JPH07509217A - 治療物質を脳に送出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療物質を脳に送出する方法 発明の分野 本発明は、遺伝子療法による疾患の治療に関する。特に、本発明は、遺伝子移入 筋細胞の移植を通して患者の脳に治療物質を送出するようになされた患者の疾患 のｔｈ療に関する。

発明の１Ｔ景 遺伝子変容組織の脳移植は、これまて遺伝性および後天性神経障害の数例の治療 ニラいて、ＧａｇｅらのＮＥＵＲＯＳ０１２３ニア９５−８０７（＋９８７）お よび、米国特許第５，０８２，６７０により提案されている。これらの疾患は、 パーキンノン病およびアルツハイマー病を含むものである。遺伝子変容細胞は、 ノナブスの点点接合を設けることにより、必ずしも神経症状を軽快するものどは 限らず、むしろ、神経成長因子のような治療蛋白質、たとえばＮＧＦまたはＬ− ＤＯＰへのような代謝物を脳液中に分泌することにより、代わりの機能を果たす 。加えて、これらの蛋白質や代謝物が調節方式て分泌される必要はなく、代わり にす・＼ての細胞に共通する非調節式構成経路により発現されるといえよう。し たかって、多くの型の細胞が、治療物質を生成するための大脳内「プラットフォ ーム」として提案されてきた。神経細胞、神経膠、皮膚、および内分泌組織か神 経生理学の研究、およびｆｒ治療形式の開発研究用としてラットの脳に移植され た。

Ｇａｇｅらの　ＮＥＵＲＯＮ、６　：　１−１２　（＋　９９１）、Ｇａ５ｈら の　ＮＥＵＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　ＯＦ　ＡＧＩＮＧ、６：１３１−１５０　（１ ９８５）。これら移植の有用性における決定的要素は、移植細胞の長寿命である 。胎児の神経細胞について（Ｂａｋａｙらの　５ｔｅｒｅｏｔａｃｔ、Ｆｕｎｃ ｔＮｅｕｒｏｓｕｒｇ、５３　：　ｌ−２０（１９８９）および、副腎細胞につ いて（Ｆ　ｒ　ｅｅｄらのＪ、ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、６５：６６４−６７０　（ １９８６））の長期生存か文献に記載されている。皮膚細胞や神経膠細胞に関す る研究は、（ＣｈｅｎらのＪ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ　４５：２５２−２５ ７　（１９９＋）、ＬａＧａｍｍａらのＳｏｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ 、＋７：５７２　（＋９９１）により目下進行中である。Ｇａｇｅらの（米国特 許第５．０８２．６７０号）は、中枢神経系の障害治療のため遺伝子移植細胞の 移植方法を開示している。Ｇａｇｅらは（１２欄、＋　５−５０行で、）移植用 に選択可能な、多種の細胞型の有用性を開示しているが、筋細胞は選択されたも のとしてリストされていない。

頭蓋内の筋移植は神々の治療用に提案されてきたが、筋移植組織は長期間生存し 得なかった。Ｈｅ１ｎｉｃｋｅの　Δｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、（Ｂｅ ｒｌ）、４９：ｌ７７−１８５　（１９８０）；　ＷａｋａｉらのＢｒａｉｎＲ ｅｓ、、３８６　：　２０９−２２２　（１９８５）、Ｗａｋａｉらによると、 脳幹の表面上に置かれた個体内移植だけが、少なくとも１年間生存を続けた。柔 組織筋移ｔａ（脳筋移植）において、移Ｖｉ量の１０％以下が横絞筋細胞により 占められ、これら少数の筋線維でさえも時間の経過とともに減少した。退行変性 筋細胞と共に、豊富で余分な基底層も１〜３ケ月経過の柔組織移植と共通であり 、１２月経過した移植組織には退行変性筋細胞と結合組織のみが含まれるにとど まった。

筋芽細胞の筋肉内への移植は、筋障害の治療用に（ＰａｒｔｒｉｄｇｅらのＭｕ ｓｃ　ｌ　ｅ＆Ｎｅｒｖｅ、ｌ　４　：１９７−２１２　（１９９１）および、 代謝障害の治療について（Ｓｍｉ　ｔｈらのＭｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１０ ＋３２６８−２７１　（＋９９０）以前から提案されてきた。移植された筋芽細 胞は動物の筋肉内て自発的腫瘍形成をすることなく長期間持続する。したがって 、筋芽細胞の人体内移植の安全性と効能については臨床試験で調査中である。（ ＨｕａｒｃｌらのＣＩ　ｉｎ、Ｓｃｉ、８１　：２８７−２８８　（１９９１） ；Ｌａｗらの　Ａｄｖ、Ｅｘｐ、　Ｎ１ｅｄ、Ｂｉｏｌ、２８０　：　７５−８ ７　（＋９９０））。

