JPH05503841A

JPH05503841A - 動物組織細胞の微片仲介トランスフォーメーション

Info

Publication number: JPH05503841A
Application number: JP3501470A
Authority: JP
Inventors: ジョンストン　ステファン　エー．; ウイリアムス　アール．サンダース; サンフォード　ジョン　シー．; マクエリゴット　サンドラ　ジー．
Original assignee: デュークユニバーシティ; コーネル　リサーチ　ファンデーション　インコーポレーテッド; イー．アイ．デュポン　デ　ニモアス　アンド　カンパニー（インコーポレーテッド）
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 1990-11-13
Publication date: 1993-06-24
Also published as: DK0500799T3; US20040092019A1; CA2068863A1; ES2113371T3; ATE162219T1; US20020006637A1; WO1991007487A1; DE69031951D1; US6194389B1; US7449449B2; US7358234B2; CA2068863C; EP0500799A4; JP2001103968A; US20040170616A1; US20080138325A1; US20040097458A1; DE69031951T2; AU6964191A; GR3026594T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】動物組繊細胞の微片仲介トランスフォーメーションのこの発明は、微小投射物衝撃によって異種接合型ＤＮＡで行う動物細胞及び組織のトランスフｔ−メーンヨンに関する。

の　。

外因性ＯＮ＾またはＲＮＡを運搬する微小投射物を用いて、実速度で細胞に微小投射物を投射することによる生細胞のトランスフォーメーンッンは最初、Ｔ、　Ｋｌｅｉｎ。

ＥＷｏｌｆ、　Ｒ，ｌ１ｌｕ及びＪ、　５ａｎｆｏｒｄ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２７．７０　（１９８７）によって提案された。参照としてｓ　Ｊ、　５ａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ二四垣且匝■５．２７　（＋９８７）を挙げる。最初の業績は、タバコモザイクウィルス由来のＲＮＡを用いたタマネギの表皮細胞のトランスフォーメーンーンが含まれていた。タマネギ表皮細胞での結果は、他の植物に拡張されてきた。例を挙げると、微片衝撃による大豆カルスのトランスフォーメーノ「ンは、Ｐ、　Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｔ、、　ＰｌａｎｔＰｈｓＩｏｌ、８７．６７１（＋９８８）に記載されている。また、大豆の分裂組織におけるトランスフォーメーションは、Ｄ、　１ｌＩｃｃａｂｅ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂ［ｏ／丁ｅｃｈｎｏｌｏ　旦、　９２３　（＋９８８）ζこ記載されている。

別途参照として、Ｂ、　Ｓｐａｌｄｉｎｇ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｗｅｅｋ、　１Ｂ　（Ａｕｇ、　３１．１９８８Ｇ　ＥｕｒｏｐｅａｎＰａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　０３０１７４９　、　Ｐ、　Ｃｈｒｉｓｔｏｕらによるものを挙げる。未熟なトウモロコンのカルス細胞の微片衝撃によるトランスフォーメーノ「ンは、Ｔ、　Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．４３０５（１９８８）に記載されて■ り、また、トウモロコン花粉の微片衝撃によりトランスフォーノーン−１ノされたトウモロコ／の種子の生産については、ヨーロッパ特許出願公開公報第０２７０３５６号（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　０２７０３５６）のデー、マクケープら（Ｄ、　ＭｃＣａｂｅ　ｅｔ　ａｔ、）らによるものに記載されている。

植物のトランスフォーメーノ１ノに加えて、微小投射物衝撃は細胞小器官のトランスフォーメーションに使用されるようになった。微小投射物衝撃による酵母２４０、１５３８　（１９８ｇ）に記載さねており、また、微小投射物衝撃によるクラミドモナ動物組織または細胞のトランスフォーメーンッンに対する微片衝撃の使用は、比較的に関心が払われていなかった。５ａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒａｔｉｃｕｌａｔｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎ虹ハ堕匹旦ｙ　５．２７．３５−３６　（１９８７）では、微片衝撃を人間の遺伝子治療法へ使用することが示唆されているが、そのような治療法を行うための組織型、または組織の成長段階は示唆されていない。米国特許出願明細１第０６／８８７７．６１９号（Ｕ、　Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　０６／８８７７．６１９）であって、′生きた細胞及び組織に物質を搬入するための方法及びそのための装置ｔ　０１ｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ　Ｉｎｔｏ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　Ｔｈｅｒｅｆｏｒ）″と命名された■ 許出願は、微小投射物衝撃による生物材料の細胞への導入に関連するものである。

示された生物学的物質は、蛍光色素や放射線標識がなされたプローブ、ウィルス、小器官、ベンクル、酵素やホルモンなどのタンパク質やＯＮ＾、ＲＮＡなどの核酸である。そこに記載された手順は、（ａ）卵や骨髄細胞、筋肉細胞や表皮細胞での微片衝撃については、１６ページの５目から６行目まで：　（ｂ）人間の組織または他の動物組織で、表皮組織や臓器組織、Ｉ！！瘍組織組織での微片衝撃については、１６ベーノの１３３行目ら１４４行目で；そして（Ｃ）骨髄組織の微片仲介トランスフォーメーションによる鎌型赤血球血症のヒトの遺伝子治療法については、２２ページの８行目から９行目までに記載されている。

Ｗ、　Ｂｒ１ｌｌは％　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｐｒｏ　ｕｌｓｉｏｎ　ｂ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｄｉｓｃｈａｒ　ｅ　（Ｔａｐｅ　ｏｆ　５ｐ■■モ■ ａｔ　ＡＡＡＳ　ｍｅｅｔｉｎｇ　ｓｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｎ■■窒奄獅■@ｆ。

ｒ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　（ＶＩＸＪａｎｕａｒｙ　１９８９））において、失っている体壁のミオン／遺伝子を微片衝撃によって修復する線虫のトランスフォーメーションについて検討している。しかしながら、トランスフォーメーションした線虫の実用性は、比較的限定されたものである。

このような観点からこの発明の目的は、動物、特にを推動物とそれらの組織や細胞の微小投射物衝撃による治療の新たな利用法を提供することにある。

この発明のさらに特別な目的は、動物の検体にタンパク質やペプチドを投与する手段として微小投射物衝撃を使用することである。

のこの発明の第一番目の外観は、あらかじめ選択されたを推動物細胞に遺伝子を伝達する方法である。その方法は、最初の段階として微小投射物を与えることであり、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、その配列には５゛側から３′側の方向へ、を推動物細胞において操作可能な調節配列と、調節配列の下流側に位置して転写制御下にある異種接合型遺伝子とが含まれている。その微小投射物は、細胞を貫通してポリ核酸配列を沈着させるのに十分な速度で細胞に接触する微小投射物で、あらかじめ選択された細胞へ促進される。（ここで用いられた「細胞」「微片」　「ポリ核酸配列」などの用語の複数の型は、一つの型式に統一する予定である６）この発明の第二番目の外観は、あらかじめ選択されたを推動物組織に遺伝子を伝達する方法である。その方法は、最初の段階として微小投射物を与えることであり、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、その配列には５゛側から３゛側の方向へ、を推動物組織において操作可能な調節配列と、ａｔ面配列の下流に位置して転写制御下にある異種接合型遺伝子とが含まれている。微小投射物は、組織の細胞を貫通してポリ核酸配列を沈着させるのに十分な速度で細胞に接触する微小投射物で、あらかじめ選択された細胞へ促進される。

