wynalazku. Wektor może być wprowadzony do organizmu ssaka, np. przez układ dostarczający w postaci wektora wirusowego.
Środki farmaceutyczne według wynalazku można podawać wieloma różnymi drogami, takimi jak domięśniowo, podskórnie, śródotrzewnowo, dożylnie lub dośluzówkowo.
W korzystnej postaci środek dostarcza się śródskórnie. W szczególnoś ci środek dostarcza się metodami podawania przez bombardowanie cząstkami za pomocą strzelby genowej, które obejmują powlekanie wektorem kulek (np. złotych), które następnie podaje się pod wysokim ciśnieniem do naskórka, tak jak np. opisano w Haynes i in., J Biotechnology 44: 37-42 (1996).
W jednym ilustrującym przykładzie, napędzane gazem przyspieszanie cząstek można osiągnąć za pomocą urządzeń, takich jak produkowane przez Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) oraz Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), których niektóre przykłady opisano w opisach patentowych US nr 5846796, 6010478, 5865796, 5584807 oraz EP nr 0500799. To rozwiązanie pozwala na bezigłowe dostarczanie, w którym preparat w postaci suchego proszku o mikroskopowych cząstkach, np. polinukleotydu, ulega przyspieszeniu do dużych prędkości w strumieniu gazowego helu wytworzonym przez urządzenie trzymane w ręku, napędzające cząstki do docelowej interesującej tkanki, zazwyczaj skóry. Cząstki korzystnie są złotymi kulkami o średnicy 0,4 - 4,0 um, korzystniej 0,6 - 2,0 μm, które powleka się koniugatem DNA, a następnie zamyka w naboju lub kasecie do umieszczenia w „strzelbie genowej.
W pokrewnej postaci, inne urządzenia oraz sposoby, które mogą być użyteczne do napędzanego gazem, bezigłowego wstrzykiwania środków według wynalazku obejmują te dostarczone przez Bioject, Inc. (Portland, OR), których niektóre przykłady opisano w opisach patentowych US nr 4790824, 5064413, 5312335, 5383851, 5399163, 5520639 i 5993412.
Wektory zawierające sekwencje nukleotydowe kodujące antygenowe peptydy podaje się w takiej ilości, aby były profilaktycznie lub terapeutycznie skuteczne. Podawana ilość zazwyczaj mieści się w zakresie 1 pg do 1 mg, korzystnie 1 pg do 10 ug przy dostarczaniu kierowanym cząstkami, oraz 100 ng do 1 mg, korzystnie 10 uq do 1 mg przy innych drogach podawania, nukleotydu na dawkę. Dokładna ilość może się znacząco różnić zależnie od wagi immunizowanego pacjenta oraz drogi podawania.
Możliwe jest aby składnik immunogenny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą peptyd antygenowy był podawany jednokrotnie lub powtarzalnie, np. 1-7 razy, korzystnie 1-4 razy, z przerwami od około 1 dnia do około 18 miesięcy. Jednakże ten tryb leczenia będzie się znacząco różnił zależnie od wielkości leczonego pacjenta, ilości podawanej sekwencji nukleotydowej, drogi podawania oraz innych czynników, które będą oczywiste dla fachowca w dziedzinie weterynarii lub medycyny. Pacjent może otrzymywać jeden lub większą liczbę innych leków przeciw retrowirusowi HIV jako część
PL 207 168 B1 jego ogólnego trybu leczenia. Ponadto immunogen kwasu nukleinowego może być podawany z adiuwantem.
Wyszczególniony tutaj składnik adiuwantowy może być podobnie podawany wieloma różnymi drogami podawania, takimi jak np. podawanie doustne, donosowe, dopłucne, domięśniowe, podskórne, śródskórne lub domiejscowe. Korzystnie składnik adiuwantowy podaje się drogą śródskórną lub domiejscową, najkorzystniej drogą domiejscową. Podawanie może być realizowane pomiędzy około 14 dni przed a około 14 dni po podaniu sekwencji nukleotydowej, korzystnie pomiędzy około dzień przed do około 3 dni po podaniu sekwencji nukleotydowej. Składnik adiuwantowy, w jednej postaci, podaje się zasadniczo równocześnie z podawaniem sekwencji nukleotydowej. Przez „zasadniczo równocześnie rozumie się, że podawanie składnika adiuwantowego korzystnie realizuje się w tym samym czasie co podawanie sekwencji nukleotydowej, a jeżeli nie, przynajmniej w przeciągu kilku godzin przed lub po podaniu sekwencji nukleotydowej. W najkorzystniejszym protokole leczenia, składnik adiuwantowy podaje się zasadniczo równocześnie z podawaniem sekwencji nukleotydowej. Oczywiście protokół ten może różnić się gdy jest to konieczne, zgodnie z typem czynników wspomnianych powyżej. Korzystne jest aby adiuwantem była pochodna 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy, taka jak imikwimod. Zazwyczaj imikwimod będzie formułowany jako preparat w postaci kremu do podawania miejscowego i będzie podawany zgodnie z powyższym protokołem.
Poza tym, zależnie od takich czynników, będzie się także różnić podawana dawka pochodnej, ale może ona mieścić się np. w zakresie około 0,1 - 100 mg na kg, przy czym „na kg dotyczy masy ciała danego ssaka. To podawanie pochodnej 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy korzystnie będzie powtarzane przy każdym kolejnym lub przypominającym podawaniu sekwencji nukleotydowej. Najkorzystniej, podawana dawka będzie mieścić się w zakresie około 1 - 50 mg na kg. W przypadku opisanego tutaj schematu „dawka początkowa-przypominająca, imikwimod lub inną pochodną 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy można podawać w dawce początkowej lub przypominającej albo zarówno w dawce początkowej, jak i przypominającej.
Gdy jest to możliwe aby składnik adiuwantowy zawierał tylko pochodne 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy podawane w surowym stanie chemicznym, korzystne dla podawania jest aby był on w postaci preparatu farmaceutycznego. Oznacza to, ż e skł adnik adiuwantowy korzystnie bę dzie zawierać 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminę połączoną z jednym lub większą liczbą farmaceutycznie dopuszczalnych nośników oraz dodatkowo inne składniki terapeutyczne. Nośnik (nośniki) musi być „dopuszczalny farmaceutycznie w znaczeniu zgodności z innymi składnikami w preparacie oraz nieszkodliwości dla jego biorcy. Natura preparatów będzie się oczywiście różnić zgodnie z zamierzoną drogą podawania i można je wytwarzać sposobami dobrze znanymi w dziedzinie farmacji. Wszystkie sposoby obejmują doprowadzenie do związania pochodnej 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy z odpowiednim nośnikiem lub nośnikami. Ogólnie preparaty wytwarza się przez jednorodne i dokładne doprowadzenie do związania pochodnej z płynnymi nośnikami lub drobno rozdrobnionymi nośnikami stałymi lub nimi obydwoma, a następnie, gdy jest to konieczne, nadanie produktowi postaci wymaganego preparatu. Preparaty według wynalazku odpowiednie do podawania doustnego mogą być obecne w postaci osobnych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki lub tabletki, wszystkie zawierające ustaloną wcześniej ilość składnika czynnego; w postaci proszku lub granulek; w postaci roztworu lub zawiesiny w cieczy wodnej lub niewodnej; lub w postaci płynnej emulsji olej w wodzie lub emulsji woda w oleju. Składnik czynny może być także obecny jako bolus, powidełko lub pasta.
Tabletkę można wytworzyć przez sprasowanie lub formowanie, dodatkowo z jednym lub większą liczbą dodatkowych składników. Sprasowane tabletki można wytworzyć przez sprasowanie w odpowiedniej maszynie skł adnika czynnego w postaci sypkiej, takiej jak proszek lub granulki, dodatkowo zmieszanego ze środkiem wiążącym, środkiem poślizgowym, obojętnym rozcieńczalnikiem, środkiem smarującym, środkiem powierzchniowo czynnym lub środkiem dyspergującym. Tabletki formowane można wytworzyć przez uformowanie w odpowiedniej maszynie mieszaniny sproszkowanego związku nawilżonego obojętnym płynnym rozcieńczalnikiem.
Tabletki ewentualnie mogą być powlekane lub nacięte i mogą być sformułowane w postaci do powolnego lub kontrolowanego uwalniania substancji czynnej.