生体内、および生体外で筋細胞を遺伝子的に変容するため、異種の遺伝子導入（ 遺伝子）をこの種の筋細胞内に移入することによる数種の方法が用いられた。

導入遺伝子はこれらの細胞内では長期発現が可能である。（Ｓｍｉ　ｔｈらのＭ 。

１、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、ＩＯ：３２６８−３２７１　（１９９０）、Ｗｏｌｆ ｆらの５ｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５−１４６８　（１９９０）、Ｙａｎｇ らのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７：９５６８−９５７ ２　（＋９９０）。これらの操作は、正常筋発育中、ないし筋痛理学における萌 芽細胞および外套細胞の役割と挙動を比較的良く理解することにより支持される ものである。　（Ｅｍｅ　ｒ　ｓ　ｏｎらの　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　ＭｕｓｃｌｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ａｌａｎ　Ｌｉａｓ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ１９８６；　５ｃｈｕｌｔｓ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、５ｐｏｒｔｓ、Ｅ ｘｅｒ、２１　：８１８１−８１８６　（＋９８９）。

疾患治療技法において必要とされるのは、遺伝子導入組織を脳へ移植することに よる治療物質の長期発現をできるようにする方法である。

発明の要約 本発明は、治療物質を脳へ送出するための方法である。該方法は、最初に、ヌク レオチド配列を隔離する工程を含み、その中で該ヌクレオチド配列は治療有用蛋 白質を符号化する。筋組織は、次いて隔離され、ヌクレオチド配列により形質転 換される。これらの形質転換筋細胞は患者の脳に移植され、その結果、前記ヌク レオチド配列が発現される。本発明の特に存利とする実施悪様において、筋組織 の形質転換は上記ヌクレオチド配列で被覆された担体粒子を用い筋組織を衝撃す ることによる。本発明の目的は、治療分子を患者の脳に導入することである。

本発明の利点は、治療分子を長期間生成するためのプラットフォームを設けたこ とである。本発明の他の目的、利点、および特徴は、添付の図面と関連して以下 の明細書を参照することにより明白となろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明に用いるのに適する装置の分解斜視図てあり、図２は図１の装置 の平面図である。

好ましい実施例の簡単な説明 本発明は、遺伝子導入筋細胞（萌芽細胞および筋骨）と、脳遺伝子導入発現用の プラットフォームとしての筋線維、および、治療物質の脳への送出を用いること に関するもので、ここでの「治療物質」とは、蛋白質または蛋白質活性の二次代 謝物のような疾患状態を軽減する治療分子を意味している。本発明は、治療物質 を脳細胞に対し送出して治療されるべき疾患を有する患者にとって特に有用であ る。約言すると、患者から筋組織を切除する。この組織は形質転換用に調整され 、蛋白質の治療評価を符号化するヌクレオチド配列により形質転換される。ここ での「治療有用蛋白質」とは、蛋白質自体が疾患状態を軽減するか、または疾患 状態を軽減する代謝物を作り出すことを意味している。遺伝子導入部組織は、患 者の脳の治療蛋白質が所望される脳部位に移植される。

１、　遺伝子導入部組織の調整 以下の実施例は、適当な筋細胞を調整する２つの方法を述べたものである。これ ら２方法は、患者から筋組織の切除、および、移植前の筋肉を細かく刻むか、ま たは、筋組織から酵素的に細胞を回収することを含んでいる。筋肉の適当な採取 源は、患者の四頭筋であって、患者に害を与えずに筋肉の細片が切除されるため に用いるか、他の源も用いられる。筋を細かに刻む方法は、四頭筋の小片を患者 から除去し、適当な緩衝梅肉に配置する。この筋は、先が尖９たはさみのような 鋭い器具により小さな試料片に細刻みされる。これらの試料片は、およそ、０゜ １ｍｍの直径が好ましい。

筋の酵宋的回収は、Ｙａｂｌｏｎｋａ−ＲｅｕｖｅｎｉらのＤｅｖ、Ｂｉｏ１１ １９：２５２−２５９　（＋９８７）におけるように遂行するのが好ましい。若 い成熟ラット、または生後３〜５日の幼いラットを、２．Ｏｍｌ／１００ｇｍ体 重の割合で３，５％抱抱水クロチラル１．　Ｐ）で麻酔し滅菌法を用いて、ひら め筋を取除き、少量のＣＭＦハンクス溶液　（［Ｘ、　Ｇｉｂｃｏ）を有する６ ０ｍｍの滅菌シャーレ内に入れた。次に筋をハンクス溶液てゆすいて血液を取除 き、次いて滅菌鋏みにより細刻みした。次いで、細刻み筋は、３７℃で１５分間 あらかしめ暖めかつ５５分間培養された（幼ラット筋の場合、培養時間は２０分 間で可）筋酵素溶液（０，１６９％トリプシン、０．０８５％　コラゲナーゼ、 ＣＭＦハンクス、ｐ）（７，４）を含有する５０ｍ１のフラスコに移し、同フラ スコを１５分ごとに振るようにしてｐＨをチェックした。必要の場合、適正ｐＨ カラーを回復するため、滅菌０．１　Ｍ　ＮａＯＨを使用する。