この発明の第三番目の外観は、を推動物検体（ｖｅｒｔａｂｒａｔｅ　５ｕｂｊｅｃｔ）のあらかじめ選択された組織に、インノトゥ（ｉｎ　５ｉｔｕ）で遺伝子を伝達する方法である。

その方法は、最初の段階として微小投射物を与えることであり、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、その配列には、５゛倒から３′側方向へ、を推動物組織において操作可能な調節配列と調節配列の下流に位置して転写制御下にある異種接合型遺伝子とが含まれている。そして微小投射物はその動物検体に促進される。

その際、その動物検体は微小投射物があらかじめ選択された組織に接触するように固定され、かつ、前記微小投射物は組織の細胞を貫通してポリ核酸配列を沈着させるのに十分な速度で組織の細胞に接触するように構成されている。

ここで発表されたデータは、この出願人に知られている（ａ）を推動物細胞、（ｂ）を推動物組織、及び（ｃ）インノトゥ（」」法並）におけるを推動物組織の微片仲介トランスフォーメーションの最初の論拠を与えている。

また、ここで発表されたものは、を推動物検体にタンパク質あるいはペプチドを投与する方法でもある。この方法は、微片衝撃でトランスフォーメーションを施されたを推動物組織が、カルスの形成、炎症、及び他の防御応答が驚異的に起こるようなことがないという我々の発見に一部基づいている。このように、（細胞がトランスフｔ−メーノヨンを受けた事による薬効で）トランスフォーメーンヨン後の細胞から放出されたタンパク質やペプチドは、その細胞が属する動物検体を通り抜けて循環することができ、そして、動物検体内で循環する細胞（例としてリンパ球）は、トランスフｔ−ノーン８ン後の細胞に接近する。この方法で標的のを推動物組織（好ましくは真皮組＄１　（ｄｅｒｍｉｓ）または下皮組織（ｈｙｐｏｄｅｒ■ｌ５））が選択され、そして微小投射物が与えられる。その微小投射物はポリ核酸配列を運び、その配列は、５゛側から３′側方向へ、選択された組織の操作可能な調節配列と、調節配列の下流に位置し転写制御下にある遺伝子とを含んでいる。

その遺伝子は、タンパク質またはペプチドをコードし、ている。そして微小投射物は、組織の細胞を貫通してトランスフォーメーンジンを受けた組織を与えるポリ核酸配列を沈着させるのに十分な速度でもって、組織の細胞に接触するように、選択された標的の組織に促進される。それからトランスフォーノーン３ンを受けた組繊細胞は、動物検体中に維持される。そしてそのトランスフォーメーションされた組繊細胞は、遺伝子の発現をうける検体内において、その遺伝子によってコードされているタンパク質やペプチドに生理応答（例として、内分泌応答や免疫応答）を生産するに十分な数で検体中に存在している。

の　単なｊこの発明は、実施例、詳細な説明、及び図面の中により詳細に説明されている。

ここで、第１図は、一般的に有効な微小投射物衝撃装置の斜視図である。

第２図は、第１図で示した衝撃チャンバー（ａｈａ閤ｂｅｒ）の詳細図で、停止板と挿入のために設けられた動物チャンバーが示された図である。

第３図は、衝撃チャンバーに設けられた動物チャンバーの斜視図で、挿入のためにｔＡ着した接着板を有する動物チャンバーが示された図である。

第４図は、第３図で示した装置の側面断面図であり、微小投射物の停止板までと微小投射物の停止板から検体までの進行経路を示す図である。

第５図は、停止板と接着板の詳細図で、接着板上での衝撃後の微小投射物と接着板までの微小投射物の進行経路を示す図である。

第６図は、微小投射物衝撃による培養された骨格の断管のトランスフォーノーン１ノ後のヒト（ｈｕ■ａｎ）　Ｈ３Ｐ７０プロモーターによってもたらされたホタルのルンフェラーゼ遺伝子の存続熱誘導性を示す図である。

第７図は、微小投射物衝撃による転写から一日後の、耳と皮膚の最大ルノフェラーゼ活性を示す図である。

、　の詳細な１ここで用いられた「組織Ｊ　（ｔｉｓｓｕｅ）という用語は、特別の機能の働きの中で一体となった類似の専門化された細胞の凝集体を意味する。「組繊細胞Ｊ　（ｔｉｓｓｕｅｃｅｌｌｓ）という用語は、組織中に存在している細胞を意味する。「細胞Ｊ　（ｃｅＩＩ）という用語はも、組ｇａ（即ち、”インントウ（ｉｎ　５ｉｔｕ）　”で）中に存在している細胞、またはそれらの起源（即ち、 ”インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒａ）″で）の組織から移してきた細胞を意味する。

動物組繊細胞は、それらの起源の組織という点でインノトゥ（凹」■匡）で衝撃が受けられ、または組織から分離されてインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で衝撃が受けられる。細胞は起源の組織という点で好んでトラ／スフｔ−メーノゴンされる。トランスフォーメ−７ヨンされるべき組織は、起源の動物であるいはトランスフォーメーンヨンされる組織が本質的に維持されたままの動物で、インビトロ（二旦皿）とイノノトゥ（旦」■肋）のいずれかで衝撃を受けることが可能で、同様の結果を与える。好ましくはその組織は、動物内に維持されたままのインノトゥでトランスフオーメーノヲノされる。

本発明の方法で処理される動物検体は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類などの典型的なを推動物である。鳥類（例えば鶏、上面′Ｉ％）と哺乳類が好ましく、特に哺乳類（例えば馬、牛、竿、豚、ヒト）が最も好ましい。この発明の方法で処理されるを推動物の組織と細胞は対応する組織と細胞の起源に相当し、即ち、好ましいあるいは最も好ましい動物に対応する好ましいあるいは最も好ましい組織と細胞の起源に相当する。

この発明は、細胞培養で固定化された、もしくは別の方法で排除された天然の段階から選択された細胞という条件の検体での、どのを推動物細胞でも実用化できるであろう。このように、この発明でトラノスフォーメーンヨンを受けるべき細胞は、天然に出現する段階にある細胞（即ち、初代細胞）で、組織内に存在しているか、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の組織から離れて存在しているかどちらかである。十分な時間インビトロで維持され、及び／またはインシトゥ（ｉｌｌ　５ｉｔｕ）で新町している性質を失わせる効果的な条件下の細胞は、この発明が関係する細胞のグループから排除される。

この発明の方法で処理されるを推動物細胞は分化細胞が望ましく、最も望ましいのは皮膚細胞や下皮細胞（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ　ｃｅｌｌｓ）　、筋肉細胞、神経細胞、膵臓細胞、肝細胞などの末端分化細胞である。例えば基底細胞（ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌ）を含む皮膚細胞や真皮細胞、下皮細胞である。

同様にこの発明の方法で処理されるを推動物組織は分化組織が望ましく、最も望ましいのは皮膚組織や下皮組織（ｈｙｐｏｄｅｒ■ｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ）　、筋肉組織、神経組織、すい織組織、肝組織などの末端分化組織である。例えば基底細胞層、真皮組織、下皮組織を含む皮膚組織である。