Preparaty do iniekcji podawane drogą np. domięśniową, śródotrzewnową lub podskórną obejmują wodne lub niewodne jałowe roztwory do iniekcji, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne oraz substancje rozpuszczone, które nadają preparatowi izotoniczność z krwią zamierzonego biorcy; oraz wodne lub niewodne jałowe zawiesiny, które mogą zawierać środki suspensujące oraz środki zagęszczające. Preparaty mogą być w postaci pojemników z pojedynczymi
PL 207 168 B1 dawkami lub wielodawkowych, np. szczelnie zamkniętych ampułek i fiolek oraz mogą być przechowywane w stanie zliofilizowanym (wysuszone sublimacyjnie) wymagającym tylko dodania jałowego ciekłego nośnika, np. wody do zastrzyków, bezpośrednio przed użyciem. Przygotowywane bezpośrednio przed użyciem roztwory oraz zawiesiny do zastrzyków można wytworzyć z jałowych proszków, granulek i tabletek typu opisanego powyżej. Preparaty odpowiednie do podawania dopłucnego przez jamę ustną lub nosową mają taką postać, że cząstki zawierające składnik czynny, korzystnie o średnicy w zakresie 0,5-7 μ m, dostarcza się do drzewa oskrzelowego biorcy. Takie preparaty mogą wystę pować w postaci silnie rozdrobnionych proszków, które dogodnie są obecne albo w przekłuwalnej kapsułce, dogodnie np. żelatynowej, do stosowania w urządzeniu do inhalacji, albo alternatywnie w postaci preparatu samonapę dowego zawierają cego skł adnik czynny, odpowiedni ciekł y propelent oraz ewentualnie inne składniki, takie jak środek powierzchniowo czynny i/lub stały rozcieńczalnik. Preparaty samonapędowe można także stosować gdy składnik czynny jest dawkowany w postaci kropli roztworu lub zawiesiny. Takie preparaty samonapędowe są analogiczne do tych znanych w dziedzinie wynalazku i można je wytwarzać zgodnie z ustalonymi procedurami. Korzystnie dostarcza się je za pomocą uruchamianego ręcznie lub funkcjonującego automatycznie zaworu, który ma wymaganą charakterystykę rozpraszania; korzystnie zawór jest zaworem odmierzającym dostarczającym ustaloną objętość, np. 50 - 100 μ|, przy każdym jego uruchomieniu.
Kolejna możliwość polega na tym, że składnik adiuwantowy może być w postaci roztworu, do stosowania w atomizerze lub nebulizerze, przy czym do wytworzenia mgiełki drobnych kropelek do inhalacji stosuje się przyspieszony strumień powietrza lub pobudzenie ultradźwiękowe.
Preparaty odpowiednie do podawania donosowego ogólnie obejmują postacie podobne do opisanych powyżej dla podawania płucnego, jednakże w takich preparatach korzystne jest aby zawierały one cząstki o średnicy w zakresie około 10 - 200 μm, aby umożliwić zatrzymanie w jamie nosowej. Można to osiągnąć przez, gdy jest to stosowne, zastosowanie proszku o odpowiedniej wielkości cząstek lub wybór odpowiedniego zaworu. Inne odpowiednie preparaty obejmują gruboziarniste proszki o średnicy cząstek w zakresie około 20 - 500 nm, do podawania przez szybką inhalację przez przewód nosowy z pojemnika trzymanego w pobliżu nosa oraz krople do nosa zawierające około 0,2 do 5% wag. środka czynnego w roztworach wodnych lub olejowych. W jednej postaci wynalazku możliwe jest aby wektor, który zawiera sekwencję nukleotydu kodującą peptyd antygenowy był podawany w tym samym preparacie jako pochodna 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy. Zatem w tej postaci składnik immunogenny oraz adiuwantowy znajdują się w tym samym preparacie.
W jednej postaci składnik adiuwantowy przygotowuje się w postaci odpowiedniej do podawania za pomocą strzelby genowej i podaje się go tą drogą zasadniczo równocześnie z podawaniem sekwencji nukleotydowej. Do wytwarzania preparatów odpowiednich do stosowania w ten sposób konieczne może być zliofilizowanie pochodnej 1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-aminy i przyczepienie do np. kulek ze złota, które są odpowiednie do podawania za pomocą strzelby genowej.
W alternatywnej postaci składnik adiuwantowy można podawać jako suchy proszek, przez napędzanie gazem pod wysokim ciśnieniem.
Nawet jeżeli nie formułuje się ich razem, korzystne może być aby składnik adiuwantowy był podawany w tym samym miejscu lub w pobliżu miejsca podania sekwencji nukleotydowej.
Inne szczegóły preparatów farmaceutycznych można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennysylvania (1985).
Odpowiednie techniki wprowadzania nagiego polinukleotydu lub wektora do organizmu pacjenta także obejmują miejscowe nanoszenie z użyciem odpowiedniego podłoża. Kwas nukleinowy może być podawany miejscowo na skórę lub na powierzchnie śluzowe, np. przez podawanie donosowe, doustne, dopochwowe lub doodbytnicze. Nagi polinukleotyd lub wektor może być obecny razem z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, taką jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS). Pobieranie DNA można dalej ułatwić przez zastosowanie środków, takich jak bupiwakaina, albo osobno albo włączonych do preparatu DNA. Inne sposoby podawania kwasu nukleinowego bezpośrednio biorcy obejmują ultradźwięki, stymulację elektryczną, elektroporację oraz mikrozaszczepianie, które opisano w opisie patentowym US nr 5697901.
Pobieranie konstruktów kwasów nukleinowych można wzmocnić przez zastosowanie kilku znanych technik transfekcji, np. tych obejmujących zastosowanie środków transfekcyjnych. Przykłady tych środków obejmują środki kationowe, np. fosforan wapnia i DEAE-Dextran oraz lipofektanty, np. lipofektam i transfektam. Podawana dawka kwasu nukleinowego może być zmieniana.
PL 207 168 B1
Sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku można także podawać za pomocą wyspecjalizowanych wektorów dostarczających użytecznych w terapii genowej. Metody terapii genowej przedyskutowano np. w Verme i in.. Nature 1997, 389:239-242. Można stosować układy wektorów zarówno wirusowych, jak i nie-wirusowych. Układy oparte na wirusach obejmują układy oparte na retrowirusach, lentiwirusach, adenowirusach, wirusach adenosatelitarnych, wirusach opryszczki, wirusie ospy kanarków oraz wirusie ospy krowiej. Nie-wirusowe układy obejmują bezpośrednie podawanie kwasów nukleinowych, technologię kapsułkowania w mikrosferach (kopolimery poli(laktyd-glikolid)) oraz układy oparte na liposomach. Układy oparte na wirusach i nieoparte na wirusach można łączyć, gdy wymagane jest podanie zastrzyków przypominających po początkowym zaszczepieniu, np. można wykonać pierwotne „początkowe zaszczepienie DNA za pomocą wektora niewirusowego, takiego jak plazmid, a następnie jedno lub większą liczbę szczepień „przypominających za pomocą wektora wirusowego lub układu nie opartego na wirusie. Możliwe są również systemy początkowegoprzypominającego szczepienia polinukleotydem według wynalazku, a następnie przypominającego białkiem w adiuwancie lub na odwrót.
Sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku można także podawać za pomocą transformowanych komórek. Takie komórki obejmują komórki zebrane od pacjenta. Do takich komórek in vitro można wprowadzić nagi polinukleotyd lub wektor według wynalazku i transformowane komórki można potem z powrotem wprowadzić do organizmu pacjenta. Polinukleotyd według wynalazku może wprowadzić do kwasu nukleinowego już obecnego w komórce przez zdarzenia rekombinacji homologicznej. Transformowana komórka może być, gdy jest to wymagane, hodowana in vitro oraz jedną lub większą liczbę tak powstałych komórek można zastosować zgodnie z wynalazkiem. Komórki można dostarczać do odpowiedniego miejsca u pacjenta z zastosowaniem znanych technik chirurgicznych lub mikrochirurgicznych (np. przeszczepianie, mikroiniekcja itd.).
Preparaty farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać związki adiuwantowe, jak wyszczególniono powyżej lub inne substancje, które mogą służyć do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez białko kodowane przez DNA. Mogą one być kodowane przez DNA, albo oddzielnie albo w fuzji z antygenem, albo mogą być włączone jako elementy nie-DNA preparatu. Przykłady substancji typu adiuwantów, które mogą być włączone w preparaty według wynalazku obejmują ubikwitynę, lizosomalne białko związane z błonami (LAMP), antygen rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B, ligand FLT3 (cytokina istotna w powstawaniu profesjonalnych komórek prezentujących antygen, w szczególności komórek dendrytycznych) oraz inne cytokiny, takie jak IFN-γ i GMCSF. Inne korzystne adiuwanty obejmują imikwimod i resimkwimod oraz tukarasol. Szczególnie korzystny jest imikwimod.
Opisana tutaj cząsteczka kwasu nukleinowego jest użyteczna w leczeniu lub profilaktyce zakażenia HIV. Cząsteczkę kwasu nukleinowego korzystnie podaje się z imikwimodem. Imikwimod korzystnie podaje się miejscowo, przy czym cząsteczkę kwasu nukleinowego korzystnie podaje się przez dostarczanie za pomocą cząstek.
Zatem możliwe jest leczenia pacjenta cierpiącego na lub podatnego na zakażenie HIV, przez podawanie cząsteczki kwasu nukleinowego i imikwimodu.
Wynalazek zostanie przedstawiony w następujących przykładach.
P r z y k ł a d 1. Optymalizacja p55 gag (p17, p24, p13) tak aby przypominały wykorzystanie kodonów silnie eksprymowanych genów ludzkich
Interesujący gen
Syntetyczny gen kodujący antygen p55gag szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B (nr GenBank K03455), zoptymalizowany do ekspresji w komórkach ssaczych złożono z nachodzących na siebie oligonukleotydów drogą PCR.
Optymalizacja objęła zmianę wzoru wykorzystania kodonów wirusowego genu, aby uzyskać częstość kodonów bliższą do występującej w silnie eksprymowanych genach ludzkich. Kodony przypisano stosując program statystyczny Visual Basic nazwany Syngene (unowocześniona wersja Calcgene, napisanego przez R.S. Hale i G. Thompson, Protein Expression and Purification tom 12 str. 185-188, 1998).