フラスコの内容物はプラスティック製滅菌試験管に移され、臨床遠心機上の４調 節点て５分間遠心分離される。完全媒体、ＮＲＭ　（正常ラット培地、５％にわ とり胎仔抽出物、＜Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ＞、１５％うま血清、８０％調整イーグ ル培地）にて２分間洗浄した後、植え込み剤は２．５ｍｌ　ＮＲＭ中にて再懸濁 され、１８ゲージ針で機械的に分離される。結果として生じた細胞懸濁は、ニテ ックス濾過器により濾過されて筋骨と結合組織とを除去し、次いで、ノ（−コー ル（ングマ）勾配遠心分離により浄化される。

筋細胞の断片は手で採集され、ＮＲＭにより希釈され、臨床遠心機内にて１０分 間遠心分離にかけられる。その結果得られた植え込み剤が適量のＮＲＭ内にて再 度懸濁され、かつ細胞の数が数えられた後、同細胞は３５ｍｍ　培養皿内に（皿 あたりＩＯ×６乗の細胞）に入れられる。上記細胞は、１日おきに交換されるＮ ＲＭ培地を有する恒温器（３７°Ｃ１空気中の５％炭酸ガス加湿雰囲気）内にて 維持される。

本発明は、外因性の典型的混合染色体による遺伝構成の筋細胞内への導入を指向 するものである。この種の外因性遺伝構成は、他の同種か異種の有機体からのＤ ＮＡにより構成される。外因性のＤＮＡ構造は通常、有機体の形質転換細胞内に て蛋白質発現を生じるのに有効な側面の調整配列に加えて、遺伝子産物用または 関連蛋白質の符号化配列を具備している。側面調整配列の例は、転写を開始する のに十分な促進因子配列と、転写または翻訳の停止かにより、遺伝子産物を終結 させるに十分な終端器配列である。適当な転写、または翻訳強化器を外因性遺伝 子構造内に具備して、形質転換筋細胞内の蛋白質評価の総合的転換プロセスと発 現効率を助長するのは可能である。治療蛋白質の細胞内空間への分泌を生じさせ るのに役立つ信号配列を、蛋白質に有効にリンクできる。移入構造物は、遺伝子 産物の一過性発現のみか所望される場合に、それ自体、ＤＮＡの交代としてのＲ ＮＡとしてもよい。多数の応用において、治療蛋白質の分泌が遺伝子導入細胞内 にて達成されると最も有利である。これは、関連蛋白質について符号化領域の５ 番端に信号ペプチド符号化配列を付着することにより達成される。

信号ペプチドは、蛋白質を頭蓋内空間に送出するように、細胞外輸送と分割を条 件付けるのが好ましい。切除され、カリ処理された筋細胞は、次いて外因性核酸 構造により形質転換される。哺乳動物細胞の転換技術には、多くの適当な方法が 含まれる。以下の例は、ＤＮＡ含有溶液の注入と、リポフエクチン媒介法により 形質転換された筋細胞、および、ＤＮＡ被覆粒子による衝撃を利用した筋細胞の 形質転換の説明である。適当な転換法は形質転換された細胞を十分に作り出すの で、形質転換体の検出は相当に効率的である。適当な方法を用いると、筋プラッ トフォーム細胞を、少なくとも細胞の一部が移植不可能になり、所望の蛋白質の 生成ができなくなるほど損傷することはない。転換事象は高度に効率的とは限ら ないため、転換された筋細胞を選択ないし濾過することが必要である。この目的 は、適当な標識またはプラットフォーム筋細胞内に移入される選択可能な因子遺 伝子を用いることにより達成される。これらの遺伝子は治療関連遺伝子とリンク でき、または単に共変換が可能となる。標識遺伝子は、簡単に効力検定がなされ るヘータ・ガラクトシダーゼのような遺伝子産物を符号化する。

標識遺伝子生成物の存在は、細胞が形質転換されることを示す。かりに、効力検 定によりて被検細胞が破壊されたとしても、形質転換体の百分率に関する情報が 得られる。

選択可能の標識遺伝子は、細胞が特定の環境下で生存するのに必要な生成物を符 号化する。選択遺伝子の例として、抗生物′ＪＲ抵抗性を符号化する遺伝子があ る。故に、問題とする細胞を抗生物質にさらせば、転換された細胞のみが生存し 続ける。

２、　患者の準備 形質転換筋細胞がいったん得られると、同組織は患者の脳に移植されなければな らない。患者自身の筋を免疫拒絶を回避するため、脳移植に用いるのが望ましい 、すなわち、移植組織は自己移植である。遺伝子導入移植が必要な、かつ遺伝子 導入組織か移植されるへき患者の脳の切開区分内に頭蓋窓を創成するため、当業 者に周知の外科技法が用いられる。