微小投射物によって運ばれるポリ核酸配列は、遺伝子と調整部位の組み換え構築物である。その構築物は、プラスミド等やラン乳頭腫ウィルスベクター等の染色体ＤＮＡ（文献参照　Ｅ、Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　２９９　Ｎａｔｕｒｅ　５２９　（１９８２））、レトロウィルスのＲＮＡ配列、既出の誘導体、及び合成オリゴヌクレオチドのような、どの適切な型も取りつるであろう。ＤＮＡ構築物、特にプラスミドが、現在選ばれている。ポリ核酸配列に使われるであろう好ましい遺伝子は、動物検体で生理的な応答（特に内分泌応答や免疫応答）を産生ずるタンパク質やペプチドをコードしている遺伝子である。遺伝子はトランスフォーメーンツンを受ける動物という点で相同型もしくは異欅接合型であろう。また異種接合型遺伝子の修飾型であろう。

内分泌応答（すなわち、動物での一時的な生理応答が、タンパク質やペプチドが検体の循環器系やリンパ系を通じて移動することを要求するトラノスフず−メーノゴンを受けた組織部位から十分に移動した。）を産生ずるタンパク質やペプチドをコードしている遺伝子の例としては、因子（Ｆａｃｔｅｒ）　ＶＩＩＩＣをコードする遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）やウロキナーゼのようなプラスミノーゲン活性イヒ因子をコードしている遺伝子（別途参照　米国特許明細１第４．３７０，４１７号及び第４．５５８．０１０号）、ヒトまたはウノ成長ホルモ７等の成長ホルモンをコードしている遺伝子、インシュリンをコードしている遺伝子、及び黄体ホルモンの放出ホルモン等の放出因子をコードしている遺伝子である。

ここに列挙した全ての参考文献は、参照としてここに組み入れられる。

免疫応答（すなわち、タンパク質やペプチドによって活性化されたＢ細胞及びＴ細胞が、トランスフｔ−メーノヨンを受けた組織から移動した部位へ検体の循環器系およびリンパ系を通ることが可能である。）を産生ずるタンパク質やペプチドをコードしている遺伝子の例は、米国特許明細書　第４．８５７．６３４号でミノ−／ｌ”）　（Ｍｉｎｏｒ　ｅｔ　ａｌ、）による”エンテロウィルスに対するワクチンに有効なペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｕｓｅｆｕｌ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）　’、米国特許明細書　第４．７３９．８４６号でローズら（Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、）による”小水泡性口内炎ウィルスに対するワクチア　（Ｖａｃｃｉｎｅ　ｆｏｒ　Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）″、米国特許明細書　第４．４２８．９４１号でガリベルトら（Ｇａｌｉｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、）による″Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原をコードするヌクレオチド配列、　前記ヌクレオチド配列を含むベクター、それらを得るための手法とそれらにより得られた抗原（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ、@Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５ａｉｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ａｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｈｅ　０ｂｔｅｎ狽■盾氏@Ｔｈｅｒｅｏｆ　ａｎｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　０ｂｔａｉｎｅｄ　Ｔｈｅｒｅｂｙ）″、米国特許明細書　第４．７６１，３７２号でマースら（Ｍａａｓ　ｅｔ　ａｌ、）による”突然変異体大腸菌腸毒素（Ｍｕｔａｎｔ　Ｅｍｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　。

ｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ）″に記載されたようなサブユニットワクチンをコードする遺伝子である。

ここに記載した方法のうち、免疫応答の産生可能なタンパク質やペプチドを処理する利点は、長期間において検体に効果的に抗原を提示する能力である。これは、検体によって急速に切断、除去されるタンパク質やペプチドの単なる注射とはＺ、Ｉ照的である。

検体中で生理応答を産生ずるタンパク質やペプチドをコードしている他の遺伝子の例としては、α１アンチトリプノ７などのＩｆｆ素をコードしている遺伝子、インシュリンレセブター等のレセプターをコードしている遺伝子（参照として米国特許明細１第４．７６１．３７１号で、ベルら（Ｂｅｌｌ　ｅｔ　ａ、１．、）による）　、ＣＤ４受容体等のアドヘソン（ａｄｈｅｓｏｎｓ　）をコードする遺伝子（参照として、ジエネンテブク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＥＰＯ特許出願公開公報第０．３１４，３１７号で、′アトへソン変異体、それらをコードする核酸、及びそれらからなる組成物（ａｄｈｅｓｏｎ　ｖａｒｉａｎｔｓ、　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅｍ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　ｔｈｅｍ、）″と命名された公開公報）であって検体内で治療活性を有する遺伝子、隣接する組繊細胞に作用（バラタリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）様の作用）するか、あるいは分泌されたり分泌細胞に作用（オートクリン様の作用）したりするタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子、及び病原体で誘導された抗体をコードする遺伝子が挙げられる。参照としてＪ、　５ａｎｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｓ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、ＩＩ３　Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｒｉａｌ、　３９５　（１９８５）；　Ｊ、５ａｎｆｏｒｄ、１R０　Ｊ、　Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ、　４６９　（１９８８）が挙げる。

ポリ核酸配列は、遺伝子の５°位から上流側にあるいは５′位までに調節配列を含んでいる。その調節配列は、遺伝子の転写を誘導することができるように、遺伝子との機能的な関連においてポリ核酸配列内に位置している。そのポリ核酸配列内で遺伝子の転写の制御を行うために用いられているであろう調節配列は、一般的には、標的とする組繊細胞内で機能することのできるプロモーターである。

プロモーターの例としては、例えばヒトのα−アクチンプロモーター（参照として丁、　Ｍｉｃａ　ａｎｄ　Ｌ、　Ｋｅｄｅｓ、　７１！ｏｌｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２８０３　（＋９８７）を挙げる。）、ヒトのβ−アクチンプロモーター（Ｊ、　Ｌｅａｖｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　４　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　＋９８１　（＋９８４））、トロボニンＴ　（ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ）遺伝子プロモーター（ＩＩ照として丁、　Ｃｏｏｐｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，０ｒｄａｓｈ１．２６０　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　１１１４０　（１９８５）を挙げる。）、ヒトのヒート７ジツタタンパク質（ｈｅａｔ　５ｈｏｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　０ＩＳＰ）７０プロモーター、ロウスサルコーマ　ウィルス（Ｒｏｕｓ　５ａｒｃｏ■ａ　Ｖｉｒｕｓ）のロングターミナルリピート（ｌ　ｏｎｇ丁ｅｒｍｉ口ａｌ　ｒｅｐｅａｔ）のようなレトロウィルスのロングターミナルリピート、一般的に見られるＲＮＡｌ１［ウィルス（Ｒ，Ｗｅｉｓｓ、　Ｎ、　Ｔｅ１ｃｈ、　Ｈ，Ｖａｒｍｕｓ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｃ。

ｆｆ１ｎ　Ｅｄｓ、　２ｄ　ｅｄ、　＋９８４）　、及びメタロチオニン遺伝子プロモーターである。そのプロモーター及び遺伝子は、当業者に実施可能に知られている装置を用いてトランスフ寸−メー／覆ン（即ち、そのプロモーターは遺伝子の転写を誘導することができ、そしてその遺伝子は翻訳されることのできるｍＲＮＡ配列のためにコードされているということである。）されるように、細胞内であるいは細胞組織内で機能することができる。一般的な参照として、Ｒ，Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ（３ｄ　Ｅｄ、　＋９８５）を挙げる。組織に関しては、これらの要素の唯一の必要性は、その組織内において−っの細胞タイプで実施できることである。