Klonowanie
Produkt PCR gag o długości 1528 pz oczyszczono z żelu, przecięto endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BamHI i wligowano do przeciętego Notl/BamHI wektora WRG7077. Umiejscowiło to gen pomiędzy CMV promotorem/intronem A a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
Klony zsekwencjonowano i sprawdzono pod względem błędów. Żaden pojedynczy klon nie był w 100% poprawny. Zatem regiony poprawnych sekwencji z dwóch klonów połączono ze sobą drogą
PL 207 168 B1
PCR z nachodzącymi ze sobą fragmentami stosując odpowiednie kombinacje optymalizującego zestawu oligonukleotydów, aby uzyskać pełnej długości gen gag ze zoptymalizowanymi kodonami. W tym ostatecznym klonie dalej znaleziono pojedynczą delecję, która powodowała przesunięcie ramki odczytu i przedwczesną terminację translacji. Delecję naprawiono przez wycięcie regionu z genu zawierającego nieprawidłową sekwencję i wklonowanie prawidłowej sekwencji z odpowiadającego regionu innego klonu. W ten sposób uzyskano ostateczny klon gag p55 ze zoptymalizowanymi kodonami: Gagoptrpr2 (patrz fig. 2).
P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie p17/p24 skróconego Nef genu fuzyjnego
Interesujący gen
Części p17 i p24 genu p55gag pochodzące ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B zamplifikowano drogą PCR z plazmidu pHXB?Pr (B.Maschera, E Furfine i E.D. Blair 1995 J. Virol 69 5431-5436). pHXB?Pr. 426 pz od 3'-końca genu nef HXB2 zamplifikowano z tego samego plazmidu. Ponieważ gen nef HXB2 zawiera kodon przedwczesnej terminacji zastosowano dwie nachodzące na siebie reakcje PCR, aby naprawić ten kodon (TGA [stop] na TGG [Trp]).
Produkty PCR p17/p24linker i trNEFlinker połączono z wytworzeniem genu fuzyjnego p17p24trNEF (fig. 3) w reakcji PCR (antysensownej).
Produkt wielkości 1542 pz oczyszczono z żelu, przecięto endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BamHI i wklonowano w miejsca Notl BamHI wektora WRG7077. Umiejscowiło to gen pomiędzy CMV promotorem/intronem A a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie genu fuzyjnego Gag p17/24opt/trNef1 („Gagopt/Nef)
Interesujący gen
Część p17/p24 genu p55gag ze zoptymalizowanymi kodonami pochodząca ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B zamplifikowano drogą PCR z plazmidu pGagOPTrpr2. Skrócony gen nef HXB2 z naprawionej kodonem przedwczesnej terminacji (TGA [stop] do TGG [Trp]) zamplifikowano drogą PCR z plazmidu 7077trNef20. Dwa produkty PCR zaprojektowano tak, aby zawierały pokrywające się końce, aby dwa geny mogły być połączone w drugiej reakcji PCR.
Produkt o długości 1544 pz oczyszczono z żelu, przecięto endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BamHI i wklonowano w miejsca Notl BamHI wektora WRG7077. Umiejscowiło to gen pomiędzy CMV promotorem/intronem A a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
P r z y k ł a d 4. Plazmid: p7077-RT3 klon #A
Interesujący gen
Syntetyczny gen kodujący część RT genu pol szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B, zoptymalizowany do ekspresji w komórkach ssaczych złożono z nachodzących na siebie oligonukleotydów drogą PCR. Sklonowana sekwencja odpowiadała pozycjom 2550-4222 sekwencji odniesienia HXB2 (nr GenBank K03455). Aby zapewnić ekspresję sklonowana sekwencja miała dwa dodatkowe kodony na 5' końcu, nieobecne w oryginalnym genie - AUG GGC (Met Gly).
Optymalizacja objęła zmianę wzoru wykorzystania kodonów genu wirusowego z uzyskaniem częstości kodonów bliższej do występującej w silnie eksprymowanych genach ludzkich, ale z wykluczeniem rzadko stosowanych kodonów. Kodony przypisano stosując program statystyczny Visual Basic nazwany Syngene (unowocześniona wersja Calcgene, napisanego przez R.S. Hale i G. Thompson, Protein Expression and Purification tom 12 str. 185-188, 1998).
Ostateczny klon skonstruowano z dwóch klonów pośrednich #16 i #21.
Klonowanie
Produkty PCR o wielkości 1,7 kz oczyszczono z żelu, przecięto Notl i BamHI i PCR oczyszczono, przed wligowaniem do przeciętego Notl/BamHI wektora pWRG7077. To umiejscowiło gen pomiędzy promotorem CMV a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu. Klony zsekwencjonowano. Żaden klon nie był w 100% poprawny, ale klon #16 poprawiono przez zastąpienie fragmentu KpnI-BamHI o wielkości 403 pz zawierającego 3 błędy prawidłowym fragmentem KpnIBamHI z klonu #21. Ostateczny klon zweryfikowano przez sekwencjonowanie (patrz fig. 5).
P r z y k ł a d 5. Zoptymalizowana RT
Interesujący gen
Syntetyczny gen kodujący część RT genu pol szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B, zoptymalizowany do ekspresji w komórkach ssaczych wycięto z plazmidu P7077-RT3 jako fragment Notl/BamHI o wielkości 1697 pz, oczyszczono z żelu i wklonowano w miejsca Notl i BamHI wektora p7313-ie (pochodzącego z pspC31) umiejscawiając gen w dół od fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej globiny (R7004 p27) (fig. 6).
PL 207 168 B1
P r z y k ł a d 6
Plazmid 7077trNef20
Interesujący gen
Wstawka zawierała część genu nef ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B. 195 pz wydeletowano z 5'-końca genu usuwając kodony dla pierwszych 65 aminokwasów Nef. Ponadto naprawiono kodon przedwczesnej terminacji z opublikowanej sekwencji nef HXB2 (TAG do TGG [Trp]), jak opisano dla plazmidu p17/24trNEF1.
Skróconą sekwencję nef zamplifikowano drogą PCR z plazmidu p17/24trNef1. Sklonowana sekwencja odpowiadała pozycjom 8992-9417 sekwencji odniesienia HXB2 (nr GenBank K03455). Aby zapewnić ekspresję sklonowana sekwencja zawierała dodatkowy kodon na 5'-końcu, który nie jest obecny w naturalnym genie - AUG (Met).
Startery:
StrNef (sensowny)
ATAAGAATGCGGCCGCCATGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTT [SEQ ID NO:1]
AStrNef (antysensowny)
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO:2]
PCR: 94°C 2 minuty, następnie 25 cykli: 94°C 30 sekund, 50°C 30 sekund, 72°C 2 minuty, zakończenie 72°C 5 minut.
Klonowanie:
Produkt RT PCR o długości 455 pz oczyszczono z żelu, przecięto endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BamHI i wligowano do wektora przeciętego Notl/BamHI WRG7077. Umiejscowiło to gen pomiędzy CMV promotorem/intronem A a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
P r z y k ł a d 7
Plazmid: 7077RT 8
Interesujący gen
Część RT genu pol pochodziła ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B. Amplifikowano ją drogą PCR z plazmidu p7077Pol14.
Sklonowana sekwencja odpowiadała pozycjom 2550-4234 sekwencji odniesienia HXB2 (nr GenBank K03455). Aby zapewnić ekspresję sklonowana sekwencja zawierała dwa dodatkowe kodony na 5' końcu nieobecne w oryginalnym genie - AUG GGC (Met Gly).
Startery:
SRT (sensowny)
ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGCCCCATTAGCCCTATTGAGACT [SEQ ID NO: 3]
ASRT (antysensowny)
CGCGGATCCTTAATCTAAAAATAGTACTTTCCTGATT [SEQ ID NO:4]
PCR: 94°C 2 minuty, następnie 25 cykli: 94°C 30 sekund, 50°C 30 sekund, 72°C 4 minuty, zakończenie 72°C 5 minut.
Klonowanie
Produkt RT PCR o długości 1720 pz oczyszczono z żelu, przecięto endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BamHI i wligowano do wektora przeciętego Notl/BamHI WRG7077. Umiejscowiło to gen pomiędzy CMV promotorem/intronem A a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
P r z y k ł a d 8 p17/24opt/RT/trNef13 („Gagopt/RT/Nef)
Konstrukt ten zwiera PCR, co powoduje zmianę aminokwasu R na H.
Interesujący gen
Część p17/p24 genu p55gag ze zoptymalizowanymi kodonami szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B zamplifikowano drogą PCR z plazmidu pGagOPTrpr2. Sekwencję kodującą RT zamplifikowano drogą PCR z plazmidu 7077RT 8. Skrócony gen nef HXB2 z naprawionym kodonem przedwczesnej terminacji (TGA [stop] na TGG [Trp]) zamplifikowano drogą PCR z plazmidu 7077trNef20. Trzy produkty PCR zaprojektowano tak, aby zawierały nachodzące na siebie końce, aby trzy geny mogły być połączone w drugiej reakcji PCR.