実施例 １、　ｒ細刻みｊ筋移植 Ａ、筋の調整 四頭筋の５Ｘ５ｘ４ｍｍの一片を生後１〜２ケ月のＬｅｗｉｓまたはＳｐｒａｇ ｕｅ　Ｄａｎｌｅｙ・ラットから切除し、室温にて０．６％のぶどう糖を含む燐 酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に収めた。血液を上記の食塩溶液で洗浄して除去し た。切除筋を尖先はさみ（フィッシャー・サイエンティフィック）を用いて直径 ０．１ｍｍの標本に細刻みした。

Ｂ、動物の調整 上記動物は、免疫拒絶を回避するため、その細刻み筋の脳移植用受容者にされた 。直径２．５ｍｍの頭蓋窓を歯科用ドリルを用いてラット内に開設した。頭蓋窓 は前頭葉上のブレグマに対し左右２ｍｍでにある。硬膜を注意深く開放して脳組 織の断片を吸引し、直径２ｍｍ、深さ２〜３ｍｍの空洞を設けた。出血を吸い取 るためゼラチン泡（アップジョン社製）を塗付した後、細刻み筋を１８ゲージ金 属カニユーレを用いて移植した。重なり皮膚は埋没縫合とクリップにより閉塞さ れた。

Ｃ１移植組織の分析 脂肪移植の長期生存可能性を判定するため、細刻み筋移植片を有する４匹ないし ６匹の動物が１週間、１ケ月、２ケ月、４ケ月、および６ケ月の割で犠牲にされ た。胴切開部のヘマトキシリン・ニオノン（Ｈ＆Ｅ）染色により、筋移植が上記 各時点において存在することが判明した。染色移植片を検査した結果、１週間経 過した筋移植片は、筋骨または小筋線維を大体等しい割合で包含していることが 確認された。

壊死線維は同時点ではほとんどが認められなかった。２週間経過した移植片は、 大多数か移植片の周辺に僅かの筋骨と共に筋線維を構成していた。２週間以上経 過した移植片は、大部分が横紋付き筋線維で構成されていた。したがって、移植 細胞は正常に発育していたことになる。脳移植での筋骨から筋線維への進行経過 は、細刻み筋が筋肉中に移植されたときに観察された経過に類似している＝　（ ＧｒｏｕｎｄらのＪ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１３２：３２５−３４１　（１９８ ０）；ＰａｒｔｒｉｄｇｅらのＪ、Ｎｅｕｒｏｌ、Ｓｃｉ、３３：４２５−４３ ５（＋９７７））。しかしながら、脳に移植された成熟筋の今回の観察における 筋骨と筋線維への進行割合は、以前に観察された成熟筋の筋移植の場合より一層 はやいよってある。この急速進行は、新生筋を筋向に移植した（Ｇｒｏｕｎｄｓ らの　５ｕｐｒａ）ときに観察されたときの進行に一層類似している。２週間以 上経過の移植組織中の筋線維の１０％以下が中心核を含有していた。残余の筋線 維は周辺核を含有していた。上記筋線維中に見出される周辺核生成の大きな比率 は、十分に分化し筋細胞を示すものである。

この周辺核生成は予期しない発見であったが、それは以前の調査で筋向に移植し 戻された細刻み、成熟筋の移植片の中心核含有割合の増加が指摘されていたから である（Ｇｒｏｕｎｄｓらの　５ｕｐｕｒａ）。事実、いろいろの条件下で再生 を受けた成熟語（げっ）肉類動物筋は、一般的に中心核を有する筋線維を含有し ていた。

対照的に、細刻みした新生筋、または新生部分細胞は、筋向に移植されたとき周 辺核を有する筋線維を形成していた（Ｇｒｏｕｎｄｓらの５ｕｐｕｒａ）。１週 間経過の筋骨と成熟筋における脳移植での周辺核生成との双方の優位性は新生筋 細胞の挙動と類似していた。これらの観察は、受容者の脳が、移植された成熟筋 に筋骨をより迅速にかつ周辺核形成筋線維の形成を可能とする要因を有する可能 性を示唆している。細刻みではなく細長に裂かれた筋を同様に移植された脳は、 １週間で滅亡しかけた筋線維を含有し、２週間ではわずかの筋骨を含有していｔ こ。