ポリ核酸配列に追加的に導入されるであろう他の調筋要素は、当業者によ（知られているエンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ　）、末端配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　ｓ及びポリアデニル化部位を、細胞に挿入される遺伝子の発現の望ましい割合を得るために必要である場合に含む。

微小投射物を用いて細胞のトランスフォーメーションを促進する装置は、その装置が酸素呼吸を行っている動物の処置を行えるように工夫されているからには、本発明を実施する土で用いられることができる。例えばその装置は、サンフォルトらの文献の　片　を　いた細　び組　への　の　（Ｓａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ｉｎｔ　Ｃｅ上Ｉｓ　ａｎｄユ１ｓｓｕｅｓ　ｕｓｉｎ　ａ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　aｏｗｂａｒｄｍｅｎｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓ、　５　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２７　（＋９８８））@ｓ　フレインらの劣きた細　へ　する核　のための　ハ　（Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｊ４ｅｌｏｃｉｔ　Ｍｉｃｒｏ　ｒｏ’ｅｃｔｉｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１ｎｔｏ　Ｌｉｖｉｎ@Ｃｅ１ｌ！、　３２７　Ｎａｔｕｒｅ　７０　（＋９８７））及びアグラセタスらのヨーロッパ特許出願公開公報第０．２７０，３５６号公報（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ＾ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎ潤A　０．２７０．３５６）でその名称が、彷仲介植　のトランスフォーメーション（Ｐｏｌｌｅｎ−脣ｅｄｉａｔｅｄ　Ｐｌａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）である公報において記載されている。発明者らは商業的に入手ａＴ能な装置を用いた。その装置はバイオリスチックス９株式会社。

、ＩＯ２ラングミューアラポラトリー、ニーネル　ビジネス　アンド　チクノロノー　バーク　ブラウンロード　イタ力、Ｎ　Ｙ、＋４８５０　（３ｉ（＋１ｉｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、　１０８Ｌａ１０８Ｌａｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｎｅｌｌ　Ｂｕｉｓｉｎｅｓｓ　ａｎｄ　丁ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐａｒｋ、Ｂｒｏｗｎ　qｏａｄ。

Ｉｔｈａｃａ、　ＮＹ、　１４８５０．）から入手した。この装置はモデルＢＰＧ−４微片加速装置（１１ｏｄｅｌ　８ＰＧ−４Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ）にデザインされたもので、本質的にはクラインら（に１ｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　３２７　Ｎａｔｕｒｅ　７０　（１９８７））が示したような配置をしている。第１図から第５図（第２ＩＸＪから第５図には改良型を示した。）に示された装置は、重さ調節可能な停止板支持体１３によって二つの独立した部屋１１．１２に分けられた衝撃チャンバー１０を備えている。加速管１４は衝撃チャンバーの上部に取り付けられている。大きな投射物１５は、火薬を充填することによって停止板１６に加速管を下方に放射される。簡便な発射装置１８及び排出圧装置ｉ１９が設けられている。その停止板１６にはまん中に、大きな投射物よりも小さな直径の穴１７が形成されており、大きな投射物が微小投射物を運び、その大きな投射物は的を絞られて穴Ｉ７に発射される。大きな投射物１５が停止板１６によって停止されている場合、微小投射物は穴１７から放射される。標的の組織４０は、ここでは動物検体として概略的に示されており、衝撃チャンバー内に配置され、穴１７を通って放射された微小投射物が標的の組織の細胞の細胞膜を貫通して、その標的組織の細胞に運び入れられたＤＮＡ構築物が沈着するように配置されている。衝撃チャンバー１０は、空気抵抗が微小投射物を不都合に減速させることがないように、使用する前に、一部分排出された。そのチャンバーは、衝撃の間、標的組織が過度に乾燥しないように、一部分排出するのみである。約２０から２６インチの間の水銀圧の減圧が好ましい。

本発明を実施するのに用いた微小投射物（即ち、微片）は、トランスフォーメーションされている組繊細胞に沈着されるように充分な密度を有し、かつ凝集性のある物質から形成され、その微片が移動しなくてはならない微片の速度及び距離が与えられるであろう。微小投射物を形成する物質の例としては、金属、ガラス、ンリカ、氷、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、及び炭素化合物（例えばグラファイト、ダイヤモンド）が挙げられるが、それらに限られるものではない。好適な金属の例としてはタングステン、金、イリジウムが挙げられるがそれらに限られるものではない。その微片は、標的の組織に接触する細胞の過度の破壊を避けるためには充分に小さな大きさであるべきで、また、標的組織の目的とする細胞を貫通するのに必要な慣性を提供するために満足のゆ（はどの大きさも必要である。直径が約１ミクロメーターから約３ミクロメーターの範囲の金の微片は、インントウでの衝撃に好適であり、（より特別には）直径が約１ミクロメーターのタングステンの微片は、インビトロでの筋肉の衝撃に好適である。

ポリ核酸配列は沈降によって微片に固定されるであろう。用いる正確な沈降パラメーターは、当業者に知られているように、用いた微片加速手段などのファクターに依存して変化するであろう。移動する微片は適宜、ＥＰＯ出願第０．２７０．３５６号明細書の第８欄に記載されているように、微片上に固定化されたポリ核酸配列構築物の安定性を上昇させる目的で、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎ）等のカプセル剤で被覆されてるであろう。

を推動物の皮膚は、外側の表皮（ｅρ１ｄｅｒ■ｉｓ）及び下層の真皮（または皮膚角質層（ｃｏｒｎｅｕ■））から形成されている。更にその真皮の下層にあるのは、通常ゆるんで柔らかい、下皮と呼ばれるスポンジ層で、ここでは皮膚の一部分として区別して扱われる。その真皮及び／または下皮は、トランスフォーメーションの目的が上記に記載したような動物検体において生理的応答を引き起こすであろう方法で、動物検体にタンパク質あるいはペプチドを投与することである場合、組織標的として好ましい。