Startery (P17/24)
Sp17p24opt (sensowny)
ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT [SEQ ID NO:5]
ASp17p24optRTlinker (antysensowny)
PL 207 168 B1
TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC [SEQ ID NO:6]
PCR: 94°C 1 minuta, następnie 20 cykli: 94°C 30 sekund, 50°C 30 sekund, 72°C 2 minuty, zakończenie 72°C 4 minuty
Produkt p17/24opt o długości 1114 pz oczyszczono z żelu.
(RT)
Sp17p24optRTlinker (sensowny)
CAGAGTGTTGATGGGCCCCATTAGCCCTAT [SEQ ID NO:7]
ASRTtrNeflinker (antysensowny)
AACCCACCATATCTAAAAATAGTACTTTCC [SEQ ID NO:8]
PCR: jak powyżej
Produkt RT PCR o długości 1711 pz oczyszczono z żelu.
(nef skrócony na 5'-końcu)
SRTtrNeflinker (sensowny)
CTATTTTTAGATATGGTGGGTTTTCCAGTCAC [SEQ ID NO:9]
AStrNef (antysensowny)
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO:10]
PCR: jak powyżej.
Produkt o długości 448 pz oczyszczono z żelu.
Następnie trzy produkty PCR połączono ze sobą w drugim PCR ze starterami Sp17/24opt i AstrNef.
PCR: 94°C 1 minuta, następnie 30 cykli: 94°C 30 sekund, 50°C 30 sekund, 72°C 4 minuty, zakończenie 72°C 4 minuty.
Produkt o długości 3253 pz oczyszczono z żelu, przecięto endonukleazami restrykcyjnymi Notl i BamHI i wklonowano w miejsca Notl BamHI wektora WRG7077. Umiejscowił o to gen pomiędzy CMV promotorem/intronem A a sygnałem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
P r z y k ł a d 9
Plazmid: pGRN#16 (p17/p24opt corr /RT/trNef.)
Interesujący gen
Zaobserowano, że poliproteina wytwarzana z p17/24opt/RT/trNef13 („Gagopt/RT/Nef) była eksprymowana w skróconej formie około 30 kDa ze względu na zebranie niekorzystnych kodonów p24 wokół aminokwasu 270. Zastąpiono je optymalnymi kodonami drogą mutagenezy łączącej PCR. p17/24opt/RT/trNef13 zastosowano jako matrycę do amplifikacji części Gag leżącej 5' względem mutacji za pomocą starterów Sp17/p24opt i GTR-A oraz części Gag leżącej 3' względem mutacji za pomocą starterów GTR-S i Asp17/p24optRTlinker. Pokrywający się fragment produktów zawierał zmiany w kodonach i produkty oczyszczone z ż elu połączono ze sobą stosują c startery Sp17/p24opt i ASp17/p24optRTlinker. Produkt przecię to za pomocą Notl i Agel i wstawiono do podobnie przecię tego D17/24opt/RT/trNef13, z wytworzeniem pGRN. Klon #16 zweryfikowano i zastosowano dalej.
Startery
5' PCR:
Sp17p24opt (sensowny)
ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT [SEQ ID NO:11]
GTR-A (antysensowny)
GCGCACGATCTTGTTCAGGCCCAGGATGATCCACCGTTTATAGATTTCTCC [SEQ ID NO:12]
3' PCR
Sensowny: GTR-S (sensowny)
ATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGCATGTACTCTCCGACATCCATCC [SEQ ID NO:13]
ASp17p24optRTlinker (antysensowny)
TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC [SEQ ID NO: 14]
Warunki PCR dla poszczególnych produktów oraz złożenia za pomocą polimerazy DNA PWO (Roche):
95°C 1 minuta, następnie 20 cykli 95°C 30 sekund, 55°C 30 sekund, 72°C 180 sekund, zakończenie 72°C 120 sekund oraz 4°C do końca.
Produkt o długości 1114 pz oczyszczono z żelu i przecięto Notl i Agel, w wyniku czego otrzymano fragment o długości 6647 pz, który oczyszczono z żelu i wligowano do ciętego Notl/Agel oczyszczonego z żelu p17/24opt/RT/trNef13, z wytworzeniem pGRN#16.
PL 207 168 B1
P r z y k ł a d 10
Plazmid: p73i-GRN2 klon #19 (p17/p24(opt)/RT(opt)trNef) - naprawiony
Interesujący gen
Część p17/p24 gag ze zoptymalizowanymi kodonami, RT ze zoptymalizowanymi kodonami oraz skróconego genu nef ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół od fragmentu Iowa promotora
HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Plazmidy zawierające gen trNef pochodzący z plazmidu p17/24trNef1 zawierały błąd PCR, który powodował zmianę aminokwasu R do H w pozycji 19 aminokwasu od końca nef. Poprawiono to przez mutagenezę PCR, a poprawiony nef połączono drogą PCR z RT ze zoptymalizowanymi kodonami z p7077-RT3 i połączony fragment strawiono Apal i BamHI i wklonowano do ApaI/BamHI przeciętego p73i-GRN.
Startery
PCR coRT z p7077-RT3 za pomocą starterów: (Polimeraza = PWO (Roche) przez cały czas).
Sensowny: U1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT [SEQ ID NO:15]
AScoRT-Nef
GGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC [SEQ ID NO:16]
Cykle: 95°C (30 sekund), a następnie 20 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (180 sekund), a następnie 72°C (120 sekund) i 4°C do końca.
Produkt PCR o wielkości 1,7 kz oczyszczono z żelu.
PCR 5' Nef z p17/24trNef1 za pomocą starterów:
Sensowny: S-Nef
ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC [SEQ ID NO:17]
Antysensowny: ASNef-G:
GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC [SEQ ID NO: 18]
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 15 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (60 sekund), następnie 72°C (120 sekund) i 4°C do końca.
PCR 3' Nef z p17/24trNef1 za pomocą starterów:
Sensowny: SNEF-G
GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC [SEQ ID NO:19]
Antysensowny:
AStrNef (antysensowny)
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO:20]
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 15 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (60 sekund), następnie 72°C (120 sekund) i do końca 4°C.
Produkty PCR oczyszczono z żelu. Początkowo dwa produkty Nef połączono stosując startery 5' (S-Nef) i 3' (AstrNef).
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 15 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (60 sekund), następnie 72°C (180 sekund) i do końca 4°C.
Produkt PCR oczyszczono PCR i połączono z produktem RT za pomocą starterów U1 i AstrNef:
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 20 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (180 sekund), następnie 72°C (180 sekund) i do końca 4°C.
Produkt wielkości 2,1 kz oczyszczono z żelu i przecięto Apal i BamHI. Plazmid p73I-GRN także przecięto Apal i BamHI, oczyszczono z żelu i zligowano z Apal-BamHI RT3trNef z odtworzeniem genu p17/p24(opt)/RT(opt)trNef.
P r z y k ł a d 11 p73i-GN2 klon #2 (p17/p24opt/trNef) - naprawiony
Interesujący gen
Część p17/p24 genów gag ze zoptymalizowanymi kodonami i skróconego Nef ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół od fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Plazmidy zawierające gen trNef pochodzący z plazmidu p17/24trNef1 zawierały błąd PCR, który powodował zmianę aminokwasu R do H w pozycji 19 aminokwasu od końca nef. Poprawiono to przez mutagenezę PCR, a poprawiony fragment pocięto BglII i BamHI i wklonowano do przeciętego
PL 207 168 B1
BglII/BamHI plazmidu p73l-GN (fig. 12), odtwarzając poprawiony gen fuzyjny p17/p24opt/trNef leżący w dół od fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
PCR 5' Nef z p17/24trNef1 za pomocą starterów:
Polimeraza = PWO (Roche) przez cały czas.
Sensowny: S-Nef
ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC [SEQ ID NO:21]
Antysensowny: ASNef-G:
GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC [SEQ ID NO: 22]
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 15 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (60 sekund), następnie 72°C (120 sekund) i do końca 4°C.
PCR 3' Nef z p17/24trNef1 za pomocą starterów:
Sensowny: SNEF-G
GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC [SEQ ID NO:23]
Antysensowny: AStrNef
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO:24]
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 15 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (60 sekund), następnie 72°C (120 sekund) i do końca 4°C.
Produkty PCR oczyszczono z żelu i połączono stosując startery 5' (S-Nef) i 3' (AstrNef).
Cykle: 95°C (30 sekund), następnie 15 cykli 95°C (30 sekund), 55°C (30 sekund), 72°C (60 sekund), następnie 72°C(180 sekund) i do końca 4°C.
Produkt PCR oczyszczono PCR, pocięto BglII/BamHI i fragment o wielkości 367 pz oczyszczono z żelu i wklonowano do przeciętego BglII/BamHI oczyszczonego z żelu p73i-GN.
P r z y k ł a d 12
Plazmid: p73I-RT w229k (Inaktywowana RT)
Interesujący gen
Wytwarzanie inaktywowanego genu RT leżącego w dół od fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Ze względu na obawy dotyczące stosowania aktywnej RT HIV w szczepionkach terapeutycznych wymagana była inaktywacja genu. Osiągnięto to przez mutagenezę PCR RT (pochodzącej z P73I-GRN2) w pozycji aminokwasowej 229 z Trp do Lys (R7271 p1-28).