細刻みにすると筋外膜と筋周膜とを分断することによって移植組織のより良好な 血管新生を可能とする。各時間期間について、４個の脳はすべてかなりの移植組 織を含有していた。移植組織の最大直径の測定により、上記移植の規模について 半定量的評価が与えられる。移植組織の平均最大直径は（士は標準誤差を示す） 全期間にわたり変化せず、移植後、１週間で１．９４（±０．１５）ｍｍ（ｎ＝ ４）、２週間で１．７８（±０．＋　１）（ｎ＝６）、１／ｌ−月で２．１７（ ±０．２２）（ｎ＝５）、２ケ月で１．７７（±０．１０）（ｎ＝６）、４ケ月 で２．３３（±０．３４）（ｎ＝４Ｌおよび、６ケ月で２．１３（±０．２１） （ｎ−４）であった。これらの結果は、筋移植が脳で少なくとも６ケ月間存在す ることを示すものである。実験動物は全部なんら明白な悪影響を受けることなく 生存し続けた。移植された細刻み筋はさらに、筋ミオシンについてＭＰ２０抗ミ オシン抗体を用い、（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒ ｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　ＭＤ）および、以前、Ｂａｄ ｅｒらのＪ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９５ニア６３−７７０　（＋９８２）で報告 されたように、ＦＩＴＣ・共役、抗ねずみ、ＩｇＧ抗体（シグマ）を用いて脳を 免疫組織化学的に染色することにより研究に付された。細刻み筋を移植された脳 だけが、ミオシン染色を線条式に有する細胞を含有していた。細刻みされない筋 を移植された脳では、ミオシン染色の保育がそれよりもかなり少ないことが判明 した。移植組織は尼子顧微鏡により検査し同検査手法により、筋移植組織が移植 後６ケ月間で正常な筋フィラメントを含有することが検証された。要約すると、 ６ケ月経過した筋組織内で線条と周辺核が存在することは、細刻み筋が健全かつ 分化状態で長期にわたり生存することを示唆するものである。

Ｄ、　遺伝子導入筋細胞の移植 プラスミドＤＮＡの筋肉内注射により遺伝子的に修正した筋細胞を移植した。

以前行った研究では、生体内の筋細胞は細胞外に送出されたプラスミドＤＮＡを 吸収しかつ上記ＤＮＡを安定して発現することを示した。

Ａｃａａｄｉらの　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ　３ニア１−８１（＋９９１） と、ｗｏｌｆｆらの５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８（＋９９０） でかつて報告されたように、２００μｇルシフェラーゼ発現ブラスミｌ−’、Ｐ Ｒ３ＶＬにより四頭筋を筋向に注入した　（ＤｅＷｅｔらの　Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２ニア８７０−７８７３　（１９ ８５）。注入して４日後に、筋はルシフェラーゼの活動度を調査するため直接分 析されるか、または脳に移植された。四頭筋の抽出物、または受容者脳の前頭部 を２００μｌの溶解緩衝剤内で調整し、かつ２０μｍの上澄みを、以前　Ａｃａ ａｄｉらのＮｅＷ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、３ニア１−８１　（１９９１）て報告 されたように、ルシフェラーゼ効力検定に付した。移植前の筋抽出物は、平均１ ゜０８６．４６０　（±２０６，７２９）ライト・ユニット（’　Ｌ、　Ｕ”　 ）　（ｎ＝５）を含有していた。移植の１日後に、受容者の脳は７０，６９７（ ±６８．５９１）Ｌ、Ｕ　（ｎ−４）を含有していた。受容者の脳は移植の７日 後に、わずかな程度のルシフェラーゼ　（＜４０ＯＬ、Ｕ、ｎ＝１２）を含有し たにすぎなかった。

２　酵素的に回収された筋移植 Ａ　部分細胞の調整 Ｙａｂｌｏｎｋａ−Ｒｅｕｖｅｎｉらの　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、１１９：２５２− ２５９　（１９８７）と同様に、部分細胞を生後１日ないし３日のＬｅｗｉｓ・ ラットから酵素的に回収し、パーコール（シグマ）勾配遠心分離により上記記載 のように浄化した。３５−ｍｍプレートの融合節管をゴム・ポリスマンを用いて トリプシン処理することなく回収した。

Ｂ、細胞の移植 筋組織を生後１〜２ケ月のＬｅｗｉｓ・ラット皮質中に移植するか、または尾状 核内に定位的に注入した。成熟おすルーイス・ラット（２００−３００ｇｍ）か 受容動物として用いられた。ラットはケタミン（１１０ｍｇ／ｋｇ）水剤の筋肉 内注射により麻酔し、定位装置内に安全に配置された。足状内移植は以下から成 る 部分細胞または筋骨の懸濁液を受容ラット脳の線紋内に、ブレグマと硬膜面に関 し以下の配位Ｐ！！（ｍｍ）にてツース・バーをゼロに設定して定位的に注入し た＝Ａ＝０．　２−０．　７．　Ｌ＝２．　５−３．　０．　Ｖ＝５．　５−６ ．　５　（Ｐａｘｉｎ。

ｓ　ａｎｄ　Ｗａｔｓｏｎ、Ｔｈｅ　Ｒａｔ　Ｂｒａｉｎ　ｉｎ　５ｔｒｅｏｔ ａｘｉｃ　Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、１９８２）。