陸居住性両性煩、爬虫類、鳥類、哺乳類等の陸居住性のを推動物では、表皮は一般に、外側表面から内側表面に向かって次のような層からなっている。即ち、：　（ａ　）　ｐｌｊｌｊ＠　（ｓｔｒａｔｕｍ　ｃｏｒｎｅｕｓ）、あるいは角質の層（ｈｏｒｎｙ　１ａｙｅｒ）で、役に立たなくなって次第に脱皮し、取り賛えられた薄い鱗片状の（平らな）角質化された細胞からなる層：　（ｂ）盗男厘（ｓｔｒａｔｕｍ　１ｕｃｉｄｕ＊）、あるいは透明な層（ｃｌｅａｒ　１ａｙｅｒ）で、その中にはケラチン生成細胞が密に入っており透明で、またその中には核が存在せず、細胞の輪郭もはっきりしていない層：　（Ｃ）ＩＬＩ！！ｌ（ｓｔｒａｔｕｍ　ｒａｎｕｌｏｓｕ＋＋）、あるいは顆粒細胞の層（ｇｒａｎｕｌａｒ　ｃｅｌｌ　１ａｙｅｒ）で、そこでケラチン化が始まる層：　（ｄ）２旦／二土３１　（ｓｔｒａｒｕｍ　ｓ　１ｎｏｓｕ＊）、あるいはプリックル細胞の層（ｐｉｃｋｌｅ　ｃｅｉｌ　１ａｙｅｒ）で、そこにはリボ核酸の豊富な細胞があり、それによってケラチン化のためのタンパク質の合成が始まるようになっている層；　そして（ｅ）基匡肩（鉦組凪り匝二」）、あるいは基底細胞の層（ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌ　１ａｙｅｒ）で、それは表皮内において有糸分裂を受ける唯一の細胞である円柱細胞（ｃｏｌｕ■ｎａｒ　）のルーの層からなっている層である。一般的な参照として、Ｇ、　Ｔｈ１ｂｏｄｅａｕ、　Ａｎａｔｏｍ　ａｎｄ　Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　、１１４−１９　（＋９８７）：Ｒ，Ｆｒａｎｄｓｏｎ、　`ｎａｔｏｍ　ａｎｄ　Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｆａｒｍ　Ａｎｉｍａｌｓ、　２０５−１２　（２ｄ　Ｅｄ、　１９８１）：　Ｒ，Ｎ１ｃｋ■戟@ｅｔ、１．、肋。但ユニ」」抑」桓鱈５ｔｉｃＢヒ臼、　１５Ｂ−５７（＋９７７）を挙げる。

真皮はまた、′本当の皮膚（ｔｒｕｅ　５ｋｉｎ）″とも呼ばれ、一般的にはＩＥＩｎ（匹組ｔｕｇ　ｓｕ匣已匹」」）あるいは乳頭状層（ｐａｐｉｌｌａｒｙ　１ａｙｅｒ）からなり、それは表皮のすぐ下に存在する。そして、その下に朶在厘（ｓｔｒａｔｕｍ　ｒｏｆｕｎｄｕｍ）あるいは網状層（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ　１ａｙｅｒ）が存在する。皮膚の動脈、静脈、毛細血管、及びリンパ管は真皮に集中している。網状層は一般に、白いコラーゲン！ｌ維、骨格筋、及び不随意筋が絡み合った密度の高い網状組織を含んでいる。乳頭状の層はゆるんだ柔らかな結合組織と薄いコラーゲン性で弾力性の繊維の細かい網状組織からなっている。

皮下組織あるいは表在性の筋膜は、ゆるんで柔らかいスポンジ構造の層で、脂肪、疎性組織（ａｒｅｏｌａｒ　ｔｉｓｓｕｅ）、及び血管が豊富に存在する。動物の皮膚が鈍に切開（ｂｌｕｎｔ　ｄｔｓｓｅｃｔｉｏｎ）されて取り除かれる場合は、少なくとも皮膚に癒着している皮下組織の一部分で、皮下組織と下層の組織との間の切断計画において、通常分離が行われる。

本発明の方法において、真皮と表皮は、（ａ）表皮を通過して微小投射物を放射すること、あるいは（ｂ）切開や動物から皮膚の弁状片をつけたままの鈍な切開を行うことによって外科的に皮下及び真皮を露出させ、外傷の表面層を通して微小投射物を投射することな（、直接皮下あるいは真皮に微小投射物を放射し、続いてその動物における皮膚の弁状片を剥した位ｌに、その切開した皮膚の弁状片を復元すること、のいずれかによってトランスフォーメーションされるであろう。その皮膚の弁状片は、微小投射物衝撃の間動物につけたままにしておくことができるし、あるいは微小投射物衝撃の間小片として取り除いておき、その後動物に植皮されることもできる。皮膚の弁状片を動物から取り除（のであれば、動物の同じ部位に戻すこともできるし、あるいは異なる部位に戻すこともできる。

あるいは違う動物に移植することも可能である。発明者らは、その皮膚の弁状片をつけたままにしておくことを好んでいる。発明者らは、外科的に真皮を露出させることにより、この微小投射物が表皮を通過する必要がなくなるため、真皮のトランスフオーメーシヨンがかなり起きるということを見いだした。しがし、その微小投射物が陸居住性のを推動物の表皮を通過して投射しても、実質的に真皮のトランスフォーメーク３ンが起きることも見いだした。

本発明の種々の見解は、以下の実施例で説明される。これらの実施例は、本発明を説明するために記述されたものであり、本発明はその記載に限られるものではない。

■ 末　の　イされた　の　の　ハーイ介トランスフォーメーン□ンこの実施例は、充分に分化された、非区分的なｆｔ格の前管の主な培養物が、［１１１人−微片受容体を用いてインビトロでトランスフｔ−メーシＩンできることを示している。その導入された遺伝子は急速には退化せず、培養物の生存中、転写的に活性を維持する（１２日間）。

断管培ＩＩ物（４Ｘ　１０５個の細胞）は、１０％のラン血清及び５％の胎児の抽出物を添加したダルベツコのミニマム　エッセンンヤル　メディアム（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ））中、ゼラチンで被覆された６０ｍｍのプラスチック圃において１１日間の胸部筋肉から作成された。フレッシュな培地を入れることなく５０間軽々後、培養物はほとんど完全に多核性の前管がらなっており、そのいくらかは横の線紋を示す。ある培養物は更に、ノトシンアラビオンド（ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｏｎｏｓｉｄｅ）　（ａｒａ−Ｃ：　１．５から３．０μ／１１）で処理されて残菌性の区別できない筋原細胞あるいは非訪原性の細胞の成長を妨げる。参照としてＧ、　Ｐｕ１ａｔｈ　ｅｔ　ａｌｌ、ｈ胆す１口、　５７１）　（１９８９）を挙げる。この段階（５日間の培養）において、条件づけされた培地は除去して保存され、そしてそのプレートは真空チャンバー内に置かれる。タングステン　微小投射物（直径１μ重である。）は、ホタルのルンフェラーゼ遺伝子を有するｐ）Ｉｂ−ＬＵＣ，即ちプラスミド構築物で被覆されており、それは、Ｊ、　ｄｅ　Ｗｅｔ　ｗｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　７．７２５（１９８７）を参照でき、ヒトの８−アクチン　プロモーター（Ｊ、　ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、阿ｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　４．１９６１（＋９８４）参照）、これらの細胞内で強いＷ４造性の活性を有するプロモーターによって運ばれる。それぞれの培養物は、２μＩの微小投射物のｑ！濶液で、真空（２０−９インチのＨｇ）の条件下、衝撃が与えられる。その微小投射物は、鏡胴の上部３ｃｍのところから発射され、＃１火薬２２内径のカートリッジで加速された。そのベトリ皿はチャンバーの底部に置かれた。微小投射物を被覆するために用いられる装置、及び方法は、Ｊ、　５ａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　５．２７（１９８７）及び、Ｔ、　Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２７．７０（＋９８７）に記載されている。この研究においては、発明者らの特別な条件のための衝撃に先だって、予備的な実験が行われ、微片速度、微片の大きさ、微片の成分、及びルシフェラーゼ活性の最大の発現を引き起こす細胞の密度が確立された。一旦これらの条件が最適化されてから、表１に示された実験が行われた。全細胞の溶解物は、衝撃後２日後の細胞から調整され、ルシフェラーゼ活性が、過剰のＡＴＰの存在下でルンフェ＋）ンの添加をした後、パーツ／リド　ハイオルメフト　Ｌ８９５０ＱＣｔレミノメーター（８ｅｒｔｈｏｌｄ　Ｂｉｏｌｕｍａｔ　ＬＢ９５００ＣＩｕｍｉｎｏｓｅｔｅｒ）で測定された。Ｊ、　ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｏ）ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２．７２５　（＋９８７）による。これらのデータも表１に示されている。