Startery
PCR 5' RT + mutacja za pomocą starterów: (Polimeraza = PWO (Roche) przez cały czas)
Sensowny: RT3-u:1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT [SEQ ID NO:25]
Antysensowny: AScoRT-Trp229Lys
GGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT [SEQ ID NO:26]
Cykle:
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (60 sekund)] x [72°C (180 sekund)]
PCR oczyszczono z żelu
PCR 3' RT + mutacja za pomocą starterów:
Antysensowny: RT3-1:1
GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC [SEQ ID NO:27]
Sensowny: ScoRT-Trp229Lys
CCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG [SEQ ID NO:28]
Cykle:
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (60 sekund)] x [72°C (180 sekund)]
PCR oczyszczono z żelu
Produkty PCR oczyszczono z żelu i 5'- i 3'-końce RT połączono ze sobą stosując startery 5' (RT3-U1) i 3' (RT3-L1).
PL 207 168 B1
Cykle:
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (120 sekund)] x [72°C (180 sekund)]
Produkt PCR oczyszczono z żelu i wklonowano do p7313ie, stosując miejsca restrykcyjne Notl i BamHI, z wytworzeniem p73I-RT w229k (patrz fig. 13).
P r z y k ł a d 13
Plazmid: p73i-Tgrn (#3)
Interesujący gen
Część p17/p24 gag optymalizowanego pod względem kodonów, RT optymalizowanej pod względem kodonów skróconego genu Nef ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Potrójny konstrukt fuzyjny zawierający aktywną formę RT może nie zostać zaakceptowany przez jednostki regulujące do zastosowania u ludzi, zatem osiągnięto inaktywację RT przez wstawienie fragmentu wyciętego Nhel i Apal z p73i-RT w229k, do przeciętego Nhel/Apal p73i-GRN2#19 (fig. 14). Spowodowało to wytworzenie zmiany W >K w pozycji 229 RT.
P r z y k ł a d 14 p73l-Tnrg (#16)
Interesujący gen
Skrócony nef, gen inaktywowanej RT ze zoptymalizowanymi kodonami i część p17/p24 genu gag ze zoptymalizowanymi kodonami ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Kolejność genów w poliproteinie kodowanej przez D73i-Tgrn zmieniono drogą PCR i połączono drogą PCR z wytworzeniem p73I-Tnrg (fig. 15). Każdy gen zamplifikowano drogą PCR i oczyszczono z żelu przed połączeniem drogą PCR genów z wytworzeniem jednej poliproteiny. Produkt oczyszczono z żelu, strawiono Notl/BamHI i wligowano do przeciętego Notl/BamHI p7313ie.
Startery: trNef PCR S-Nef (Notl)
CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC [SEQ ID NO:29]
AS-Nef-coRT linker
GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG [SEQ ID NO:30]
RTw229k PCR
S-coRT
ATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG [SEQ ID NO:31]
AS-coRT-p17p24 linker
CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC [SEQ ID NO:32] p17p24opt PCR
S-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO:33]
AS-p17p24opt (BamHI)
GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC [SEQ ID NO:34]
Warunki PCR dla poszczególnych produktów i połączenia za pomocą polimerazy DNA VENT (NEB):
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (120 sekund [p17p24 lub RT] lub 60 sekund [trNef])] x [72°C (240 sekund)]
Produkty PCR oczyszczono z żelu i zastosowano do połączenia drogą PCR stosując startery S-trNef (Notl) i ASp17p24opt (BamHI):
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (210 sekund)] x [72°C (240 sekund)]
Produkt o wielkości 3000 pz oczyszczono z żelu i przecięto Notl i BamHI, oczyszczono drogą PCR i wligowano do strawionego Notl/BamHI oczyszczonego z żelu p7313ie, z wytworzeniem p73iTnrg.
PL 207 168 B1
P r z y k ł a d 15
1. Plazmid: P73i-Tngr (#3)
Interesujący gen
Skrócony nef, część p17/p24 gag ze zoptymalizowanymi kodonami oraz gen inaktywowanej RT ze zoptymalizowanymi kodonami ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Kolejność genów w poliproteinie kodowanej przez p73i-Tgrn zmieniono drogą PCR i połączono drogą PCR z wytworzeniem p73l-Tngr (fig. 16). p17/p24 oraz RT ze zoptymalizowanymi kodonami wytworzono jako pojedynczy produkt i dołączono drogą PCR do zamplifikowanego trNef. Produkt oczyszczono z żelu, strawiono Notl/BamHI i wligowano w przecięty Notl/BamHI p7313ie.
Startery
P17/p24 - RT 3'PCR;
Sp17p24opt (sensowny)
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO:35]
RT3 1:1 (antysensowny)
GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC [SEQ ID NO:36]
TrNef 5'PCR
S-Nef (Notl)
CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC [SEQ ID NO:37]
AS-Nef-p17p24
CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG [SEQ ID NO:38]
Warunki PCR dla poszczególnych produktów i połączenia za pomocą polimerazy DNA VENT (NEB):
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (180 sekund [p17p24+RT] lub 60 sekund [trNef] lub 210 sekund [łączenie])] x [72°C (240 sekund)]
Produkt o wielkości 3000 pz oczyszczono z żelu i strawiono Notl i BamHI, oczyszczono PCR i wligowano do strawionego Notl/BamHI oczyszczonego z żelu p7313ie, z wytworzeniem p73i-Tngr.
P r z y k ł a d 16
Plazmid: p73l-Trgn (#6)
Interesujący gen
Inaktywowana RT ze zoptymalizowanymi kodonami, część p17/p24 gag ze zoptymalizowanymi kodonami oraz skrócony gen nef ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Kolejność genów w konstrukcie uzyskano przez amplifikację PCR p17p24-trNef i RTw229k z plazmidów odpowiednio p73l-GN2 i p73l-RTw229k. Połączenie przeprowadzono drogą PCR i produkt oczyszczono z żelu i przecięto Notl/BamHI przed wligowaniem do strawionego Notl/BamHI p7313ie. Sekwencjonowanie ujawniło, że p17p24 nie był całkowicie zoptymalizowany, zatem fragment o długości 700 pz wycięto Agel/MunI z regionu kodującego i zastąpiono go fragmentem Munl/Agel z p73i-Tgrn#3 zawierającego prawidłową sekwencję kodującą (patrz fig. 17).
Startery p17p24-trNef PCR
S-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO:39]
AstrNef (BamHI)
RTw229k
RT3-U:1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT [SEQ ID NO:40]
AS-coRT-p17p24opt linker
CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC [SEQ ID NO:41]
Warunki PCR dla poszczególnych produktów i połączenia za pomocą polimerazy DNA VENT (NEB):
x [94°C (30 sekund)]
PL 207 168 B1 x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (120 sekund (PCR) lub 180 sekund (połączenie) x [72°C (240 sekund)]
Produkt o wielkości 3000 pz z łączącej PCR oczyszczono z żelu i przecięto Notl i BamHI, oczyszczono drogą PCR i wligowano do strawionego Notl/BamHI oczyszczonego z żelu p7313ie, z wytworzeniem p73i-Tngr. Analiza sekwencji wykazała, że p17p24 uzyskany z p73I-GN2 nie miał całkowicie zoptymalizowanych kodonów, oraz że tak został on przeniesiony do nowego plazmidu. Naprawiono to przez wycięcie fragmentu o wielkości 700 pz z p73i-Tngr przeciętego MunI i Agel i zastąpienie go przez ligację z produktem o wielkości 700 pz strawionym przez Munl/Agel z p73i-Tgrn, z wytworzeniem konstruktu p73l-Tngr#6.
P r z y k ł a d 17
Plazmid: p73i-Trng (#11)
Interesujący gen
Inaktywowana RT ze zoptymalizowanymi kodonami, skrócone Nef i część p17/p24 genu gag ze zoptymalizowanymi kodonami ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Kolejność genów w konstrukcie osiągnięto przez amplifikację PCR genów RT-trNef i p17p24 z p73i-Tgrn. Przeprowadzono połączenie drogą PCR tych dwóch fragmentów DNA i produkt o wielkości 3 kz oczyszczono z żelu i strawiono Notl/BamHI przed wligowaniem do strawionego Notl/BamHI p7313ie, z wytworzeniem p73I Trng (#11).
Startery:
RTw229k-trNef
RT3-u:1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT [SEQ ID NO:42]
AS-Nef-p17p24opt linker
CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG [SEQ ID NO:43]
P17p24
S-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO:44]
AS-p17p24opt(BamHI)
GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC [SEQ ID NO:45]
Warunki PCR dla poszczególnych produktów i połączenia za pomocą polimerazy DNA VENT (NEB):
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (120 sekund [PCR genów) lub 180 sekund (połączenie) x [72°C (240 sekund)]
Produkt o wielkości 3000 pz z łączącej PCR oczyszczono z żelu i przecięto Notl i BamHI, oczyszczono drogą PCR i wligowano do strawionego Notl/BamHI oczyszczonego z żelu p7313ie, z wytworzeniem p73i-Tngr.
P r z y k ł a d 18 p73i-Tgnr (#f1)
Interesujący gen
Część p17/p24 genu gag ze zoptymalizowanymi kodonami, skrócony Nef i gen RT ze zoptymalizowanymi kodonami ze szczepu HXB2 HIV-1 podtypu B leżące w dół od fragmentu Iowa promotora HCMV + egzon 1 i w górę od sygnału poliadenylacji króliczej β-globiny.