細胞懸濁液は遠心分離され、植え込み剤（ペレット剤）を塩基性培地の容量内で 再度懸濁液に入れ、マイクロリットルあたり約４万の生体細胞を産出するように した。全部で１０μｍの細胞懸濁液（合計ておよそ５０Ｘ１０Ｘ４乗の生細胞に 等しい）を線紋に２３ゲージ針を備えた５０μｌのハミルトン注入器を用い５分 間かけて送出した。線紋への各注入時針を５分間そのまま留置し、その後静かに 脳から引き抜いた。少量のゼラチン泡を頭蓋の開口部に挿入し、頭皮を縫合した 。移植組織の最大直径の測定により移植組織のサイズについ経時的半定量的評価 か得られた。移植群の中で、移植組織の平均最大直径（士は標準誤差を示す）は 、移植後の１週間で１．３６（±０．０８）ｍｍ　（ｎ＝６）、２週間で１．　 ６０（±０．ｌ　Ｉ）ｍｍ　（ｎ＝６）、１ケ月で１．３３（±０．２０）ｍｍ 　（ｎ＝６）、および、６ケ月で１２８（±０．　１９）ｍｍ　（ｎ＝６）であ った。移植後、６ケ月を経過した移植組織のミオシン染色（Ｂａｄｅｒらの　Ｊ 、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、９５ニア６３−７７０　（１９８２））および、ヘマト キシリン・ニオジン（Ｈ＆Ｅ）染色で、筋細胞がミオシンと筋フィラメントとを 含有することが確認された。節管培養を足状核内に注入した脳もまた６ケ月経過 後、ミオシン陽性筋細胞を含有していた。電子顧微鏡検査により筋フィラメント を有する健常な育核筋細胞が明らかにされた。

Ｃ１遺伝子導入筋細胞の移植 リポソーム媒介変換により培養中の筋骨をトランスフェクト（細胞内へのＤＮＡ の人工移入）する方法が開発された。３５ｍｍプレート内筋管を筋骨ないし８日 間分化しＦｅｌｇｎｅｒらのＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８ ４　：　７４１３−７４１７　（１９８７）と同様にリボフエクチンを用いてト ランスフェクトした。節管培養は血清遊離すブチ・ＭＥＭ　（ＢＲＬ）により３ 回洗浄した。上記培養を１．０ｍｌのすブチ・ＭＥＭ内の１５μｇのＰＲ３ＶＬ ４５μｇのりボッエフチンとの事前混合複合群に４時間露呈した後、１．５ｍｌ の完全培地を添加した。トランスフェクトの３日後、培養は１１，３７０，００ ０　（±１．５９８．３７６）Ｌ、Ｕのルシフェラーゼ活性（ｎ＝６）を含有し たが、この活性は、３Ｔ３マウスの線維芽細胞を類似の方法を用いてトランスフ ェクトして得た活性よりも５倍から１０倍も大きい。上記筋骨は、Ｅ、ｃｏｌｉ ベータ・ガラクトシダーゼ、プラスミド、ＰＲ３ＶＬａｃ−Ｚ　（Ｎｏｒ　ｔｏ ｎらの　Ｍｏｆ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５：２８１−２９０　（１９８５）によ り同様にトランスフェクトされ、トランスフェクトされた筋骨の割合を判定した 。１５μｇのＰＲ３ＶＬａｃ−Ｚと４５μｇのりボッエフチンを用いてトランス フェクトされたおよそ５０％の筋骨が、この効力検定において青色に染色され、 ベータ・ガラクトシダーゼ発現を示した。上記トランスフェクトされた筋骨を、 成熟したＬｅｗｉｓ−ラットの脳に移植した。ＰＲ３ＶＬａｃ−Ｚを用いてトラ ンスフェクトされた筋骨を移植し脳の切開部を、Ａｃａａｄｉらの　Ｎｅｗ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、３ニア］−８１（１９９１）に記載されているように組織化学的 に染色した。

移植後２週間経過したとき、筋移植組織はベータ・ガラクトシダーゼ・陽性の筋 線線維を含有していた。

さらに定量的な情報がＰＲ３ＶＬによりトランスフェクトされた筋骨を用いて得 られた。ＰＲ３ＶＬによりトランスフェクトされた筋骨の移植後、平均ルシフェ ラーゼ活性は（士標準誤差、各時間期間についてｎ＝６）、移植後１週間で１６ ７．１４２　（＋７１，６２６）Ｌ、Ｕであり、移植後２週間で１９５．０１３ （＋７０．６９７）Ｌ、Ｕ、４週間で１５０．５３７Ｌ、Ｕ（±２７．５００） 、および、移植後８週間で１９１，８５２　Ｌ、Ｕ（±３３．２３３）であった 。移植を受けなかった脳の反対側はルシフェラーゼについて僅かな程度の（く４ ００Ｌ、Ｕ）の含有にとどまった。ルシフェラーゼの発現は、移植前の１１．３ ７０．０００Ｌ、Ｕから移植後、７日間で１６７．１４２Ｌ、Ｕに減少したが、 発現は移植後７日から２ケ月にわたって安定していた。移植後まもなくのルシフ ェラーゼの発現の顕著な低下の理由は、おそらく移植処置の間に筋骨に与えた損 傷に起因するものであろう。