表　１充分に分化されたｆｔ格の前管の微片衝撃によるトランスフエフ／ロンの後に起こる、ヒトのβ−アクチン　プロモーターによるホタルのルシフェラーゼ遺伝子の発現、ルシフェラーゼ活性（ピーク、光の放出７６０ｍｍ培養皿）モック（Ｍｏｃｋ）　トランスフエフ／ロン　１４　＋／−７（ｎ−３）ｐＨＢ−ＬＩＪＣ１１２，Ｉ６４　＋／−１９，０８６（ロー６）ｐＨＢ−ＬＩＩＣ＋　ａｒａ−ＣＩＯ２，６２０＋／−１９，８８１（ｎ＝６）微小投射物によるトランスフォーメーンゴンは、標準的な燐酸カルシウム共洗物によって前管の培養物のトランスフォーメーンーンによって得られる活性よりも１０−２０培の強度／プレート及び２００−４００培の強度／μｇ　ＤＮＡであるレポーター遺伝子活性を生成する。参照としてＣ，Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉａ１片′　によって　・にＩイされた　の　に、　されるＤＮＡの　−′による　命この実施例は、衝撃の後のさまざまな時間で誘導できるプロモーターの応答を測定することによって、導入されたＤＮＡの時間経過後の運命が記憶される。前管は上記実施例１に記載したようにトランスフォーメーンぼンされるが、ヒトのＨ３Ｐ７０プロモーターの制御のもとで、ホタルのルンフェラーゼ遺伝子を用いてトランスフォーメー７．ンされる。参照としてＢ、　ｆｕ　ｅｔ、　ａｉ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　５ｃｉ。

フントロール＝Ｃ）で維持されるか、あるいは４５℃で９０分間処理した（熱シｄツク＝Ｈ５）のに引続き、３時間３７°Ｃで回復させることで得られる姉妹培養物内で測定された。

衝撃の後、６−７日間維持された培養物は、トランスフェクトされていない前管の培養物から条件づけされた培地（細胞分裂促進性の成長因子の枯渇した培地）で、２日の間隔で再フェフド（ｒｅ−ｆｅｄ）された。第６図は、この期間の間中、導入されたプラスミドの誘導可能な発現が維持されるということを示している。コントロールプレートにおける基底レベルでの発現に比較して計算した場合、２日後の培養物（７，９倍の誘導）及び７日後の培養物（１１，９倍の誘導）の間で、その発現において減少は見られなかった。このように、これらの培養物の生存期間の間中、プラスミドの実質的な退化も、異種接合型プロモーターが作用しないということもない。

この実施例は、これらの第１番目の培養物内に残っている単核細胞と区別される場合に、トランス遺伝子の発生が、充分に分化されたＭ管内にて起こっているかどうかを決定できるように導かれた。分化された前管の培養物は、実施例１に示されたように、ロウス　サルコーマ　ウィルスの長い末端のリピート（ｐＲ５Ｖ −ＡＤＨ）　（Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ　（ｐＲ５Ｖ−ＡＤＨ））の制御の下で、ドロソフィラ　アルコール　デバイドロゲナーゼ（Ｄｒｏｇｏｐｈｉ！ａ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒ。

ｇｅｎａｓｅ）　（ＡＤＨ）を含むプラスミド構築物を用いて、微小投射物衝撃によってトランスフェクトされた。日がたつにつれて、細胞は固定化されて、シー、オーダールら（Ｃ，０Ｒｄａｈｆ　ｅｔ　ａｌ−）の、Ｍｏ１ｅｃｕｉａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｗｅｎｔ　５４７　i Ｃ，Ｅｍｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｄｓ、　１９８８）に記載された方法によって染色され、さらに、位相の調整が不七分のリングを有する位相差顕微鏡を用いて写真がとられた。

ドロソフィラ＾ＯＨは、単核細胞の中に検出されたが、活性のほとんど大部分は、多核化された融合層管内に見いだされた。興味深いことに、前管の染色には二つのパターンが現れていた。ある前管では、ＡＤＨ活性は単一核の周りに場所的に限られて存在し、一方、残りの多核化された細胞には活性は全く認められなかった。

この染色パターンは、これらの細胞内で、個々の核を取り巻いている空間のドメインにトランス遺伝子が発現するのを制限するように条件が整っていることを示している。しかしながら他の前管では、ＡＤＨ染色は細胞に均一で一様に施されていた。このトランス遺伝子発現の拡散パターンは、多核が単一の断管内でトランスフｔ−メーン、ンされているということか、あるいはある条件下において、ＡＤＨタンパク質がこれらの延長された細胞の全期間を通じて自由に拡散されているということかを意味している。トランスフォーメーンｉンの出現頻度についての見解は、次の説明でうまく述べられている。

Ｒ５Ｖ　ＡＤＨを　する細　で′−の（ａ　ｌ　ｔｅｒｎａｔｅトランスフォーメーシロン上記の実施例３に示された実験では、心臓の細胞がインビトロで骨格の前管の代わりに用いられること以外は本質的に同様の方法で繰り返された。陽性の結果は得られなかった。トランスフォーメーノｅンが起きないことは明らかに、用いられた細胞のプレート上に、非常に限られた数の細胞しがないことによるものであった。

実施例３に記載された実験はもう一度、全体のマウスの横隔膜が骨格の筋管に代えて用いられる以外は本質的に同様な方法で繰り返された。その横隔膜は一片のスクリーンを用いて皿の上に平らに置かれ、そのスクリーンは自重により下るされた。トランスフォーメーンｄ）は認められなかった。用いられた１ミクロンのタングステンの小さな微片が、横隔膜の組織を貫通する充分な運動エネルギーを有していなかったことは明かである。

のトランスフｔ−メーンヨンのための　置上記実施例で用いられる装置は、第１図から第５図に示された仕様で、そっくりそのままの動物内における組織のトランスフォーメーン覆ンのために修飾された。衝撃チャンバー１０に取り付けられたドア２０が開かれ、動物の衝撃のための取り付は部品３０または”トラップ（ｔｒａｐ）″が挿入されている。動物衝撃取り付は部品３０にはカバープレート３１と動物チャンバー３２が備えてられている。

動物チャンバー３２は上面、底面、側面、背面、゛及び外側のフランジ３３とからなる。そのチャンバー３２は、カバープレート３１内に開口部から挿入され、カバープレート３１の開口部と動物チャンバー３２のフランジの縁部との間に位置している、カバープレー）３１の前面倒に設けた樹脂製のガスケットによって封止されている。留め金具３４を貫通させてカバープレート３１に動物チャンバー３２を固定している。衝撃チャンバー１．０にカバープレート３１を封止するために、カバープレート３１の裏倒には、その外側の縁部から内側に向かって配置された樹脂製のガスケットが取り付けられている。