Kolejność genów w konstrukcie uzyskano przez amplifikację PCR p17p24-trNef i RTw229k z plazmidów odpowiednio p73I-GN2 i p731-RTw229k. Przeprowadzono połączenie PCR i produkt oczyszczono z żelu i przecięto Notl/BamHI przed wligowaniem do strawionego Notl/BamHI p7313ie. Znaleziono dwa błędy w sekwencji (p17p24 i RT), które następnie naprawiono przez zastąpienie prawidłowymi częściami genów z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych w obrębie poliproteiny (patrz fig. 19).
Startery p17p24-trNef PCR
S-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO:46]
AS-Nef-coRTlinker
PL 207 168 B1
GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG [SEQ ID NO:47]
RTw229k
S-coRT
ATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG [SEQ ID NO:48]
RT3-1:1
GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC [SEQ ID NO:49]
Warunki PCR dla poszczególnych produktów i połączenia za pomocą polimerazy DNA VENT (NEB):
x [94°C (30 sekund)] x [94°C (30 sekund)/55°C (30 sekund)/72°C (120 sekund (PCR) lub 180 sekund (połączenie) x [72°C (240 sekund)]
Produkt o wielkości 3000 pz oczyszczono z żelu i strawiono Notl i BamHI, oczyszczono drogą PCR i wligowano do strawionego Notl/BamHI oczyszczonego z żelu p7313ie, z wytworzeniem p73iTngr. Sekwencjonowanie ujawniło, że p17p24 nie miał całkowicie zoptymalizowanych kodonów, zatem następnie fragment o wielkości 700 pz wycięto z regionu kodującego przez Agel/MunI i zastąpiono go fragmentem z p73i-Tgrn#3 zawierającym prawidłową sekwencję kodującą. Poliproteina także zawierała pojedynczą mutację punktową (G2609A) powodującą podstawienie aminokwasu Thr na Ala w części RT poliproteiny. Mutację poprawiono przez strawienie konstruktu Apal/BamHI, oczyszczenie drogą PCR w celu usunięcia zmutowanej sekwencji, którą zastąpiono przez wligowanie części RT z p73i-Tgnr strawionej Apal/BamHI.
P r z y k ł a d 19
Przygotowywanie powlekanej plazmidem „zawiesiny złota do naboi DNA do „strzelby genowej
Plazmidowy DNA (około 1 gg/pl), np. 100 μg i 2 pm cząstki złota, np. 50 mg, (PowderJect), zdyspergowano w 0,05 M spermidynie, np. 100 gl, (Sigma). DNA wytrącono na cząstkach złota przez dodanie 1M CaCl2, np. 100 gl (American Pharmaceutical Partners, Inc., USA). Kompleks DNA/złoto inkubowano przez 10 minuty w temperaturze pokojowej, przemyto trzykrotnie w absolutnym etanolu, np. 3x1 ml, (wcześniej wysuszonego na sicie molekularnym 3A (BDH)). Próbki ponownie zdyspergowano w absolutnym etanolu zawierającym 0,05 mg/ml poliwinylopirolidonu (PVP, Sigma) i podzielono na trzy równe porcje do 1,5 ml probówek do mikrowirówki, (Eppendorf). Porcje były do analizy (a) „zawiesiny złota, (b) eluatu - plazmidu wyeluowanego z (a) oraz (c) do przygotowania naboi Tefzel ze złota powlekanego plazmidem do „strzelby genowej, (patrz przykład 20 poniżej). Do przygotowania próbek (a) i (b) probówki zawierające plazmidowy DNA/„zawiesinę złota w etanolu/PVP odwirowano przez 2 minuty przy najwyższej prędkości w mikrowirówce Eppendorf 5418, supernatant odrzucono i „zawiesinę złota wysuszono przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Próbkę (a) ponownie zdyspergowano przy 0,5 - 1,0 gg/gl plazmidowego DNA w TE pH 8,0, zakładając około 50% powleczenie. Do elucji próbkę (b) zdyspergowano przy 0,5 - 1,0 gg/gl plazmidowego DNA w TE pH 8,0 i inkubowano w 37°C przez 30 minut z intensywnym wytrząsaniem, a następnie odwirowano przez 2 minuty przy najwyższej prędkości w mikrowirówce Eppendorf 5418 i supernatant, eluat, usunięto i przechowywano w -20°C. Dokładne stężenie wymytego DNA oznaczono metodą spektrofotometrycznej analizy ilościowej z zastosowaniem Genequant II (Pharmacia Biotech).
P r z y k ł a d 20
Przygotowanie naboi do immunizacji DNA
Przygotowanie naboi do urządzenia Accell do transferu genów opisano wcześniej (Eisenbraun i in., DNA and Cell Biology, 1993 tom 12 nr 9 str. 791-797; Pertner i in.). W skrócie, plazmidowym DNA powleczono 2 gm cząstki złota (DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., USA) i wprowadzono do rurki Tefzel, którą następnie pocięto na fragmenty o długości 1,27 cm, aby służyły jako naboje i przechowywano je na sucho w 4°C do czasu użycia. Przy typowym szczepieniu każdy nabój zawierał 0,5 mg złota powlekanego całkowitą ilością 0,5 gg DNA/nabój.
P r z y k ł a d 21
Odpowiedź immunologiczna na antygeny HIV po szczepieniu DNA z wykorzystaniem strzelby genowej
Myszy (n=3/grupę) zaszczepiono antygenami kodowanymi przez kwas nukleinowy i umieszczonymi w dwóch wektorach. P7077 wykorzystywał promotor lE HCMV włącznie z intronem A i egzonem 1 (promotor fcmv). P73I dostarczał ten sam antygen, ale zawierał promotor lE HCMV (promotor icmv) pozbawiony intronu A, ale zawierający egzon 1.
PL 207 168 B1
Plazmid dostarczono do ogolonego miejsca docelowego na skórze na brzuchu myszy F1 (C3H x Balb/c). Myszom podano pierwotną immunizację 2 x 0,5 μg DNA dnia 0, dawki przypominające 2 x 0,5 μg DNA dnia 35 i odpowiedź komórkową wykryto dnia 40 za pomocą IFN-γ Elispot.
- P73I - pusty wektor
- P7077 - pusty wektor
P7077 GRN - (promotor f CMV) Gag, RT, Nef
P73I GRN - (promotor i CMV) Gag, RT, Nef
P73I GR3N - (promotor CMV) optymalizowany Gag, optymalizowana RT, Nef
P7077 GN - (promotor f CMV) Gag, Nef
P73I GN - (promotor i CMV) Gag, Nef
Odpowiedź cytotoksycznych komórek T
Odpowiedź cytotoksycznych komórek T zbadano za pomocą testu IFN-γ ELISPOT ograniczonego do komórek T CD8+ limfocytów śledzionowych zebranych 5 dni później. Myszy uśmiercono przez skręcenie szyi i zebrano śledziony do lodowatego PBS. Limfocyty śledzionowe rozdzielono igłą w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), następnie zlizowano czerwone komórki krwi (1 minuta w buforze składającym się z 155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA). Po dwóch przemyciach w PBS w celu usunięcia materiału w postaci cząstek zawiesinę pojedynczych komórek rozporcjowano na płytkach ELISPOT wcześniej powlekanych wychwytującym IFN-γ przeciwciałem i stymulowano ograniczonym do CD8 pokrewnym peptydem (Gag, Nef lub RT). Po hodowli przez noc komórki produkujące IFN-γ uwidoczniono przez naniesienie przeciw-mysiego przeciwciała znakowanego IFN-Y-biotyną (Pharmingen), następnie streptawidyny sprzężonej z alkaliczną fosfatazą i oznaczono ilościowo metodą analizy obrazu.
Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 20, 21 i 22.
P r z y k ł a d 22
Immunogenność konstruktów szczepionkowych
1. Analiza komórek
Odpowiedź immunologiczna komórek obejmuje cytotoksyczne komórki CD8 oraz komórki pomocnicze CD4. Czułą metodą wykrywania specyficznych komórek CD8 i CD4 jest test ELIspot, który można stosować do ilościowego oznaczania liczby komórek zdolnych do wydzielania interferonu-γ lub IL-2. Test ELIspot polega na wychwytywaniu cytokin wydzielanych z poszczególnych komórek. W skrócie, wyspecjalizowane płytki do mikromianowania powleka się przeciwciałami przeciw cytokinom. Limfocyty śledzionowe wyizolowane od immunizowanych zwierząt inkubuje się przez noc w obecności specyficznych peptydów odpowiadających znanym epitopom (CD8) lub białek (CD4). Jeżeli komórki są stymulowane do wydzielania cytokin, będą one wiązać się z przeciwciałami na powierzchni płytki w pobliżu miejsca, w którym znajdują się poszczególne produkujące komórki. Cytokiny pozostają przyłączone do powlekającego przeciwciała po zlizowaniu komórek i przemyciu płytek. Test jest opracowany podobnie to testu ELISA i stosuje system wzmocnienia biotyna/awidyna. Liczba kropek równa jest liczbie komórek wytwarzających cytokiny.