要約すると、移植された筋細胞は脳で少なくとも６ケ月間生存し、かつプラスミ ドの発現は少なくとも２ケ月間安定を保った、移植筋細胞の健全で、かつ恒常的 な長期生存は、この型の細胞が、脳での遺伝子導入の発現用に有効な「プラット フォーム」をなすことを示唆している。本実験により、プラスミドによりトラン スフェクトされた分化部分細胞培養が遺伝子導入を脳で少なくとも２ケ月間安定 して発現することが指摘される。

３、　粒子媒介形質転換 粒子媒介形質転換法において、細胞または組織は、核酸被覆粒子により衝撃され る。上記の被覆粒子は、異種遺伝物質を細胞の内部に送出する。公告されたＰＣ Ｔ出ＷＥＷ０９１１０　Ｏ３５９に記載された粒子媒介形質転換処置法は、遺伝 子導入哺乳類細胞の創成に特に適するものである。この技法は、遺伝子導入筋細 胞を創成し、次いて前記で述べたように脳に移植するのに用いられる。この方法 で適当な筋細胞を前述したように得ることができる。

粒子の衝撃は、細刻み、または筋組織を隔離するのに用いる酵素消化の前か後に 行ってもよい。

他にも適当な粒子媒介形質転換方法があり、その１つの適当な粒子媒介形質転換 がＰＣＴ公開出願ＷＯ’　９１１０７４８７に記載されている。またこの技術に 使用される装置はＢｉｏＲａｄから市販されている。以下に、公開されたＰＣＴ 出願Ｗ０　９１１００３５９の方法による筋細胞の形質転換について述べる。図 １と図２とは、筋細胞と組織の粒子媒介形質転換用に適当な装置の図解説明であ る本発明では、図１と図２の装置を独自の用法にて使用し、可調整の放電を設は 小粒そ上に披ＩしたＤＮＡを筋細胞の遺伝物質内に物理的に加速促進するように している。

」１記装置は、２個の電極１４を挿入した火花放電チャンバ１２からなり、同２ 個の電極は約１〜２ｍｍの間隔をおいて離隔しである。

火花放電チャンバは、その上端外方に２つの開口部１６と１８を存する横方向に 伸長した長方形である。

開口部１８は、アクセス・プレート２０により覆われている。

電極１４の反対側に配置した他の開口部はキャリア・シート２２によりカバーさ れるように意図したものである。

１極１４は、適当な可調整放電電圧源に接続しである。この種の放電電圧源は、 ｌないし２マイクロフアラツド規模範囲のキャパシタに接続された適当な電気ス イッチングを具備することが好ましい。キャパシタ内に導入される電圧の充電量 は、単巻き変圧器などを用いて、たとえば、■ないし５万ボルトの範囲で調整さ れる。利用者によりｔ極１４を用いてキャパシタを安全かつ簡便に放電できるよ うに適当なスイッチングが設けである。キャリア・シート２２は、火花放電チャ ンバ１２の開口部１８上に配置されるためのものである。キャリア・シート２２ はアルミめっきサラン（商標）で被覆されたマイラー（商標）製のシートである ことか好ましい。火花放電チャンバ内の開口部のおよそ５〜ｌＯミリメートル上 方に保持スクリーン２４かある。上記保持スクリーンの約５〜２５ミリメートル 」１方には標的面２６か配しである。筋細胞内に変換されるのを目的とする外因 性異種遺伝構成体は、当業者により熟知される適当なりＮＡまたはＲＮＡ調整法 により調整される。核酸は金のような耐久性に富む高密度物質からなる１〜３マ イクロン・サイズの微粒子上で乾燥される。核酸を金徹粒子上で乾燥させる適当 な方法が、ＰＣＴ出願　Ｗ０９１１００３５９の中に記載しである。