動物チャンバー３２の上面には、そこに開口部３５が設けられており、動物チャンバー３２がこの衝撃チャンバー１０内に取り付けられた時に、その開口部は停止板１６の穴１７の中心軸の方向にＭＷ！に調整されている。内側の円筒状で上部と下部が開いたスリーブ３６は、上部の開口部３５に連結してシールされている。内部スリーブ３６の底縁部には樹脂製のガスケットが挿入されている。

封止プレート３８は内部スリーブ３６の底面開口部を封止するために取り付けられている。その封止プレート３８には中心孔３９が形成されている。トランスフォーメーンタンされるべき動物検体４０上の組織表面は、封止プレート３８に接触して位置しており、トランスフｔ−メータオンされるべき組織が中心孔３９をとおって投射されやすいようになっている。そして封止プレート３８は、内部スリーブ３６の底縁部に接触して配置され、減圧チャンバー内が減圧にされる。

その封止プレート３８への検体組織の接触、内部スリーブ３６への封止プレート３８の接触、動物チャンバー３２への内部スリーブ３６の接触、カバープレート３１への動物チャンバー３２の接触、及び衝撃チャンバー１０へのカバープレート３■の接触はすべて、衝撃チャンバー１０内を封止できるように管理されている。膜が、チャンバー内に入れられた組織の傷みやすさを減少するために、封止プレート３８の底面にある中心孔３９にかぶせて設けられている。微小投射物が投射されるときには、封止プレート３８に設けた中心孔３９は、微小投射物が中心孔３９を通って組織表面に接触するように位置づけられている。スボンノあるいは他の間隔保持手段４１が、封止プレート３８に向かって動物検体を持ち上げるために用いられうる。

一楽　させたマウスの　片′ マウスを安楽死させて、その後ろ足の皮膚が露出するように、除毛剤を用いてマウスの後ろ足からその体毛を取り除いた。そして、その皮膚を剥すかあるいは切開除去して、下層の筋肉を露出させた。動物を上記実施例５において記述したように装置の上に置き、後ろ足の皮膚、あるいは筋肉組織のいずれかが衝撃を受けるように位置させ、チャンバー内を２６インチの水銀圧だけ降下させて、その組織を１ミクロンのタングステン微小投射物を投射することで衝撃した。１ミクロンのタングステン微片は、筋肉、あるいは皮膚のいずれかを貫通させるには小さすざるごとが判明した。最適なのは金の微片で、直径１ミクロンから３ミクロンのものである。

生きたままのマウスの　び耳の　片生きたままの成熟した雌のバルブＣ（Ｂａｌｂ　Ｃ）及びチャールスリバーＣＤＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　ＣＤＩ　ｍ１ｃｅ）は、この装置によってトランスフォーメーシタンされ、手順は方法の実施例の中で記述された。直径１ミクロンから３ミクロンの金の微片は、上記記載したように、沈降法によってｐ）Ｉｂ−ＬＬＩＣを用いて被覆された。動物は、ケタミン（ｋｅｔａ園１ｎｅ）及びキノラノン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）の等量ずつを含む混合物（体重１グラムあたり０．００６７ｍｇ）を用いて麻酔がかけられた。標的部位は、後ろ足の皮膚及び耳であり、それは上記に示したような脱毛を行って準備された。後ろ足の皮膚に対しては２６インチの水銀圧の減圧を行い、耳に対しては２０インチの水銀圧の減圧を行った。衝撃の後、その組織はほとんど、あるいは全く衝撃の跡がないように見えた。かすかな茶色の染色が、はとんどの動物において微片を含んでいる領域に残っており、まれに毛細血管からの皮肉出血の小さな領域（くＩＩりが認められた。トランスフェクションの１日後の皮膚及び耳のルシフェラーゼ活性のピークが、１分当りのカウント数で、第７図に示されている。その値は、平均＋／−標準偏差を表している。１７個の皮膚のサンプルの活性は、４．６９９　＋／−＋ｔ。

１２６であり、１２個の耳のサンプルの活性は、４７．１１４　＋／−３，６７９であった。ホトルミネッセフス（Ｐｈｏｔｏｌｕｗｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、抽出の５０マイクロリツター（皮膚）のサンプル及び２５マイクロリツター（耳）のサンプルで１０秒間の調整を行ったベルトルドＬＢ　９５００　Ｃ／レミノメーターセット（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　ＬＢ　９５００　Ｃｌｕｓｉｎｏｗｅｔｅｒ　５ｅｔ）において、２倍にして測定された。期間中の皮膚や耳に対しての平均ルシフェラーゼ活性は、１分当りのカウント数で下記表２に示されている。

皮膚　平均　４．６９９　８１０　２１７　１０４標準偏差　４１２８　１０９７　２６５　１４０耳　平均　＋４９３９６　１１８１１４　６９９８６標準偏差　４９３９２　１２２４５５　８６４８１麻酔から回復した後、動物の行動に異常は見られず、皮膚のトランスフォーメーンゴンされた領域に痛みやかゆみの兆候は現れなかった。過去の衝撃を与えた皮膚の実験においても、組織構造に重要な変化は現れなかったが、ただ時折、トランスフｔ−メークタンされた部位のリンパ球あるいは多形核白血球に現れたことがあった。インントウにおけるハイプリダイゼーノーンの研究で、表皮内にルシフェラーゼ園ＲＮ＾が発現する細胞の比率は高く（約２５％）、真皮及び責の小胞に発現する比率は低い（注目に値しない）ことが明らかとなった。

による生きたマウスの耳における。在トランス遺伝　の活上記実施例７に記載したように、マウスの耳は、１ミクロンから３ミクロンの金の微片上に沈降させたｐＧＨを用いてトランスフォーメーンロンされた。そのプラスミドｐＧＨは、メタロチオニンプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ　ｐｒｏｓ＋ｏｔｅｒ）によって運搬されるヒトの成長ホルモン（ＨにＨ）遺伝子を含んでいる。ＨＧ）Ｉの局在レベルは、商業的に入手可能なニコルス　インスチチュート　アレグロ　ＨＧ）ｌ　ラジオイムノアブセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ａｌｌｅｇｒｏ　ＨＧＨＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて測定された。その旧人データは、下記の表３に示されている。活性は１分間当りのカウント数で表されている。

表　３マウスの耳における。　ＨＧＨ？陽性のコントロール　４４１左の耳　５２０右の耳　２２０陰性のコントロール　９０陰性のコントロール　６７上記の実施例は本発明の一例であり、本発明がその実施例に限られるものではない。本発明は、次に記載した請求の範囲であって、この請求の範囲に含まれるような同等の技術を育する請求の範囲によって定義される。