Odpowiedzi CD8 na poszczególne K2d-ograniczone mysie epitopy: Gag (AMQMLKETI), Nef (MTYKAAVDL) i RT (YYDPSKDLI) oraz odpowiedzi CD4 na białek Gag i RT oznaczono dla 6 konstruktów. Wyniki tych testów analizowano statystycznie i konstrukty oszacowano pod względem ich immunogenności. Wynik przedstawiono na fig. 23.
2. Testy humoralne
Próbki krwi zebrano w celu analizy przeciwciał 7 i 14 dni po dawkach przypominających z dwóch doświadczeń. Surowicę oddzielono i przechowywano zamrożoną do czasu gdy można było zmierzyć miana przeciwciał za pomocą specyficznych testów ELISA. Wszystkie próbki zbadano pod względem Gag, Nef i RT. W skrócie, płytki ELISA powlekano odpowiednim białkiem. Nadmiar białka wymywano przed inkubowaniem w studzienkach rozcieńczonych próbek surowicy. Próbki surowicy wymywano i dodawano surowicę przeciw-mysią sprzężoną z odpowiednim znacznikiem. Płytki wywoływano i odczytywano w czytniku płytek. Wyniki przedstawiono na fig. 24.
3. Dane z przeciwciał
Miana przeciwciał mierzono dla wszystkich sześciu konstruktów w czterech doświadczeniach. Konstrukt p73i-GNR konsekwentnie nie wytwarzał odpowiedzi przeciwciał na Gag oraz ograniczał odpowiedź przeciwciał na Nef. Powód tego nie jest jasny, gdyż odpowiedzi komórek T obserwowane na limfocytach śledzionowych wyizolowanych z tych samych myszy wskazywały, że białko Gag było eksprymowane in vivo.
PL 207 168 B1
Ranking wytwarzania przeciwciał specyficznych dla Gag był następujący:
RNG>GRN>NRG>RGN>NGR>GNR
Analiza komórkowych danych immunologicznych
Przedmiotem było porównanie 6 konstruktów w oparciu o dane zliczenia plam z trzech doświadczeń immunologicznych. Zbadano trzy zestawy odpowiedzi:
odpowiedzi CD8 na Gag, Nef i RT dnia 7 (7 dni po początkowym szczepieniu), odpowiedzi CD4 na Gag i RT dnia 35 (7 dni po przypominającym szczepieniu), odpowiedzi CD8 na Gag, Nef i RT dnia 35 (7 dni po przypominającym szczepieniu).
Każdą odpowiedź (np. odpowiedź CD8 na Gag) modelowano stosując model efektu liniowego mieszanego SAS wersja 8. Model obejmował ustalone efekty konstruktu, tego czy konkretny antygen (Gag, Nef lub RT) był czy nie był obecny oraz czy była czy nie była obecna IL-2. Ponadto, dla odpowiedzi CD8, dla których dane były dostępne dla każdej poszczególnej myszy, osobniki włączono w tym modelu jako efekty losowe. Model obejmował składniki oddziaływania tak by umożliwić różne efekty dla konstruktu w każdej kombinacji antygenu (obecny/brak) i IL-2 (obecny/brak).
Z modelu różnicę pomiędzy średnimi poprawionymi dla każdego konstruktu i p7313 (grupa kontrolna) ustalano osobno dla każdej kombinacji antygenu (obecny/brak) i IL-2 (obecny/brak), włącznie z wartością p, która oznaczała czy różnica była istotna statystycznie. W oparciu o różnice i wartości p w obecności antygenu i przy braku IL-2, konstrukty porównano przez przypisanie punktacji 6 konstruktowi o największej różnicy, 5 następnemu najwyższemu, itd., ale 0 jakimkolwiek konstruktom dla których różnica nie była istotna statystycznie przy poziomie 5%.
Założenia modelu - że reszty miały rozkład normalny ze stałą wariancją, oceniano z zastosowaniem metod graficznych i analizy czułości, przy czym wymodelowano transformację najpierw log, a następnie pierwiastka kwadratowego z odpowiedzi. Ranking konstruktów nie był czuły na odchylenia od założeń modelu.
Po obliczeniu rang dla każdej odpowiedzi osobno w każdym doświadczeniu całkowitą liczbę rang dla trzech zestawów odpowiedzi obliczono we wszystkich trzech doświadczeniach. Poniższa tabela przedstawia całkowity ranking we wszystkich trzech doświadczeniach.
Całkowity ranking konstruktów dla każdego z trzech zestawów odpowiedzi połączony w trzech doświadczeniach immunologicznych
Konstrukt Dzień 7 (7 dni po szczepieniu początkowym) CD8 Dzień 35 (7 dni po szczepieniu przypominającym) CD4 CD8
GRN 5 18 3
GNR 17 24 28
RGN 28 23 33
RNG 25 27 37
NRG 25 19 0
NGR 4 14 10
RNG był najlepszy w rankingu dla obydwu zestawów odpowiedzi dnia 35 oraz drugim po RGN w kolejności w rankingu dnia 7. RGN także był wysoko w rankingu w obydwu zestawach odpowiedzi dnia 35.

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że koduje białko gag HIV-1 lub fragment zawierający jego epitop gag, białko Nef HIV-1 lub fragment zawierający epitop Nef oraz białko RT lub fragment zawierający epitop RT, funkcjonalnie połączona z heterologicznym promotorem.
  2. 2. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że białko gag zawiera p17.
    PL 207 168 B1
  3. 3. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 2, znamienna tym, że białko gag dodatkowo zawiera p24.
  4. 4. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1-3, znamienna tym, że sekwencja gag ma tak zoptymalizowane kodony aby przypominała wykorzystywanie kodonów w silnie eksprymowanym ludzkim genie, przy czym wartość RSCU sekwencji nukleotydowej jest większa niż 0,5.
  5. 5. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1-4, znamienna tym, że sekwencja RT lub jej fragment ma tak zoptymalizowane kodony aby przypominała silnie eksprymowany ludzki gen.
  6. 6. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1-5, znamienna tym, że kolejność sekwencji obejmuje RT, gag, Nef lub RT Nef gag.
  7. 7. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1-6, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej:
    - Gag (p17,p24) z optymalizacją kodonów, RT z optymalizacją kodonów, Nef skrócona
    - RT (z optymalizacją kodonów), Gag (p17, p24) z optymalizacją kodonów, Nef skrócona
    - RT (z optymalizacją kodonów), Nef skrócona, gag p17, p24 z optymalizacją kodonów.
  8. 8. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1-7, znamienna tym, że heterologicznym promotorem jest promotor genu lE HCMV.
  9. 9. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 8, znamienna tym, że 5'-promotora zawiera egzon 1.
  10. 10. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1-9, znamienna tym, że RT koduje mutację tak, aby zasadniczo inaktywować jakąkolwiek aktywność odwrotnej transkryptazy.
  11. 11. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 10, znamienna tym, że RT ulega mutacji przez podstawienie tryptofanu 229 lizyną.
  12. 12. Wektor, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1-11.
  13. 13. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że stanowi wektor wirusowy.
  14. 14. Wektor wirusowy według zastrz. 13, znamienny tym, że stanowi wektor adenowirusowy z defektem replikacji.
  15. 15. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że stanowi plazmid w postaci dwuniciowego DNA.
  16. 16. Białko, znamienne tym, że jest kodowane przez sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1-11.
  17. 17. Środek farmaceutyczny zawierający składnik czynny oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, rozcieńczalnik, nośnik lub adiuwant, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1-11 lub wektor zdefiniowany w zastrz. 12, 13, 14 albo 15.
  18. 18. Środek farmaceutyczny według zastrz. 17, znamienny tym, że jest przystosowany do podawania domięśniowego lub śródskórnego.
  19. 19. Środek farmaceutyczny według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że jako nośnik zawiera złotą kulkę.
  20. 20. Urządzenie do podawania śródskórnego, zwłaszcza w postaci strzelby genowej, znamienne tym, że zawiera środek farmaceutyczny zdefiniowany w zastrz. 17, 18 albo 19.
  21. 21. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1 - 11, wektor według zastrz. 12 - 15 lub środek według zastrz. 17 - 19, do stosowania w medycynie.
  22. 22. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej w zastrz. 1 - 11, lub wektora według zastrz. 12 - 15, do wytwarzania leku do leczenia choroby.
  23. 23. Sposób wytwarzania nukleotydu zdefiniowanego w zastrz. 1 - 11, znamienny tym, że funkcjonalnie łączy się sekwencję nukleotydową kodującą białko gag HIV-1 lub jego fragment i drugie białko HIV lub jego fragment, z heterologiczną sekwencją promotora.