約言すると、ＤＮＡは、カルシューム塩素を添加した２５ｍＭスペルミジン／６ ％　ポリエチレングリコール（Ｍ、Ｗ、３０００）を最終濃度と０．６Ｍに濃縮 した後、沈降させて微粒子に付着される。ＤＮＡは、Ｍｇ微粒子あたり０，１〜 ０．５μｇ　ＤＮＡ濃度でビード上に被覆されるのが好ましい。被覆した粒子は 、１００％エタノール中ですすいだ後、キャリア・シート２２に付着する。被覆 キャリア粒子は、次いで火花放電チャンバ１２の上部に挿入されるキャリア・シ ート２２上に配置される。次いで、筋細胞または筋組織のようなターゲット組織 が、標的面２６に隣接して配置される。次に、およそ２〜４マイクロリツトル量 の水の小滴を電極１４両端間を橋絡するように配置する。次いでアクセス・プレ ートカバー２０を放電チャンバ１２の頂上部上に載置する。キャリア・シート２ ２とターゲット間の大気をヘリウムと置換えるため、装置とターゲットを密閉し 十分な量のヘリウムを包囲体内に導入して大気ガスの大部分を移動させるように する。火花放電を電極内にて開始させるため適切な電子スイッチングが使用され る。好ましくは、上記装置を５ないし１５ｋＶの火花放電レベルで作動するよに する。放電作用力が、電極１４間の火花放電の隙間に残る水の小滴を瞬時に気化 することにより同すきまを橋絡するようにする。水の気化作用力により、火花放 電チャンバ１２内に全方向に外方に放射する衝撃波を創成する。キャリア・シー ト２２上に及ぼす上記衝撃波の影響によりキャリア・シート２２を上方に向は急 速度で推進させる。上記移動中のキャリア・シート２２は、保持スクリーン２４ と接触するまで上方向に向は加速される。ヘリウムが存在することにより、キャ リア・シートの走行を遅滞させないようにすると共に、衝撃波のターゲットに向 けての伝播勢力を低下させる。キャリア・シート２２は保持スクリーン２４に保 留され、かつ以前に該シート２２に付着されたＤＮＡ被覆粒子は、同キャリア・ シートから飛び去って標的面に向は自在に走行し続ける。粒子は標的面内に進行 し同面上の筋細胞内に入る。標的組織の表面に衝撃を及ぼす粒子の運動量は、電 極１４に与えられる最初の放電電圧に基づいて調整が可能である。したがって、 Ｋｆｉ１４により放電される電気エネルギーの変化率により、粒子が標的に及ぼ す衝撃の速度を調整することができ、また、標的組織内への粒子の侵入深度を電 極１４の全放電の調整範囲にわたって連続的にｍｓｔすることも可能である。移 植される遺伝子導入筋細胞の移植および分析は、以上に述べたように好ましく実 行される。種々の細胞の型について以前の粒子媒介形質転換に関する経験によっ て得た知識から、全部ではないにしても、はとんどの細胞の型において、低レベ ルでも長期レベルの発現における発現の低下に追随して有意レベルの衝撃後の一 過性遺伝子活動が得られる。処理した細胞の中には、永続的に形質転換されるも のも若干ある。故に、いったん筋プラットフォーム細胞が脳で長期生存が可能に なると、遺伝子導入の長期発現と脳への送出も同様に達成されるようになる。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ　６１　Ｋ　４８１ ００　８３１４−４ＣＣ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ９２８２−４８７７２９−４Ｂ （７２）発明者　イーアオ　ショウ　シューアメリカ合衆国　ライスコンシン州 ５３７０５　マディソン　ユニヴアーシティハウジズ　２７　アパートメント　 ディＩ Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）治療有用蛋白質を患者の脳の中で発現できるヌクレオチド配列を構成 し（ｂ）患者から筋組織を隔離し、 （ｃ）前記筋組織の細胞を前記ヌクレオチド配列により形質転換し、（ｄ）前記 筋組織を患者の脳に移植し、その結果、蛋白質がヌクレオチド配列により発現さ れ、かつ治療物質が形質転換された細胞により作られる、治療物質を患者の脳に 送出する方法。 ２．前記工程（ｃ）の転換は、工程（ａ）のヌクレオチド配列で被覆されたキャ リア粒子により工程（ｂ）の筋組織を衝撃する請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記工程（ｃ）の転換はリポソーム媒介転換による請求の範囲第１項に記載 の方法。 ４．前記工程（ｃ）の転換は核酸含有溶液を筋組織に注入することによる請求の 範囲第１項に記載の方法。 ５．前記工程（ｂ）の隔離された筋組織は筋を細刻みして得られる請求の範囲第 １項に記載の方法。 ６．前記隔離された筋組織は筋を酵素的に消化することにより得られる請求の範 囲第１項に記載の方法。 ７．前記工程（ｄ）の移植は脳の皮質になされる請求の範囲第１項に記載の方法 。 ８．前記工程（ｄ）の移植は脳の尾状核になされる請求の範囲第１項に記載の方 法。 ９．前記患者は人間である請求の範囲第１項に記載の方法。 １０．前記隔離された筋組織は筋芽細胞である請求の範囲第１項に記載の方法１ １．いくらかの筋芽細胞が筋管を形成するまで筋芽細胞を培養する工程を加えて 有し、その培養は工程（ｃ）の転換前に行われる請求の範囲第１０項に記載の方 法。 １２．（ａ）治療有用蛋白質を患者の脳の中で発現できるヌクレオチド配列を構 成し、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をキャリア粒子上に被覆し、（ｃ）患者から筋組織 を切除し、 （ｄ）前記被覆キャリア粒子を前記筋組織内に加速促進し該筋組織中の若干の細 胞をヌクレオチド配列で形質転換し、（ｅ）前記筋組織を患者の脳で治療物質の 存在の望まれる位置に移植する、治療物質を患者の脳に送出する方法。