第６図ＣＨ３ＣＨ３ＣＨ３ＣＨＳ　ＣＨＳ　Ｃ）ｔｓ第７図国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．あらかじめ選択された動物細胞に遺伝子をトランスファーする方法であって、その方法が次の段階：（ａ）微小投射物を提供する段階であって、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、そのポリ核酸配列は５′から３′方向で前記動物細胞の中で機能する調節配列を含み、かつその調節配列の下流側に位置し転写を制御されている前記遺伝子を含む段階；及び（ｂ）あらかじめ選択された前記動物細胞に前記微小投射物を投射する段階であって、その微小投射物が前記動物細胞を貫通してその中に前記ポリ核酸配列を沈着させるのに充分な速度で接触する段階からなることを特徴とする方法。
２．前記あらかじめ選択された細胞が皮層細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記皮層細胞が基底細胞（ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌ）、真皮細胞（ｄｅｒｍｉｓ　ｃｅｌｌ）、下皮細胞（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ　ｃｅｌｌ）からなるグループから選択された細胞であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
４．前記前もって選択された細胞が筋肉細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
５．前記細胞がインビトロでトランスフォーメーションされることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
６．前記微小投射物が、約１ミクロンから３ミクロンの直径の物であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
７．あらかじめ選択された動物組織に遺伝子をトランスファーする方法であって、その方法が次の段階：（ａ）微小投射物を提供する段階であって、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、そのポリ核酸配列は５′から３′方向で前記動物組織の中で機能する調節配列を含み、かつその調節配列の下流側に位置し転写を制御されている前記遺伝子を含む段階；及び（ｂ）あらかじめ選択された前記動物組織に前記微小投射物を投射する段階であって、その微小投射物が前記動物組織を貫通してその中に前記ポリ核酸配列を沈着させるのに充分な速度で接触する段階からなることを特徴とする方法。
８．前記あらかじめ選択された組織が皮層粗織であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
９．前記皮層の組織が、基底細胞層組織（ｂａｓｅｌ　ｃｅｌｌ　ｌａｙｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ）、真皮組織（ｄｅｒｍｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ）、及び下皮組織（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ）からなるグループから選択された組織であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
１０．前記あらかじめ選択された組織が筋肉組織であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
１１．前記組織が、インビトロでトランスフォーメーションされることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
１２．前記微小投射物は、約１ミクロンから３ミクロンの直径の物であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
１３．脊椎動物検体内のあらかじめ選択された脊椎動物組織にインシトゥで遺伝子をトランスファーする方法であって、その方法が次の段階：（ａ）微小投射物を提供する段階であって、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、そのポリ核酸配列は５′から３′方向で前記動物組織の中で機能する調節配列を含み、かつその調節配列の下流側に位置し転写を制御されている前記遺伝子を含む段階；及び（ｂ）前記脊椎動物検体に前記微小投射物を投射する段階であって、その脊椎動物検体は前記微小投射物があらかじめ選択された組織に接触するように配置され、そして前記微小投射物は前記動物組織を貫通してその中に前記ポリ核酸配列を沈着させるのに充分な速度で前記組織の細胞と接触する段階からなることを特徴とする方法。
１４．前記あらかじめ選択された組織が皮層組織であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．前記皮膚の組織が、基底細胞層組織（ｂａｓｅｌ　ｃｅｌｌ　ｌａｙｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ）、真皮組織（ｄｅｒｍｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ）、及び下皮組織（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ）からなるグループから選択された組織であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
１６．前記あらかじめ選択された組織が筋肉組織であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
１７．前記微小投射物は、約１ミクロンから３ミクロンの直径の物であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
１８．脊椎動物の検体にタンパク質あるいはペプチドを投与する方法であって、その方法が次の段階：（ａ）標的の脊椎動物組織を選択する段階；（ｂ）微小投射物を提供する段階であって、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、そのポリ核酸配列は５′から３′方向で前記選択された標的組織の中で機能する調節配列及びその調節配列の下流側に位置し転写を制御されている前記遺伝子を含み、その遺伝子はタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子である段階；（ｃ）前記選択された標的組織に前記微小投射物を投射する段階であって、その微小投射物が、前記組織の細胞を貫通してその中に前記ポリ核酸配列を沈着させてその組織細胞にトランスフォーメーションを起こすのに充分な速度で前記組織の細胞と接触する段階；及び（ｄ）前記動物検体にトランスフォーメーションされた組織を維持する段階であって、そのトランスフォーメーションされた組織細胞が、前記遺伝子の発現をうける検体内において、前記遺伝子によってコードされているタンパク質あるいはペプチドに生理的な応答を産生するに充分の数で検体内に存在している段階からなることを特徴とする方法。
１９．前記トランスフォーメーションされた組織細胞は、前記遺伝子の発現をうける動物検体内において、前記遺伝子によってコードされたタンパク質やペプチドに対して免疫応答を生産することを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２０．前記トランスフォーメーションされた組織細胞は、前記遺伝子の発現をうける動物検体内において、前記遺伝子によってコードされたタンパク質やペプチドの組織的な集中を増大することを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２１．前記遺伝子コードは成長ホルモンの産生のためのコードであることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の方法。
２２．前記選択された標的組織が、真皮組織及び下皮組織からなるグループから選択されたことを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２３．前記組織はインビトロでトランスフォーメーションされ、そのトランスフォーメーションされた組織細胞はその後動物細胞検体にトランスファーされることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２４．前記組織細胞は動物検体にインシトゥでトランスファーされることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２５．前記微小投射物は、約１ミクロンから３ミクロンの直径の物であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
２６．脊椎動物の検体に、インシトゥでの微小投射物衝繋によってタンパク質あるいはペプチドを投与する方法であって、その方法が次の段階：（ａ）検体内に存在する標的の脊椎動物粗織を選択する段階であって、その組織が真皮組織及び下皮組織からなるグループから選択される段階；（ｂ）微小投射物を提供する段階であって、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、そのポリ核酸配列は５′ から３′方向で前記選択された標的組織の中で機能する調節配列及びその調筋配列の下流側に位置し転写を制御されている前記遺伝子を含み、その遺伝子はタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子である段階；（ｃ）前記検体に前記微小投射物を投射する段階であって、その検体は前記微小投射物が選択された標的組織に接触するように配置され、そして前記微小投射物は前記標的組繊細胞を貫通してその中に前記ポリ核酸配列を沈着させてその組織細胞にトランスフォーメーションを起こすのに充分な速度で前記標的組織の細胞と接触する段階；及び（ｄ）前記検体内においてトランスフォーメーションされた組織細胞を維持する段階であって、そのトランスフォーメーションされた組織細胞が、前記遺伝子の発現をうける検体内において、前記遺伝子によってコードされているタンパク質あるいはペプチドに生理的な応答を産生するに充分の数で検体内に存在している段階からなることを特徴とする方法。
２７．前記トランスフォーメーションされた組織細胞は、前記遺伝子の発現をうける動物検体内において、前記遺伝子によってコードされたタンパク質やペプチドに対して免疫応答を産生することを特徴とする請求の範囲第２６項記載の方法。
２８．前記トランスフォーメーションされた組織細胞は、前記遺伝子の発現をうける動物検体内において、前記遺伝子によってコードされたタンパク質やペプチドの組織的な集中を増大することを特徴とする請求の範囲第２６項記載の方法。
２９．前記遺伝子コードは成長ホルモンの産生のためのコードであることを特徴とする請求の範囲第２８項記載の方法。
３０．前記微小投射物は、動物検体の表皮を通って推進されることを特徴とする請求の範囲第２６項記載の方法。
３１．更に外科的に組織細胞を露出させる段階を含み、微小投射物は、表皮を通過することなく組織細胞に放出されることを特徴とする請求の範囲第２６項記載の方法。
３２．前記微小投射物は、約１ミクロンから３ミクロンの直径の物であることを特徴とする請求の範囲第２６項記載の方法。