PL370359A 2001-09-20 2002-09-18 Sekwencja nukleotydowa, wektor, białko, środek farmaceutyczny, urządzenie do podawania śródskórnego, zastosowanie sekwencji nukleotydowej i sposób wytwarzania nukleotydu PL207168B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/GB2001/004207 WO2002024225A1 (en) 2000-09-20 2001-09-20 Use of immidazoquinolinamines as adjuvants in dna vaccination
GB0129604A GB0129604D0 (en) 2001-12-11 2001-12-11 Novel compounds
GB0206462A GB0206462D0 (en) 2002-03-19 2002-03-19 Vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL370359A1 PL370359A1 (pl) 2005-05-16
PL207168B1 true PL207168B1 (pl) 2010-11-30

Family

ID=27256076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL370359A PL207168B1 (pl) 2001-09-20 2002-09-18 Sekwencja nukleotydowa, wektor, białko, środek farmaceutyczny, urządzenie do podawania śródskórnego, zastosowanie sekwencji nukleotydowej i sposób wytwarzania nukleotydu

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20070015721A1 (pl)
EP (2) EP2322626A1 (pl)
JP (1) JP4601956B2 (pl)
CN (1) CN100392085C (pl)
AR (1) AR036566A1 (pl)
AU (1) AU2002362368B2 (pl)
BR (1) BR0212619A (pl)
CA (1) CA2461056A1 (pl)
CO (1) CO5560591A2 (pl)
HU (1) HUP0402259A3 (pl)
IL (1) IL160809A0 (pl)
MX (1) MXPA04002631A (pl)
NO (1) NO331826B1 (pl)
NZ (1) NZ531814A (pl)
PL (1) PL207168B1 (pl)
WO (1) WO2003025003A2 (pl)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60325838D1 (de) * 2002-03-19 2009-03-05 Glaxo Group Ltd Imidazoquinolinamine als adjuvantien für hiv dna vakzine
GB0225788D0 (en) 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
US8080642B2 (en) 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
GB2406336A (en) * 2003-09-24 2005-03-30 Oxxon Pharmaccines Ltd HIV Pharmaccines
GB0417494D0 (en) * 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
DE102004049223A1 (de) * 2004-10-08 2006-04-20 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Zubereitung zum Impfen, Impfverfahren und Verwendung einer Impf-Zubereitung
CN103088060A (zh) * 2005-05-12 2013-05-08 葛兰素集团有限公司 疫苗组合物
AU2012201827B2 (en) * 2005-05-12 2014-09-04 Glaxo Group Limited Vaccine composition
US8772256B2 (en) * 2006-11-30 2014-07-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Codon modified immunogenic compositions and methods of use
GB0700914D0 (en) * 2007-01-18 2007-02-28 Animal Health Inst Polynucleotides and uses thereof
LT2137210T (lt) 2007-03-02 2016-12-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Naujas būdas ir kompozicijos
UY31101A1 (es) 2007-05-24 2009-01-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composición antigénica liofilizada
US20110091496A1 (en) * 2008-01-19 2011-04-21 Graham Barney S Methods and compositions for the delivery of vaccines to disrupted epithelium
WO2011043830A2 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 New York University Methods, agents and peptides for inducing an innate immune response in hiv vaccination
BRPI0914507A2 (pt) * 2009-12-23 2012-04-10 Fundacao Oswaldo Cruz vacina para lentivìrus baseada em vìrus recombinante vacinal da febre amarela
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
DK2772265T3 (en) 2010-05-14 2018-04-30 Univ Oregon Health & Science Recombinant HCMV and RHCMV vectors and uses thereof
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
ES2667425T3 (es) 2011-06-10 2018-05-10 Oregon Health & Science University Glucoproteínas y vectores recombinantes de CMV
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
EP2964769B1 (en) 2013-03-05 2018-08-22 Oregon Health & Science University Cytomegalovirus vectors enabling control of t cell targeting
US9695171B2 (en) 2013-12-17 2017-07-04 Pfizer Inc. 3,4-disubstituted-1 H-pyrrolo[2,3-b]pyridines and 4,5-disubstituted-7H-pyrrolo[2,3-c]pyridazines as LRRK2 inhibitors
KR102205348B1 (ko) 2014-07-16 2021-01-20 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 외인성 항원을 포함하는 인간 시토메갈로바이러스
MA40783A (fr) 2014-10-03 2017-08-08 Los Alamos Nat Security Llc Vaccins contre le vih comprenant un ou plusieurs antigènes episensus de population
MX2017010027A (es) 2015-02-10 2018-08-15 Univ Oregon Health & Science Métodos y composiciones útiles en la generación de respuestas de células t cd8+ no canónicas.
JP6873980B2 (ja) 2015-09-14 2021-05-19 ファイザー・インク ＬＲＲＫ２阻害薬としての新規のイミダゾ［４，５−ｃ］キノリンおよびイミダゾ［４，５−ｃ］［１，５］ナフチリジン誘導体
CN116926128A (zh) 2015-11-20 2023-10-24 俄勒冈健康与科学大学 包含微小rna识别元件的cmv载体
SG11201903340TA (en) 2016-10-18 2019-05-30 Univ Oregon Health & Science Cytomegalovirus vectors eliciting t cells restricted by major histocompatibility complex e molecules
AU2020384323A1 (en) 2019-11-14 2022-06-02 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
JPH05503841A (ja) 1989-11-16 1993-06-24 デューク ユニバーシティ 動物組織細胞の微片仲介トランスフォーメーション
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5583035A (en) * 1992-12-07 1996-12-10 Bayer Aktiengesellschaft HIV antisense expression vectors
US5654186A (en) 1993-02-26 1997-08-05 The Picower Institute For Medical Research Blood-borne mesenchymal cells
DK1293559T3 (da) 1994-01-21 2005-11-28 Powderject Vaccines Inc Gasdrevet genindförselsinstrument
DK0772619T4 (da) 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
US5786464C1 (en) * 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
GB9502879D0 (en) 1995-02-14 1995-04-05 Oxford Biosciences Ltd Particle delivery
PL328730A1 (en) * 1996-02-22 1999-02-15 Merck & Co Inc Synthetic hiv genes
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
EP0991771A2 (en) * 1997-03-06 2000-04-12 Klaus Überla Lentivirus based vector and vector system
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP2206785A1 (en) * 1998-12-31 2010-07-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Improved expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles
JP2003523721A (ja) * 1998-12-31 2003-08-12 カイロン コーポレイション 抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用
CN101586106B (zh) * 1999-11-16 2015-04-01 真那特股份公司 Hiv-1亚型间(c/b’)基因组和其用途
JP2003516741A (ja) * 1999-12-17 2003-05-20 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド コドン最適化ＨＩＶ−１Ｎｅｆ及び修飾ＨＩＶ−１Ｎｅｆを発現するポリヌクレオチドワクチン
BR0016510A (pt) * 1999-12-23 2002-08-27 Medical Res Council Aperfeçoamentos em ou relacionados as respostas imunes ao hiv
US6656706B2 (en) * 1999-12-23 2003-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular clones with mutated HIV gag/pol, SIV gag and SIV env genes
DE60026199T2 (de) * 2000-05-18 2006-11-23 Geneart Ag Synthetische Gene für gagpol und deren Verwendungen
CA2419822C (en) * 2000-08-14 2011-02-08 Gary J. Nabel Modifications of hiv env, gag, and pol enhance immunogenicity for genetic immunization

Also Published As

Publication number Publication date
CN1606624A (zh) 2005-04-13
WO2003025003A3 (en) 2003-12-04
NO20041157L (no) 2004-05-19
JP4601956B2 (ja) 2010-12-22
HUP0402259A3 (en) 2010-01-28
IL160809A0 (en) 2004-08-31
US20070015721A1 (en) 2007-01-18
CN100392085C (zh) 2008-06-04
CA2461056A1 (en) 2003-03-27
EP2322626A1 (en) 2011-05-18
US20090203144A1 (en) 2009-08-13
EP1427826B1 (en) 2011-04-20
AU2002362368B2 (en) 2006-09-21
PL370359A1 (pl) 2005-05-16
WO2003025003A2 (en) 2003-03-27
HUP0402259A2 (hu) 2005-01-28
EP1427826A2 (en) 2004-06-16
AR036566A1 (es) 2004-09-15
NO331826B1 (no) 2012-04-16
MXPA04002631A (es) 2004-07-08
NZ531814A (en) 2005-10-28
JP2005511019A (ja) 2005-04-28
CO5560591A2 (es) 2005-09-30
BR0212619A (pt) 2004-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002362368B2 (en) HIV-gag codon-optimised DNA vaccines
AU2002362368A1 (en) HIV-gag codon-optimised DNA vaccines
KR100874552B1 (ko) 코돈-최적화 파필로마 바이러스 서열
EP0689551B1 (en) Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
HRP970092A2 (en) Synthetic hiv genes
JP2010187681A (ja) ＨＩＶに対する免疫のためのｇｐ１２０と、Ｎｅｆ及び／又はＴａｔを含むワクチン
JP2012012416A (ja) Ｈｉｖワクチン処方物
JP2004528012A (ja) 改善された免疫応答を誘導し得る発現ベクターおよびこのベクターの使用方法
US7655235B2 (en) Vaccine
EP1558635B1 (en) Vaccine
RU2312896C2 (ru) Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок gag вич-1, способ получения указанной последовательности, вектор, содержащий ее, белок, кодируемый ею, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики и/или лечения вич-инфекции и спида
ES2364466T3 (es) Vacunas de adn optimizadas por codón rt-nef-gaf para vih.
TWI329647B (en) Vaccines
HK1066830B (en) Hiv- rt-nef-gag codon optimised dna vaccines
CN101255434A (zh) 疫苗
Newman et al. Characterization of Immune Responses Elicited by an Experimental Facilitated-DNA Vaccine for Human Immunodeficiency Virus Type-1 (HIV-1)

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120918